專利名稱：一種酶制劑及其用于提取葛根總黃酮的應(yīng)用和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶制劑及其用于提取葛根總黃酮的應(yīng)用和方法。
背景技術(shù)：
葛根(Puerana labata)是豆科葛屬多年生藤本植物，是一種傳統(tǒng)的中藥材，其總黃酮是葛根中主要有效成分，具有抗炎解熱、擴張冠狀動脈血管、增加冠狀動脈血流量的作用，同時也有降低血壓的作用。作為醫(yī)藥和保健食品的原料或添加劑，目前，葛根總黃酮國際市場需求量約500 800噸/年，我國需求量約150噸/年，葛根總黃酮的開發(fā)越來越引起研究者及開發(fā)商的關(guān)注。傳統(tǒng)的提取分離方法，如煎煮法、浸漬法、滲濾法、回流法等，存在有效成分提取率不高、雜質(zhì)清除率低等問題。酶工程技術(shù)是近幾年來用于重要工業(yè)的一項生物工程技術(shù)。通過酶反應(yīng)溫和地將植物組織分解，加速有效成分的釋放提取，選用相應(yīng)的酶可將影響液體制劑澄清度的雜質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等分解去除，并且針對根中含有脂溶性成分多，通過葡萄糖苷酶或轉(zhuǎn)糖苷酶，使脂溶性成分轉(zhuǎn)化成水溶性糖苷類，酶反應(yīng)提取溫度低，可破壞植物細胞壁，促進有效成分提取；改變提取的目的成分的性質(zhì)，加強藥物活性；去除體系內(nèi)雜質(zhì)，提高提取體系澄清度、改變藥材質(zhì)地。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種酶制劑，并將其應(yīng)用在提取葛根總黃酮，進一步給出了具體的操作方法，該方法能在溫和的條件下對植物有效成分進行高選擇性轉(zhuǎn)化，不僅可以克服工業(yè)中常用的醇水提取方法中有效成分提取率低、工序復(fù)雜等問題，提高提取體系澄清度、改變藥材質(zhì)地，還可以在提取中改變原有天然成分的結(jié)構(gòu)，增加提取物的生理活性，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。為實現(xiàn)該目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種酶制劑，其特征在于包括以下重量份的組分
纖維素酶 1-5份木聚糖酶 1-5份蛋白酶1-5份
淀粉酶1-5份所述蛋白酶選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一種。所述淀粉酶選用中溫α -淀粉酶和β -淀粉酶中的至少一種。上述酶制劑用于提取葛根總黃酮的應(yīng)用。上述酶制劑用于提取葛根總黃酮的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將葛根烘干粉碎，過篩，取葛根粉加入蒸餾水溶解；
(2)調(diào)節(jié)pH至4. 0-6.0，加入一定量的酶制劑，在40_60°C的溫度下酶解1-6小時；(3)高溫滅酶；(4)離心，沉淀用70%乙醇加熱回流提取l_3h，過濾，提取2-4次。(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。上面提到的提取葛根總黃酮的方法中，所述植物粉碎至40-100目，植物材料與加入的蒸餾水的質(zhì)量比為1 10-30。所述的酶制劑與蒸餾水的質(zhì)量比為1 5-15。步驟O)中所述的酶制劑添加量為葛根粉添加量的0. 1_1%。步驟(3)中所述的滅酶溫度為80_100°C，時間5-lOmin。步驟⑷中所述的70%乙醇與沉淀的質(zhì)量比為1 8-15，回流提取溫度為 60-80 "C。本發(fā)明選用此種酶制劑的原理是纖維素酶，可以降解植物纖維素；木聚糖酶可以水解植物中的木聚糖；蛋白酶，可以水解提取物中的蛋白質(zhì)，提高提取物的純度；淀粉酶，可以水解淀粉。這幾種酶相互作用，能夠破壞葛根細胞壁的纖維結(jié)構(gòu)，甚至將其分解成小分子物質(zhì)，減少提取傳質(zhì)阻力，有效釋放葛根黃酮等活性成分；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明采用酶法提取葛根總黃酮，反應(yīng)條件溫和，能保持天然產(chǎn)物的構(gòu)象，不破壞其立體結(jié)構(gòu)和生物活性，有利于保持有效成分原有的藥效。(2)本發(fā)明選用酶不僅能夠去除體系內(nèi)雜質(zhì)，提高提取液的澄清度，同時又提高了中藥有效成分的提取率。(3)本發(fā)明對酶制劑的配比、提取時間、提取溫度、加酶量、PH值進行了優(yōu)化組合， 實現(xiàn)了葛根總黃酮提取得率的最大化。(4)本發(fā)明酶制劑用于提取葛根總黃酮的方法中，采用酶提和醇提結(jié)合的條件下， 提高了活性成分的得率。(5)采用本發(fā)明從中藥葛根中提取總黃酮，葛根總黃酮提取率在7%以上，而一般的水提取法，提取率一般僅為1-2%，醇提取法，提取率一般僅為4-5%，因此酶提法提取得率高。(6)本發(fā)明工藝簡單、操作方便、投資少、不會產(chǎn)生噪音和污染，適應(yīng)工藝生產(chǎn)應(yīng)用。
具體實施例方式實施例1(1)取葛根烘干粉碎至80目，取該粉末10g，加入蒸餾水IOOmL溶解；(2)取酶制劑纖維素酶0.0037g，木聚糖酶0.0056g，木瓜蛋白酶0.0018g，中溫 α-淀粉酶0. 0037g加入葛根溶液中，調(diào)節(jié)pH至4.0，在40°C條件下酶解1小時；C3)80°C滅酶 IOmin ；(4)離心，沉淀加入10倍體積的70%乙醇，80°C加熱回流提取1小時，過濾，提取2次。(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。
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采用分光光度法測定總黃酮含量，葛根總黃酮提取率為7. 34%。實施例2(1)取葛根烘干粉碎至80目，取該粉末10g，加入蒸餾水150mL溶解；(2)取酶制劑纖維素酶0.0062g，木聚糖酶0.0093g，堿性蛋白酶0.0031g，中溫 α -淀粉酶0. 0062g，加入葛根溶液中，調(diào)節(jié)pH至4. 5，在45°C條件下酶解2小時；C3)85°C滅酶 IOmin ；(4)離心，沉淀加入12倍體積的70%乙醇，70°C回流提取3小時，趁熱過濾，提取 3次；(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。采用分光光度法測定總黃酮含量，葛根總黃酮提取率為7. 49%。實施例3 (1)取葛根烘干粉碎至100目，取該粉末15g，加入蒸餾水400ml溶解；(2)取酶制劑纖維素酶0.0125g，木聚糖酶0.0375g，中性蛋白酶0.0325g，β-淀粉酶0. 065g加入葛根溶液中，調(diào)節(jié)pH至5. 0，在50°C條件下酶解3小時；C3)85°C滅酶 IOmin ；(4)離心，沉淀加入10倍體積的70%乙醇，75°C回流提取2小時，趁熱過濾，提取 2次；(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。采用分光光度法測定總黃酮含量，葛根總黃酮提取率為7. 82%。實施例4(1)取葛根烘干粉碎至80目，取該粉末10g，加入蒸餾水300mL溶解；(2)取酶制劑纖維素酶0.02g，木聚糖酶O.Olg，中性蛋白酶0.02，中溫α -淀粉酶0.03g加入葛根溶液中，調(diào)節(jié)pH至5.0，在40°C條件下酶解1. 5小時；C3)85°C滅酶 IOmin ；(4)離心，沉淀加入8倍體積的70%乙醇，750C回流提取3小時，趁熱過濾，提取2 次；(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。采用分光光度法測定總黃酮含量，葛根總黃酮提取率為7. 82%。實施例5 (1)取葛根烘干粉碎至80目，取該粉末10g，加入蒸餾水IOOmL溶解；(2)取酶制劑(纖維素酶木聚糖酶木瓜蛋白酶中溫α-淀粉酶= 2:2:3: 1)0. 05g，調(diào)節(jié)pH至6. 0，在60°C條件下酶解1小時；C3)85°C滅酶 IOmin ；(4)離心，沉淀加入10倍體積的70%乙醇，85°C回流提取3小時，趁熱過濾，提取 3次；(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。采用分光光度法測定總黃酮含量，葛根總黃酮提取率為8. 59%。實施例6 (1)取葛根烘干粉碎至100目，取該粉末10g，加入蒸餾水200mL溶解；
(2)取酶制劑(纖維素酶木聚糖酶堿性蛋白酶中溫α-淀粉酶= 2:3:1: 2)0. 08g，調(diào)節(jié)ρΗ至4. 5，在45°C條件下酶解2小時；C3)90°C滅酶 IOmin ；(4)離心，沉淀用75%乙醇80°C回流提取3小時，趁熱過濾，提取3次；(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。采用分光光度法測定總黃酮含量，葛根總黃酮提取率為7. 55%。實施例7 (1)取葛根烘干粉碎至80目，取該粉末10g，加入蒸餾水200ml溶解；；(2)取酶制劑(纖維素酶木聚糖酶中性蛋白酶中溫α-淀粉酶= 1:2:2: 5)0. lg，調(diào)節(jié)ρΗ至4. 5，在45°C條件下酶解3小時；C3)85°C滅酶 IOmin ；(4)離心，沉淀加入10倍體積的70%乙醇，65°C回流提取80mim，趁熱過濾，提取3 次；(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。采用分光光度法測定總黃酮含量，葛根總黃酮提取率為7. 73%。實施例8 (1)取葛根烘干粉碎至80目，取該粉末10g，加入蒸餾水150ml溶解；(2)取酶制劑(纖維素酶木聚糖酶中性蛋白酶β -淀粉酶= 1:1:3: 2)0. 22g，調(diào)節(jié)ρΗ至5. 0，在60°C條件下酶解3小時；(3) 100°C滅酶 IOmin ；(4)離心，沉淀用75%乙醇75°C回流提取80mim，趁熱過濾，提取3次；(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。采用分光光度法測定總黃酮含量，葛根總黃酮提取率為7. 25%。
權(quán)利要求
1.一種酶制劑，其特征在于包括以下重量份的組分纖維素酶 1-5份木聚糖酶 1-5份蛋白酶1-5份淀粉酶1-5份
2.權(quán)利要求1所述的一種酶制劑，其特征在于所述蛋白酶選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一種。
3.權(quán)利要求1所述的一種酶制劑，其特征在于所述淀粉酶選用中溫α-淀粉酶和 β-淀粉酶中的至少一種。
4.權(quán)利要求1所述的酶制劑用于提取葛根總黃酮的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將葛根烘干粉碎，過篩，取葛根粉加入蒸餾水溶解；(2)調(diào)節(jié)ρΗ至4.0-6. 0，加入一定量的酶制劑，在40-60°C的溫度下酶解1_6小時；(3)高溫滅酶；(4)離心，沉淀用70%乙醇加熱回流提取l_3h，過濾，提取2-4次。(5)合并上清液和濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液為葛根總黃酮浸膏。
5.權(quán)利要求3所述的酶制劑用于提取葛根總黃酮的方法，其特征在于步驟(1)中所述的植物粉碎至40-100目，植物材料與加入的蒸餾水的質(zhì)量比為1 10-30。
6.權(quán)利要求3所述的酶制劑用于提取葛根總黃酮的方法，其特征在于步驟O)中所述的酶制劑添加量為葛根粉添加量的0.1-1%。
7.權(quán)利要求3所述的酶制劑用于提取葛根總黃酮的方法，其特征在于步驟(3)中所述的滅酶溫度為80-100°C，時間5-lOmin。
8.權(quán)利要求3所述的酶制劑用于提取葛根總黃酮的方法，其特征在于步驟中所述的70%乙醇與沉淀的質(zhì)量比為1 8-15，回流提取溫度為60-80°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種酶制劑及其用于提取葛根總黃酮的應(yīng)用和方法，屬于酶制劑的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種酶制劑，包括以下重量份的組分纖維素酶1-5份、木聚糖酶1-5份、蛋白酶1-5份、淀粉酶1-5份，本發(fā)明還給出了將此酶制劑用于提取葛根總黃酮的應(yīng)用，并給出了具體的操作步驟，最終實現(xiàn)了葛根總黃酮提取率70mg/g以上。本發(fā)明的有益效果是反應(yīng)條件溫和，能保持天然產(chǎn)物的構(gòu)象，不破壞其立體結(jié)構(gòu)和生物活性，有利于保持有效成分原有的藥效；能夠去除體系內(nèi)雜質(zhì)，提高提取液的澄清度，提高了中藥有效成分的提取率；對反應(yīng)條件進行了優(yōu)化組合，實現(xiàn)了提取得率的最大化。
文檔編號A61P9/10GK102492666SQ20111044554
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者劉宇, 劉敏堯, 劉海慶, 劉靚, 宋海瓊, 李文歡 申請人:天津濱海諾奧酶工程技術(shù)有限公司