專利名稱：一種白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑及其在制備抗心肌纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種受體拮抗劑及其在制備藥物中的應(yīng)用，尤其涉及一種白介素-17(IL-17)受體拮抗劑及其在制備抗心肌纖維化藥物中的應(yīng)用。屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
全世界范圍內(nèi)最新的死亡原因分析中，心血管疾病位列前三，嚴(yán)重地威脅著人類的生命和健康。心力衰竭(heart failure，簡稱心衰)作為各種心臟疾患發(fā)展的最終階段， 正在成為本世紀(jì)最重要的心血管致死原因。流行病學(xué)資料顯示，目前全球心衰患者的數(shù)量已高達(dá)2250萬，且仍以每年200萬的速度遞增，5年存活率與惡性腫瘤相仿，已成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。以往研究的焦點主要集中于心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)，但近年來人們逐漸認(rèn)識到，心肌纖維化在心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展中起有十分重要的作用，因而已成為心力衰竭治療的一個新靶標(biāo)。心肌纖維化(myocardial fibrosis)，又稱為心肌重構(gòu)， 是由中 重度的冠狀動脈粥樣硬化性狹窄引起心肌纖維持續(xù)性和(或)反復(fù)加重的心肌缺血缺氧所產(chǎn)生的結(jié)果，導(dǎo)致逐漸發(fā)展為心力衰竭的IHD，即慢性缺血性心臟病(chronic ischemic heart disease)0IL-17是新近引起注意的炎癥性細(xì)胞因子家族重要成員，其功能尚未完全闡明。 IL-17由激活的Thl7細(xì)胞產(chǎn)生。Thl7細(xì)胞主要作用于成纖維細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和MMI^s等表達(dá)。IL-17是新近發(fā)現(xiàn)的新型輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)_Thl7的效應(yīng)因子，已被證實參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。如果能夠從受體水平阻斷IL-17R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，必將顯著降低炎癥性細(xì)胞因子所導(dǎo)致的致死和致殘率。然而，由于anti-IL-17R的抗體與IL-17 結(jié)合力較弱，加之作用廣泛、全身副作用較大，無法應(yīng)用于臨床等缺陷，限制了其作為IL-17 信號拮抗劑的藥物研發(fā)。國外的某些研究制成與IL-17R結(jié)合的肽段來阻斷IL-17信號，缺陷在于這類肽段C末端不穩(wěn)定，不利于肽段分子構(gòu)象的維持，造成生物學(xué)不穩(wěn)定。因此，臨床上亟待一種與IL-17R特異性結(jié)合、副作用小的IL-17R阻斷劑的出現(xiàn)。本發(fā)明人探討了 Thl7細(xì)胞的效應(yīng)子IL-17，對于心肌纖維化的作用。結(jié)果顯示 在體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中，IL-17以劑量依賴性方式促進(jìn)膠原和MMPs的產(chǎn)生，阻斷 IL-17受體，則顯著減輕心衰和心肌纖維化。IL-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過膜受體IL-17RA進(jìn)行傳導(dǎo)， IL-17RA結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示，細(xì)胞因子受體發(fā)揮功能的前提是受體亞單位寡聚化(預(yù)裝配)，這是受體激活共同通路(圖1所示)，而配體組裝前結(jié)構(gòu)域(pre-ligand assembly domain, PLAD)是受體寡聚化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，PLAD的發(fā)現(xiàn)使選擇性抑制細(xì)胞因子受體，阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成為可能。因此本發(fā)明人設(shè)想如果封閉IL-17RA PLAD，抑制受體寡聚化，從源頭上阻斷 IL-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對抑制IL-17信號介導(dǎo)性心肌纖維化將是效率最高的?；诖耍覀儤?gòu)建了表達(dá)IL-17RA PLAD可溶蛋白的病毒載體，以阻斷IL-17信號介導(dǎo)性疾病。本發(fā)明是以IL-17RA PLAD與IgG Fc段的可溶性融合蛋白封閉IL-17RA PLAD，抑制受體寡聚化。在“配體-受體-受體后信號通路”的源頭上阻斷受體信號，符合“生物體能量消耗最小化”原則。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供了一種能夠特異性阻斷IL-17RA PLAD的融
合蛋白ο本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)的既往研究表明，IL-17RA由2個FN [FNl (第69-183氨基酸殘基)和FN2，即PLAD (第 205-282氨基酸殘基)]結(jié)構(gòu)域通過一無結(jié)構(gòu)性linker (第184-204氨基酸殘基)結(jié)合。本發(fā)明的技術(shù)方案是在GenBank檢索人IL-17RA、IgG Fc段mRNA序列(序列號為NM_014339 和AJJ94731)確定擴(kuò)增區(qū)域，其中IL-17RA FNl結(jié)構(gòu)域為第69 183氨基酸殘基；PLAD 結(jié)構(gòu)域為第205 282氨基酸殘基；中間第184 204氨基酸為天然linker ；利用引物設(shè)計軟件設(shè)計IL-17RA FN2, IgG Fc引物，核酸和蛋白質(zhì)序列分析軟件EdiUeq 對融合基因及Linker部位翻譯后二級結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性，如柔性、抗原性、親水性及表位等預(yù)測分析， 證明設(shè)計合理(圖3所示)。當(dāng)然，上述所得結(jié)論僅是理論上的推測，所選用軟件也存在一定局限，最終結(jié)論應(yīng)從下一步在體或離體實驗中獲得。通過大量實驗，本發(fā)明得到了一種白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑(命名為IL-17RA PLAD-Ig)，其特征在于所述的阻斷劑為一多肽，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO. 1所示的序列以及SEQ ID NO. 2所示的序列通過柔性連接序列相連得到，連接順序從氮端到碳端依次為SEQ ID NO. 1所示的序列、連接序列以及SEQ ID NO. 2所示的序列；或由SEQ ID N0:1及/或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有同樣功能的蛋白衍生物通過柔性連接序列相連得到，連接順序從氮端到碳端依次為SEQ ID NO. 1所示序列的蛋白衍生物、連接序列以及SEQ ID N0. 2所示的序列的蛋白衍生物。需要說明的是，蛋白質(zhì)的功能是由氨基酸序列所決定的，但是并不是說一個或幾個氨基酸的替換、缺失或插入都必將影響該蛋白質(zhì)的功能，這一點是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。在本發(fā)明提供的氨基酸序列的基礎(chǔ)上本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過保守方式替換所述序列的氨基酸而方便地獲得本發(fā)明蛋白的多種衍生物。例如，可用其他疏水性氨基酸替換序列中的疏水性氨基酸，或用其他芳香族氨基酸替換序列中的芳香族氨基酸或用其他堿性氨基酸替換序列中的堿性氨基酸等，當(dāng)然也可通過缺失或插入的方式刪除或增加幾個或多個氨基酸，只要該獲得的蛋白仍具有與本發(fā)明所述的蛋白相同的功能則都應(yīng)該包括在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。其中所述功能是指經(jīng)過一個或幾個氨基酸的替換、缺失或插入后得到的蛋白質(zhì)其仍然具有與白細(xì)胞介素-17受體結(jié)合的能力或能夠賦予該蛋白可溶性的能力，而不論這種結(jié)合能力或可溶性能力強(qiáng)弱大小發(fā)生怎樣的變化，都應(yīng)視為仍具有與本發(fā)明所述的蛋白相同的功能。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的連接序列如SEQ ID N0. 3所示。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示。本發(fā)明還提供了編碼以上所述的白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，其特征在于所述的載體含有以上所述的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的表達(dá)載體為病毒載體。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有以上所述的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了所述的白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑在制備抗心肌纖維化藥物中的應(yīng)用。及所述的核苷酸序列在在制備抗心肌纖維化藥物中的應(yīng)用。根據(jù)IL-17RA結(jié)構(gòu)域序列，圖2所示，SEFIR結(jié)構(gòu)域位于IL-17RA第379-536氨基酸，據(jù)此推算編碼SEFIR結(jié)構(gòu)域mRNA序列位于1137-1508堿基，設(shè)計引物以IL-17RA cDNA 為模版進(jìn)行Realtime RT-PCR,定量分析SEFIR結(jié)構(gòu)域表達(dá)變化。本發(fā)明以特異性存在于IL-17受體的IL-17RA PLAD與IgG Fc段組成可溶性融合蛋白，二者以柔性連接蛋白Linker連接，不影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，并且可針對Ig進(jìn)行分離提純，以此封閉IL-17RA PLAD，抑制受體寡聚化。因此，本發(fā)明的融合蛋白具有特異性強(qiáng)、阻斷效率高等優(yōu)勢。


圖1為IL-17RA信號傳導(dǎo)途徑示意圖；中間為預(yù)裝配的IL-17RA，左箭頭示配體IL-17A與IL-17RA結(jié)合后誘導(dǎo)信號傳遞；右箭頭示可溶性IL-17R PLAD與受體亞單位結(jié)合，抑制寡聚化，阻斷IL-17受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；圖2為IL-17RA結(jié)構(gòu)域序列示意圖；圖3為利用核酸和蛋白質(zhì)序列分析軟件EdiUeqTM對IL-17RA PLAD-IgG的柔性、 抗原性、親水性及表位進(jìn)行預(yù)測性分析；圖4為pLenO-DCE載體圖譜；圖5為pUC57-PI載體酶切鑒定結(jié)果；圖6為病毒感染細(xì)胞48小時后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；圖6A-6D對應(yīng)的感染的病毒的量依次為IOul、Iul、0. lul.O. Olul ；圖7為流式細(xì)胞儀檢測病毒的滴度結(jié)果；圖8為MOI為2的IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染的細(xì)胞組分別在明場及熒光下的顯微鏡照片；圖9為MOI為5的IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染的細(xì)胞組分別在明場及熒光下的顯微鏡照片；圖 10 為 Western Blot 結(jié)果；1為空細(xì)胞組；2為IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染細(xì)胞組一，MOI為23為IL-17RAPLAD_Ig慢病毒感染細(xì)胞組二，MOI為5
圖IlA為轉(zhuǎn)化觀小時后的大鼠不同組織中的IL-17RA PLAD-Ig mRNA的表達(dá)情況；圖IlB為IL-17RA PLAD-Ig在大鼠不同組織部位的表達(dá)情況；1 心臟，2肝臟，3 腎，4 脾，5 肺*P < 0. 05與GFP和對照組圖12為組織學(xué)分析結(jié)果；圖12A-C分別為對照組組織切片、IL-17RA PLAD-Ig組織切片、GFP組組織切片用蘇木精和曙紅(H&E)進(jìn)行染色分析，40倍顯微鏡下，觀察除冠狀血管及血管外周組織外的受炎癥影響的區(qū)域與分類排列區(qū)域的比值。圖12D-E分別為對照組組織切片、IL-17RA PLAD-Ig組組織切片、GFP組組織切片用苦味酸天狼猩紅(PSR)進(jìn)行染色的結(jié)果。圖12G為對在用蘇木精和曙紅(H&E)進(jìn)行染色后觀察的纖維化影響的區(qū)域統(tǒng)計；圖12H為用苦味酸天狼猩紅(PSR)進(jìn)行染色后的測定的相對光密度值；圖13為MMP-2，MMP-9, TIMP-1，TIMP-2，I型和III型膠原蛋白在左心室組織中的表達(dá)。圖 13A 為 MMP-2 和 MMP-9 的 western bloting 分析結(jié)果；圖 13B 為 TIMP-1 和 TIMP-2 的 western bloting分析結(jié)果；圖13C為I型和III型膠原蛋白的western bloting分析結(jié)果； 圖13D為匪I3S與TIMPs的表達(dá)比率；圖13E為MMP、TIMP和膠原蛋白的表達(dá)結(jié)果；①M(fèi)MP ； ②TIMP ；③膠原蛋白；④β -肌動蛋白。以平均值士 S. Ε. M表示.< 0. 05與其他兩組；圖14為ΜΜΡ-2，ΜΜΡ-9的活性分析結(jié)果；圖15為mRNA的穩(wěn)定性分析。在含有⑴或不含有㈠IL-17RA PLAD-Ig慢病毒的情況下，用TNF-α (20毫微克/毫升)和IL-17AQ00毫微克/毫升)處理培養(yǎng)的CFs ； 加入放線菌素D(5yg/mL)進(jìn)一步抑制RNA轉(zhuǎn)錄；與放線菌素D孵育0，6，12和18小時后提取總 RNA，通過 RT-PCR 對 MMP-2，MMP-9, TIMP-I, TIMP-2 和膠原蛋白(I 型和 III 型)mRNA 的表達(dá)進(jìn)行了量化。圖15A和圖15B是I型和III型膠原蛋白的RT-PCR結(jié)果；圖15C，圖 15D,圖 15E 和圖 15F 分別顯示 MMP-2，MMP-9, TIMP-I 和 TIMP-2 的 RT-PCR 結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實施例1IL-17RA PLAD-IgG慢病毒載體構(gòu)建慢病毒載體構(gòu)建及包裝由上海英為信生物科技有限公司協(xié)助完成。1、實驗試劑和耗材1)載體pLenO-DCE，載體圖譜如圖4所示2) T4DNA ligase :NEB3)限制性內(nèi)切酶NEB4)凝膠回收試劑盒=Axygen5) PCR (酶切)產(chǎn)物純化試劑盒=Axygen6)熱敏磷酸酶NEB7) RNA 提取試劑盒Axygen
8)MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit :BBI9)DL2, 000DNA Marker =TaKaRa10)電熱恒溫培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司11)恒溫?fù)u床上海蘇坤實業(yè)有限公司12)電熱恒溫水浴鍋上海康路實驗儀器有限公司13)電泳儀天能科學(xué)儀器14)數(shù)碼凝膠處理系統(tǒng)天能科學(xué)儀器2、實驗步驟和方法2. 1、IL-17RA PLAD IgG (簡稱PI)融合蛋白基因序列的合成在GenBank 檢索人 IL-17RA、IgG Fc 段 mRNA 序列(序列號為 NM_014339 和 AJ_294731)確定合成區(qū)域，其中IL-17RA FNl結(jié)構(gòu)域為第69 183氨基酸殘基；PLAD結(jié)構(gòu)域為第205 282氨基酸殘基；中間第184 204氨基酸為天然linker ；核酸和蛋白質(zhì)序列分析軟件EdiUeqTM對融合基因及Linker部位翻譯后二級結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性，如柔性、 抗原性、親水性及表位等進(jìn)行預(yù)測分析，以驗證設(shè)計的合理性。應(yīng)用可溶性融合蛋白制作方法，設(shè)計IL-17RA PLAD與IgG Fc段連接4種方式 (a) IL-17RA PLAD-IgG, (b) IgG_IL_17RA PLAD 和(c) IL-17RA PLAD-柔性 Linker-IgG、(d) IgG-柔性Linker-IL-17RA PLAD。利用計算機(jī)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析軟件EdiUeqTMJ;! 定連接蛋白設(shè)計最佳方案。通過上述預(yù)測分析，確定了如SEQ ID NO. 5所示的序列，其中1-237位為 IL-17RAPLAD的合成片段，238-306位為柔性連接，307-978位為IgG Fc片段，通過全基因合成的方法合成了兩端帶有酶切位點的含有SEQ ID NO. 5所示序列的片段。上游引物選用 BamH I，下游引物選用Ml I。全基因組由金斯特生物技術(shù)公司合成。2. 2pLen0-DCE_PI 載體的構(gòu)建pLenO-DCE載體用BamH I及Ml I酶切后，按照凝膠回收試劑盒說明書操作，回收載體片段，將載體片段與合成的IL-17RA PLAD-IgG(PI)融合蛋白基因序列連接，酶切鑒定正確，用于接下來的構(gòu)建工作。2. 3pUC57-PI 載體的構(gòu)建pUC57載體與pLenO-DCE-PI載體用EcoRV酶切后，分別回收pUC57載體片段及 IL-17RA PLAD-IgG(PI)融合蛋白基因片段，將回收的片段連接，得到的重組載體進(jìn)行測序分析及酶切鑒定，測序引物為CACGCTGTTTTGACCTCCATAGA測序結(jié)果比對后完全正確。BamH I及Ml I雙酶切鑒定結(jié)果如圖5所示。結(jié)果載體構(gòu)建正確。大量制備該載體備用。2. 4、IL-17RA PLAD-IgG 慢病毒載體包裝2. 4. 1 材料1.材料采用慢病毒的包裝細(xì)胞細(xì)胞株(ATCC)2.大腸桿菌菌株DH5 α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶Qnvotrogen公司)3.慢病毒載體系統(tǒng)(Tronolab 公司[url]www. tronolab. com/lentivectors. php[/url])該病毒包裝系統(tǒng)由pRsv-REV，plg-RRE，pMD2G，pPGK-Linker四質(zhì)粒組成，其中 pPGK-Linker含有多克隆位點的穿梭質(zhì)粒.pRsv-REV, plg-RRE, pMD2G含有病毒包裝所必須的元件。
4.大量質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Qiagen公司)2. 4. 2 步驟慢病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞密度為 0. 5 X109/L時，重新接種于25mL的15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 °C，50mL/L C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)， 細(xì)胞密度達(dá)60% 70%時轉(zhuǎn)染.制備慢病毒包裝系統(tǒng)中四種質(zhì)粒DNA溶液(pRsv-REV 10 μ g, ρIg-RRE 15 μ g, pMD2G 7. 5 μ g，pPGK-Swi 20ug)，無菌水定容至 1800 μ L，再加入 CaCl2 (2. 5mol/L)溶液200 μ L，混勻，加入2XBBS緩沖鹽溶液2000 μ L,室溫放置20 30min.將DNA磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)1 后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，加入PBS 15mL，輕搖后棄去，重復(fù)該步驟3次.然后每瓶細(xì)胞中加入含 100mL/L小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液15mL，繼續(xù)培養(yǎng)48h.收集轉(zhuǎn)染7 的細(xì)胞上清液.于 40C，4000g離心IOmin ；以0. 45 μ m濾器過濾后置于40mL超速離心管中，4°C，25000r/min離心20min ；而后以冰PBS液重旋病毒沉淀，于4°C溶解過夜.次日，以10 μ L每管分裝病毒液置于-70°C冰箱中保存.測定病毒滴度后感染體外培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞；以表達(dá)綠色熒光蛋白的 pLenti6. 2-Gff/EmGFP 慢病毒作對照。2. 4. 3IL-17plad慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建包裝純化-滴度測定2. 4. 3. 1慢病毒載體滴度測定病毒滴度測定使用逐孔稀釋滴度測定法1.測定前一天，為測定滴度所需的細(xì)胞鋪板，每個96孔中加4X IO4個細(xì)胞， 體積為100 μ 1。2.根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備7-10個無菌的Ep管。在每個管中加入90 μ 1的新
鮮培養(yǎng)基。3.取待測定的病毒原液10μ 1加入到第一個管中，混勻后，取10μ 1加入到第二個
管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。4.選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 μ 1培養(yǎng)基。加入稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5. 24小時后，加入新鮮培養(yǎng)基100 μ 1。小心操作，不要吹起細(xì)胞。6. 4天后，觀察細(xì)胞生長狀況，并收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)滴度測定。IOul、Iul、0. Iul、0. Olul病毒感染四31~細(xì)胞48小時，熒光顯微鏡下的結(jié)果如圖6所示。FACS (流式細(xì)胞檢測)方法檢測病毒的滴度，實驗的操作步驟如下On day 0 在 24 孔板接種三孔 293T 細(xì)胞(每孔 3-5X IO4Cells)；On day 1 細(xì)胞計數(shù)，每孔需有細(xì)胞約6_8 X 104cells ；取濃縮的病毒液體 1 μ 1 (或者未濃縮的病毒50 μ 1)作為第一個濃度，并依次稀釋成3到4個稀釋度(倍比稀釋1 100)，每個稀釋度的總體積為ιοομ 1 ；On day 2 去除培養(yǎng)基換500 μ 1新鮮培養(yǎng)基；On day 3 使用無鈣PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，37 °C用胰酶消化細(xì)胞一分鐘，加入 250 μ 1含有2 % (w/v) formaldehyde的無鈣PBS，將細(xì)胞完全重懸浮，使用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測分析GFP陽性表達(dá)細(xì)胞。取其中GFP陽性率為10-50%—孔細(xì)胞進(jìn)行滴度計算。 0. 01 μ 1病毒感染細(xì)胞48小時，流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果如圖7所示。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果計算滴度公式Titer (293T-transducing units/ml) = 100000 (target cells)X( % of GFP-positive cells/100)/volume of supernatant (in ml).本次病毒制備的滴度為3. 4X 108TU/ml2. 5ffestern blot 檢測 IL-17RA PLAD-Ig 表達(dá)實驗設(shè)計靶細(xì)胞慢病毒感染實驗在6孔板中進(jìn)行，每孔樣品排列如下所示。1 “空白對照”為正常目的細(xì)胞組(293T)；2 “過表達(dá)組一”為IL-17RA PLAD慢病毒感染的細(xì)胞組093T)，MOI為2 ；3 “過表達(dá)組二”為IL-17RA PLAD慢病毒感染的細(xì)胞組093T)，MOI為5實驗步驟2. 5. 1. 細(xì)胞的培養(yǎng)2. 5. 1. 1細(xì)胞復(fù)蘇從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管迅速放入37°C水浴鍋中，并不時搖動使其盡快解凍，70%酒精擦拭凍存管消毒后，移至超凈臺，吸出細(xì)胞懸液至含有3ml含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，置于37°C 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。2. 5. 1. 2細(xì)胞傳代將生長90%匯合的細(xì)胞進(jìn)行傳代，棄去舊培養(yǎng)液，加入5ml滅菌PBS溶液，洗滌細(xì)胞生長面，然后棄去PBS溶液，加入2ml胰酶消化液，消化約Hmin直到細(xì)胞完全消化下來，加入含10%胎牛血清和100U/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)基5ml，用刻度吸管吹打數(shù)次，將瓶壁上的細(xì)胞沖洗下來，混勻細(xì)胞后分至兩個新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。2. 5. 2. IL-17RA PLAD-Ig 慢病毒感染細(xì)胞2. 5. 2. 1細(xì)胞懸液制備處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液， 取10 μ 1上述細(xì)胞懸液，與等體積0.4%的臺盼蘭溶液混合，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。不著色為活細(xì)胞，著色為死細(xì)胞，根據(jù)需要制備成相應(yīng)濃度的細(xì)胞懸液。2. 5. 2. 2IL-17RA PLAD-Ig 慢病毒感染靶細(xì)胞將細(xì)胞懸液接種于6-well中，37°C 5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)30 40%，根據(jù)不同的MOI值，加入適宜量的病毒，IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染目的細(xì)胞24h后觀察細(xì)胞狀態(tài)如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)4 后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，馬上更換培養(yǎng)基，感染4-5天后觀察慢病毒上報告基因GFP的表達(dá)情況，感染效率大于70%者繼續(xù)培養(yǎng)，然后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western Blot檢測實驗；感染效率低于70%的實驗組，重新進(jìn)行感染實驗。過表達(dá)組一照片(明場和熒光)如圖8所示，過表達(dá)組二照片(明場和熒光)如圖9所示。3, Western Blot 檢測 IL-17RA PLAD-Ig 表達(dá)水平3.1.總蛋白抽提從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，冰上PBS洗滌2次。棄去PBS，加入適量預(yù)冷的IXLysis Buffer (無溴酚藍(lán))和50 μ 1 10mg/ml PMSF，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞10 15min，將樣品轉(zhuǎn)移入Ep管中，超聲破碎儀破碎細(xì)胞，4°C，12000g, 離心lOmin，取上清液，-80°C凍存Mhr，4°C 12000rpm再次離心lOmin，取上清分裝，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚藍(lán)(0. 1% (W/V))后于100°C加熱％iin，后于-20°c保存待用。測蛋白濃度后，每個樣品蛋白終濃度均調(diào)整為2 μ g/μ 1，-80°C保存?zhèn)溆谩?. 2.蛋白定量根據(jù)總蛋白測定試劑盒說明書操作測定樣本中的總蛋白含量，電泳上樣量定為 40 μ g，測蛋白濃度后，每個樣品蛋白終濃度均調(diào)整為2 μ g/μ 1，_80°C保存?zhèn)溆谩?.3.上樣樣品準(zhǔn)備每個樣品取相同總蛋白量，根據(jù)要求加入相應(yīng)的6X loading buffer上樣緩沖液 3. 2振蕩器混勻后，100°C煮5-10min，4°C存放備用。4. SDS-PAGE 電泳配制5 % (濃縮膠)-10 % (分離膠)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。5.轉(zhuǎn)膜及檢測將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)經(jīng)半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5. 1去除濃縮膠和多余的分離膠，用直尺測量余下的分離膠面積，將其在Transfer Buffer中平衡15分鐘。5. 2將Mylar Mask挖洞，其面積稍微小于膠面積(約每邊小2mm)。5. 3切至少6張Blotting Paper,與凝膠同樣大小或稍微小于凝膠，用transfer buffer 飽和。5. 4將PVDF膜切至與凝膠同樣大小或稍微小于凝膠，用甲醇預(yù)濕，然后在 transfer buffer中浸泡2 5分鐘。5. 5將三張濕的Blotting Paper放在Mylar Mask上對準(zhǔn)所挖的洞，周邊疊在Mask 上，然后在其上面放置濕的PVDF膜，對齊。5. 6將平衡好的凝膠小心地放在PVDF膜上，四周對齊(最好一次放到位)，其上再放置三張濕的Blotting Paper。5. 7蓋上電泳槽的蓋子，插好電源，用0. 8mA/cm2的電流強(qiáng)度電泳1 1. 5小時。5.8封閉將膜轉(zhuǎn)移至另一容器中，PVDF膜用3%明膠封閉(常溫，低溫下明膠會凝結(jié))或3% BSA(可低溫)，PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉Ihr或者4°C過夜。5.9—抗孵育用封閉液將17 1^0抗體(本實驗室保存。)稀釋成0. 1 μ g/ml，按膜面積0. lml/cm2的量加入塑料袋，放入PVDF膜，趕走氣泡，用封口機(jī)封口，室溫平緩搖動1 小時或4°C過夜。5. 10 洗膜TBST 洗滌 3 次，每次 lOmin。5. 11 二抗孵育堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體用封閉液以1 1000稀釋，按膜面積0. lml/cm2的量加入塑料袋，放入PVDF膜，趕走氣泡，用封口機(jī)封口室溫孵育lhr。洗膜TBST洗滌3次，每次lOmin。5. 13將PVDF膜放入檢測緩沖液中平衡5分鐘。5. 14稀釋顯色底物每Iml檢測緩沖液中加入4. 5 μ 1底物9及3. 5 μ 1底物10。5. 15按膜面積0. lml/cm2的量加入玻璃平皿中，放入PVDF膜；取出PVDF膜，去 J^^it, ECL(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, USA) l^^&M lmin,壓片，顯影,定影。5. 16棄去顯色液，將膜用TE洗滌2次，在TE中浸泡。
5. 17掃描及分析6. Western Blot 結(jié)果如圖10所示。1為四31~空細(xì)胞組；2 為 IL-17RA PLAD-Ig 慢病毒感染細(xì)胞組一，MOI 為 2 ；3 為 IL-17RAPLAD_Ig 慢病毒感染細(xì)胞組二，MOI 為 5。上圖結(jié)果顯示IL_17RA PLAD-Ig慢病毒感染組有顯著增強(qiáng)表達(dá)作用，MOI值越高增強(qiáng)表達(dá)越明顯。實施例2IL-17RA PLAD-Ig在抗心肌纖維化中的作用1、肌凝蛋白誘導(dǎo)的大鼠心肌炎模型的建立材料6周齡雄性Lewis大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；純化的豬源心臟肌凝蛋白購自sigma公司。方法0. OlM的PBS以及添加有10mg/ml結(jié)核分支桿菌H37RA(Mycobacterium tuberculosis H37RA)的完全弗氏佐劑按照體積比為1 1混合，混合后的溶液溶解純化的豬源心臟肌凝蛋白(porcine cardiac myosin，購自 Sigma-Aldrich，St Louis, MO, USA), 得到免疫乳劑用于大鼠的免疫。每只大鼠在第0天和第7天從腳墊采用單皮下注射的方法注射0. 2ml上述制備得到的乳劑。免疫后的大鼠分為兩組IL-17RA PLAD-Ig組(n = 13)， 在第7天經(jīng)尾部注射混合有IL-17RA PLAD-Ig慢病毒的超聲微泡劑；GFP組(n = 8)在第 7天經(jīng)尾部注射混合有GFP慢病毒的超聲微泡劑。8只既不注射免疫制劑也不注射微泡劑的大鼠作為正常對照。基因轉(zhuǎn)入后48小時，從IL-17RAPLAD_Ig組中隨機(jī)取出5只大鼠無痛致死，分別從心臟、肝臟、腎臟、脾以及肺組織中提取RNA，通過以下引物進(jìn)行RT-PCR來評估IL-17RA PLAD-Ig在不同組織中的侵染效率，引物序列如下所示上游5，-GTCGCC ACC AAG TGC AGA GA—3，；下游5，-GCCGTC CAC GTA CCA GTT GA-3，RT-PCR檢測結(jié)果如圖11所示。從結(jié)果可以看出IL-17RA PLAD-Ig在心臟中的表達(dá)水平最高。2、超聲心動檢測注射后35天對上述大鼠進(jìn)行超聲心動檢測，檢測前，通過肌肉向大鼠體內(nèi)注射增補(bǔ)有l(wèi)mg/kg的乙酰丙嗪的40mg/kg的克他命(ketamine)麻醉大鼠，使用儀器HPSonos 2500 (Hewlett-Packard Co.)并結(jié)合使用一個10-MHz的成像線性掃描傳感器對大鼠左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)，收縮末期直徑(LVEDs)，舒張期室間隔厚度(IVSTd)和舒張期后壁厚度(PWTd)進(jìn)行了評估。超聲心動圖通過裝配有7. 5-MHz傳感器Wkquoia C256心動超生檢測系統(tǒng)進(jìn)行分析，檢測結(jié)果如表1所示表1超聲心動檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑，其特征在于所述的阻斷劑為一多肽，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO. 1所示的序列以及SEQ ID NO. 2所示的序列通過柔性連接序列相連得到，連接順序從氮端到碳端依次為SEQ ID NO. 1所示的序列、連接序列以及SEQ ID NO. 2所示的序列；或由SEQ ID N0:1及/或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有同樣功能的蛋白衍生物通過柔性連接序列相連得到， 連接順序從氮端到碳端依次為SEQ ID NO. 1所示序列的蛋白衍生物、連接序列以及SEQ ID NO. 2所示的序列的蛋白衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑，其特征在于所述的連接序列如SEQ ID NO. 3 所示。
3.如權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑，其特征在于所述的阻斷劑其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.編碼權(quán)利要求1-3任一項所述的白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，其特征在所述的核苷酸序列如SEQID NO. 5所示。
6.一種表達(dá)載體，其特征在于所述的載體含有權(quán)利要求4或5所述的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為病毒載體。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求6或7所述的表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求1-3任一項所述的白細(xì)胞介素-17受體阻斷劑在制備抗心肌纖維化藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4或5所述的核苷酸序列在制備抗心肌纖維化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種白細(xì)胞介素-17(IL-17)受體阻斷劑，其特征在于所述的阻斷劑為一多肽，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示的序列以及SEQ ID NO.2所示的序列通過柔性連接序列相連得到，連接順序從氮端到碳端依次為SEQ ID NO.1所示的序列、連接序列以及SEQ ID NO.2所示的序列。本發(fā)明以特異性存在于IL-17受體的IL-17RA PLAD與IgG Fc段組成可溶性融合蛋白，二者以柔性連接蛋白Linker連接，不影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，并且可針對Ig進(jìn)行分離提純。以此封閉IL-17RAPLAD，抑制受體寡聚化。具有特異性強(qiáng)、阻斷效率高等優(yōu)勢。
文檔編號A61K38/17GK102516397SQ20111044231
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者劉巍, 劉穎, 宋云艷, 尹鵬志, 高成 申請人:劉巍