專利名稱：一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的pH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Paclitaxel)，又俗稱泰素，紫素，特素，是臨床上常用的抗生素類抗腫瘤藥，抗癌譜廣，療效廣，可治療多種腫瘤，但該藥對心臟具有嚴(yán)重的毒副作用，尤其是嚴(yán)重的心臟損害，骨髓抑制等副反應(yīng)限制了它在臨床上的應(yīng)用。多年來，各國科學(xué)家一直在尋找著降低其毒副反應(yīng)的有效方法，如調(diào)整給藥方案，研制心臟毒性低的紫杉醇類似物，聯(lián)合用藥以及改變藥物劑型的方式來減輕其嚴(yán)重的心臟毒性。脂質(zhì)體包裹紫杉醇比游離藥物的毒性降低 50-70% (Budai M，et al. Liposomes as drug carrier systems !preparation， classification and therapeutic advantages of liposomes. Acta Pharm Hung. ,2001, 71(1) :114-8.),但是脂質(zhì)體由于其易被巨噬細(xì)胞吞噬，在正常組織中的含量依然很高，為了進(jìn)一步降低阿霉素脂質(zhì)體的藥物毒性，利用靶向物質(zhì)或粒子對脂質(zhì)體表面或內(nèi)部進(jìn)行修飾，使得脂質(zhì)體克服藥物在體內(nèi)輸送過程中所遇到的各種生理屏障，將藥物送到特定的靶位，提高藥物的靶向性。PH敏感性脂質(zhì)體就是其中的一種，利用腫瘤組織在局部缺血時，腫瘤間質(zhì)液會出現(xiàn)異常酸化現(xiàn)象，PH值比正常組織低，利用這一特性科學(xué)家采用了不同方法進(jìn)行了表面修飾，如在脂質(zhì)體表面嫁接具有PH敏感的生物高分子材料或使用具有pH敏感性的磷脂材料來制備脂質(zhì)體。羧甲基殼聚糖(CMCT)是殼聚糖經(jīng)羧甲基化反應(yīng)后生成的一種水溶性衍生物，其性質(zhì)穩(wěn)定，生物相容性和可降解性好，毒性較小。它既含有弱堿陽離子(-NH3+)基團(tuán)，又含有弱酸陰離子(-COO—)基團(tuán)，是一種兩親性聚電解質(zhì)。由于其具有pH敏感，在不同的pH值條件下，其鏈段的構(gòu)象不同，利用這一特性，將羧甲基殼聚糖修飾到脂質(zhì)體表面，使得在不同PH 值下由于構(gòu)象不同其作用力將脂質(zhì)體內(nèi)包裹的藥物釋放，達(dá)到PH敏感。仝新勇等(羧甲基殼聚糖修飾對紫杉醇自組裝前體脂質(zhì)體大鼠體內(nèi)組織分布的影響.中國天然藥物，2007， 5(1) :45-49)利用這一規(guī)律進(jìn)行了紫杉醇脂質(zhì)體的修飾并對其藥代分布進(jìn)行了研究，研究結(jié)果表明，在添加羧甲基殼聚糖進(jìn)行表面修飾后，大鼠的體內(nèi)配置發(fā)生了明顯的變化，肝、 脾、肺、卵巢、子宮等的藥物攝取量明顯增加。納米級藥物載體的靶向形式以被動靶向?yàn)橹?，即利用載體的疏水性(或親水性)、 靜電作用、載體的大小、質(zhì)量、PH值等理化因素容易被位于肝、脾、肺及骨髓的單核、巨嗜細(xì)胞系統(tǒng)攝取，增強(qiáng)抗腫瘤藥物對位于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的腫瘤的化療效果。為了加強(qiáng)靶向作用，可以設(shè)計具有主動靶向作用的納米粒，通過靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，使藥物能夠準(zhǔn)確送到腫瘤細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的靶向治療。由于葉酸受體在腫瘤細(xì)胞外膜的過度表達(dá)，已經(jīng)確知腫瘤細(xì)胞與葉酸之間有特殊的密切關(guān)系。當(dāng)葉酸通過側(cè)基連接于羧甲基殼聚糖的羧基(葉酸-羧甲基殼聚糖)，其依舊保持正常的受體親和力，因此可以通過受體胞吞作用被內(nèi)在化。且葉酸受體在多種人類腫瘤細(xì)胞的過度表達(dá)也為特效藥物對腫瘤的靶向提供了一種有效方式(Sumanta K.，et al. In vitro evaluation of folic acid modified carboxymethyl chitosan nanoparticles loaded with doxorubicin for targeted delivery. J Mater Sci =Mater Med, 2010, 21 :1587—1597.)。葉酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞攝粒過程，也就是葉酸的選擇性主動靶向作用。先由羧甲基殼聚糖的Ph敏感性將載藥脂質(zhì)體靶向至患病部位，再經(jīng)葉酸與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合使藥物精確定位，使更多的載藥納米粒進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)藥物利用率，同時降低藥物對正常細(xì)胞的傷害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的PH敏感納米紫杉醇質(zhì)體及其制備方法。葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感納米紫杉醇脂質(zhì)體由紫杉醇、卵磷脂、膽固醇、維生素E、葉酸-羧甲基殼聚糖等作為組分制備而成。本發(fā)明葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感納米紫杉醇脂質(zhì)體，由下列質(zhì)量分?jǐn)?shù)比的組分組成
紫杉醇3.2-16份
卵磷脂16-80份
膽固醇4-20份
維生素E0.16-0.8份
葉酸-羧甲基殼聚糖1-5份
緩沖液800-1000份其中，優(yōu)選的是由下列質(zhì)量份數(shù)比的成分組成
紫杉醇4-12份
卵磷脂20-60份
膽固醇4-15份
維生素E0.2-0.6份
葉酸-羧甲基殼聚糖1.25-3.75份
緩沖液800-1000份本發(fā)明葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感納米紫杉醇脂質(zhì)體的制備包括以下步驟(1)按配方稱取相應(yīng)的磷脂、膽固醇、紫杉醇和維生素E放入適當(dāng)容器中，然后加入無水乙醇超聲震蕩溶解成溶液，將此溶液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中；在40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，成膜；加入緩沖溶液(pH = 7. 4)進(jìn)行洗膜、水化，間隔0. 5h超聲一次，水化池， 制得紫杉醇脂質(zhì)體；(2)將制備的紫杉醇脂質(zhì)體用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)間隙超聲或高壓均質(zhì)制得納米級的紫杉醇脂質(zhì)體，過0. 22 μ m濾膜得到粒徑均一的紫杉醇納米脂質(zhì)體；
(3)將葉酸-羧甲基殼聚糖溶液加入到紫杉醇脂質(zhì)體中，在37°C水浴下水合0. 5h, 制得葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的PH敏感納米紫杉醇脂質(zhì)體。所述的卵磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂或氫化蛋黃卵磷脂。所述的羧甲基殼聚糖的羧甲基取代度為0. 6-1. 2，分子量為3000-100000 ；所述的葉酸-羧甲基殼聚糖是由葉酸在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl) 存在的條件下室溫活化池后，再與羧甲基殼聚糖反應(yīng)生成的。所述的緩沖液選自磷酸鹽緩沖溶液或0. 9%氯化鈉的生理鹽水。所述的細(xì)胞粉碎機(jī)間歇超聲空白脂質(zhì)體的優(yōu)化功率為200-300W，間隙時間5s，超聲時間3s，工作時間為30min ；或采用高壓均質(zhì)的優(yōu)化壓力參數(shù)為40_90MPa，循環(huán)次數(shù)為 6-15 次。采用本發(fā)明的方法，可以制備小粒徑、性能穩(wěn)定的葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感納米紫杉醇脂質(zhì)體制劑，葉酸-羧甲基殼聚糖的修飾可以使其具備PH敏感性、腫瘤靶向性，并延長其體內(nèi)長循環(huán)性能。本發(fā)明采用無水乙醇作為有機(jī)溶劑，排除了文獻(xiàn)中使用的毒性較大的有機(jī)溶劑氯仿或甲醇的殘留，減少了環(huán)境污染，降低了生產(chǎn)成本，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為葉酸-羧甲基殼聚糖的傅里葉紅外譜圖。圖2為葉酸-羧甲基殼聚糖修飾紫杉醇納米脂質(zhì)體在不同pH緩沖液中的藥物釋放率圖。
具體實(shí)施例方式通過下面實(shí)施例說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍，不局限于此。實(shí)施例1在無菌條件下取注射用大豆卵磷脂2g，膽固醇0. 5g，紫杉醇0. Olg和維生素E 0. 025g。將上述物料置于適當(dāng)容器中，加入無水乙醇IOOml超聲震蕩至完全溶解成溶液，將上述溶液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，在恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至形成透明淡黃色薄膜。取PBS(pH =7. 4)緩沖溶液IOOml洗脫，緩緩洗膜。洗膜后用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)在功率為200-300W，間隙時間k，超聲時間3s，工作時間為30min超聲粉碎，控制粒徑在50nm-200nm之間，用0. 22 微米濾膜過濾除菌，加入一定量的葉酸-羧甲基殼聚糖溶液，水合0. 5h得到pH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體溶液。實(shí)施例2在無菌條件下取注射用蛋黃卵磷脂1. 6g，膽固醇0. 4g，紫杉醇0. OOSg和維生素E 0. 020g。將上述物料置于適當(dāng)容器中，加入無水乙醇80ml超聲震蕩至完全溶解成溶液，將上述溶液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，在恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至形成透明淡黃色薄膜。取PBS(pH =7. 4)緩沖溶液80ml洗脫，緩緩洗膜。洗膜后采用高壓均質(zhì)在壓力參數(shù)為SOMPa時循環(huán) 10次，加入一定量的葉酸-羧甲基殼聚糖溶液，水合0. 5h得到葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH 敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體溶液。實(shí)施例3
5
在無菌條件下取注射用蛋黃卵磷脂0. 4g，膽固醇0. lg，紫杉醇0. 002g和維生素E 0. 005g。將上述物料置于適當(dāng)容器中，加入無水乙醇20ml超聲震蕩至完全溶解成溶液，將上述溶液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，在恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至形成透明淡黃色薄膜。取PBS(pH =7. 4)緩沖溶液20ml洗脫，緩緩洗膜。洗膜后用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)在功率為200-300W，間隙時間5s，超聲時間3s，工作時間為30min超聲粉碎，控制粒徑在50nm_200nm之間，用0. 22 微米濾膜過濾除菌，加入一定量的葉酸-羧甲基殼聚糖溶液，水合0. 5h得到葉酸-羧甲基殼聚糖修飾PH敏感多柔比星納米脂質(zhì)體溶液。
權(quán)利要求
1.一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的pH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體，其特征在于，是由以下重量百分比的組分組成紫杉醇3. 2-16份，卵磷脂16-80份，膽固醇4-20份，維生素E 0. 16-0.8份，葉酸改性的羧甲基殼聚糖(葉酸-羧甲基殼聚糖)1-5份，緩沖液800-1000份； 將卵磷脂、膽固醇和維生素E，紫杉醇分別按比例稱取相應(yīng)的重量放入適當(dāng)容器中，然后加入定量無水乙醇超聲震蕩溶解成溶液，將此溶液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓除去有機(jī)溶劑后成膜，加入比例量的緩沖溶液(pH = 7. 4)洗膜，水化、間隔0.證超聲一次，水化池，制得紫杉醇脂質(zhì)體懸浮液，將紫杉醇脂質(zhì)體懸浮液用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)間歇超聲或高壓均質(zhì)制得納米脂質(zhì)體，過0. 22 μ m濾膜后，在37°C水浴下水合池，將葉酸-羧甲基殼聚糖溶液加入到紫杉醇納米脂質(zhì)體中，在37°C水浴下水合0. 5h，制得pH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體，其特征在于，是由以下重量百分比的組分組成紫杉醇4-12份，卵磷脂20-60份，膽固醇4-15 份，維生素E 0. 2-0. 6份，葉酸-羧甲基殼聚糖1. 25-3. 75份，緩沖液800-1000份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的pH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述的卵磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂或氫化蛋黃卵磷脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的pH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述的羧甲基殼聚糖中的羧甲基取代度為0. 6-1. 2，分子量為 3000-100000 ；所述的葉酸-羧甲基殼聚糖是由葉酸在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)與碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HCl)存在的條件下室溫活化池后，再與羧甲基殼聚糖反應(yīng)生成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的制備葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的pH敏感納米紫杉醇脂質(zhì)體的方法，其特征在于所述的緩沖液選自磷酸鹽緩沖溶液或0. 9%的氯化鈉生理鹽水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的制備葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的pH敏感納米紫杉醇脂質(zhì)體的方法，其特征在于將所得紫杉醇脂質(zhì)體使用細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎的時候，其功率為 200-300W,間隙時間5s，超聲時間3s，工作時間為30min ；或?qū)⑺每瞻字|(zhì)體進(jìn)行高壓均質(zhì)，壓力為40-90MPa，循環(huán)次數(shù)為6_15次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的pH敏感紫杉醇納米脂質(zhì)體及其制備方法。本發(fā)明中的脂質(zhì)體是由紫杉醇、磷脂、膽固醇、維生素E、葉酸-羧甲基殼聚糖等組成。所制備的脂質(zhì)體具有pH敏感性、腫瘤靶向性以及長循環(huán)主動靶向給藥功能。
文檔編號A61P35/00GK102488658SQ20111043972
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者侯娟, 徐云龍, 楊勇強(qiáng), 楊盛兵, 梁婧, 王麗丹, 田文寅, 邢萬里, 錢秀珍 申請人:華東理工大學(xué)