專利名稱：一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬支原體肺炎，又稱豬喘氣病或豬地方流行性肺炎，是由豬肺炎支原體引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病?；疾∝i的主要臨床癥狀為咳嗽和氣喘，體溫基本正常，生長遲緩，飼料轉(zhuǎn)化率低。剖檢時，以肺部病變?yōu)橹?，尤以兩肺心葉，中間葉和尖葉出現(xiàn)胰樣變和肉樣變?yōu)槠涮卣?。該病存在于世界各地，其死亡率雖然不高，但由于流行的廣泛性、長期性和消耗性，可使飼料轉(zhuǎn)化率降低，并引起豬的多種并發(fā)病，是造成養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的最重要的疾病之一。目前，該病的控制有改善飼養(yǎng)條件、藥物治療和疫苗免疫3種方式。改善飼養(yǎng)條件和藥物治療都不能根除該病的發(fā)生，且抗生素治療存在耐藥性問題，疫苗免疫是首選、有效的控制方式。國內(nèi)自主研發(fā)的疫苗只有弱毒活疫苗，包括中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的兔肺凍干苗、乳兔肌肉凍干苗及雞胚卵黃囊凍干苗，南京天邦和江蘇省農(nóng)科院共同研制的豬支原體肺炎168株活疫苗。弱毒活疫苗由于需要胸腔接種，所以不易于推廣普及；國外已有多家獸藥公司研發(fā)生產(chǎn)了豬支原體肺炎滅活疫苗，如梅里亞有限公司、美國先靈葆雅動物保健公司和美國富道公司等，均通過肌肉注射進(jìn)行接種，易于操作，但其價格較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬支原體肺炎滅活疫苗，該疫苗免疫效果顯著，能夠有效預(yù)防豬肺炎支原體疾病發(fā)生，填補(bǔ)了國內(nèi)自主研發(fā)豬支原體滅活疫苗空白，解決了弱毒活疫苗操作復(fù)雜、不易推廣的問題。本發(fā)明的另一目的是提供該豬支原體肺炎滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:本發(fā)明提供一種豬支原體肺炎滅活疫苗，該疫苗所用的菌種為豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae) DJ-166株,菌種的保藏號為CGMCC N0.4545,上述菌種經(jīng)滅活后作為水相，佐劑作為油相，水相與油相按配比乳化而成。其中，所述的佐劑為礦物油佐劑。進(jìn)一步，礦物油佐劑為白油、206佐劑、50V佐劑(即MontanideISA 50V佐劑)中的任一種。本發(fā)明的豬支原體肺炎滅活疫苗中水相與油相按1:1 1: 3體積配比進(jìn)行乳化。進(jìn)一步， 水相與油相按1:1體積配比進(jìn)行乳化。本發(fā)明制備的疫苗每頭份疫苗抗原含量不小于lOOug。進(jìn)一步，每頭份疫苗抗原含量為100 500ug。
更進(jìn)一步,每頭份疫苗抗原含量為300ug。本發(fā)明免疫接種方式為每頭豬I次肌肉注射2.0毫升，免疫期為6個月；種豬群
每半年重復(fù)接種一次。本發(fā)明還提供了該豬支原體肺炎滅活疫苗的制備方法，其制備步驟如下:(1)制備豬肺炎支原體DJ-166株菌液，培養(yǎng)至菌液pH值降至6.5 7.0 ;A.菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量的8% 10%接種菌液，置37±1°C培養(yǎng)5 9日，待培養(yǎng)基顏色變黃、呈輕度渾濁，pH值降至6.50 7.00之間收獲菌液。B.純粹檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗，應(yīng)純粹。C.CCU 測定將收獲菌液接種液體培養(yǎng)基，并進(jìn)行10倍系列稀釋至10_12，置37± 1°C培養(yǎng)14日，活菌滴度應(yīng)≥108CCU/mL。(2)將步驟(1)得到的菌液進(jìn)行濃縮、純化，并進(jìn)行滅活；A.濃縮、純化將菌液以10000r/min離心30分鐘，棄掉上清液，沉淀菌體用PBS(pH7.2 7.4)緩沖液懸浮，配制成為原培養(yǎng)物體積1/100菌懸液，-40°C保存。B.滅活經(jīng)濃縮的菌液加入1.0%的硫柳汞溶液使其終濃度為0.01 %，混合均勻，2 8°C放置12 24小時，期間振搖1 3次，然后在冰水浴上超聲波裂解4 6次，每次I分鐘，功率250 300W，超聲5 8秒，間歇5 8秒。(3)將滅活后的菌液進(jìn)行半成品檢驗，包括:無菌檢驗，滅活檢驗和蛋白濃度測定;A.滅活檢驗取5.0ml滅活菌液接種于45ml液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)14日，觀察培養(yǎng)基顏色變化。同時設(shè)未滅活菌液為陽性對照，液體培養(yǎng)基為陰性對照。培養(yǎng)5 7日，取出0.2ml接種固體培養(yǎng)基，置5% CO2環(huán)境，37°C培養(yǎng)10日。液體培養(yǎng)基應(yīng)無顏色變化，固體培養(yǎng)基上應(yīng)無菌落生長為滅活完全。B.無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌生長。C.蛋白濃度測定用紫外分光光度計檢測樣品在260nm和280nm波長下的吸收值,計算:蛋白濃度(mg/mL) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 < 1.4。(4)將步驟(3)得到的滅活后的菌液與佐劑按比例配比乳化，得到豬支原體肺炎滅活疫苗。A.水相制備將滅活菌液用PBS (pH7.2 7.4)緩沖液稀釋，每頭份疫苗蛋白抗原含量應(yīng)不低于100 μ gB.油相制備
將礦物油佐劑裝入滅菌瓶內(nèi)，在121°C滅菌30分鐘，冷卻后備用。C.乳化將水相與油相按1:1 1: 3的體積比配比乳化。先將油相加入剪切機(jī)內(nèi)，在低速攪拌的同時緩緩加入水相后，以lOOOOr/min攪拌5 8分鐘，即成乳白色油乳劑滅活疫苗。
有益效果:本發(fā)明的疫苗采用I次單劑量2.0ml肌肉注射，操作簡便；該疫苗所用菌種免疫原性好，免疫持續(xù)期可達(dá)6個月，能夠有效預(yù)防豬肺炎支原體疾病發(fā)生。本發(fā)明疫苗解決了國內(nèi)弱毒活疫苗操作復(fù)雜、不易推廣的問題，填補(bǔ)了國內(nèi)自主研發(fā)豬支原體肺炎滅活疫苗的空白。本發(fā)明疫苗所用的菌種豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)DJ-166株為申請人從山西養(yǎng)豬場35日齡二元雜交病豬肺臟組織分離得到，其免疫原性好。本發(fā)明的豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株申請人已于2011年01月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，簡稱CGMCC，保藏編號為=CGMCC N0.4545。


圖1抗體消長曲線圖
具體實施例方式實施例1豬支原體肺炎滅活疫苗的制備(I)菌(CGMCC N0.4545)液制備A.菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量10%比例接種豬肺炎支原體CGMCC N0.4545菌液，置37土 1°C培養(yǎng)5日，培養(yǎng)基顏色變黃、呈輕度渾濁，PH值降至7.00收獲菌液。B.純粹檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗，應(yīng)純粹。C.CCU 測定取收獲的菌液接種液體培養(yǎng)基，并進(jìn)行10倍系列稀釋至10_1(1，置37±1°C培養(yǎng)14日，活菌滴度為101QCCU/ml。D.濃縮、純化將菌液以10000r/min離心30分鐘，棄掉上清液，沉淀菌體用PBS(pH7.2 7.4)緩沖液懸浮，配制成為原培養(yǎng)物體積1/100菌懸液，-40°C保存。E.滅活經(jīng)濃縮的菌液加入1.0%的硫柳汞溶液使其終濃度為0.01 %，混合均勻，2 8°C放置12小時，期間振搖I次，然后在冰水浴上超聲波裂解4次，每次I分鐘(功率250 300W，超聲5秒，間歇5秒)。(2)半成品檢驗A.滅活檢驗取5.0ml滅活菌液接種于45ml液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)14日，觀察培養(yǎng)基顏色變化。同時設(shè)未滅活菌液為陽性對照，液體培養(yǎng)基為陰性對照。培養(yǎng)5 7日，取出0.2ml接種固體培養(yǎng)基，置5% CO2環(huán)境，37°C培養(yǎng)10日。液體培養(yǎng)基應(yīng)無顏色變化，固體培養(yǎng)基上應(yīng)無菌落生長為滅活完全。B.無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，無細(xì)菌、霉菌生長。C.蛋白濃度測定用紫外分光光度計檢測樣品在260nm和280nm波長下的吸收值,計算:蛋白濃度(mg/mL) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 < 1.4。(3)油乳 劑滅活疫苗的配制A.水相制備將滅活菌液用PBS (pH7.2 7.4)緩沖液稀釋至蛋白濃度300 μ g/ml。B.油相制備將注射用白油裝入滅菌瓶內(nèi)，在121°C滅菌30分鐘，冷卻后備用。C.乳化將水相成分與油相成分按1:1的體積比配比乳化。先將油相加入剪切機(jī)內(nèi)，在低速攪拌的同時緩緩加入水相后，以lOOOOr/min攪拌5 8分鐘，即成乳白色油乳劑滅活疫苗。實施例2豬支原體肺炎滅活疫苗的制備(I)菌液制備A.菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量的8%接種豬肺炎支原體CGMCC N0.4545菌液，置37± 1°C培養(yǎng)9日，待培養(yǎng)基顏色變黃、呈輕度渾濁，PH值降至6.50收獲菌液。B.純粹檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗，應(yīng)純粹。C.CCU 測定取收獲的菌液接種液體培養(yǎng)基，并進(jìn)行10倍系列稀釋至10_1(1，置37±1°C培養(yǎng)14日，活菌滴度為101QCCU/ml。D.濃縮將菌液以10000r/min離心30分鐘，棄掉上清液，沉淀菌體用PBS(pH7.2 7.4)緩沖液懸浮，配制成為原培養(yǎng)物體積1/100的菌懸液，-40°c保存。E.滅活經(jīng)濃縮、純化的菌液加入1.0 %的硫柳汞溶液使其終濃度為0.01%，混合均勻，2 8°C放置24小時，期間振搖3次，然后在冰水浴上超聲波裂解6次，每次I分鐘(功率250 300W，超聲8秒，間歇8秒)。(2)半成品檢驗A.滅活檢驗取5.0ml滅活菌液接種于45ml液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)14日，觀察培養(yǎng)基顏色變化。同時設(shè)未滅活菌液為陽性對照，液體培養(yǎng)基為陰性對照。培養(yǎng)5 7日，取出0.2ml接種固體培養(yǎng)基，置5% CO2環(huán)境，37°C培養(yǎng)10日。液體培養(yǎng)基應(yīng)無顏色變化，固體培養(yǎng)基上應(yīng)無菌落生長為滅活完全。B.無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌生長。C.蛋白濃度測定用紫外分光光度計檢測樣品在260nm和280nm波長下的吸收值,計算:蛋白濃度(mg/ml) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 < 1.4。(3)油乳劑滅活疫苗的配制A.水相制備將滅活菌液用PBS(pH7.2 7.4)緩沖液稀釋至蛋白濃度750 μ g/ml。B.油相制備將50V佐劑裝入滅菌瓶內(nèi)，在121°C滅菌30分鐘，冷卻后備用。C.乳化 將水相成分與油相成分按1: 2的體積比配比乳化。先將油相加入剪切機(jī)內(nèi)，在低速攪拌的同時緩緩加入水相后，以lOOOOr/min攪拌5 8分鐘，即成乳白色油乳劑滅活疫苗。實施例3豬支原體肺炎滅活疫苗制備(I)制苗用囷液制備A.菌液培養(yǎng)按培養(yǎng)基量的9%接種豬肺炎支原體CGMCC N0.4545菌液，置37±1°C培養(yǎng)7日，培養(yǎng)基顏色變黃、呈輕度渾濁，PH值降至6.82收獲菌液。B.純粹檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗，應(yīng)純粹。C.CCU 測定取收獲的菌液接種液體培養(yǎng)基，并進(jìn)行10倍系列稀釋至10_1Q，置37±1°C培養(yǎng)14日，活菌滴度為10nCCU/ml。D.濃縮將菌液以10000r/min離心30分鐘，去掉上清液，沉淀菌體用PBS(pH7.2 7.4)緩沖液懸浮，配制成為原培養(yǎng)物體積1/100菌懸液，-40°C保存。E.滅活經(jīng)濃縮的菌液加入1.0%的硫柳汞溶液使其終濃度為0.01 %，混合均勻，2 8°C放置18小時，期間振搖2次，然后在冰水浴上超聲波裂解5次，每次I分鐘(功率250 300W，超聲6秒，間歇6秒)。(2)半成品檢驗A.滅活檢驗取5.0ml滅活菌液接種于45ml液體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)14日，觀察培養(yǎng)基顏色變化。同時設(shè)未滅活菌液為陽性對照，液體培養(yǎng)基為陰性對照。培養(yǎng)5 7日，取出0.2ml接種固體培養(yǎng)基，置5% CO2環(huán)境，37°C培養(yǎng)10日。液體培養(yǎng)基應(yīng)無顏色變化，固體培養(yǎng)基上應(yīng)無菌落生長為滅活完全。B.無菌檢驗
按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，無細(xì)菌、霉菌生長。C.蛋白濃度測定用紫外分光光度計檢測樣品在260nm和280nm波長下的吸收值，計算:蛋白濃度(mg/ml) = 1.45 X OD280-0.74X OD260, OD260/OD280 < 1.4。(3)油乳劑滅活疫苗的配制A.水相制備將滅活菌液用PBS(pH7.2 7.4)緩沖液稀釋至蛋白濃度200 μ g/ml。B.油相 制備將206佐劑裝入滅菌瓶內(nèi)，在121°C滅菌30分鐘，冷卻后備用。C.乳化將水相成分與油相成分按1: 3的體積比配比乳化。先將油相加入剪切機(jī)內(nèi)，在低速攪拌的同時緩緩加入水相后，以lOOOOr/min攪拌5 8分鐘，即成乳白色油乳劑滅活疫苗。實施例4疫苗成品檢驗制備的3批疫苗，批號為20100901 (實施例1制備)>20101005 (實施例2制備)和20101106(實施例3制備),進(jìn)行性狀檢驗、無菌檢驗、安全性檢驗、效力檢驗和硫柳萊殘
留量檢驗。(I)性狀檢驗疫苗外觀為油包水(0/W)型乳白色乳劑，久置后上層有少量油質(zhì)，振搖后呈均勻乳狀液。以3000r/min離心15分鐘，管底部無水相析出，疫苗穩(wěn)定性良好。(2)無菌檢驗制備的3批疫苗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，均無細(xì)菌、霉菌生長。(3)安全性檢驗A.小白鼠安全性試驗制備的3批疫苗分別皮下注射18 22g小白鼠各8只，每只0.5ml,同時設(shè)對照組小白鼠8只，每只皮下注射生理鹽水0.5ml, 14日觀察期內(nèi)，小白鼠均全部健活，疫苗對非靶動物小白鼠使用安全。結(jié)果見表I。表I 3批疫苗注射小白鼠安全性試驗
權(quán)利要求
1.一種豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于菌種為豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)DJ-166株,菌種的保藏號為CGMCCN0.4545,上述菌種經(jīng)滅活后作為水相，佐劑作為油相，水相與油相按配比乳化而成。
2.權(quán)I所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于所述的佐劑為礦物油佐劑。
3.權(quán)2所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于所述的礦物油佐劑為白油、206佐劑、50V佐劑中的任一種。
4.權(quán)I所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于水相與油相按1:1 1: 3體積配比進(jìn)行乳化。
5.權(quán)4所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于水相與油相按1:1體積配比進(jìn)行乳化。
6.權(quán)I所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于每頭份疫苗抗原含量不小于lOOug。
7.權(quán)6所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于每頭份疫苗抗原含量為100 500ugo
8.權(quán)7所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于每頭份疫苗抗原含量為300ug。
9.一種如權(quán)利要求1-8任一項所述的豬支原體肺炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下: (1)制備豬肺炎支原體DJ-16 6株菌液，培養(yǎng)至菌液pH值降至6.5 7.0 ; (2)將步驟(I)得到的菌液進(jìn)行濃縮、純化，并進(jìn)行滅活； (3)將滅活后的菌液進(jìn)行半成品檢驗，包括:無菌檢驗，滅活檢驗和蛋白濃度測定； (4)將步驟(3)得到的滅活后的菌液與佐劑按比例配比乳化，得到豬支原體肺炎滅活疫苗。
10.權(quán)9所述的制備方法，其特征在于，滅活方式為濃縮、純化后的抗原加入終濃度0.01 %硫柳汞溶液，混勻后2 8°C放置12 24小時，期間振搖I 3次，然后在冰水浴上超聲波裂解4 6次，每次I分鐘，功率250 300W，超聲5 8秒，間歇5 8秒。
全文摘要
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法。該疫苗所用菌種免疫原性好，采用1次單劑量2.0ml肌肉注射，免疫持續(xù)期可達(dá)6個月，能夠有效預(yù)防豬肺炎支原體疾病發(fā)生。本發(fā)明解決了國內(nèi)弱毒活疫苗操作復(fù)雜不易推廣的問題，填補(bǔ)了國內(nèi)自主研發(fā)豬支原體肺炎滅活疫苗的空白。
文檔編號A61K39/02GK103182076SQ20111045215
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者車艷杰, 王海燕, 張鋒, 王勇鶼, 閆國暉, 高玉梅, 石松, 高潔, 趙亞榮 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司