專利名稱：H22肝癌細胞自噬小體在制備肝癌治療性疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于肝癌疫苗研制技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及H22肝癌細胞自噬小體在制備肝癌治療性疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌(HCC)是惡性程度極高、且預(yù)后極差的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康。 治愈性切除手術(shù)或肝移植是目前肝癌病人首選的治療方法，但由于肝癌的肝內(nèi)多發(fā)病灶、 肝外轉(zhuǎn)移及供體缺乏等因素，新診斷出的肝癌病人只有10% 15%可采取手術(shù)治療。臨床資料顯示，大部分肝癌病人對化療、放療等治療不敏感，因此，肝癌的臨床治療迫切需要新的方法和手段。腫瘤生物治療作為一種新的肝癌治療策略，具有特異性強、毒副作用小等優(yōu)點，越來越受到人們重視。其中，以樹突狀細胞(DC)為載體的肝癌疫苗目前已成為肝癌生物治療的研究熱點。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤抗原不能有效呈遞給T細胞是導(dǎo)致免疫逃逸的重要原因。同時在荷瘤機體中，由于存在抗原遞呈細胞的功能低下甚至缺陷，特別是DC在數(shù)量和功能的改變，可造成腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展。目前，基于 DC的腫瘤疫苗被認為是最有效的腫瘤疫苗之一，已開展大量基礎(chǔ)研究和臨床試驗。DC疫苗功能的實現(xiàn)主要取決于兩部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是負載有效的抗原， 抗原信息得以充分表達。然而，研究試驗中存在許多問題有待解決，包括DC來源、制備過程、DC的抗原負載、用量、使用頻度、免疫途徑和次數(shù)，以及如何更好的募集腫瘤抗原等成為目前關(guān)注的熱點。pAPC交叉遞呈的抗原多肽是誘導(dǎo)特異性效應(yīng)細胞的物質(zhì)基礎(chǔ)、而腫瘤細胞直接遞呈的抗原多肽是效應(yīng)細胞有效識別并殺傷腫瘤細胞的靶點。一方面，腫瘤細胞直接遞呈的抗原多肽主要來源于腫瘤細胞的短壽蛋白(平均半衰期約為10分鐘)；另一方面，PAPC交叉遞呈的抗原多肽主要來源于腫瘤細胞的長壽蛋白(經(jīng)自噬途徑降解)，兩者間可能存在著不對稱現(xiàn)象，因此，解決上述的不對稱性是腫瘤免疫需要解決的課題。如何充分利用腫瘤細胞產(chǎn)生的全部抗原信息，誘導(dǎo)能更有效識別腫瘤細胞的特異性效應(yīng)細胞是目前以“長壽蛋白”為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗所面臨的難題。自噬(autophagy)是普遍存在的細胞生物學(xué)現(xiàn)象，是指胞漿組分及細胞器被包裹形成自噬小體(autophagosome)，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，最終實現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)降解的過程。大量研究結(jié)果顯示采用自噬抑制劑(3-AM、wortmarmin)、siRNA技術(shù)下調(diào)自噬相關(guān)基因(AtgU)等方法抑制腫瘤細胞的自噬，則明顯降低DC交叉提呈腫瘤抗原的免疫效果；反之，采用自噬誘導(dǎo)劑(rapamyCin、NH4CL)、饑餓等方法誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生細胞自噬，則明顯增強DC交叉提呈的免疫效果。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，是提供H22/BNL兩種肝癌細胞自噬小體在制備肝癌治療性疫苗中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下H22/BNL肝癌細胞自噬小體DRibbles在制備肝癌治療性疫苗中的應(yīng)用。其中，所述的H22/BNL肝癌細胞自噬小體DRibbles按如下步驟制備得到(1)H22/BNL肝癌細胞的培養(yǎng)復(fù)蘇凍存H22/BNL細胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (V/V)胎牛血清、100U/ ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，重懸細胞至1 X IO6個/ml，并將其移入500ml細胞培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% (V/V) CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 2天換液一次，常規(guī)0. 25% (g/mL)胰蛋白酶消化傳代；Q)H22/BNL肝癌細胞的處理待步驟(1)培養(yǎng)后的細胞貼壁良好，密度適中后(所述的密度適中是以細胞單層均勻鋪滿培養(yǎng)板底部約80-90%的面積確定)，加入雷帕霉素(Rapamycin)、萬珂(Velcade) 和氯化銨(NH4CL)，雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為1 OOnmo 1 /L、200nmo 1 /L和 30mmol/L,干預(yù)H22肝癌細胞16小時，誘導(dǎo)自噬小體DRibbles ；(3)提取 DRibbles 將步驟(2)誘導(dǎo)后的細胞經(jīng)離心得到沉淀，即為自噬小體一DRilAles。其中，步驟(3)中，提取DRibbles具體包含如下步驟(3a)將細胞及培養(yǎng)液倒入50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；(3b)將步驟(3a)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm， 30min,4°C ；(3c)將步驟(3a)離心后的沉淀的細胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，IOminJf 低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C;(3d)將步驟(3b)和(3c)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm 高速離心30min，4°C ；(3e)棄步驟(3d)得到的上清，沉淀即為自噬小體DRibbles，將沉淀用Iml PBS重懸后分裝，凍存于_20°C，備用。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢1.快速獲取大量自噬小體(DRitDbles)。本技術(shù)采用3種藥物聯(lián)合應(yīng)用處理H22/ BNL兩種肝癌細胞，誘導(dǎo)自噬小體的大量產(chǎn)生，然后以分步高速離心的方法從細胞培養(yǎng)上清中提取到H22/BNL肝癌細胞的DRilAles。2.本技術(shù)還涉及了自噬小體的鑒定，對其相關(guān)生物學(xué)活性進行檢測。通過電子顯微鏡方法，可以觀察到典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑在IOOnm IOOOnm之間，符合自噬小體的特征，提示有效地募集了自噬小體。3.本技術(shù)利用尾靜脈聯(lián)合輸注Flt3L和GM-CSF表達質(zhì)?？梢杂行дT導(dǎo)小鼠樹突狀細胞的擴增，其亞型更為豐富并具有很強的抗原遞呈能力。4. DRibbles作為一種新型交叉提呈的抗原載體，免疫小鼠，能夠在體內(nèi)抑制小鼠腫瘤的生長。


圖1為電鏡觀察DRibbles形態(tài)(X 80000)。圖2藥物處理后DRibbles中LC3含量的變化。圖3不同抗原刺激Dribble (H22)預(yù)免疫小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-的水平。圖4DRit3bleS再刺激DRibbles (H22)預(yù)免疫小鼠以及PBS免疫小鼠淋巴細胞分泌 IFN-的水平。圖5小鼠H22細胞皮下移植瘤模型的建立。其中，1. H22細胞接種3天后；2. H22 細胞接種10天后。圖6DRit3ble (H22)疫苗免疫小鼠后H22皮下腫瘤生長情況。圖7抗原刺激Dribble (BNL)預(yù)免疫小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ的水平。其中， Α、抗原刺激淋巴結(jié)細胞分泌IFN- γ的水平；B、抗原刺激⑶8+Τ細胞組分泌IFN- γ的水平； C、抗原刺激⑶4+Τ細胞組分泌IFN-γ的水平；D、抗原刺激⑶4+Τ細胞組分泌IL-4的水平。圖8不同劑量BNL細胞皮下注射第15天后的小鼠皮下瘤生長情況。圖9DRit3bleS (BNL)疫苗免疫小鼠后BNL皮下腫瘤生長情況。圖IODribbles (BNL)疫苗免疫組和PBS組小鼠腫瘤組織的病理切片。其中，A =PBS 組小鼠腫瘤組織(100X)，腫瘤細胞為多邊形和卵圓形，大小，形態(tài)不一，核大，深染，核仁明顯，核分裂相易見，周圍可見疏松結(jié)締組織，未見明顯炎細胞浸潤，可見大量血管血供豐富； B :DC/DRibbles疫苗免疫組腫瘤組織(100X)，腫瘤細胞形態(tài)及排列同上，周圍可見疏松結(jié)締組織包繞，結(jié)締組織內(nèi)可見少量炎細胞；C :DC/DRibbles疫苗免疫組腫瘤組織Q00X)， 炎細胞類型有中性粒細胞，單核巨噬細胞和淋巴細胞。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 :H22/BNL肝癌細胞自噬小體DRibbles的制備。1、H22/BNL肝癌細胞的培養(yǎng)取凍存在液氮中的H22/BNL細胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液，重懸細胞至1 X IO6個/ml，并將其移入500ml細胞培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% (V/V) CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 2天換液一次， 常規(guī)0. 25%胰蛋白酶消化傳代；2、H22/BNL肝癌細胞的處理待步驟(1)培養(yǎng)后的細胞貼壁良好，密度適中后，加入雷帕霉素 (Rapamycin) 100nmol/L、萬珂(Velcade) 200nmol/L、氯化銨(NH4CL) 30mmol/L 組合處理 16 小時，誘導(dǎo)自噬小體一DRilAles。并設(shè)置對照組(只加入培養(yǎng)基)。3、提取 DRibbles 誘導(dǎo)后的細胞經(jīng)離心得到沉淀，即為自噬小體DRilAles。具體包含如下步驟(a)將細胞及培養(yǎng)液倒入50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；(b)將步驟(3a)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm，30min,4°C ；(c)將步驟(3a)離心后的沉淀的細胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，lOmin，將低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C ；(d)將步驟(3b)和(3c)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm 高速離心30min，4°C ；(e)棄步驟(3d)得到的上清，沉淀即為自噬小體DRibbles，將沉淀用Iml PBS重懸后分裝，凍存于-20°C，備用。(f)將低速離心時得到的細胞沉淀用PBS重懸分裝，反復(fù)凍融后得到細胞裂解物， 使細胞徹底裂解，將產(chǎn)物凍存于_20°C，備用。實施例2 透射電子顯微鏡鑒定DRibbles的形態(tài)。將提取好的DRibbles高速離心使其壓縮緊密，棄上清，沉淀用2. 5% (V/V)戊二醛固定，送電鏡室進行處理，上鏡觀察DRibbles的形態(tài)。如圖1所示電鏡下可見含膜結(jié)構(gòu)的小體，平均直徑約為200-300nm(箭頭所指)，證實有效募集了 H22肝癌細胞的自噬小體。實施例3 =DRibbles總蛋白含量測定(Bradford法)。1)完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取25 μ 1用PBS稀釋至100 μ 1 ；2)將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μ 1分別加到96孔板中，加PBS補足到 20μ 1 ；3)提前將待測DRibble反復(fù)凍融，離心取上清，加適量體積樣本到96孔板中，加 PBS補足到20 μ 1 ；4)各孔加入200 μ LG250染色液，室溫放置3_5分鐘；5)用酶標(biāo)儀測定Α595，或560-610nm之間的其它波長的吸光度；6)用軟件ElisaCalc繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的蛋白濃度，結(jié)果大約為左右。實施例4 =Western blot檢測細胞裂解物和DRibble中標(biāo)記蛋白一LC3的表達LC3-I為胞漿型蛋白，參與了自噬小體的形成并以LC3-II的形式錨定于自噬小體的雙層膜上，因而，LC3-II已被公認為自噬小體的特征性標(biāo)記物。1)制備分離膠和濃縮膠配方如下A分離膠(15%)制備
ddH200.8ml
30% Arc1.75ml
1.5M Tris-Hcl (pH 8.8)0.9ml
10%SDS35 μ
10%APS35 μ
TEMED1.5 μ
總體積3.5 ml。B濃縮膠(5% )的制備
6ddH201.05ml
30% Arc0.25ml
1.0M Tris-Hcl(pH6.8)0.19ml
10%SDS15 nl
10%APS15 nl
TEMED1.5 \il
總體積1.5 ml。2) SDS-PAGE 電泳待濃縮膠凝固后，用去離子水沖洗梳孔。根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整上樣量，細胞裂解物每孔約12 μ 1，加入5X SDS樣品加樣緩沖液3 μ 1混勻，100°C煮沸5min, 12000rpm離心 5min后棄沉渣取上清準(zhǔn)備上樣。加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，在上、下槽中加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，開始電泳，恒壓80V，待樣本進入分離膠后，加大電壓至120V，待溴酚藍移動至膠板底部時終止電泳。3)轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜開始前約半小時，將轉(zhuǎn)移裝置浸泡于預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液中，待電泳結(jié)束后，取下膠板，根據(jù)目的蛋白分子量切下相應(yīng)大小的膠，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，根據(jù)膠的大小剪出適當(dāng)大小的PVDF膜，浸泡于甲醇溶液中，待膜浸透后移至轉(zhuǎn)移緩沖液中繼續(xù)浸泡20min，制備“三明治”。恒流250mA電轉(zhuǎn)移60min。4)封閉用0. 05% TBST浸泡洗滌PVDF膜5min后，置于含3%牛血清白蛋白TBST中室溫慢搖封閉1小時5) 一抗孵育TBSTl 1000稀釋抗-LC3兔抗鼠單克隆抗體，4°C過夜。次日TBST洗滌3次，每次洗滌10分鐘，搖床振動幅度120轉(zhuǎn)/分鐘6) 二抗孵育及顯影TBST 1 5000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，室溫，搖床孵育1小時；TBST洗滌3次，每次洗滌10分鐘，搖床振動幅度120rpm ；以ECL超敏發(fā)光底物曝光顯影。如圖2所示藥物處理后DRibbles中自噬特征性標(biāo)記物L(fēng)C3-II的表達遠遠高于未處理組。提示自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素雖促進了自噬小體的生成，但由于自噬小體與溶酶體融合的降解途徑未被阻斷，自噬小體的降解未受抑制，因而DRibbles中自噬小體的總量無明顯增加；而采用NH4Cl處理細胞抑制了溶酶體的酸化，阻止了溶酶體對自噬小體的降解， 因而從NH4Cl處理組募集到的DRibbles富含自噬小體。推測采用萬珂、雷帕霉素及NH4Cl 處理H22/BNL細胞可以更有效地募集自噬小體。實施例5 小鼠DC的獲取以及DC攝取DRibbles。1.小鼠體內(nèi)DC的誘導(dǎo)采用尾靜脈快速注射法，于實驗的第1天給小鼠注射Flt3-L質(zhì)粒，劑量為2 6 μ g/只，10天后，按照相同方法及劑量注射GM-CSF質(zhì)粒，5天后收獲小鼠脾臟；同時輸注 PBS為對照小鼠。
2.小鼠DC的獲取1.斷頸處死小鼠，浸泡于75%酒精當(dāng)中，于無菌手術(shù)臺固定小鼠；2.無菌取出小鼠脾臟，將其置于平皿中，浸泡于PBS ；3.小鼠脾臟經(jīng)磨砂玻片碾磨法獲得單細胞懸液，用200目無菌不銹鋼濾網(wǎng)過濾至 50ml離心管；4.加滿 PBS, IOOOrpm 離心 IOmin ；5.離心后棄上清，加入5 IOml紅細胞裂解液裂解紅細胞，靜置5min ；6.用PBS洗滌1次并調(diào)整計數(shù)單核細胞個數(shù)；7.用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，將細胞濃度調(diào)至2X107ml，加入細胞凍存液于液氮中凍存。3.小鼠DC的鑒定1.另取脾細胞用BSA-PBS調(diào)整細胞濃度至1 X IO6個/ml，分至各Enpendoff 管；2. 2000rpm,離心IOmin ；棄上清，加入500 μ 1封閉液，室溫下封閉30min ；3.用洗滌液(1% BSA-PBS)洗滌1遍；4.設(shè)6組分別加入熒光標(biāo)記抗體1)不加任何抗體；2) CDl Ic-APC ；3)CDllc-APC+CDlIb-FITC ；4)CDllc-APC+CDllb-FITC+B220-PE ；5)CDllc-APC+CDllb-FITC+CD8-PE ；6)CDllc-APC+CDllb-FITC+NKl. I-PE ；各抗體各加入1μ 1，4°C，避光30min。5.用洗滌液洗滌2遍，去除多余的抗體，加入適量PBS重懸細胞進行流式細胞儀檢測，CellQuest Plot軟件分析結(jié)果。4.體內(nèi)誘導(dǎo)DC吞噬DRilAles的檢測CFSE是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞特異結(jié)合的基團，是一種良好的細胞標(biāo)記物。CFSE不可逆地與細胞內(nèi)氨基結(jié)合偶連到蛋白質(zhì)上，作為細胞標(biāo)記物它可以穩(wěn)定存在于細胞核中且不會引起細胞凋亡或死亡。利用流式細胞儀488nm激發(fā)光和熒光 1 (FLl)檢測通道可對其進行分析。本實驗利用其可與細胞內(nèi)蛋白結(jié)合的特性，用CFSE標(biāo)記DRibbles，將標(biāo)記后的DRibbles與小鼠DC共孵育，并通過PE-CDllc染色DC，檢測DC中 CFSE的平均熒光強度，從而了解DC吞噬DRibbles的情況。具體操作步驟如下1. CFSE儲存液的配制通過計算將25mg的CFSE用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配置成濃度為5mM的儲存液；2.將制備好的用PBS重懸，每用PBS重懸，每ml懸液中加入2μ 1 5mM的CFSE，使其終濃度為10 μ M，置于37°C染色10-15min，在此期間輕輕搖晃2次；3.停止染色，加入5倍體積的預(yù)冷的PBS，置冰上5min ；4. 4°C,12000rpm, lOmin，離心收集沉淀；5.用PBS洗滌2次，12000rpm，IOmin,去除殘留未結(jié)合的CFSE ；
6.用PBS重懸，取少量滴于96孔板中，在熒光顯微鏡下觀察是否標(biāo)記成功；7.如果標(biāo)記成功，取適量標(biāo)記后的與DC共孵育，1與DC共孵育，12小時后收集細胞；8. 1200rpm，10min，洗滌3次細胞，將未被DC攝取的游離的DRibbles去除掉；9.用PE-⑶Ilc抗體對細胞進行染色(流式細胞樣本制作詳見幻，上機檢測⑶Ilc+ 細胞中CFSE熒光陽性細胞的比例。實施例6DRit3bleS(H2》免疫小鼠的特異性免疫應(yīng)答研究。1.小鼠效應(yīng)性淋巴細胞的制備1)將小鼠置于小型動物麻醉機中，異氟烷全身吸入式麻醉；2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以無菌手術(shù)器械剪開小鼠腹部皮膚，找到兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)；3)第1天一組每側(cè)淋巴結(jié)注射201三種藥物誘導(dǎo)的Dribbles (H22)，無菌手術(shù)縫線縫合傷口 ；另一組皮下2點注射三種藥物誘導(dǎo)的DRibbles (每側(cè)100 μ 1)；對照組注射 PBS ；4)第2、3天皮下2點注射DRibbles (每側(cè)100 μ 1)進行免疫；對照組注射PBS ；5)第7天皮下2點注射DRibbles (每側(cè)100 μ 1)進行增強免疫；對照組注射 PBS ；6)第15天將小鼠處死，于75%乙醇中浸泡5min，無菌手術(shù)取出小鼠的脾臟和淋巴結(jié)，制備單細胞懸液，用1640完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)整至2 XlO6Ail，培養(yǎng)于M孔板中。2. DRilAles、滅活腫瘤細胞以及細胞裂解液與小鼠效應(yīng)淋巴細胞體外共孵育，檢測效應(yīng)性淋巴細胞的增殖活性設(shè)A. DRibbles刺激組蛋白總濃度設(shè)30，10，3，0 μ g/ml 4個濃度;B. H22(絲裂霉素處理)刺激組蛋白總濃度設(shè)30，10, 3,0 μ g/ml 4個濃度；C. H22細胞裂解液組蛋白總濃度設(shè)30，10，3，0 μ g/ml 4個濃度；D.陰性對照組1640培養(yǎng)液；將各組抗原與效應(yīng)性脾細胞共同培養(yǎng)于M孔板中；每孔2X 106/ml個脾細胞。收集72小時的培養(yǎng)上清，ELISA法檢測上清中IFN-的含量。同時，設(shè)對照組小鼠(未經(jīng)免疫)A. DRibbles刺激組蛋白總濃度設(shè)30，10，3，0 μ g/ml 4個濃度；B. H22(絲裂霉素處理)刺激組蛋白總濃度設(shè)30，10, 3,0 μ g/ml 4個濃度；C. H22細胞裂解液組蛋白總濃度設(shè)30，10，3，0 μ g/ml 4個濃度；D.陰性對照組1640培養(yǎng)液。步驟同前。3.用H22細胞來源的DRibbles和致死性處理的H22細胞以及腫瘤細胞裂解液體外刺激DRibble預(yù)免疫小鼠的淋巴細胞，7 后收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測特異性淋巴細胞產(chǎn)生IFN-的情況。同時，用PBS免疫的小鼠作為對照，進行相同處理，從而分析Dribble 在細胞特異性免疫應(yīng)答中的作用(細胞因子ELISA檢測試劑盒購自e-Bioscience)。操作步驟如下1)按說明書要求稀釋捕獲抗體(capture antibody)，以1001/孔量包被96孔板，
9封板，4度過夜；2)棄去孔中液體，洗滌液洗5次(每孔> 2501)，每次洗滌時間約1分鐘，吸水紙上扣干；3)將5X的稀釋液稀釋至IX，每孔加入2001，封閉，室溫放置1小時；4)棄去孔中液體，洗滌液洗5次(每孔> 2501)，每次洗滌時間約1分鐘，吸水紙上扣干；5)用IX的稀釋液按要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，按需要每孔加入1001，做倍比稀釋，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每孔加入1001樣本，封板，室溫孵育2小時；6)棄去孔中液體，洗滌液洗5次(每孔> 2501)，每次洗滌時間約1分鐘，吸水紙上扣干；7)每孔加入1001檢測抗體(用IX稀釋液稀釋按要求稀釋)，封板，室溫孵育1 小時；8)棄去孔中液體，洗滌液洗5次(每孔> 2501)，每次洗滌時間約1分鐘，吸水紙上扣干；9)每孔加入1001 HRP標(biāo)記的親和素(用IX稀釋液稀釋按要求稀釋)，封板，室溫孵育半小時；10)在棄去孔中液體前先加入洗滌液放置1-2分鐘，其余同步驟2，本次洗滌次數(shù)為7次；11)每孔加入1001顯色液，室溫孵育15分鐘；12)每孔加入501終止液；波長450nm處讀數(shù)。結(jié)果提示圖3，在DRibble的刺激濃度為30、10、3、0 ( μ g/ml)時，檢測到的IFN-g 的分泌分別為369、270J84、52(pg/ml)；明顯高于其他抗原(如滅活腫瘤細胞和細胞裂解液)刺激淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-，ρ < 0.01o圖4，PBS對照組小鼠的脾淋巴細胞接受相同劑量的DRitDble刺激時，幾乎沒有檢測到IFN-的分泌，與實驗組對比差異顯著，ρ < 0.01o DRibbles作為抗原的載體，體外刺激免疫小鼠的淋巴細胞產(chǎn)生IFN-的能力遠遠強于致死性處理的腫瘤細胞以及腫瘤細胞裂解液等，并且這種免疫應(yīng)答是細胞特異性免疫應(yīng)答。實施例7 小鼠肝癌(Η22)皮下移植瘤模型的建立。1. Η22細胞的復(fù)蘇及體外培養(yǎng)取凍存在液氮中的Η22細胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (V/V)胎牛血清、 100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液，重懸細胞至1 X IO6個/ml，并將其移入 500ml細胞培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% (V/V)CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 2天換液一次，常規(guī)0.25% (W/V)胰蛋白酶消化傳代。2.腹腔接種傳代Balb/c小鼠腹腔進行增殖傳代。經(jīng)過8_10天的時間，小鼠腹腔長出大量腹水，此時將小鼠頸椎脫臼法處死，小心抽取小鼠腹腔內(nèi)腹水置入離心管內(nèi)。用PBS緩沖液對離心管內(nèi)的腹水腫瘤細胞進行清洗，離心，紅細胞裂解液裂解紅細胞，加PBS緩沖液稀釋，取出1 滴稀釋后的細胞溶液于顯微鏡下觀察，并計數(shù)，用PBS緩沖液調(diào)配瘤細胞濃度至IO7個/mL 3.腫瘤模型的建立
將經(jīng)腹腔傳代的小鼠H22腫瘤細胞按每只小鼠IX IO6個/1001通過皮下注射接種于小鼠的左前腋窩下。瘤體長出后，每三天測量小鼠腫瘤長徑及短徑大小。計算所得小鼠腫瘤腫塊面積S，計算公式S = LlX L2;其中Ll為腫塊長徑(mm)、L2為短徑(mm)。結(jié)果顯示小鼠肝癌細胞皮下移植瘤模型的建立成功(圖5)。實施例8Drit3bleS(H22)疫苗對肝癌腫瘤的治療作用。1.淋巴結(jié)或皮下注射DRibbles疫苗對Balb/c小鼠進行免疫，2周后皮下加強免疫。1)將小鼠置于小型動物麻醉機中，異氟烷全身吸入式麻醉；2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以無菌手術(shù)器械剪開小鼠腹部皮膚，找到兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)；3) 一組每側(cè)淋巴結(jié)注射三種藥物誘導(dǎo)的DRibbles201，無菌手術(shù)縫線縫合傷口 ； 另一組皮下2點注射三種藥物誘導(dǎo)的DRibbles (每側(cè)1001)；對照組注射PBS ；4)淋巴結(jié)注射2周后，皮下2點注射DRibbles (每側(cè)1001)進行增強免疫；對照組注射PBS ；5)皮下注射1周后，在小鼠皮下建立H22移植瘤；觀察腫瘤的生長情況，測量腫瘤的大小，記錄小鼠的生存率。結(jié)果顯示在皮下注射H22第3-5天，各組小鼠注射部位均不同程度觀察到有皮下腫瘤的出現(xiàn)，觀察情況如下A組(PBS對照組)4只小鼠在第5天有3只出現(xiàn)皮下腫瘤；B 組(DRilAle淋巴結(jié)注射組)只有1只出現(xiàn)皮下腫瘤；C組(DRilAle皮下注射組):4只中有2只出現(xiàn)皮下腫瘤。觀察發(fā)現(xiàn)，隨著時間的進展到第8天左右，A組各小鼠均長出皮下腫瘤，B組仍然只有1只小鼠長出皮下瘤，C組也是均長出皮下瘤，但是平均腫瘤面積明顯小于 A組。觀察到第15天左右，A組的4只小鼠中有1只出現(xiàn)腫瘤消失的現(xiàn)象，但同時，其余小鼠腫瘤繼續(xù)生長；B組中的另外2只小鼠也出現(xiàn)皮下腫瘤的生長；C組總體來說變化不大， 腫瘤呈縮小趨勢。于注射后第5天起開始進行腫瘤直徑的測量，每3-5天測量并記錄(圖 6)。實施例9DRit3bleS (BNL)免疫小鼠的特異性免疫應(yīng)答研究。1.小鼠效應(yīng)性淋巴細胞的制備1)將小鼠置于小型動物麻醉機中，異氟烷全身吸入式麻醉；2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以無菌手術(shù)器械剪開小鼠腹部皮膚，找到兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)；3)第1天一組每側(cè)淋巴結(jié)注射201三種藥物誘導(dǎo)的Dribbles(BNL)，無菌手術(shù)縫線縫合傷口 ；另一組皮下2點注射三種藥物誘導(dǎo)的DRibbles (每側(cè)100 μ 1)；對照組注射 PBS ；4)第2、3天皮下2點注射DRibbles (每側(cè)100 μ 1)進行免疫；對照組注射PBS ；5)第7天皮下2點注射DRibbles (每側(cè)100 μ 1)進行增強免疫；對照組注射 PBS ；6)第15天將小鼠處死，于75%乙醇中浸泡5min，無菌手術(shù)取出小鼠的脾臟和淋巴結(jié)，制備單細胞懸液，用1640完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)整至2 XlO6Ail，培養(yǎng)于M孔板中。2. Dribbles/PBS與小鼠效應(yīng)淋巴細胞體外共孵育，檢測效應(yīng)性淋巴細胞的特異性免疫應(yīng)答設(shè)A. DRibbles刺激組(蛋白總濃度3 μ g/ml)；B.陰性對照組PBS;將各組抗原與效應(yīng)性脾細胞共同培養(yǎng)于M孔板中；每孔2X 106/ml個脾細胞。收集72小時的培養(yǎng)上清，ELISA法檢測上清中IFN-的含量。同時，設(shè)對照組小鼠(未經(jīng)免疫)A. DRibbles 刺激組(蛋白總濃度 3 μ g/ml)；B.陰性對照組PBS。步驟同前。3. Dribbles/PBS與小鼠效應(yīng)CD8+T淋巴細胞體外共孵育，檢測效應(yīng)性CD8+T淋巴細胞的特異性免疫應(yīng)答磁珠分離1.(本實施例)中小鼠的脾臟細胞中的CD8+T細胞設(shè)A. DRibbles刺激組(蛋白總濃度3 μ g/ml)；B.陰性對照組PBS;將各組抗原與效應(yīng)性⑶8+T細胞共同培養(yǎng)于M孔板中；每孔2 X 106/ml個脾細胞。收集72小時的培養(yǎng)上清，ELISA法檢測上清中IFN-的含量。同時，設(shè)對照組小鼠(未經(jīng)免疫)A. DRibbles 刺激組(蛋白總濃度 3 μ g/ml)；B.陰性對照組PBS。步驟同前。4. Dribbles/PBS與小鼠效應(yīng)CD4+T淋巴細胞體外共孵育，檢測效應(yīng)性CD4+T淋巴細胞的特異性免疫應(yīng)答磁珠分離1.(本實施例)中小鼠的脾臟細胞中的CD4+T細胞設(shè)A. DRibbles刺激組(蛋白總濃度3 μ g/ml)；B.陰性對照組PBS;將各組抗原與效應(yīng)性⑶8+T細胞共同培養(yǎng)于M孔板中；每孔2 X 106/ml個脾細胞。收集72小時的培養(yǎng)上清，ELISA法檢測上清中IFN-和it的含量。同時，設(shè)對照組小鼠(未經(jīng)免疫)A. DRibbles 刺激組(蛋白總濃度 3 μ g/ml)；B.陰性對照組PBS。步驟同前。結(jié)果顯示采用淋巴結(jié)注射方法將DRibbles(BNL)免疫小鼠，采用DRibbles體外再刺激DRibbles預(yù)免疫小鼠和對照小鼠的脾細胞，結(jié)果顯示(如圖7A) =DRibbles再刺激預(yù)免疫小鼠脾細胞產(chǎn)生IFN-Y明顯高于對照組小鼠脾細胞以及實驗組(CM) ；IFN-γ檢測顯示(如圖7B，C，D) =DRibbles(BNL)免疫小鼠不僅誘導(dǎo)了特異性⑶8+T細胞應(yīng)答、同時誘導(dǎo)了特異性CD4+T細胞應(yīng)答。實施例10 小鼠肝癌(BNL)皮下移植瘤模型的建立。1. BNL細胞的復(fù)蘇及體外培養(yǎng)取凍存在液氮中的BNL細胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液，重懸細胞至1 X IO6個/ml，并將其移入 500ml細胞培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% (V/V)C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 2天換液一次，常規(guī)0.25% (W/V)胰蛋白酶消化傳代。2.腫瘤模型的建立將經(jīng)體外傳代的小鼠BNL腫瘤細胞按IXlO6個/150μ 1、2X106個/150μ 1、 5Χ106Α/150μ1*1Χ107Α/150μ1的劑量通過皮下注射接種于小鼠的左側(cè)腹部。3天以后，觀察到2Χ106Α/150μ1、5Χ106Α/150μ1和IX IO7個/150 μ 1的劑量有皮下瘤體長出，每三天測量小鼠腫瘤長徑及短徑大小，計算所得小鼠腫瘤腫塊面積S (如圖8)，計算公式S = LlXL2 ；其中Ll為腫塊長徑(mm)、L2為短徑(mm)。結(jié)果顯示小鼠肝癌細胞(BNL)皮下移植瘤模型的建立成功(圖8)。實施例11 取實施例10中構(gòu)建的小鼠肝癌細胞(BNL)皮下移植瘤模型，隨機分為治療組和對照組(每組10只)。1)將小鼠置于小型動物麻醉機中，異氟烷全身吸入式麻醉；2)待小鼠完全麻醉后，固定小鼠，以無菌手術(shù)器械剪開小鼠腹部皮膚，找到兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)；3)第1天治療組每只小鼠每側(cè)淋巴結(jié)注射201三種藥物誘導(dǎo)的Dribbles，無菌手術(shù)縫線縫合傷口 ；對照組注射PBS ；4)第2天治療組和對照組小鼠都進行皮下注射0X865)第3，6天，皮下2點注射DRibbles (每側(cè)1001)進行增強免疫；對照組注射PBS ；6)觀察腫瘤的生長情況，測量腫瘤的大小，記錄小鼠的生存率。結(jié)果顯示在皮下注射BNL細胞第3天，小鼠注射部位均不同程度觀察到有皮下腫瘤的出現(xiàn)。在第6天時，進行第一次免疫(免疫第1天)。觀察至第20天，治療組小鼠的腫瘤大小已小于對照組，并且出現(xiàn)一定的減小趨勢。觀察至第30天，治療組小鼠的腫瘤成生長趨勢，但此時已明顯小于對照組腫瘤大小。(如圖9A. B)治療組和對照組小鼠腫瘤的病理切片顯示PBS對照組的腫瘤能觀察到大量血管，說明血供豐富，腫瘤細胞為多邊形和卵圓形，核大，深染，核仁明顯，核分裂相易見，未見明顯炎細胞浸潤。與此同時，治療組的腫瘤周圍可見疏松結(jié)締組織包繞，結(jié)締組織內(nèi)可見少量炎細胞，(如圖10A.B)。
1權(quán)利要求
1.H22肝癌細胞自噬小體DRibbles在制備肝癌治療性疫苗中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的H22肝癌細胞自噬小體DRibbles 按如下步驟制備得到(1)H22肝癌細胞的培養(yǎng)復(fù)蘇凍存H22細胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，重懸細胞至1 X IO6個/ml，并將其移入500ml細胞培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% (V/V)C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 2天換液一次，常規(guī)0. 25%胰蛋白酶消化傳代；O) H22肝癌細胞的處理待步驟(1)培養(yǎng)后的細胞貼壁良好，密度適中后，加入雷帕霉素、萬珂和氯化銨，雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干預(yù)H22肝癌細胞 16小時，誘導(dǎo)自噬小體DRibbles ；(3)提取 DRibbles 將步驟(2)誘導(dǎo)后的細胞經(jīng)離心得到沉淀，即為自噬小體DRibbles。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)中，提取DRibbles具體包含如下步驟(3a)將細胞及培養(yǎng)液倒入50ml離心管中，低速離心1200rpm，IOmin ；(3b)將步驟(3a)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管，高速離心12000rpm， 30min,4°C ；(3c)將步驟(3a)離心后的沉淀的細胞用PBS重懸，低速離心1200rpm，lOmin，將低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中，高速離心12000rpm，30min，4°C ；(3d)將步驟(3b)和(3c)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸，合并，12000rpm高速離心 30min，4°C ；(3e)棄步驟(3d)得到的上清，沉淀即為自噬小體DRibbles，將沉淀用Iml PBS重懸后分裝，凍存于_20°C，備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了H22肝癌細胞自噬小體DRibbles在制備肝癌治療性疫苗中的應(yīng)用。肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。研制肝癌疫苗將能夠有效的預(yù)發(fā)肝癌的發(fā)生。發(fā)明人的多年研究結(jié)果顯示腫瘤細胞的自噬小體是腫瘤抗原交叉遞呈的有效載體之一。本發(fā)明包括用人肝癌細胞中提取自噬小體——DRibbles的核心技術(shù)，并證實其能夠有效的誘導(dǎo)機體抗腫瘤免疫應(yīng)答，具有良好的生物治療前景。
文檔編號A61K39/00GK102430118SQ201110440169
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者曹萌, 王立新 申請人:東南大學(xué)