專利名稱：一種利用生物反應(yīng)器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用生物反應(yīng)器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，尤其涉及一種利用激流灌注式生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。目前控制PRRS的主要方法是使用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，因此，高效價(jià)的病毒液是疫苗生產(chǎn)中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。豬繁殖與呼吸綜合征疫苗生產(chǎn)主要是通過轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)而增殖豬繁殖與呼吸綜合征病毒。生產(chǎn)中細(xì)胞及病毒培養(yǎng)條件難以控制，導(dǎo)致細(xì)胞和疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定，產(chǎn)品批間差異大，而且自動(dòng)化程度低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，極大的限制了疫苗的質(zhì)量與產(chǎn)量。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式已難以滿足市場(chǎng)的需求，使用生物反應(yīng)器不緹是一種很好的選擇。但應(yīng)用反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗也存在諸多問題比如因接種的細(xì)胞狀態(tài)不一、接種方式不科學(xué)導(dǎo)致疫苗批次間差異大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定；因營(yíng)養(yǎng)供給方式不科學(xué)導(dǎo)致細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏、生長(zhǎng)不均勻；因細(xì)胞種子鏈擴(kuò)增困難導(dǎo)致細(xì)胞再擴(kuò)大培養(yǎng)難以實(shí)現(xiàn)； 以及因清洗、滅菌帶來(lái)的操作繁瑣、污染幾率增大、耗費(fèi)能源等，諸多問題難以枚舉。綜上所述，本領(lǐng)域還需要繼續(xù)研發(fā)一種適用的培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，以進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量，優(yōu)化生產(chǎn)條件，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝及流程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，提供一種利用激流灌注式生物反應(yīng)器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法。本發(fā)明所述技術(shù)問題是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種利用生物反應(yīng)器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，它利用一個(gè)激流灌注式生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)工具，所述激流灌注式生物反應(yīng)器的液體循環(huán)系統(tǒng)由蠕動(dòng)泵、硅膠管、激流袋、灌注袋、有孔硅膠管與紙片載體組成；所述第一蠕動(dòng)泵通過硅膠管與激流袋、灌注袋連通、且蠕動(dòng)泵控制流向?yàn)橛晒嘧⒋郊ち鞔凰龅诙鋭?dòng)泵通過硅膠管與激流袋、 灌注袋連通、且控制流向?yàn)橛杉ち鞔焦嘧⒋?br> 制備操作按如下步驟進(jìn)行
a.制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)
將細(xì)胞懸液(宿主細(xì)胞和細(xì)胞生長(zhǎng)液)接種至激流灌注式生物反應(yīng)器的灌注袋(6)，使細(xì)胞貼附在紙片載體(8)上，設(shè)定設(shè)備參數(shù)，啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，得到制苗用細(xì)胞；
b.病毒接種與培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞達(dá)到最大密度時(shí)，排空反應(yīng)器內(nèi)液體，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種步驟a 所得制苗用細(xì)胞；加入細(xì)胞維持液，調(diào)節(jié)設(shè)備參數(shù)，啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序，擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒；
c.病毒液收獲
收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液，備用；
d.疫苗的制備
將步驟C收獲的病毒液制備疫苗。上述制備方法，在步驟a中，宿主細(xì)胞是經(jīng)過有限稀釋法克隆純化篩選的 Marc-145 或者 M104 細(xì)胞。上述制備方法，在步驟a中，細(xì)胞懸液接種采用兩步法，第一步從灌注袋(6)下部打入細(xì)胞懸液，充滿灌注袋(6)，靜置吸附Ih ；第二步將灌注袋(6)中的液體打出1/4 1/3，再?gòu)纳喜坑锌坠枘z管(7)內(nèi)打入細(xì)胞懸液，至細(xì)胞懸液充滿灌注袋(6)，再靜置吸附 0. 5 Ih ；細(xì)胞接種密度為每克載體接種0. 6 1. 5 X IO7個(gè)細(xì)胞。上述制備方法，在步驟a中，系統(tǒng)參數(shù)設(shè)定為溫度Tl :37 37. 5°C、T2:42 450C、T3 :35 36°C，pH :7. 0 7. 4，DO 30% 70%，振蕩速度 30 50rpm。上述制備方法，在步驟a中，細(xì)胞生長(zhǎng)液循環(huán)灌注速度隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增大，使硅膠管3、硅膠管4內(nèi)液體顏色保持基本一致。上述制備方法，在步驟a中，根據(jù)細(xì)胞耗糖及時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)液和10 20g/L的葡萄糖，當(dāng)殘?zhí)橇康陀趌g/L時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)液。上述制備方法，在步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒是經(jīng)過蝕斑法亞克隆純化篩選后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞克隆株。上述制備方法，在步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種劑量為0. 01 0. 3M0I， 接毒吸附時(shí)間為30 45min。上述制備方法，在步驟b中，設(shè)備參數(shù)為溫度Tl :36 37°C、T2 :39 43°C、T3 35 36°C，pH :7. 2 7. 6，DO 30% 70%，振蕩速度 30 50rpm。上述制備方法，在步驟b中，接毒后18 20h時(shí)需要補(bǔ)充循環(huán)系統(tǒng)總體積1/10 1/5的2 5倍濃縮DMEM液和10 20g/L的葡萄糖。上述制備方法，在步驟a、步驟b中，營(yíng)養(yǎng)液(細(xì)胞生長(zhǎng)液、細(xì)胞維持液)的流動(dòng)方式為液體流過灌注袋的方向是從下到上，從灌注袋(6)抽走液體的管道為深層管一有孔硅膠管(7)。上述制備方法，在步驟c中，收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液有三種方法第一種收獲方法為一次性收獲，在產(chǎn)毒高峰期(32 40h)—次性收獲；第二種方法為多次收獲， 18 24h時(shí)首次收獲，以后每隔6 他收獲一次，收獲同時(shí)補(bǔ)充新細(xì)胞維持液，共收獲3 5次；第三種方法為連續(xù)流加收獲，24 30h時(shí)開始收獲，連續(xù)收獲12 16h，控制每分鐘收獲量為細(xì)胞維持液總體積0. 5 2%，至44 50h時(shí)收獲剩余病毒液。上述制備方法，細(xì)胞生長(zhǎng)液的配方為體積百分含量90% 擬％高糖DMEM液， 8% 10%新生犢牛血清，調(diào)整PH值為7. 2 7. 4 ；所述細(xì)胞維持液的配方為體積百分含量 98% 99%高糖DMEM液，1% 2%新生犢牛血清，調(diào)整PH值為7. 2 7. 6。上述制備方法，所述生物反應(yīng)器有效培養(yǎng)體積為10LU00L和600L三種；制苗用細(xì)胞直接在IOL或者100L的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)；或者經(jīng)過IOL — 100L或IOL — 100L — 600L 逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞種子鏈逐級(jí)擴(kuò)增。
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與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1、在本發(fā)明中，制苗用細(xì)胞預(yù)先經(jīng)過有限稀釋法克隆純化篩選，保證了種子細(xì)胞的狀態(tài)均一，減小了批次間差異，確保了生產(chǎn)工藝參數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。2、在本發(fā)明中，反應(yīng)器細(xì)胞接種采用兩步法，此方法可保證灌注袋(6)各點(diǎn)細(xì)胞接種均勻，紙片載體(8)利用充分，有利于提高產(chǎn)毒效價(jià)。3、本發(fā)明中在細(xì)胞培養(yǎng)過程中逐步提高細(xì)胞生長(zhǎng)液的循環(huán)灌注速度，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的交換速度更適合細(xì)胞增殖。4、本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)過程中和病毒增殖過程中進(jìn)行補(bǔ)液，保證了細(xì)胞和病毒增殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又提高了營(yíng)養(yǎng)液的利用率，節(jié)約成本。5、本發(fā)明營(yíng)養(yǎng)液的流動(dòng)方式為倒灌注、深抽液。此灌注過程不但能保證灌注袋 (6)各處細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)均勻，又可達(dá)到供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并帶走細(xì)胞代謝廢物的目的。6、本發(fā)明接種的豬繁殖與呼吸綜合征病毒系經(jīng)蝕斑法亞克隆純化篩選的亞克隆株，保證了種毒的純度，減小了批次間差異，確保了生產(chǎn)工藝參數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。7、本發(fā)明病毒液的收獲可以根據(jù)目的不同，靈活選擇收獲方式。8、應(yīng)用本法生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，細(xì)胞種子鏈能夠?qū)崿F(xiàn)IOL 600L的逐級(jí)擴(kuò)大，且三種規(guī)模設(shè)備培養(yǎng)的病毒效價(jià)基本一致；放大效果好，適合規(guī)?；a(chǎn)。9、本發(fā)明中，使用一次性無(wú)生物毒性耗材，使用完畢直接進(jìn)行無(wú)害化處理，減少了罐體式生物反應(yīng)器的清洗、消毒、滅菌等復(fù)雜的工藝環(huán)節(jié)和工藝配套設(shè)施的安裝，解決了因消毒不徹底帶來(lái)的污染問題，同時(shí)節(jié)約能耗，整個(gè)生產(chǎn)工藝不涉及其他生物安全和公共衛(wèi)生問題。


圖1是激流灌注式生物反應(yīng)器的液體循環(huán)系統(tǒng)組成示意圖； 圖2是本發(fā)明的工藝路線圖3是接毒前細(xì)胞單日耗糖量曲線圖。圖中各標(biāo)號(hào)為1.第一蠕動(dòng)泵(灌注出液泵)、2.第二蠕動(dòng)泵(灌注進(jìn)液泵)，3、 4.硅膠管、5.激流袋、6.灌注袋、7.有孔硅膠管、8.紙片載體。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，本實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。實(shí)施例1 AP20C型激流灌注式生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98 株)
本實(shí)施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反應(yīng)器，灌注袋6體積為5L，激流袋5)體積為15L，灌注袋(6)內(nèi)含有150g聚酯纖維紙片載體8);理論有效培養(yǎng)體積收獲液體積)為 10L。圖1是激流灌注式生物反應(yīng)器的液體循環(huán)系統(tǒng)組成示意圖；其中，制苗用細(xì)胞、 病毒全部在灌注袋內(nèi)生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)液(細(xì)胞生長(zhǎng)液、細(xì)胞維持液)通過外置蠕動(dòng)泵(第一蠕動(dòng)泵 1、第二蠕動(dòng)泵2)在灌注袋和激流袋中循環(huán)。
種毒為采用蝕斑法亞克隆純化篩選后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98株，保藏號(hào)為CCTCC V201138，于2011年11月27日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。檢驗(yàn)用強(qiáng)毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株在專利申請(qǐng)20101(^94953. 5 中有記載，保藏號(hào)NO. M67，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。A、準(zhǔn)備工作
檢驗(yàn)系統(tǒng)氣密性，校準(zhǔn)電極，PBS處理紙片載體8，連接灌注袋6與激流袋5，用細(xì)胞生長(zhǎng)液浸泡紙片載體8，平衡系統(tǒng)。B、生產(chǎn)具體步驟如下
a、制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)
選擇有限稀釋法純化篩選后的Marc-145細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，在IOL轉(zhuǎn)瓶中用含10%新生牛血清、PH7. 4的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液于37°C培養(yǎng)，長(zhǎng)成良好單層時(shí)備用；以0. 025%胰酶對(duì) 7瓶長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞進(jìn)行消化，制備種子液6L，細(xì)胞總數(shù)約2. 3 X IO9個(gè)。細(xì)胞接種采用兩步接種法，第一步從灌注袋6下部打入細(xì)胞懸液(Marc-145細(xì)胞和DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液)4. 5L，靜置吸附Ih ；第二步將灌注袋6中的液體打出1. 5L，再?gòu)纳喜可顚庸軆?nèi)打入余下的細(xì)胞懸液，充滿灌注袋6，靜置吸附0. 5h ；同時(shí)在激流袋5內(nèi)補(bǔ)充5. 5L 細(xì)胞生長(zhǎng)液預(yù)熱；細(xì)胞接種密度為每克載體接種1. 5 X IO7個(gè)細(xì)胞；
吸附過程完成后，設(shè)置設(shè)備參數(shù)如下:T1 :37°C、T2 :42°C、Τ3 :36°C，PH :7. 3，DO :50%， 震蕩速度45rpm，液體循環(huán)速度250ml/min，啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；每日取樣測(cè)殘?zhí)橇?，及時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液和10g/L的葡萄糖；逐漸增大液體循環(huán)速度；
b、病毒的接種與培養(yǎng)
細(xì)胞接種后第4日單日耗糖量達(dá)到3. 63g/d/L，且趨于平穩(wěn)；確定細(xì)胞密度達(dá)到了接毒要求；排空反應(yīng)器內(nèi)液體，將經(jīng)亞克隆純化篩選后效價(jià)為107 3TCID5Q/ml的PRRSV-R98毒液 IOOml打至激流袋5內(nèi)，連同激流袋5內(nèi)的4. OL無(wú)血清單倍DMEM，一同打至灌注袋6內(nèi)，靜置吸附45min，同時(shí)在激流袋5中補(bǔ)充4. OL含血清4%的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，病毒接種劑量約為 0. 03M0I。吸附完成后，調(diào)整設(shè)備參數(shù)如下溫度Tl 36. 50C> T2 :39°C、T3 :36°C，pH :7. 4， DO :50%，振蕩速度45rpm，液體循環(huán)速度250ml/min，啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序開始培養(yǎng)，接毒18h 時(shí)，補(bǔ)充2倍濃縮DMEM 2L，10g/L葡萄糖IOOrnl ；
c、病毒液收獲
接毒34h時(shí)開始收獲，一次性收獲灌注袋6內(nèi)的上清病毒液，將含有紙片載體8和部分病毒液的灌注袋6凍融兩次后取上清病毒液與已收獲的病毒液混合，約10. 5L，于-20°C冷凍保存；
d、制苗毒液的檢驗(yàn)
按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版)附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體生長(zhǎng)； 病毒液對(duì)豬安全無(wú)副作用，收獲的病毒液用細(xì)胞測(cè)定效價(jià)，每Iml含病毒IO9 2tlTCID5ci ；
e、配苗、分裝及凍干
將檢驗(yàn)合格的病毒液混合于同一容器，加入5%的蔗糖脫脂乳凍干保護(hù)劑充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98株)成品。C、疫苗安全性檢驗(yàn)選用7日齡健康易感仔豬3頭，每頭豬頸部肌肉注射10頭份該疫苗。連續(xù)觀察14日， 免疫后仔豬精神、食欲無(wú)明顯變化，無(wú)異常臨床反應(yīng)，疫苗安全性檢驗(yàn)合格。D、疫苗效力檢驗(yàn)
選用30日齡健康易感仔豬10頭，隨機(jī)分為兩組，第一組5頭各頸部肌肉注射該疫苗1 頭份，第二組5頭不接種疫苗，作為對(duì)照，在同等條件下隔離飼養(yǎng)。所有豬各滴鼻攻毒檢驗(yàn)用強(qiáng)毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株病毒培養(yǎng)液:3ml(104_5TCID5cZml )，每日測(cè)溫， 連續(xù)觀察觀日。結(jié)果對(duì)照豬均發(fā)病，且死亡2頭，5頭免疫豬均未發(fā)病。疫苗效力檢驗(yàn)合格。與轉(zhuǎn)瓶工藝比較轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝每瓶收獲體積1L，病毒效價(jià)約是107_° 7 5 TCID50/ ml ；本次實(shí)驗(yàn)病毒總產(chǎn)量是轉(zhuǎn)瓶工藝的500倍以上。實(shí)施例2用AP200型激流灌注式生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98 株)
本實(shí)施例中所用的AP200型激流灌注式生物反應(yīng)器，灌注袋6體積為50L，激流袋5體積為150L，灌注袋6內(nèi)含有2000g聚酯纖維紙片載體8 ；理論有效培養(yǎng)體積(收獲液體積)為 IOOL0A、準(zhǔn)備工作
選用AP20C型和AP200型兩種激流灌注式生物反應(yīng)器，做培養(yǎng)細(xì)胞前準(zhǔn)備工作。B、生產(chǎn)工作，具體步驟如下 a、制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)
依實(shí)施例1方法用AP20C型生物反應(yīng)器培養(yǎng)的Marc-145細(xì)胞，至第4日，單日耗糖量達(dá)到3. 8g/d/L時(shí)，用0. 025%胰酶消化灌注袋6)內(nèi)細(xì)胞，制得細(xì)胞懸液17L，約含Marc-145 細(xì)胞2. 5X 101°個(gè)。將消化下來(lái)的細(xì)胞懸液中加入28L細(xì)胞生長(zhǎng)液，采用兩步接種法接種于AP200灌注袋6內(nèi)，細(xì)胞接種密度為每克載體接種1.25X 107個(gè)細(xì)胞。吸附同時(shí)在激流袋5內(nèi)補(bǔ)充 55L細(xì)胞生長(zhǎng)液預(yù)熱。吸附過程完成后，設(shè)置設(shè)備參數(shù)如下T1:37°C、T2:42°C、T3:35. 5°C, PH7. 2， 00:70%，震蕩速度43印111，液體循環(huán)速度3171^11。啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。每日取樣測(cè)殘?zhí)橇?，及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液、逐漸增大液體循環(huán)速度。種子細(xì)胞接種至AP200型生物反應(yīng)器后，單日葡萄糖的消耗量(g/d/L)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，以第4、5日增長(zhǎng)速度最快，直至第6日細(xì)胞單日耗糖達(dá)到3. 69g/d/L，增長(zhǎng)速度趨于緩慢，說(shuō)明反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞增長(zhǎng)速度趨緩，細(xì)胞已經(jīng)增加到了最大密度，達(dá)到了接毒需要(見圖 3)。b、病毒的接種與培養(yǎng)
排空反應(yīng)器內(nèi)液體，將經(jīng)亞克隆純化篩選的效價(jià)為107 4TCID5Q/ml的PRRSV-R98毒液 2000ml打至激流袋5內(nèi)，與預(yù)先打入激流袋5的40L無(wú)血清單倍DMEM —同打至灌注袋6內(nèi)， 靜置吸附45min，同時(shí)在激流袋5中補(bǔ)充40L含血清4%的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，病毒接種劑量約為 0. IMOI。吸附完成后，調(diào)整設(shè)備參數(shù)如下溫度Tl 36. 50C> T2 :39°C、T3 :36°C，pH :7. 4， DO :70%，振蕩速度45rpm，液體循環(huán)速度3. 8L/min。啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序開始培養(yǎng)。接毒18h時(shí)，補(bǔ)充4倍濃縮DMEM 10L, 10g/L葡萄糖IL0C、病毒液的收獲
接毒40h時(shí)開始收獲。一次性收獲灌注袋6內(nèi)上清病毒液，將含有紙片載體8和部分病毒液的灌注袋6凍融兩次后去上清病毒液液與已收獲的病毒液混合，約102L，于-20°C冷凍保存。d、制苗毒液的檢驗(yàn)
按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版)附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體生長(zhǎng)。 病毒液對(duì)豬安全無(wú)副作用，收獲的病毒液用細(xì)胞測(cè)定效價(jià)，每Iml含病毒109_ 12TCID5tlt5e、配苗、分裝及凍干
將檢驗(yàn)合格的病毒液混合于同一容器，加入5%的蔗糖脫脂乳凍干保護(hù)劑充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得成品。C、疫苗安全性檢驗(yàn)
選用7日齡健康易感仔豬3頭，每頭豬頸部肌肉注射10頭份該疫苗。連續(xù)觀察14日， 免疫后仔豬精神、食欲無(wú)明顯變化，無(wú)異常臨床反應(yīng)，疫苗安全性檢驗(yàn)合格。D、疫苗效力檢驗(yàn)
選用30日齡健康易感仔豬10頭，隨機(jī)分為兩組，第一組5頭各頸部肌肉注射該疫苗1 頭份，第二組5頭不接種疫苗，作為對(duì)照，在同等條件下隔離飼養(yǎng)。所有豬各滴鼻攻毒檢驗(yàn)用強(qiáng)毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXAl株病毒培養(yǎng)液:3ml(104_5TCID5cZml )，每日測(cè)溫， 連續(xù)觀察觀日。結(jié)果對(duì)照豬均發(fā)病，且死亡3頭，5頭免疫豬均未發(fā)病。疫苗效力檢驗(yàn)合格。實(shí)施例3三種收獲病毒液方法應(yīng)用比較實(shí)驗(yàn) 1、材料與方法
設(shè)備、種毒等材料同實(shí)施例2 ；
實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)組，均按照實(shí)施例2中同樣方法培養(yǎng)制苗用細(xì)胞、接種病毒、擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒，但三組采用不同的方法收獲病毒液，收獲的病毒液均按照常規(guī)方法測(cè)定病毒液體積和效價(jià)。第一組采用一次性收獲法見實(shí)施例2 ；
第二組采用多次收獲法24h時(shí)首次收獲，以后每隔他收獲一次，至4 時(shí)最后一次收獲，共收獲5次；前4次收獲，每次收獲病毒液體積總量的70 90%，并補(bǔ)充等體積量的細(xì)胞維持液，最后1次收獲操作與實(shí)施例2相同；混合收獲的全部病毒液；
第三組采用連續(xù)流加收獲法，24h時(shí)開始連續(xù)流加收獲，24 3 控制收獲速度1. 5L/ min,32 38h收獲速度1. OL/min,收獲同時(shí)連續(xù)補(bǔ)充等量細(xì)胞維持液；3 時(shí)停止連續(xù)流加收獲，繼續(xù)培養(yǎng)至48h，同實(shí)施例2操作收獲剩余病毒液；混合收獲的全部病毒液。2、結(jié)果
第一組收獲得病毒液體積最小，但是病毒液效價(jià)最高，第二組與第三組收獲病毒液體積較大，病毒液效價(jià)較低，但是病毒收獲總量高。(結(jié)果見表1)。表1收獲病毒液測(cè)定結(jié)果_
權(quán)利要求
1.一種利用生物反應(yīng)器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，其特征在于，它利用一個(gè)激流灌注式生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)工具，所述激流灌注式生物反應(yīng)器的液體循環(huán)系統(tǒng)由兩個(gè)蠕動(dòng)泵、硅膠管、激流袋(5)、灌注袋(6)、有孔硅膠管(7)與紙片載體(8)組成；所述第一蠕動(dòng)泵(1)通過硅膠管(3)與激流袋(5)、灌注袋(6)連通、且蠕動(dòng)泵(1)控制流向?yàn)橛晒嘧⒋?6)到激流袋(5)；所述第二蠕動(dòng)泵(2)通過硅膠管(4)與激流袋(5)、灌注袋(6)連通、 且控制流向?yàn)橛杉ち鞔?5)到灌注袋(6)；制備按如下步驟進(jìn)行a.制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)將細(xì)胞懸液，內(nèi)含宿主細(xì)胞和細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種至激流灌注式生物反應(yīng)器的灌注袋 (6)，使細(xì)胞貼附在紙片載體(8)上，設(shè)定設(shè)備參數(shù)，啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，得到制苗用細(xì)胞；b.病毒接種與培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到最大密度時(shí)，排空反應(yīng)器內(nèi)液體，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種步驟a 所得制苗用細(xì)胞；加入細(xì)胞維持液，調(diào)節(jié)設(shè)備參數(shù)，啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序，擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒；c.病毒液收獲收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液，備用；d.疫苗的制備將步驟c收獲的病毒液制備疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，宿主細(xì)胞是經(jīng)過有限稀釋法克隆純化篩選的Marc-145或者M(jìn)104細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，細(xì)胞懸液接種采用兩步法， 第一步從灌注袋(6)下部打入細(xì)胞懸液，充滿灌注袋(6)，靜置吸附Ih ；第二步將灌注袋 (6)中的液體打出1/4 1/3，再?gòu)纳喜坑锌坠枘z管(7)內(nèi)打入細(xì)胞懸液，至細(xì)胞懸液充滿灌注袋(6)，再靜置吸附0. 5 Ih ；細(xì)胞接種密度為每克載體接種0. 6 1. 5 X IO7個(gè)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，系統(tǒng)參數(shù)設(shè)定為溫度Tl 37 37. 5°C、T2 :42 45°C、T3 :35 36°C，pH :7. 0 7. 4，DO :30% 70%，振蕩速度 30 50rpmo
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，細(xì)胞生長(zhǎng)液循環(huán)灌注速度隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增大，使硅膠管(3)、硅膠管(4)內(nèi)液體顏色保持基本一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟a中，根據(jù)細(xì)胞耗糖及時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)液和10 20g/L葡萄糖，當(dāng)殘?zhí)橇康陀趌g/L時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒是經(jīng)過蝕斑法亞克隆純化篩選后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒亞克隆株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒接種劑量為0. 01 0. 3M0I，接毒吸附時(shí)間為30 45min。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，設(shè)備參數(shù)為溫度Tl:36 37°C、T2 39 43°C、T3 :35 36°C，pH :7. 2 7. 6，DO :30% 70%，振蕩速度 30 50rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，接毒后18 20h時(shí)需要補(bǔ)充循環(huán)系統(tǒng)總體積1/10 1/5的2 5倍濃縮DMEM液和10 20g/L的葡萄糖。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述步驟a、步驟b中，細(xì)胞生長(zhǎng)液或細(xì)胞維持液的流動(dòng)方式為液體流過灌注袋的方向是從下到上，從灌注袋(6)抽走液體的管道為深層的有孔硅膠管(7)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述步驟c中，收獲豬繁殖與呼吸綜合征病病毒液采用三種方法中的任一種第一種收獲方法為一次性收獲，在病毒高峰期一次性收獲；第二種方法為多次收獲，18 24h時(shí)首次收獲，以后每隔6 他收獲一次，收獲同時(shí)補(bǔ)充新細(xì)胞維持液，共收獲3 5次；第三種方法為連續(xù)流加收獲，24 30h時(shí)開始收獲， 連續(xù)收獲12 16h，控制每分鐘收獲量為細(xì)胞維持液總體積0. 5 2%，至44 50h時(shí)收獲剩余病毒液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞生長(zhǎng)液的配方為體積百分含量為90% 擬％的高糖DMEM液，8% 10%新生犢牛血清，調(diào)整PH值為7. 2 7. 4 ；所述細(xì)胞維持液的配方為體積百分含量98% 99%的高糖DMEM液，1% 21新生犢牛血清，調(diào)整 PH值為7. 2 7. 6。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述生物反應(yīng)器有效培養(yǎng)體積為IOL 600L ；制苗用細(xì)胞直接在IOL或者100L的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)；或者經(jīng)過IOL — 100L或 IOL — 100L — 600L逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞種子鏈逐級(jí)擴(kuò)增。
全文摘要
一種利用生物反應(yīng)器制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的方法，它利用一個(gè)激流灌注式生物反應(yīng)器作為培養(yǎng)工具，制備按如下步驟進(jìn)行a.制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)；b.病毒接種與培養(yǎng)；c.病毒液收獲；d.疫苗制備等工序。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便，污染幾率小，生產(chǎn)成本顯著降低，疫苗產(chǎn)量大，質(zhì)量均一穩(wěn)定，免疫效果優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，整個(gè)生產(chǎn)工藝不涉及其他生物安全和公共衛(wèi)生問題，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102552896SQ20111045860
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者劉濤, 楊保收, 邱貞娜, 郁宏偉, 鄭朝朝 申請(qǐng)人:瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司