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從紅果小檗粗提物中篩選出的1型艾滋病病毒蛋白酶抑制劑及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:871804閱讀:659來源:國知局
專利名稱:從紅果小檗粗提物中篩選出的1型艾滋病病毒蛋白酶抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種抗艾滋病毒物質(zhì)的篩選方法及其應(yīng)用,具體通過熒光底物和晶體浸泡聯(lián)合篩選艾滋病病毒蛋白酶抑制劑,在天然產(chǎn)物中采用生物活性跟蹤測試分離純化出的一系列化合物組分對HIV-1蛋白酶的抑制活性,直至最終分離純化出成分單一的天然產(chǎn)物小分子抑制劑。
背景技術(shù)
艾滋病,醫(yī)學(xué)全名為“獲得性免疫缺陷綜合癥”(Acquired Immune DeficiencySyndrome—AIDS),現(xiàn)在科學(xué)研究普遍認(rèn)為是人體感染了人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus,簡稱HIV)所導(dǎo)致的傳染病。艾滋病病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae),慢病毒(Ientivirus)屬,靈長類免疫缺陷亞屬。現(xiàn)已證實HIV分為兩型:HIV-1型和HIV-2型,其中IV-2主要分布于非洲西部,在歐洲和美洲的一些感染者中也被檢測到,但毒力和傳播力都低于HIV-1,引起的艾滋病病程較慢且較緩和。HIV-1廣泛分布于世界各地,是引起全世界AIDS流行的病原,目前HIV的研究也是以HIV-1為主進(jìn)行的。艾滋病病毒可透過直接接觸黏膜組織的口腔、生殖器、肛門等或帶有病毒的血液、精液、陰道分泌液、乳汁而傳染。艾滋病病毒自從20世紀(jì)80年代由撒哈拉以南的非洲地區(qū)蔓延以后,至今已成為全球性的大流行病之一,目前,科學(xué)家尚未發(fā)現(xiàn)能夠完全抵御艾滋病病毒的疫苗,也沒有找到能夠根治艾滋病的藥物,因此,開發(fā)針對HIV的特效藥物一直是一個世界性的難題。艾滋病病毒主要感染人體免疫系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在的輔助型T細(xì)胞,巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞。病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,將啟動由Reverse Transcriptease (逆轉(zhuǎn)錄酶)主導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程,將病毒自身的單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA,然后在integrase (整合酶)的作用下,將病毒DNA插入人體自身的DNA中,跟隨宿主本身DNA的復(fù)制而復(fù)制。并且利用宿主的復(fù)制機(jī)器表達(dá)自身需要的蛋 白。在病毒蛋白表達(dá)完成之后,由艾滋病病毒蛋白酶將未成熟蛋白切割形成成熟的蛋白,組裝得到成熟的病毒顆粒后繼續(xù)感染下一個細(xì)胞。HIV的基因組主要編碼了結(jié)構(gòu)蛋白,調(diào)控蛋白以及輔助蛋白。其中結(jié)構(gòu)蛋白包括Gag7Pol以及Env。Gag基因表達(dá)形成一段55kD的蛋白,在HlV-1Protease (艾滋病病毒蛋白酶)的作用下,切割形成四段小蛋白,分別是基質(zhì)蛋白MA(P17),衣殼蛋白CA(p24),核衣殼蛋白NC (p9),以及p6蛋白;Gag-Pol融合蛋白在HIV-1Protease (艾滋病病毒蛋白酶)的作用下切為四個小蛋白,分別是蛋白酶(PlO)、逆轉(zhuǎn)錄酶(p50)、RNA酶H (P 15)、及整合酶(p31)。Env最初是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成,是一段分子量為88kD的蛋白質(zhì),在向高爾基體的轉(zhuǎn)運過程中被糖基化而成為分子量160kD(gp 160)的包膜糖蛋白前體。gpl60被宿主體內(nèi)的蛋白酶切割為gp 120和gp41兩部分,gpl20位于感染細(xì)胞和毒粒的表面,稱外膜蛋白,gp41鑲嵌于病毒的脂質(zhì)雙層中,稱跨膜蛋白,在病毒感染過程中能夠介導(dǎo)病毒脂膜與細(xì)胞膜的融合。除此之外,HIV基因組中還編碼了 tat, nef, rev, vpu, vpr, vif等調(diào)控和輔助蛋白。
從艾滋病病毒的生活周期和基因組成可以看出,艾滋病病毒蛋白酶對于艾滋病病毒的生存與繁殖具有至關(guān)重要的作用,如果能夠有效的抑制艾滋病病毒蛋白酶的活性,那么艾滋病病毒將無法形成新的成熟的病毒顆粒,從而阻止獲得性免疫缺陷癥(AIDS)的發(fā)生。HIV-1蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族,是由兩個相同亞基組成具有對稱性的同源二聚體,每個亞基含有99個氨基酸。根據(jù)蛋白酶結(jié)構(gòu)和底物的研究,人們在不斷尋找蛋白酶特異結(jié)合的抑制劑,目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)的PIs共9種:saquinavir, ritonavir,indinavir, nelfinavir,, amprenavir, lopinavir, atazanavir, tipranavir, darunavir。除了 tipranavir外,另外8種抑制劑都是多肽類似物(生物利用率低),競爭性抑制劑,都含有一個輕基乙烯中心結(jié)構(gòu),tipranavir則是一個二氫卩比喃酮環(huán)結(jié)構(gòu)。由于“雞尾酒療法”HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy)的應(yīng)用,這些抑制劑在前期治療過程中確實能有效的抑制HIV的傳播,但是由于患者要承擔(dān)高昂的醫(yī)藥費用,較高的注射劑量,發(fā)燒,腹瀉,惡心等毒副作用,以及HIV病毒高突變率產(chǎn)生抗藥性,艾滋病一直危害人類的健康,雖然全世界眾多醫(yī)學(xué)研究人員付出了巨大的努力,至今尚未研制出根治艾滋病的特效藥物,也沒有可用于預(yù)防的有效疫苗,這也促使人們在不斷尋找新的抗HIV-1藥物。隨著一些HIV復(fù)制過程中的重要蛋白以及這些蛋白與相關(guān)配體或抑制劑的精確三維結(jié)構(gòu)的解析,基于這些蛋白的三維結(jié)構(gòu)設(shè)計、篩選治療HIV感染的藥物,成為目前開發(fā)治療HIV藥物的重要手段。雖然在HIV不同的基因型、亞型以及突變體中,protease的蛋白質(zhì)序列不盡相同,但是其總體組成和相關(guān)活性位點卻是非常保守的,這就為我們從已解析結(jié)構(gòu)的protease出發(fā),篩選特異性針對的protease藥物提供了重要的依據(jù)。天然產(chǎn)物又稱次級代謝產(chǎn)物(Secondary Metabolites),具有結(jié)構(gòu)的多樣性和生物活性的多樣性。天然產(chǎn)物及其衍生物在以往的疾病治療中發(fā)揮了無可限量的作用,也是當(dāng)今藥物研發(fā)過程中最具潛力的資源之一?,F(xiàn)在對中藥等傳統(tǒng)藥物、海洋生物以及微生物代謝過程中的天然產(chǎn)物研究方興未艾,每年都會有大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物被發(fā)現(xiàn)提供出來,這些新穎化合物是合成方法所無法實現(xiàn)的藥物和藥物先導(dǎo)化合物的重要源泉,在新藥和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著重要作用。利用體外藥物模型篩選天然產(chǎn)物一直是藥物或其前導(dǎo)物的主要來源。體外篩選一般以短肽為底物進(jìn)行酶促反應(yīng),然后根據(jù)底物的有無標(biāo)記和標(biāo)記物的特點分別進(jìn)行HPLC、放射性、熒光分析或ELISA檢測。根據(jù)這些方法,人們從不同來源得到一些有抑制HIV蛋白酶活性的物質(zhì)。下面我們熒光分析為例闡明現(xiàn)有技術(shù):參考文獻(xiàn)Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J.Novel f luorogenicsubstrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer.Science.1990Feb 23 ;247(4945):954-8.
焚光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonance energy transfer,F(xiàn)RET)技術(shù)測定針對HIV-1蛋白酶的抑制劑的活性,是目前最常用的一種檢測方法,主要依據(jù)HIV-1蛋白酶識別位點設(shè)計并合成人工多肽底物:DABCYL-g-Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1le-Val-Gln-EDANS,當(dāng)抑制劑對 HIV-1 蛋白酶沒有抑制作用時,HIV-1蛋白酶可以切 割底物Tyr-PiO之間的肽鍵,淬滅基團(tuán)(DABCYL)遠(yuǎn)離熒光基團(tuán)(EDANS),熒光基團(tuán)吸收336nm波長,激發(fā)出472nm的波長,通過檢測器檢測熒光強(qiáng)度,如果抑制劑對HIV-1蛋白酶有抑制作用,肽鍵不被切開,淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)之間的距離較近,促使熒光基團(tuán)吸收336nm的波長后一部分能量會轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán),336nm的激發(fā)波強(qiáng)度就會減弱,檢測不出熒光強(qiáng)度的變化,以此來判斷抑制劑對HIV-1蛋白酶的抑制效果。根據(jù)待測化合物存在或不存在時的熒光強(qiáng)度變化,可以計算化合物對蛋白酶活性的抑制程度或剩余活性,從而完成對蛋白酶抑制劑的初步篩選。利用該方法可以在短時間內(nèi)完成對大量樣品的篩選工作,該模型也可以用于已知有抗HIV-1活性的物質(zhì),以檢驗其作用位靶點是否是蛋白酶。熒光底物HIV-1蛋白酶抑制劑篩選模型是目前普遍使用篩選模型,該方法操作簡單,較容易實現(xiàn)化合物的高通量篩選,但是這個體系也存在一定的缺陷,比如備選化合物不能含有過高的熒光值,篩選結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性。隨著生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展,藥物化學(xué)家們越來越關(guān)注在酶動力學(xué)測定中發(fā)現(xiàn)的有抑制活性的化合物,在原子水平上與蛋白質(zhì)之間的相互作用位點和作用方式。這也是目前基于分子水平上的酶活測定無法達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種基于熒光底物和晶體浸泡聯(lián)合篩選艾滋病病毒蛋白酶抑制劑的方法。目前,普遍采用生物活性跟蹤測試在天然產(chǎn)物中逐級分離純化出的一系列化合物組分(包括復(fù)合物組分和單一組分)對HIV-1蛋白酶的抑制活性,最終分離純化出成分單一組分,這單一組分就是天然產(chǎn)物小分子抑制劑,本發(fā)明利用熒光底物篩選方法發(fā)現(xiàn)紅果小檗的復(fù)合物組分能夠有效抑制HIV-1蛋白酶的活性,通過晶體浸泡的方法找到與HIV-1蛋白酶結(jié)合能力較強(qiáng)的小分子,然后再通過酶活測定小分子對HIV-1蛋白酶的抑制活性。最終,提供一種能夠有效抑制艾滋病病毒蛋白酶活性的小分子抑制劑。本發(fā)明提供一種能夠有效抑制艾滋病病毒蛋白酶活性的中藥小分子抑制劑。本發(fā)明提供一種能夠有效抑制艾滋病病毒蛋白酶活性的非競爭性抑制劑。本發(fā)明還提供一種通過小分子物質(zhì)與艾滋病病毒蛋白酶復(fù)合物結(jié)合篩選抗艾滋病毒物質(zhì)的方法。本發(fā)明還提供一種小分子抑制劑與艾滋病病毒蛋白酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以及該晶體結(jié)構(gòu)的制備方法。本發(fā)明還提供了一種艾滋病病毒蛋白酶能與抑制劑相互作用的新位點以及利用該位點篩選抗艾滋病毒活性物質(zhì)的方法。本發(fā)明提供了一種中藥小分子抑制劑在制備用于治療或者預(yù)防艾滋病病毒感染的藥物中的用途。本發(fā)明提供了一種源于中藥等天然產(chǎn)物混合物備選樣品中篩選到得靶向與HIV-1protease蛋白結(jié)合,且結(jié)合能力最好的小分子抑制劑-鹽酸小檗堿。
由于紅果小檗中所含的成分相當(dāng)復(fù)雜的,因此必須對其粗提物進(jìn)行優(yōu)化,目的是去除對艾滋病病毒蛋白酶體外活性測定和晶體浸泡實驗中的干擾因素如蛋白、多糖等,保留成藥性較好的小分子并使之盡量集中,提高其相對濃度,以制備適用于以艾滋病病毒蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行抑制劑篩選的備選樣品。本發(fā)明不僅提供了可以實現(xiàn)這一目的制備備選樣品的技術(shù)方案,而且對篩選有抑制活性的樣品,用各種色譜、波譜方法分離、鑒定了其中小分子抑制劑-鹽酸小檗堿的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還對紅果小檗各分離段位(即用萃取、大孔樹脂等方法分離得到的各個部分的樣品)進(jìn)行了艾滋病病毒蛋白酶的體外抑制活性測定。篩選出的紅果小檗乙酸乙酯中的鹽酸小檗堿在100 μ M的濃度時仍對艾滋病病毒蛋白酶顯示出較強(qiáng)的抑制活性,是較好的藥物或潛在的藥物前體。本發(fā)明還從結(jié)構(gòu)上解釋化合物與蛋白之間的抑制作用方式,提供了一個艾滋病病毒蛋白酶能與抑制劑相互作用的新位點,提供一個能夠有效抑制艾滋病病毒蛋白酶活性的非競爭性抑制劑,這為進(jìn)一步的藥物設(shè)計和篩選提供了寶貴的依據(jù)和參考。本申請使用的縮略語和關(guān)鍵術(shù)語定義為:HIV-1PR:1型人類免疫缺陷病毒蛋白酶
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AIDS:獲得性免疫缺陷綜合征LB: Luria-Bertani 培養(yǎng)基SOC:含營養(yǎng)較之LB培養(yǎng)基更為豐富一種培養(yǎng)基,可用于電轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞的復(fù)蘇IPTG:異丙基硫代-D半乳糖苷,一種乳糖類似物。PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)FRET:熒光共振能量轉(zhuǎn)移,當(dāng)一個熒光分子(又稱為供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(又稱為受體分子)的激發(fā)光譜相重疊時,供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光,同時供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。本發(fā)明提供的抗艾滋病病毒物質(zhì)的篩選方法具體包括如下步驟:(I).制備艾滋病病毒蛋白酶,并結(jié)晶得到艾滋病病毒蛋白酶的晶體;(2).制備天然產(chǎn)物提取物,所述提取物包括通過提取、溶劑萃取或大孔樹脂、硅膠等柱層析分離純化得到的各個部位;(3).將步驟⑵得到的天然產(chǎn)物提取物溶于有機(jī)溶劑;使用緩沖溶液對步驟(I)中的艾滋病病毒蛋白酶溶解、稀釋,然后將兩種溶液混合得到混合溶液,配制熒光底物溶液,再將熒光底物溶液加入上述混合溶液中;(4).檢測樣品的熒光強(qiáng)度變化,并與不加入天然產(chǎn)物提取物的陰性對照品比較,得到具有抑制艾滋病病毒蛋白酶的活性天然產(chǎn)物提取物。上述方法中,所述艾滋病病毒蛋白酶為I型人類免疫缺陷病毒蛋白酶,制備所用HIV-1protease 質(zhì)粒的氨基酸序列為 PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFo上述方法中,進(jìn)一步包括采用活性追蹤的方法,對確定的具有活性的天然產(chǎn)物提取物進(jìn)一步分離純化,對分離純化的組分重復(fù)步驟(3)和(4),如此多級分離、純化和步驟
(3)-(4)的活性測定,最終得到具有活性的單體化合物。上述方法中,所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選:戊烷、己烷、辛烷、環(huán)己烷、環(huán)己酮、甲苯環(huán)己酮、三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、、醋酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酮、甲基丁酮、甲基異丁酮、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚、乙二醇單丁醚、乙腈、吡啶、二甲基亞砜、二氯甲酰胺。
所述熒光底物優(yōu)選為:MCA- Y -Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1le-Val-Gln-Lys (Dnp) _Lys_NH2。該突光底物的氨基酸序列來源于艾滋病病毒蛋白酶的特異性剪切序列。用于熒光強(qiáng)度測定的儀器為Fluoraskan Ascent突光儀(ThermoLabsystems,Helsinki,Finland),激發(fā)光和發(fā)射光的波長分別為320nm和405nm。按照本發(fā)明制備的用于進(jìn)行HIV-1protease蛋白的抑制劑篩選的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中的樣品稱為天然產(chǎn)物混合物備選樣品。優(yōu)選將天然產(chǎn)物混合物備選樣品溶于二甲基亞砜(DMSO)中使其終濃度為50mg/mL,制得天然產(chǎn)物混合物備選樣品的DMSO溶解物。本發(fā)明方法中優(yōu)選使用緩沖溶液(50mMNaAc, pH5.2, ImMEDTA, 2.5mM DTT, 1.0MNaCl, 2.5% (v/v) glycerol)將lOmg/ml艾滋病病毒蛋白酶進(jìn)行一百倍稀釋。使用DMSO溶解熒光底物,使終濃度為10禮,再用緩沖溶液(50mM sodium acetate, pH5.2, ImMEDTA,
2.5mM DTT, 1.0M NaCl,2.5% (v/v) glycerol)十倍稀釋熒光底物。本發(fā)明方法優(yōu)選使用96孔酶標(biāo)板,每孔中加入97 μ L上述稀釋的蛋白溶液,再加入I μ L上述天然產(chǎn)物混合物備選樣品的反應(yīng)緩沖液溶解物(如紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品的反應(yīng)緩沖液溶解物),30度放置10分鐘后,迅速加入2 μ L上述稀釋的熒光標(biāo)記底物。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為320nm和405nm,溫度保持30度,每3秒鐘記錄一次熒光讀數(shù),共讀取60次。上述方法中,陰性對照品優(yōu)選不加入天然產(chǎn)物提取物,用I μ L100% DMSO代替,其余制備條件與天然產(chǎn)物提取物相同。本發(fā)明所述方法中天然產(chǎn)物提取物優(yōu)選為紅果小檗經(jīng)過乙醇提取、乙酸乙酯萃取然后用HP-20型大孔樹脂柱層析分離,得到30% -80%的乙醇洗脫部位。所述單體化合物優(yōu)選為小檗堿或其藥學(xué)上可接受鹽。本發(fā)明還提供一種通過上述篩選方法得到的活性天然產(chǎn)物提取物、活性單體化合物以及小檗堿或其藥學(xué)上可接受鹽在制備抗艾滋病病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種通過HIV蛋白酶的位點篩選抗艾滋病毒藥物的方法,其特征在于:所述位點是小檗堿或其藥學(xué)上可接受鹽與HIV-1蛋白酶的結(jié)合位點。本發(fā)明還提供一種HIV-1蛋白酶上的結(jié)合位點,其特征在于:所述結(jié)合位點是小檗堿或其藥學(xué)上可接受鹽與HIV-1蛋白酶的結(jié)合位點。


圖1為本發(fā)明紅果小檗的篩選樣品對艾滋病病毒蛋白酶的活性抑制曲線圖,樣品濃度:50mg/mL。1:對照(不加入任何樣品的艾滋病病毒蛋白酶的活性曲線)2:紅果小檗總提取物樣品對HIV-1蛋白酶的活性抑制曲線3:紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品對HIV-1蛋白酶的活性抑制曲線4:紅果小檗大孔樹脂50%乙醇洗脫樣品對HIV-1蛋白酶的活性抑制曲線。圖2為本發(fā)明鹽酸小檗堿對艾滋病病毒蛋白酶的半數(shù)抑制曲線圖。HIV-1蛋白酶濃度:500nM,底物濃度20 μ M,鹽酸小檗堿的IC5tl為114.8± 17.6 μ Μ。圖3為本發(fā)明艾滋病病毒蛋白酶與底物反應(yīng)的米氏方程曲線。HIV-1蛋白酶濃度:500nM,底物濃度分別為 200.000 μ Μ, 180.000 μ Μ, 150.000 μ Μ, 120.000 μ Μ, 100.000 μ Μ,50.000 μ Μ, 25.000 μ Μ, 12.500 μ Μ, 6.250 μ Μ, 3.125/ μ Μ。米氏常數(shù) Km24.29±3.7 μ Μ, Vmax96.24 μmoL/L/s。圖4為本發(fā)明鹽酸小檗堿存在于反應(yīng)體系中時艾滋病病毒蛋白酶與底物反應(yīng)的初速度與底物濃度曲線。反應(yīng)體系鹽酸小檗堿終濃度分別為O μ M,80 μ M,120 μ Μ,蛋白濃度為 500ηΜ,底物濃度分別為 200.000 μ Μ, 180.000 μ Μ, 150.000 μ Μ, 120.000 μ Μ,100.000 μ Μ, 50.000 μ Μ, 25.000 μ Μ, 12.500 μ Μ, 6.250 μ Μ, 3.125/ μ Μ,鹽酸小檗堿的 Ki 值為180.2 ± 16.8 μ Μ,鹽酸小檗堿抑制類型為非競爭性抑制劑。圖5為HIV-1蛋白酶與鹽酸小檗堿復(fù)合物晶體的電子密度圖。虛線框內(nèi)表示的是鹽酸小檗堿的電子云密度,虛線框外表示的是HIV-1蛋白酶的電子云密度。將10mg/ml的艾滋病蛋白酶與紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品以4: I混合,高速離心后進(jìn)行晶體生長,最終得到鹽酸小檗堿與HIV-1蛋白酶復(fù)合物的晶體。
具體實施例方式下面的實施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明,但不以任何方式限制本發(fā)明。

實施例1:艾滋病病毒蛋白酶的表達(dá)、純化和晶體生長HIV-lcDNA文庫(pNL4_3)獲贈于中科院生物物理所高光俠教授實驗室,使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得HlV-1Protease的基因片段,將其構(gòu)建與pET_lla載體上。PCR上下游引物分別為:5’ protease-1la-s ATCATATGGCCGATAGACAAGGAAC5, protease-1la-as GCGGATCCCTAAAAATTTAAAGTGCHIV-1protease 的基因序列:GCCGATAGACAAGGAACTGTATCCTTTAGCTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTCGTCACAATAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGATACTCATAGAAATCTGCGGACATAAAGCTATAGGTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTCAACATAATTGGAAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTAAATTTTTAG氨基酸序列:PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNF(I)將上述構(gòu)建在pET-1 Ia載體上的HIV-1protease質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Ε.coliBL21(DE3)菌株,并用LB平板(含100mg/L氨芐青霉素)篩選陽性克隆。(2)在(I)中所述的平板上挑取陽性克隆培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)入IL的LB培養(yǎng)基(含100mg/L氨芐青霉素),當(dāng)0D600達(dá)到0.6-0.8時,加入200 μ M的IPTG,在37°C培養(yǎng)6小時左右。
(3) 5000-8000rpm/min離心10_15min收集細(xì)胞,然后冰浴超聲破菌20-30分鐘;破菌液 13000-15000rpm 離心 20_40min。(4)棄去上清液,將沉淀用 40mL 20mM Tris-HCl,pH8.0, 5OOmMNaCI, 2mM EDTA,2%Triton-XlOO 充分洗滌,13000-15000rpm 離心 20_40min。(5)同⑷法再重復(fù)兩次。(6)棄去上清,將沉淀用 40mL 20mM Tris-HCl, pH8.0,500mM NaCl,2mM EDTA,2%Tween 充分洗漆,13000-15000rpm 離心 20_40min。(7)棄去上清,將沉淀用 80ml 20mM Tris, pH8.0, IOmM NaCl,8mM Urea 溶解,13000-15000rpm 離心 20_40min。收集上清(8)把上清加入截留分子量為30kD的Amicon濃縮管中,濃縮至上層剩余Iml左右,收集離心管下部分。(9)把(8)中得到的管下部分加入截留分子量為5kD的Amicon濃縮管中,濃縮至上層剩余ImL左右,收 集離心管上部分。(10)測定管上部分蛋白濃度,用20mM Tris, pH8.0, IOmM NaCl,8mM Urea稀釋至
0.lmg/mL的濃度。(11)將蛋白加入截留分子量為3500Dalton的透析袋中,放入4度預(yù)冷的透析緩沖液 A 中,其成分如下:20mM NaH2P04-Na2HP04, ρΗ7.2,25mM NaCl,10%甘油,0.2% beta-巰基乙醇,透析過夜。(12)將透析袋轉(zhuǎn)移入4度預(yù)冷的透析緩沖液B中,其成分如下:20mMNaAc-HAc,ρΗ5.2,0.2% beta-巰基乙醇,透析3小時。(13)取出透析袋中溶液,13000-15000rpm離心20-40min。收集上清。(14)把(13)中得到的上清加入截留分子量為5kD的Amicon濃縮管中,在20mMNaAc-HAc, pH5.2的緩沖液中濃縮至10mg/mL。(15) HIV-1protease 的晶體生長:結(jié)晶條件如下:10-15 % (w/v) PEG3350,5mMDTT, 0.2M MgC12。在該結(jié)晶條件下,5mg/mL的蛋白濃度,得到尺寸較大,衍射分辨率較高(聞于2.0人)的晶體。實施例2:紅果小檗備選樣品的制備將紅果小檗全草除去枯枝枯葉和其它摻雜物,洗凈剪碎,置于50°C真空干燥箱中干燥12小時。精確稱取500克干燥粉碎的紅果小檗藥材,于2500mL圓底燒瓶中加入95%乙醇IOOOmL,在80°C水浴中提取4小時,趁熱抽濾。然后再向殘渣中加入IOOOmL 95%乙醇進(jìn)行第二次提取,時間3小時,同樣趁熱抽濾,將濾液合并。再接著將合并后的濾液濃縮至20mL左右,分別轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿在常溫下進(jìn)行自然蒸發(fā)干燥,然后再轉(zhuǎn)入50°C真空干燥箱中干燥24小時,得到浸膏。稱取此浸膏20.5克,用150毫升雙蒸水懸浮,傾入1000毫升分液漏斗中,用乙酸乙酯萃取3次,每次萃取用乙酸乙酯650毫升,充分振搖,靜置6-10小時分層。萃取后得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯萃取物用EYELA NlOOl型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑,得干膏狀紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品,備用。萃取后的水相部分用EYELA NlOOl型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯,用HP-20型大孔樹脂柱層析分離(大孔樹脂用170毫升,玻璃柱規(guī)格30 X 300mm),依次用水、50%乙醇為流動相洗脫。先用水洗脫8次,每次洗脫250毫升,棄去水洗部分。然后用50 %乙醇洗脫5次,每次洗脫300毫升,合并各次50 %乙醇洗脫得到的洗脫液。將50 %乙醇洗脫部分使用EYELA N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑,得干膏狀紅果小檗水相大孔樹脂50%乙醇洗脫樣品,備用。上述乙酸乙酯萃取樣品和大孔樹脂50%乙醇洗脫樣品即為紅果小檗對艾滋病病毒蛋白酶體外抑制活性的篩選樣品。實施例3:紅果小檗備選樣品對艾滋病病毒蛋白酶抑制活性測定HIV-1protease 的體外活性測定方法參見(Dieter Hoffmann 等人,Journal ofClinical Virology 32 (2005) 294299),并做了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。艾滋病蛋白酶的活性測定是使用熒光底物MCA- Y-Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1le-Val-Gln—Lys(Dnp)_Lys_NH2(純度大于95%,上海吉爾生化有限公司)來完成的。該熒光底物的氨基酸序列來源于艾滋病病毒蛋白酶的特異性剪切序列。用于熒光強(qiáng)度測定的儀器為Fluoraskan Ascent熒光儀(ThermoLabsystems, Helsinki, Finland),激發(fā)光和發(fā)射光的波長分別為 320nm 和 405nm。按照本發(fā)明制備的用于進(jìn)行HIV-1protease蛋白的抑制劑篩選的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中的樣品稱為天然產(chǎn)物混合物備選樣品。將天然產(chǎn)物混合物備選樣品溶于二甲基亞砜(DMSO)中使其終濃度為50mg/mL,制得天然產(chǎn)物混合物備選樣品的DMSO溶解物。使用緩沖溶液(50mMNaAc, pH5.2, ImMEDTA, 2.5mM DTT, 1.0M NaCl,2.5% (v/v)glycerol)將lOmg/ml艾滋病病毒蛋白酶進(jìn)行一百倍稀釋。使用DMSO溶解熒光底物,使終濃度為 10mM,再用緩沖溶液(50mM sodium acetate, pH5.2, ImMEDTA, 2.5mM DTT, 1.0M NaCl,2.5% (v/v) glycerol)十倍稀`釋熒光底物。使用96孔酶標(biāo)板,每孔中加入97 μ L上述稀釋的蛋白溶液,再加入I μ L上述天然產(chǎn)物混合物備選樣品的反應(yīng)緩沖液溶解物(如紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品的反應(yīng)緩沖液溶解物),30度放置10分鐘后,迅速加入2 μ L上述稀釋的熒光標(biāo)記底物。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為320nm和405nm,溫度保持30度,每3秒鐘記錄一次熒光讀數(shù),共讀取60次。根據(jù)待測化合物存在或不存在時的熒光強(qiáng)度變化,可以計算化合物對蛋白酶活性的抑制程度或剩余活性,從而完成對蛋白酶抑制劑的初步篩選。具體計算方法是,酶促反應(yīng)中,根據(jù)反應(yīng)過程曲線(圖1),產(chǎn)物的生成量(即熒光強(qiáng)度)與反應(yīng)時間的曲線,曲線的斜率表示單位時間內(nèi)產(chǎn)物生成量的變化,所以曲線上任何一點的斜率就是該相應(yīng)時間的反應(yīng)速率,在底物消耗小于10% (反應(yīng)開始很短的時間內(nèi))范圍內(nèi),曲線斜率為酶反應(yīng)的初速率(VO),有不同抑制劑存在時,酶的反應(yīng)初速率(Vi)會有不同程度的下降,酶的剩余活性(Vi/V0)低于10%,為陽性結(jié)果。對照:陰性對照不加入備選樣品,用I μ L100% DMSO代替,其余條件相同。結(jié)果示于圖1中。由圖1可知紅果小檗乙酸乙酯萃取物具有較強(qiáng)的抑制活性,說明紅果小檗中的小分子抑制劑主要存在于乙酸乙酯萃取樣品中。將篩選到有抑制活性的樣品,用各種色譜、波譜方法分離、鑒定了其中小分子抑制劑-鹽酸小檗堿的結(jié)構(gòu)。實施例4:鹽酸小檗堿對艾滋病病毒蛋白酶抑制的IC5tl測定和抑制類型的判斷IC5tl(半數(shù)抑制濃度)的測定:底物濃度分別為20μΜ,蛋白濃度為500ηΜ,將鹽酸小檗堿進(jìn)行1/2濃度梯度稀釋,一般測定15個點,然后計算每個化合物濃度對應(yīng)的剩余活性,利用軟件GraphPad Prism 5軟件分析,作出剩余活性值與化合物濃度的對數(shù)值的曲線,計算出IC5tl值。鹽酸小檗堿的IC5tl為114.8± 17.6 μ M(圖2)。Km和Ki的測定以及抑制類型的判斷,蛋白濃度為500ηΜ,底物濃度分別為200.000 μ Μ,180.000 μ Μ,150.000 μ Μ,120.000 μ Μ,100.000 μ Μ,50.000 μ Μ,25.000 μ Μ,
12.500 μ Μ, 6.250 μ Μ, 3.125/μ Μ,計算每個底物濃度對應(yīng)的反應(yīng)初速度,利用軟件GraphPad Prism 5軟件分析,作出反應(yīng)初速度與底物濃度的曲線,計算出Km值(圖3), Km為 24.29±3.7μΜ。反應(yīng)體系中加入鹽酸小檗堿,使鹽酸小檗堿終濃度分別為80 μ Μ,120 μ Μ,蛋白濃度為 500ηΜ,底物濃度分別為 200.000 μ Μ, 180.000 μ Μ, 150.000 μ Μ, 120.000 μ Μ,100.000 μ Μ, 50.000 μ Μ, 25.000 μ Μ, 12.500 μ Μ, 6.250 μ Μ, 3.125 μ Μ,計算每個底物濃度對應(yīng)的反應(yīng)初速度,利用軟件GraphPad Prism 5軟件分析,作出反應(yīng)初速度與底物濃度的曲線,計算出鹽酸小檗堿Ki值(圖4),Ki為180.2± 16.8 μ M,鹽酸小檗堿抑制類型為非競爭性抑制劑。 實施例5:艾滋病病毒蛋白酶與紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品浸泡與共結(jié)晶根據(jù)文獻(xiàn)報道,由于艾滋病病毒蛋白酶的活性口袋較大,蛋白酶與大分子量的抑制劑結(jié)合后將在很大程度上改變蛋白酶的構(gòu)型,因此通過晶體浸泡的方法較難得到大分子量的抑制劑。但是另一方面,由于用于艾滋病病毒蛋白酶抑制劑篩選的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中的每一個樣品都含有許多種天然產(chǎn)物小分子(因此,將其稱為天然產(chǎn)物混合物備選樣品),若采用共結(jié)晶的方法,對艾滋病病毒蛋白酶結(jié)晶體系的影響又較大。因此,我們同時采用了兩種方法,一方面通過浸泡的方法,期望得到分子量較小的抑制劑,另一方面則優(yōu)化蛋白與天然產(chǎn)物混合庫的共結(jié)晶體系,期望得到分子量較大的抑制劑。方法I晶體浸泡法為了盡可能的在保證晶體質(zhì)量的基礎(chǔ)上,提高浸泡時紅果小檗乙酸乙酯樣品中小分子化合物的濃度,可以采用如下兩種方法制備艾滋病病毒蛋白酶的晶體浸泡液:將紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品的DMSO溶解物(按照步驟3中的方法制備)10倍稀釋至艾滋病病毒蛋白酶晶體生長池液(10-15% (w/v)PEG3350,5mM DTT,0.2M MgC12)中,以13000-15000rpm高速離心,之后取上清液,得浸泡液,備用;為了保證晶體浸泡時,不至于使紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品中的小分子化合物濃度過高而影響晶體的衍射質(zhì)量,將浸泡液分別稀釋至原液濃度的5倍,10倍。浸泡時,利用尼龍晶體環(huán)等工具,將已生長好的艾滋病病毒蛋白酶的晶體從結(jié)晶池液中取出,分別加入浸泡液中以及相應(yīng)的5倍、10倍稀釋液中,浸泡2-48小時。方法2:共結(jié)晶法將紅果小檗乙酸乙酯萃取樣品的DMSO溶解物(按照步驟3中的方法制備)10倍稀釋至艾滋病病毒蛋白酶晶體生長池液(10-15% (w/v)PEG3350,5mM DTT,0.2M MgC12)中,以13000-15000rpm高速離心,之后取上清液,備用。將10mg/ml的艾滋病蛋白酶與上述上清液分別以4: 1、2: 1、1: 1、1: 2、1: 4四個梯度混合,作用1-5個小時后,以13000-15000rpm高速離心,之后取上清液,備用。HIV-1protease-抑制劑復(fù)合物的晶體生長與單獨的HIV-1protease晶體生長條件相同,結(jié)晶條件如下:10-15% (w/v)PEG3350,5mM DTT,0.2MMgC12。得到尺寸較大,衍射分辨率較高(高于2.2人)的晶體。實施例6:晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和分析使用具備較好衍射能力(分辨率優(yōu)選大于2.6人)的晶體,進(jìn)行X射線衍射數(shù)據(jù)的收集和分析。進(jìn)行數(shù)據(jù)收集時,首先使用Hampton Research公司的尼龍晶體環(huán),從浸泡液I和浸泡液2中獲取浸泡一定時間(通常為2-48小時)的晶體;并迅速使用Rigaku公司的冷卻系統(tǒng)或Oxford Cyrosystem公司的冷卻系統(tǒng),將晶體在上述的冷凍系統(tǒng)產(chǎn)生的低溫氮氣流中冷凍至零下150°C -180°C ;使X射線通過晶體,使用旋進(jìn)法收集X射線衍射數(shù)據(jù)。選擇衍射質(zhì)量好的晶體(分辨率優(yōu)選大于2.0人)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、處理,檢測是否有小分子的結(jié)合。在收集到將靶標(biāo)蛋白質(zhì)的晶體與天然產(chǎn)物混合物備選樣品接觸后的晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)后,需要按照下述步驟進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理:首先,使用HKL2000等(包括Mosflm、D*trek等)衍射數(shù)據(jù)處理程序包等本領(lǐng)域已知的常用的數(shù)據(jù)處理的方法,對上一步驟中收集得到的衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,獲得完整的數(shù)據(jù)文件;其次,使 用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep等各種分子置換(MolecularReplacement)程序等本領(lǐng)域已知的常用的數(shù)據(jù)處理方法,利用分子置換(MolecularReplacement)的方法,以靶標(biāo)蛋白的母體晶體結(jié)構(gòu)為初始模型,得到候選的靶標(biāo)蛋白與靶分子的復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu);再次,使用程序COOT、XtalView等可視化程序包等本領(lǐng)域已知的常用的數(shù)據(jù)處理的方法,觀測可能的靶標(biāo)蛋白與抑制劑或者配體小分子復(fù)合體的電子密度。如果此時發(fā)現(xiàn),在靶標(biāo)蛋白相應(yīng)的活性位點,有不屬于蛋白質(zhì)分子本身的、不屬于溶劑分子的、不屬于結(jié)晶溶液中存在的分子的未知電子密度存在,并且該電子密度與靶標(biāo)蛋白的活性位點的氨基酸有產(chǎn)生包括氫鍵作用、共價作用等在內(nèi)合理的化學(xué)環(huán)境,則可以確認(rèn)此天然產(chǎn)物混合物備選樣品中,有抑制劑小分子等配體分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合。數(shù)據(jù)收集的統(tǒng)計如下表1:表1:艾滋病病毒蛋白酶母體、艾滋病病毒蛋白酶與紅果小檗乙酸乙酯萃取物樣品浸泡后的復(fù)合體數(shù)據(jù)收集統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.一種抗艾滋病病毒物質(zhì)的篩選方法,其特征在于:包括如下步驟: (1).制備艾滋病病毒蛋白酶,并結(jié)晶得到艾滋病病毒蛋白酶的晶體; (2).制備天然產(chǎn)物提取物,所述提取物包括通過提取、溶劑萃取或大孔樹脂、硅膠等柱層析分離純化得到的各個部位; (3).將步驟(2)得到的天然產(chǎn)物提取物溶于有機(jī)溶劑;使用緩沖溶液對步驟(I)中的艾滋病病毒蛋白酶晶體溶解、稀釋,然后將兩種溶液混合得到混合溶液,配制熒光底物溶液,再將熒光底物溶液加入上述混合溶液中; (4).檢測樣品的熒光強(qiáng)度變化,并與不加入天然產(chǎn)物提取物的陰性對照品比較,得到具有抑制艾滋病病毒蛋白酶的活性天然產(chǎn)物提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的篩選方法,其特征在于:所述艾滋病病毒蛋白酶為I型人類免疫缺陷病毒蛋白酶,制備所用HIV-1protease質(zhì)粒的氨基酸序列為PQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGHKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法,其特征在于:采用活性追蹤的方法,對確定的具有活性的天然產(chǎn)物提取物進(jìn)一步分離純化,對分離純化的組分重復(fù)步驟(3)和(4),如此多級分離、純化和步驟(3)-(4)的活性測定,最終得到具有活性的單體化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法,其特征在于:步驟(3)所述的有機(jī)溶劑選自:戊烷、己烷、辛烷、環(huán)己烷、環(huán)己酮、甲苯環(huán)己酮、三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、、醋酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酮、甲基丁酮、甲基異丁酮、乙二醇單甲醚、乙二醇單乙醚、乙二醇單丁醚、乙腈、吡啶、二甲基亞砜、二氯甲酰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法,其特征在于:步驟(3)所述的熒光底物為MCA-Y-Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-1le-Val-Gln-Lys(Dnp)-Lys-NH2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法,其特征在于:步驟(4)所述的陰性對照品為不加入天然產(chǎn)物提取物,用I μ Lioo % DMSO代替,其余制備條件與天然產(chǎn)物提取物相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的篩選方法,其特征在于:步驟(2)所述的天然產(chǎn)物提取物為紅果小檗經(jīng)過乙醇提取、乙酸乙酯萃取然后用ΗΡ-20型大孔樹脂柱層析分離,得到30% -80%的乙醇洗脫部位。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的篩選方法,其特征在于:所述單體化合物為小檗堿或其藥學(xué)上可接受鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述篩選方法得到的活性天然產(chǎn)物提取物在制備抗艾滋病病毒藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述篩選方法得到的活性單體化合物在制備抗艾滋病病毒藥物中的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述篩選方法得到的小檗堿或其藥學(xué)上可接受鹽在制備抗艾滋病病毒藥物中的應(yīng)用。
12.一種抗艾滋病病毒的藥物組合物,其特征在于:包含了根據(jù)權(quán)利要求1-8所述篩選方法得到的活性物質(zhì)。
13.—種通過HIV蛋白酶的特定結(jié)合位點篩選抗艾滋病毒藥物的方法,其特征在于:所述特定結(jié)合位點是小檗堿或其藥學(xué)上可接受鹽與HIV-1蛋白酶的結(jié)合位點。
14.一種HIV-1蛋白酶上的結(jié)合位點,其特征在于:所述結(jié)合位點是小檗堿或其藥學(xué)上可接受鹽與HIV-1蛋白酶的結(jié) 合位點。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于熒光底物和晶體浸泡聯(lián)合篩選艾滋病病毒蛋白酶抑制劑的方法。采用生物活性跟蹤測試在天然產(chǎn)物中逐級分離純化出的一系列化合物組分對HIV-1蛋白酶的抑制活性,最終分離純化出成分單一組分,這單一組分就是天然產(chǎn)物小分子抑制劑,通過上述方法,本發(fā)明發(fā)現(xiàn)紅果小檗的提取物能夠有效抑制HIV-1蛋白酶的活性,通過晶體浸泡的方法找到與HIV-1蛋白酶結(jié)合能力較強(qiáng)的小分子,然后再通過酶活測定小分子對HIV-1蛋白酶的抑制活性。最終,提供一種能夠有效抑制艾滋病病毒蛋白酶活性的小分子抑制劑,并且提供一種通過小分子物質(zhì)與艾滋病病毒蛋白酶復(fù)合物結(jié)合篩選抗艾滋病毒物質(zhì)的方法以及艾滋病病毒蛋白酶能與抑制劑相互作用的新位點以及利用該位點篩選抗艾滋病毒活性物質(zhì)的方法。
文檔編號A61P31/18GK103184264SQ20111045008
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者饒子和, 楊誠, 郭宇, 唐延婷, 牛國君, 孫玉桃, 汪穎, 李智 申請人:天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院
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