專利名稱：用于因子xa抑制劑的解毒劑和其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及因子敘^乂幻衍生物的用途，所述因子fe(fXa)衍生物具有降低的固有促凝血活性或沒有固有促凝血活性，但能夠結合和/或中和fXa抑制劑，由此作為靶向 fXa的抗凝血劑的解毒劑。
背景技術：
市場上在治療或預防在不活動時或正接受醫(yī)療手術時易于形成血凝塊的患者 (例如，那些患有凝血病癥的患者)的不期望血栓形成時需要抗凝血劑。然而，抗凝血療法的一個重要限制是與治療有關的出血風險，且在服用過量或如果需要緊急手術的情況下限制了迅速逆轉抗凝血活性的能力。因此，業(yè)內極為期望針對所有形式的抗凝血療法的特定且有效解毒劑。出于安全考慮，同樣有利的是在研發(fā)新的抗凝血劑藥物中獲得抗凝血劑-解毒劑對。目前對于過度抗凝血可用的抗凝血劑-解毒劑對是肝素-魚精蛋白和華法林 (warfarin)-維生素K。新鮮的冷凍血漿和重組因子VIIa(rfVIIa)也已用作在低分子量肝素治療中正經(jīng)受嚴重創(chuàng)傷或嚴重失血的患者的非特異性解毒劑。(勞里岑(LaUritzen，B.) 等人，血液(Blood), 2005，607A-608A。)還報導了魚精蛋白片段(美國專利第6，624，141 號)和小的合成肽(美國專利第6，200，955號)作為肝素或低分子量肝素解毒劑；和凝血酶突變蛋白質(美國專利第6，060, 300號)作為凝血酶抑制劑的解毒劑。已報導將凝血酶原中間產物和衍生物作為水蛭素和合成凝血酶抑制劑的解毒劑(美國專利第5，817，309號和第 6，086，871 號)?？鼓煼ǖ囊环N有希望的形式靶向因子fe(fXa)，且實際上，目前在臨床研發(fā)的不同階段中有多種直接《a抑制劑用于抗凝血療法中。這些中的大多數(shù)是小分子。盡管這些新的《a抑制劑展示有希望用于治療，但仍需要特定且有效的解毒劑。在過度抗凝血或利用這些《a抑制劑治療的患者需要手術的情況下，可能需要一種試劑來實質上中和所投與的一種或多種fXa抑制劑并恢復正常止血。目前可用試劑(例如重組因子Vila(rfVIIa))是以機械方式進行限制且并非特定用于ffe抑制劑的逆轉且因此臨床醫(yī)生極為期望經(jīng)改良的方案。在人類研究中，已經(jīng)使用 rfVIIa來逆轉間接抗凝血酶III依賴性《Ca抑制劑(例如磺達肝素(fondaparinux)和伊達肝素(idraparinux))的作用(比斯特沃特(Bijsterveld，NR)等人，循環(huán)(Circulation)， 2002,106 :2550-2554 ；比斯特沃特(Bijsterveld, NR)等人，英國血液病學雜志(British J. of Haematology), 2004 (124) :653-658)。因子 Vlla(fVIIa)的作用機制是與組織因子一起作用將血液循環(huán)中存在的因子X(fX)轉化成《a來恢復患者的正常止血。必須說明的是， 這種作用模式可能達到以中和活性位點定向《a抑制劑的fXa的最高可能濃度受fX的循環(huán)血漿濃度限制。因此，使用rfVIIa來逆轉直接《Ca抑制劑的作用的潛力機械上受限。由于fX的循環(huán)血漿濃度為150毫微摩爾(“nM”)，所以通過這種模式所產生的fXa的最大量將為150nM。因此，使用rfVIIa來逆轉直接ffe抑制劑的作用的潛力機械上受限。小分子 fi(a抑制劑(例如利伐沙班(rivaroxaban))的報告治療濃度(大約600nM，庫比察(Kubitza D)等人，歐洲臨床藥理學雜志(Eur. J. Clin. Pharmacol)，2005，61 :873-880)高于由 rfVIIa 所生成的fXa的可能量。因此，使用rfVIIa來逆轉由《a抑制劑所產生的治療或超治療水平的抗凝作用將提供不充分的效能水平。如圖4中所示，在中和因子敘抑制劑貝特沙班 (betrixaban)的抗凝血活性中使用rfVIIa具有有限的作用(如下文所闡述)。重組fVIIa 展示50nM至IOOnM的劑量反應解毒活性，但所述作用在IOOnM至200nM之間趨于穩(wěn)定，此表明其解毒作用受除其濃度以外的因素的限制。在所有所測試的rfVIIa濃度中，貝特沙班在250nM的濃度下仍展示fXa的劑量反應抑制(高達約75%抑制)。此觀察結果與fVIIa 的建議作用機制一致。此結果還被展示rfVIIa不能完全逆轉磺達肝素對凝血酶生成和凝血酶原活化的參數(shù)的抑制作用的研究所支持。(吉偌提法斯(Gerotiafas，GT)等人，血栓形成和止血(Thrombosis &Haemostasis) 2204 (91) :531-537)。外源活性fXa不能以類似于rfVIIa的方式直接投與個體。不像rfVIIa在缺少其輔因子組織因子的情況下具有極低促凝血活性那樣，天然fXa是強效酶且具有造成血栓形成的潛在風險。因此，使用rfVIIa或活性《Ca作為《Ca抗凝血療法的解毒劑具有許多缺點。因此，需要經(jīng)改良的解毒劑，其不會造成不期望的血栓形成且在《Ca抑制劑服用過量的情況下或在需要恢復正常止血以阻止或停止出血的情況下有效地實質上中和fXa 抑制劑的抗凝血活性。本文所提及的任何及所有出版物、專利和專利申請案均以整體引用的方式并入本文中。

發(fā)明內容
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，投與fXa蛋白質的經(jīng)修飾衍生物可用作靶向fXa的抗凝血劑的解毒劑。所述《a蛋白質的經(jīng)修飾衍生物并不與fXa競爭組裝成凝血酶原酶復合物，而是結合和/或實質上中和抗凝血劑(例如fXa抑制劑)?？捎米鹘舛緞┑难苌锝?jīng)修飾以降低或去除固有的促凝血和抗凝血活性，同時保留結合至抑制劑的能力。預計本發(fā)明的衍生物可包括修飾活性位點、或改變Gla結構域或自《a去除整個Gla結構域、或其各種組合。由于已知活性位點經(jīng)修飾的全長fXa是抗凝血劑，因此進一步預計修飾Gla結構域將降低或消除fXa衍生物對正常止血的抗凝血作用。進一步預計，修飾fXa的EGF結構域(通過EGF1、EGF2、或EGFl和EGF2兩個結構域的缺失或取代)提供用于本發(fā)明方法的衍生物。EGF結構域修飾可單獨實施或連同Gla 結構域修飾一起實施。
在一個實施例中，衍生物保留結合靶向fXa的抗凝血劑(或《a抑制劑)所需的結構特性。通過衍生物直接或間接結合抑制劑，抑制劑實質上被中和。在一個方面中，本發(fā)明提供阻止或降低正利用因子敘抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的方法，其包含向所述個體投與有效量的因子fe蛋白質衍生物，所述衍生物結合至因子敘抑制劑但不會組裝成凝血酶原酶復合物。在一個實施例中，衍生物具有一個或一個以上的以下性質降低的促凝血活性或沒有促凝血活性；經(jīng)修飾或去除的Gla結構域；和經(jīng)修飾的活性位點。本發(fā)明的衍生物選擇性地結合并抑制以外源方式投與的因子fe抑制劑，由此實質上中和《a抑制劑的抗凝血活性。此方法涵蓋活體外和活體內方法二者。本發(fā)明所涵蓋的對因子)(a蛋白質的各種修飾可在整個具體實施方式
中找到。應了解，本發(fā)明所涵蓋的衍生物不是血漿源性因子Vila、重組因子Vila、新鮮冷凍血漿、凝血酶原復合物濃縮物、或全血。本發(fā)明的一個方面是使用因子)(a衍生物和含有其的組合物來治療已接受或正利用因子fe抑制劑接受過度抗凝血療法的患者或之前已投與因子fe抑制劑且然后需要止血的患者(例如非急需或急診手術可能需要)。在一個方面中，經(jīng)修飾《a蛋白質不同于天然存在的fXa，這是因為其具有降低的固有促凝血活性或消除固有促凝血活性且將不會妨礙在止血方面的生理fXa功能，同時仍能夠結合并實質上中和fXa抑制劑。在另一方面中，經(jīng)修飾的因子敘蛋白質是與能夠延長所述因子敘衍生物的血漿半壽期(或循環(huán)半壽期)的試劑共同投與。在又一方面中，解毒劑與一個部分偶聯(lián)以延長其血漿半壽期。還提供含有因子衍生物的醫(yī)藥組合物，所述因子fe衍生物結合(和/或實質上中和)因子)(a抑制劑，但不會組裝成凝血酶原酶復合物。所述醫(yī)藥組合物任選地包含醫(yī)藥上可接受的載劑。在另一方面中，本發(fā)明提供試劑盒，其包含用于抗凝血用途的《Ca抑制劑和當需要實質上中和fXa抑制劑的抗凝血活性時使用的fXa抑制劑解毒劑(或因子fe衍生物)。本發(fā)明的一個實施例涉及分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 12或與SEQ ID NO. 12具有至少80%同源性的多肽。另一實施例涉及分離的雙鏈多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或與SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽。再一實施例涉及分離的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 15或與SEQ ID N0. 15具有至少80%同源性的多肽。還提供包含載劑和剛剛所闡述多肽的醫(yī)藥組合物。還提供編碼剛剛所闡述多肽的多核苷酸。本發(fā)明進一步提供肽偶聯(lián)物，其包含以共價或非共價方式連接至剛剛所闡述多肽的載劑。載劑可為脂質體、膠束、醫(yī)藥上可接受的聚合物、或醫(yī)藥上可接受的載劑。本發(fā)明還涉及結合剛剛所闡述多肽的抗體。所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、 嵌合抗體或人源化抗體。還提供抗體的生物活性片段。所述抗體可以可檢測方式標記。所述抗體(或抗體片段)還作為組合物的一部分提供，所述組合物進一步包含載劑。在一個實施例中提供抗體-肽復合物，其包含本發(fā)明的抗體和特異性結合至所述抗體的多肽。所述多肽是受到對抗可產生所述抗體的多肽。所述抗體可為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在另一實施例中提供制備本發(fā)明多肽的方法，其包含在原核或真核宿主細胞中表達編碼所述多肽的多核苷酸。在一個實施例中，所述宿主細胞是真核細胞且尤其是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell)。在一個實施例中，重鏈(SEQ ID NO. 15)表達于原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))中。在另一實施例中，多肽經(jīng)分離。在再一實施例中提供分離的原核或真核宿主細胞，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。在一個實施例中，所述宿主細胞在組合物中，所述組合物進一步包含載劑。在又一實施例中提供阻止或降低正利用因子敘抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的方法，其包含向所述個體投與有效量的組合物，所述組合物包含本發(fā)明的多肽和載劑。 進一步提供選擇性結合并抑制正進行抗凝血療法的個體中以外源方式投與的因子)(a抑制劑，其包含向所述個體投與有效量的剛剛所闡述的組合物。


圖1示意性地展示表1中所示的人類因子X (SEQ ID NO. 1)的結構域結構，如在李塔斯(Leytus)等人，生物化學(Biochem.)，1986，25，5098-5102 中所報告。SEQ ID NO. 1 是由表2中所示的人類fX的核苷酸序列(SEQ ID N0. 2)編碼的人類fX的氨基酸序列， 如此項技術中所習知。例如，經(jīng)翻譯的氨基酸序列報告于李塔斯等人(Leytus)，生物化學(Biochem.)，1986，25, 5098-5102 中且可在 <http //www, ncbi. nlm. nih. gov/entrez/ viewer, fcgi ？ db = nuccore&id = 89142731〉的基因庫(GenBank)，“NM_000504”中找至Ij。 此序列中的氨基酸編號是基于fX序列。人類fX前體(SEQ ID NO. 1)含有前導序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸1至40)，隨后是對應于fX輕鏈(LC)的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸41至 179)、在fX分泌期間去除的RKR三聯(lián)體的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸180至182)、和fX 重鏈的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸183至488)，所述重鏈含有激活肽(AP) (SEQ ID NO. 1 的氨基酸183至234)和催化結構域(SEQ ID NO. 1的氨基酸235至488)。圖2(SEQ ID NO. 3)展示成熟人類因子X的氨基酸序列。此圖中氨基酸編號是基于成熟fx序列自fx輕鏈的N-末端開始。因子X在血漿中作為通過二硫鍵連接的雙鏈分子循環(huán)。輕鏈(LC)具有139個氨基酸(SEQ ID NO. 1的氨基酸41至179)殘基且含有富 Y-羧基谷氨酸(Gla)的結構域(SEQ ID N0. 3的1_45)(包括短芳香族堆棧(AS) (SEQ ID NO. 3的氨基酸40-45))，之后是兩個表皮生長因子(EGF)樣結構域(EGF1 =SEQ ID N0. 3的氨基酸46-84，EGF2 =SEQ ID N0. 3氨基酸85-1 )。重鏈(HC)具有306個氨基酸且含有52 個氨基酸激活肽(AP =SEQ ID N0. 3的氨基酸143-194)，然后是催化結構域(SEQ ID N0. 3的氨基酸195-448)。糜蛋白酶編號中的H57-D102-S195的催化三元體等效物位于fX序列中的 His236、Asp282、和 Ser379 處并加下劃線(SEQ ID N0. 3 的氨基酸 236,282 和 379)。圖3示意性地展示圖2中所示的成熟人類因子X的結構域結構。此圖中的氨基酸編號是基于成熟fx序列。突出顯示用于糜蛋白酶消化以去除含Gla-結構域的片段(SEQ ID N0. 3的氨基酸1-44)和用于fX激活以去除激活肽的切割位點。糜蛋白酶消化《3產生缺少1-44氨基酸殘基的無Gla結構域fXa(SEQ ID NO. 4)。圖4展示在凝血酶生成(表示為相對熒光單位(RFU))分析中在組織因子的存在下各種濃度的rfVIIa對《Ca抑制劑貝特沙班(如下文所述)的抗凝血活性的影響(如實例2中所述))。數(shù)據(jù)顯示，rfVIIa和組織因子的組合在高達200nM的濃度下不能完全中和 fXa抑制劑貝特沙班的抗凝血活性。
圖5展示在含活性fXa和貝特沙班(空心圓)的純化系統(tǒng)中Gla-結構域完整的酐_fXa逆轉貝特沙班的fXa抑制作用，而與活性fXa相比，僅酐-fXa的促凝血活性(空心三角)可忽略。將fXa發(fā)色活性標準化成在無任何抑制劑的情況下的活性fXa(空心正方形)。此更充分地闡述于實例2中。數(shù)據(jù)表明，酐對于fla底物無活性，但仍保留fXa 抑制劑結合能力。圖6展示在血漿凝血酶生成(表示為相對熒光單位(RFU))分析(如實例2中所述)中，圖5中具有完整Gla結構域的酐-ffe是有效抑制劑。其在115nM約時幾乎完全抑制凝血酶生成。數(shù)據(jù)表明，Gla-結構域未修飾的酐-fXa并不適于用作fXa抑制劑解毒劑。圖7展示在96孔板格式中活性fXa的凝血活性在糜蛋白酶消化之前和在糜蛋白酶消化15分鐘和30分鐘之后的比較。如此圖中所示，凝血時間(0D405的變化)在《Ca被糜蛋白酶消化15分鐘之后明顯延遲，且當fXa被消化30分鐘時有長達20分鐘的時間未觀察到凝血。此結果還用于建立糜蛋白酶消化酐_fXa的條件，這是因為在消化期間可監(jiān)測到酐_fXa沒有活性。此更充分地闡述于實例3中。圖8展示去Gla的酐-fXa對因子)(a抑制劑貝特沙班的結合親和力，如實例4中所闡述。數(shù)據(jù)表明，通過糜蛋白酶消化酐所制備以去除含Gla-結構域的片段(殘基1-44)的去Gla的酐- a能夠以與天然fla類似的親和力結合貝特沙班(fXa :Ki = 0. 12nM,去 Gla 的酐-fXa :Kd = 0. 32nM)。圖9展示，在實例2的凝血酶生成分析中，通過添加濃度為680nM的解毒劑(去Gla 的酐_fXa)逆轉不同濃度貝特沙班的抗凝血活性。在濃度為680nM時，去Gla的酐-fXa能夠產生實質上完全的fXa活性恢復。圖10展示，在凝血延長分析中使用aPTT試劑在96孔板格式(如實例3中所述)， 通過不同濃度的解毒劑(去Gla的酐-fXa)逆轉250nM貝特沙班的抗凝血活性。數(shù)據(jù)表明， 當使用約608nM的解毒劑來中和250nM的fXa抑制劑貝特沙班時，凝血時間與對照貧血小板血漿的凝血時間相當。圖11展示，在凝血延長分析中使用aPTT試劑在96孔板格式中，563nM的解毒劑 (去Gla的酐-fXa)對依諾肝素(enoxaparin) (0. 3125-1. 25U/mL)的抗凝血活性的影響，其表示為標準化之后的倍數(shù)變化。分析方案闡述于實例3中。數(shù)據(jù)表明，添加563nM的解毒劑明顯中和低分子量肝素依諾肝素的活性。圖12展示在發(fā)色分析中解毒劑(去Gla的酐-fXa)對凝血酶(5nM)活性的作用和50nM阿加曲班(argatroban)( 一種特異性凝血酶抑制劑)對其的抑制作用。正如所預期，fXa抑制劑的解毒劑在高達538nM濃度下不會以可檢測方式影響凝血酶活性或所述特異性抑制劑阿加曲班對其的抑制作用。此更充分地闡述于實例14中。圖13展示，在aPTT分析中使用標準凝血計時器通過改變解毒劑去Gla的酐-fXa 的濃度對400nM貝特沙班抗凝血活性的影響。分析方案闡述于實例3中。數(shù)據(jù)展示，《3抑制劑的解毒劑實質上400nM貝特沙班對fXa的抑制作用。據(jù)估計，在400nM貝特沙班的情況下，解毒劑的EC5tl為約656nM。圖14展示CHO細胞中用于表達fXa三重突變體(SEQ ID NO. 12)的DNA構建體的圖。將質粒DNA線性化并轉染至CHO dhfr(-)細胞中。使用四氫葉酸酯(HT)缺乏的培養(yǎng)基加甲氨蝶呤(MTX)米選擇細胞。通過ELISA來針對高蛋白質表達篩選穩(wěn)定克隆。在無血清培養(yǎng)基中產生《a三重突變體并通過離子交換與親和柱的組合來純化。圖中的編號是基于編碼人類fX SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列進行。例如，活性位點S419(SEQ ID NO. 1)處的丙氨酸突變等效于成熟人類fX的S379(SEQ ID NO. 3)處的突變，如整個申請案且更具體地實例7所討論。圖15展示分別使用識別fX重鏈和輕鏈的單克隆抗體純化的r-解毒劑的西方印跡(Western blot)。當將連接輕鏈和重鏈的二硫鍵還原后，r_解毒劑重鏈以類似于血漿源性fXa的預計分子量遷移。與正常FXa相比，fXa突變體的Gla-結構域中缺失6_39aa使得r-解毒劑輕鏈的分子量帶較低。圖16展示經(jīng)口單獨投與貝特沙班(15mg/kg)、或經(jīng)口投與貝特沙班(15mg/kg)然后靜脈注射(300 μ g，IV)根據(jù)實例1制得的血漿源性解毒劑(Pd-解毒劑)之后小鼠(η =7-10/組)中的貝特沙班血漿水平。pd-解毒劑是在1. 5小時的時間點之前5分鐘時投與，并在經(jīng)口投與貝特沙班之后1. 5,2. 0和4. 0小時時取小鼠血液樣品(0. 5mL)。分析全血 INR、貝特沙班和解毒劑血漿水平。將小鼠血漿中的貝特沙班水平(平均值士SEM)繪示為小鼠投與15mg/kg(空心正方形)和15mg/kg然后解毒劑注射(空心圓)之后隨時間變化的曲線。在1.5小時時間點(解毒劑注射后5分鐘)解毒劑治療組的H(-PD相關性匯總于表13中。根據(jù)INR測量值，單次注射解毒劑使功能性貝特沙班減少> 50%。此更充分地闡述于實例8中。圖17展示利用經(jīng)純化r-解毒劑進行小鼠實驗(n = 4-10/組)的結果。比較經(jīng)口單獨投與貝特沙班(15mg/kg)或經(jīng)口投與貝特沙班(15mg/kg)然后靜脈注射(300 μ g) r-解毒劑之后小鼠血漿中的貝特沙班水平(圖17A)和全血INR(圖17B)。標明各治療組的平均值。如表14中所匯總，單次靜脈注射r-解毒劑使得離體全血1冊有> 50%校正，此證明經(jīng)由多次注射或其它方案解毒劑有效中和《a抑制劑。這些結果表明，本發(fā)明的fXa 變體具有用作普遍解毒劑來逆轉在出血或其它醫(yī)療急診的患者中《a抑制劑的抗凝血作用的潛力。此更充分地闡述于實例8中。圖18展示在96孔濁度變化凝血分析中r-解毒劑逆轉依諾肝素的抑制作用。這些結果基本上類似于Pd-解毒劑(圖11)，此表明兩種《a衍生物具有相當?shù)墓δ苄越舛緞┗钚浴?0nM r-解毒劑實質上校正(>75%)1.25U/mL依諾肝素的抑制作用。分析方案呈現(xiàn)于實例11中。圖19展示r-解毒劑逆轉低分子量肝素(LMWH)的抑制作用，如在人類血漿凝血分析中所測試。圖18和19 二者均于實例11中討論。圖20展示r-解毒劑逆轉利伐沙班的抗凝血作用。此更充分地討論于實例12中。圖21展示r-解毒劑的多核苷酸序列和經(jīng)翻譯多肽序列的排列。圖22展示在單次靜脈注射(1次注射)或兩次注射O次注射)r_解毒劑的情況下小鼠實驗(n = 5/組，312ug/200ul r_解毒劑)的結果。對經(jīng)口投與貝特沙班(15mg/ kg)之后靜脈注射媒劑或r-解毒劑之后的血漿中的貝特沙班水平進行比較(圖22A)(參見實例8的詳細闡述)。如圖22A中所示，與媒劑對照(對照1)相比，單次靜脈注射r-解毒劑使血漿中的貝特沙班水平增加8倍以上，此表明解毒劑在活體內有效捕獲貝特沙班的能力。與單次注射相比，第二次注射解毒劑又使貝特沙班水平增加不到2倍，此表明在小鼠血漿中貝特沙班的數(shù)量有限且其抗凝血作用可能被解毒劑逆轉。圖22B表明，單次和雙次注射解毒劑之后，所測量的INR隨小鼠血漿中解毒劑/貝特沙班的比例的增加而降低。
具體實施例方式I.定義除非另有說明，否則本發(fā)明的實踐將使用組織培養(yǎng)、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA的常規(guī)技術，此在所屬領域的技術人員的范圍內。參見例如薩姆布魯克(Sambrook)和羅塞爾(Russell)編輯Q001)分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，第 3 版；奧蘇貝爾(Ausubel)等人編輯 Q007)最新分子生物學實驗方法匯編(Current Protocols in Molecular Biology)系列；酶學方法 (Methods in Enzymology)系列(學術出版社公司(Academic Press，he.)，紐約(N. Y.))； 麥克弗森(MacPherson)等人(1991)PCR 1 實用方法(PCR 1 :A Practical Approach) (牛津大學出版社(Oxford University Press)的 ^L Press)；麥克弗森(MacPherson) 等人(1995)PCR 2:實用方法(PCR 2 :A Practical Approach)；哈洛(Harlow)和萊恩 (Lane)編輯(1999)抗體，實驗室手冊(Antibodies, A Laboratory Manual)；富潤氏尼 (Freshney) (2005)動物細胞的培養(yǎng)基本技術手冊(Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique)，第5版；蓋特(Gait)編輯(1984)寡核苷酸的合成(Oligonucleotide Synthesis)；美國專利第4，683，195號；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)編輯(1984) 核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)；安德森(Anderson) (1999)核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)編輯(1984)轉錄和翻譯； 固定化細胞禾BBS (Transcription and Translation ；Immobilized Cells and Enzymes) (IRL Press (1986))；佩巴爾(Perbal) (1984)分子克隆實驗指南(A Practical Guide 至 Molecular Cloning)；米勒(Miller)和考斯(Calos)編輯(1987)哺乳動物細胞的基因轉移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory))；馬克瑞德斯(Makrides)編輯^)0 哺乳動物細胞的基因轉移禾口表達(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells)；邁耳口 (Mayer)禾口沃克 (Walker)編輯(1987)細胞核分子生物學中的免疫化學方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology) ((Academic Press) ,^ (London)) -M 岑貝格(Herzenberg)等人編輯(1996)韋爾的實驗免疫學手冊(Weir' s Handbook of Experimental Immunology)；小鼠胚胎操作實驗指南(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual)，第 3 版(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press) (2002))ο所有包括范圍在內的數(shù)值指定(例如，pH、溫度、時間、濃度、和分子量)都是近似值，其以⑴或(-)0. 1的增量變化。應了解，但不一定明確陳述所有數(shù)值指定前面皆有術語“約”。還應該了解，但未必明確陳述本文所述的試劑僅是例示性的且這些試劑的等效物已為此項技術習知。除非上下文另有明確說明，否則說明書和權利要求書中使用的單數(shù)形式“一(a， an)”和“所述的(the)”包括復數(shù)意義。例如，術語“醫(yī)藥上可接受的載劑”包括多種醫(yī)藥上可接受的載劑(包括其混合物)。本文所用術語“包含”意欲指組合物和方法包括所列舉要素，但并不排除其它要素。當使用“基本上由...組成”定義組合物和方法時，將意味著出于所想要的用途不包括對所述組合有任何本質意義的其它要素。因此，基本上由本文所定義的要素組成的組合物不會將來自分離和純化方法的痕量污染物和醫(yī)藥上可接受的載劑(例如磷酸鹽緩沖的鹽水、防腐劑、和諸如此類)排除在外。“由...組成”將意味著排除超過其它成分的痕量元素和用于投與本發(fā)明組合物的大量方法步驟。通過這些過渡術語中的每一者定義的實施例均在本發(fā)明的范圍內。診斷或治療的“個體”是細胞或哺乳動物(包括人類)。診斷或治療的非人類動物個體包括(例如)鼠科動物(例如大鼠、小鼠)、犬科動物(例如狗)、兔科動物(例如兔子)、家畜、運動動物和寵物。術語“蛋白質”和“多肽”可互換使用且在其最廣泛意義上是指兩個或兩個以上的亞單位氨基酸、氨基酸類似物或擬肽的化合物。所述亞單位可通過肽鍵連接。在另一實施例中，所述亞單位可通過其它鍵(例如，酯、醚等)連接。蛋白質或肽必須含有至少兩個氨基酸且對蛋白質或肽序列中可包含的氨基酸的最大數(shù)量并無限制。本文所用術語“氨基酸” 涉及天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，其包括甘氨酸和D與L光學異構體二者、氨基酸類似物和擬肽物質。天然存在的氨基酸的單個字母和三個字母縮寫列示于下文中。如果肽鏈短，通常將三個或三個以上氨基酸的肽稱為寡肽。如果肽鏈較長，則通常將所述肽稱為多肽或蛋白質。
權利要求
1.一種分離的因子敘衍生物多肽，所述分離的因子敘衍生物多肽(a)包含因子敘重鏈和(b) Gla缺乏的或去Gla的因子fe輕鏈或者不包括輕鏈，所述因子fe重鏈包含在所述重鏈的活性位點處的修飾。
2.如權利要求1所述的分離的因子敘衍生物多肽，其中，所述修飾是脫氫丙氨酸或丙氨酸取代^^379。
3.如權利要求1所述的分離的因子敘衍生物多肽，其中，所述修飾是S379A。
4.如權利要求1至3任一項所述的分離的因子衍生物，其中，所述重鏈還包括在氨基酸的Arg306、Glu310、Arg347、Lya35ULys414或Arg4M位置的至少一種氨基酸的取代。
5.如權利要求1至4任一項所述的分離的因子敘衍生物多肽，其中，所述分離的因子 )(a衍生物多肽不包括輕鏈。
6.如權利要求1至5任一項所述的分離的因子fe衍生物多肽，其中，所述分離的因子 Xa衍生物多肽包括Gla缺乏的輕鏈。
7.如權利要求6所述的分離的因子fe衍生物多肽，其中，Gla結構域為未羧化的、羧化不全的或經(jīng)脫羧的。
8.如權利要求1至5任一項所述的分離的fe衍生物多肽，其中，所述分離的fe衍生物多肽包含去Gla的輕鏈。
9.如權利要求8所述的分離的fe衍生物多肽，其中，所述輕鏈缺乏SEQID NO. 3的氨基酸殘基 1-39、6-39、1-44 或 1-45
10.如權利要求1至9任一項所述的分離的fe衍生物多肽，其中，所述輕鏈不包括EGFl 結構域和/或EGF2結構域。
11.如權利要求1至10任一項所述的分離的fe衍生物多肽，其中，所述分離的衍生物多肽為具有分離的輕鏈和重量的雙鏈多肽。
12.如權利要求11所述的分離的fe衍生物多肽，所述輕鏈和所述重鏈相連。
13.如權利要求12所述的分離的fe衍生物多肽，其中，所述分離的fe衍生物多肽還包含輕鏈和重鏈之間的肽連接體。
14.如權利要求13所述的分離的衍生物多肽，其中，所述肽連接體包含-RKRRKR-。
15.如權利要求1至14任一項所述的分離的fe衍生物多肽，其中，所述分離的fe衍生物多肽不包括活化的肽。
16.一種分離的雙鏈多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或與SEQ ID NO. 13 具有至少90%同源性的氨基酸序列，其中所述與SEQ ID NO. 13具有至少90%同源性的氨基酸序列(a)與野生型因子敘相比具有降低的促凝血活性，(b)能夠結合至因子敘抑制劑并且(c)不會組裝成凝血酶原酶復合物。
17.一種分離的雙鏈多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13。
18.一種分離的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID N0. 12或與SEQ ID N0. 12具有至少90%同源性的氨基酸序列，其中，所述與SEQ ID N0. 12具有至少90%同源性的氨基酸序列(a)與野生型因子敘相比具有降低的促凝血活性，(b)能夠結合至因子敘抑制劑并且(c)不會組裝成凝血酶原酶復合物。
19.一種分離的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID N0. 12。
20.一種分離的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID N0. 15或與SEQ ID N0. 15具有至少90%同源性的氨基酸序列，其中，所述與SEQ ID NO. 15具有至少90%同源性的氨基酸序列(a)與野生型因子敘相比具有降低的促凝血活性，(b)能夠結合至因子敘抑制劑并且(c)不會組裝成凝血酶原酶復合物。
21.一種分離的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO. 15。
22.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含載劑和權利要求1至21任一項所述的多肽。
23.一種多肽偶聯(lián)物，所述多肽偶聯(lián)物包含共價或非共價連接至權利要求1至21任一項所述的多肽的載劑。
24.如權利要求23所述的多肽偶聯(lián)物，其中，所述載劑是脂質體、膠束、醫(yī)藥上可接受的聚合物或醫(yī)藥上可接受的載劑。
25.—種編碼權利要求1至21任一項所述的多肽的多核苷酸。
26.一種抗體，所述抗體結合權利要求1至21任一項所述的多肽。
27.如權利要求沈所述的抗體，其中，所述抗體為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
28.如權利要求沈或27所述的抗體，所述抗體還包含可檢測的標記。
29.一種權利要求沈至觀任一項所述的抗體的生物活性片段。
30.一種組合物，所述組合物包含權利要求沈至觀任一項所述的抗體；以及載劑。
31.一種組合物，所述組合物包含權利要求四所述的抗體片段。
32.—種抗體-肽復合物，所述復合物包含權利要求沈至觀任一項所述的抗體；以及特異性結合至所述抗體的多肽。
33.如權利要求32所述的復合物，其中，所述多肽為受到對抗可產生所述抗體的多肽。
34.如權利要求32或33所述的復合物，其中，所述抗體為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
35.一種用于制備權利要求1至21任一項所述的多肽的體外方法，所述方法包括在原核或真核宿主細胞中表達編碼所述多肽的多核苷酸。
36.如權利要求35所述的方法，其中，所述方法還包括除去連接體，并且所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13。
37.如權利要求35或36所述的方法，其中，所述宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
38.如權利要求35至37任一項所述的方法，所述方法還包括分離所述多肽。
39.一種分離的原核或真核宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼權利要求1至21任一項所述的多肽的多核苷酸。
40.一種組合物，所述組合物包含載劑和權利要求39所述的原核或真核宿主細胞。
41.一種用于阻止或降低正利用因子敘抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的權利要求22所述的組合物。
42.一種用于選擇性結合并抑制正利用因子fe抑制劑進行抗凝血療法的個體中以外源方式投與的因子)(a抑制劑的權利要求22所述的組合物。
43.如權利要求41或42所述的組合物，其中，所述因子敘抑制劑選自磺達肝素、 伊達肝素、生物素化的伊達肝素、依諾肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、組織因子途徑抑制劑、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、PD_34^92、奧米沙班、DU_176b、 LY517717、GSK913893、雷扎沙班、低分子量肝素、貝特沙班或其醫(yī)藥上可接受的鹽、和其組口 O
44.如權利要求43所述的組合物，其中，所述因子敘抑制劑選自貝特沙班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和其組合。
45.如權利要求43所述的組合物，所述組合物的特征為在手術之前投與。
46.一種組合物，所述組合物包含因子fe蛋白質衍生物，所述因子fe蛋白質衍生物結合至因子fe抑制劑并且不會組裝成凝血酶原酶復合物用于阻止或降低正利用因子fe抑制劑進行抗凝血療法的個體出血。
47.一種組合物，所述組合物包含因子fe蛋白質衍生物，所述因子fe蛋白質衍生物結合至因子fe抑制劑并且不會組裝成凝血酶原酶復合物用于選擇性結合并抑制個體中以外源方式投與的因子)(a抑制劑。
48.權利要求46或47所述的組合物，其中，所述衍生物為Gla缺乏的因子蛋白質衍生物或去Gla的因子fe蛋白質。
49.如權利要求46至48任一項所述的組合物，其中，所述衍生物具有修飾的活性位點。
50.如權利要求46至49任一項所述的組合物，其中，所述衍生物包括催化結構域，所述催化結構域任選地以化學方式或重組方式修飾以失去蛋白水解活性但保持結合所需的結構特性，所述結構域源自以下中的任一種a.選自血漿激肽釋放酶、凝血酵素和胰蛋白酶的哺乳動物蛋白酶；或b.細菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶。
51.如權利要求46至50任一項所述的組合物，所述組合物的特征在于所述組合物與有效量的藥劑聯(lián)合投與，所述藥劑延長所述衍生物的半壽期。
52.如權利要求51所述的組合物，其中，所述藥劑為抗因子fe抗體，所述抗因子敘抗體特異性識別并結合因子)(a的外部位點或結合因子fe衍生物的α -2-巨球蛋白。
53.如權利要求46至52任一項所述的組合物，其中，所述因子fe抑制劑選自磺達肝素、伊達肝素、生物素化的伊達肝素、依諾肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、組織因子途徑抑制劑、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、PD_348^2、奧米沙班、DU_176b、 LY517717、GSK913893、雷扎沙班、低分子量肝素、貝特沙班或其醫(yī)藥上可接受的鹽、和其組口 O
54.如權利要求46至53任一項所述的組合物，其中，所述個體正經(jīng)歷選自下組的臨床重大出血事件失血、重要器官出血、需要再次手術或新的治療程序的出血和出血指數(shù)等于或大于2.0并伴有明顯出血。
55.如權利要求46至M任一項所述的組合物，其中，所述個體正經(jīng)歷選自下組的出血事件持續(xù)性或復發(fā)性鼻出血、不需要治療程序的直腸或泌尿道出血、顯著的注射位點血腫、非注射位點的自發(fā)性血腫、伴隨輕微創(chuàng)傷出現(xiàn)的血腫、大量血液流失和需要非計劃性輸血的出血。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向因子Xa的抗凝血劑的解毒劑。所述解毒劑是因子Xa蛋白質衍生物，所述因子Xa蛋白質衍生物結合至因子Xa抑制劑，由此實質上中和所述因子Xa抑制劑而不會組裝成凝血酶原酶復合物。本文所述衍生物缺少固有凝血活性或具有降低的固有凝血活性。本文揭示了停止或阻止目前正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的患者出血的方法。
文檔編號A61K47/48GK102533702SQ20111044720
公開日2012年7月4日 申請日期2008年9月26日 優(yōu)先權日2007年9月28日
發(fā)明者烏馬·辛哈, 盧根民, 帕特里克·安德烈, 戴維·R·菲利普斯 申請人:普托拉制藥有限公司