專利名稱：一種誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的抑制劑、其誘導(dǎo)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域。概括地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種miciORNA-421抑制齊U，該抑制劑在體外誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的用途，一種用上述抑制劑誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的制備方法，該方法所制成的干細(xì)胞、所述的干細(xì)胞在制備用于治療心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途，以及所述的抑制劑在制備用于治療心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途，同時(shí)還涉及上述的用于治療心臟疾病的藥物制劑或試劑盒。
背景技術(shù)：
一、心血管疾病概述心血管疾病是人類健康的頭號(hào)殺手，全世界范圍內(nèi)每年約有一千七百萬(wàn)人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。
在我國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人民生活水平和醫(yī)療保健水平明顯提高，人均壽命已大大延長(zhǎng)，然而心血管疾病卻日益成為危害我國(guó)人民健康的嚴(yán)重問(wèn)題，其中心肌梗死及心力衰竭、冠心病已成為中國(guó)三大主要疾病之一。心血管疾病的死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，目前已超過(guò)癌癥成為第一大致死因素，嚴(yán)重影響人民生活質(zhì)量和身體健康，很大程度上降低了整個(gè)社會(huì)的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)預(yù)測(cè)，今后10年我國(guó)中年人群心血管發(fā)病率還將顯著增加。為了保證人民健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，開(kāi)展心血管疾病的研究和防治工作刻不容緩。二、多功能性干細(xì)胞2006年8月，日本科學(xué)家Shinya Yamanaka等成功誘導(dǎo)出小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem cell, iPS cell)后，短時(shí)間內(nèi)iPS相關(guān)研究已經(jīng)成為國(guó)際疾病研究的熱點(diǎn)。目前，iPS的相關(guān)研究已經(jīng)由體細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)轉(zhuǎn)向再生醫(yī)學(xué)的研究。iPS技術(shù)的成熟后，其多功能性逐漸被應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療人類損傷性或缺陷性疾病的研究中。一方面，利用產(chǎn)生的iPS細(xì)胞或組織器官對(duì)損傷或缺陷部位修復(fù)，將會(huì)大大降低一些器官移植等手術(shù)的費(fèi)用，甚至將可能通過(guò)合成藥物來(lái)有效治療這些疾?。涣硪环矫?，將會(huì)很大程度上造福于人類和社會(huì)，間接促進(jìn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，提高社會(huì)效益。目前，iPS細(xì)胞誘導(dǎo)方法有逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)法、慢病毒誘導(dǎo)法、小分子復(fù)合物誘導(dǎo)法、小分子蛋白復(fù)合物誘導(dǎo)法、PiggyBac轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)法。但是，目前，這些誘導(dǎo)方法分別存在致癌、致瘤風(fēng)險(xiǎn)以及誘導(dǎo)過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)。iPS研究技術(shù)仍需進(jìn)一步深入，以拓深其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，并推廣其應(yīng)用。三、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞治療心肌梗死的研究進(jìn)展心肌梗塞是心血管疾病的常發(fā)病，心肌梗塞的患者呈逐年增加趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類健康，目前其死亡率超過(guò)所有癌癥死亡率的總和。由于成年個(gè)體的心肌細(xì)胞通常不能再生，心臟移植成為治療重型心肌壞死的惟一有效途徑。但是由于供體心臟的嚴(yán)重匱乏，致使成千上萬(wàn)的心肌梗死患者在等待中死亡。因此心臟相關(guān)疾病的研究與治療是當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
心臟主要是由處于終末分化狀態(tài)的心肌細(xì)胞組成的，心肌細(xì)胞不能分裂和增殖。這意味著心肌細(xì)胞的損傷和凋亡后不能夠通過(guò)有效的心肌細(xì)胞分裂和增殖來(lái)彌補(bǔ)。許多心臟病都與心肌細(xì)胞數(shù)目減少相關(guān)，如心肌梗死、心力衰竭、原發(fā)性心肌病、心肌肥厚、蒽環(huán)霉素誘導(dǎo)的心肌中毒等。因此，要想維持心肌細(xì)胞數(shù)目的恒定，進(jìn)而維持心臟在結(jié)構(gòu)和功能上的完整性，最重要、最有效的途徑之一就是通過(guò)向心臟中移植干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)其分化為心肌細(xì)胞，來(lái)治療心肌缺損。胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞均能分化成多種器官和組織細(xì)胞，被稱為“萬(wàn)能細(xì)胞”，均可用來(lái)誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞來(lái)治療心臟相關(guān)疾病。目前為止，胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞應(yīng)用于心臟相關(guān)疾病治療的研究已比較深入，臨床上也有成功應(yīng)用案例；但胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞應(yīng)用上仍分 別存在倫理、道德問(wèn)題和誘導(dǎo)分化率低、難于鑒定、純化的問(wèn)題。而2006年最新誘導(dǎo)成功的iPS細(xì)胞，不涉及胚胎干細(xì)胞研究倫理道德問(wèn)題以及成體干細(xì)胞定向分化效率低的問(wèn)題，在再生醫(yī)療領(lǐng)域具有更廣闊的研究前景和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。短短幾年內(nèi)iPS相關(guān)研究已經(jīng)成為國(guó)際疾病研究的熱點(diǎn)。培育人類iPS細(xì)胞系可為許多退行性或損傷性疾病患者提供“個(gè)性化”的自體干細(xì)胞，也為治療帶來(lái)新的希望，對(duì)于相關(guān)疾病的藥物研發(fā)也有幫助。例如利用iPS細(xì)胞分化產(chǎn)生的心肌細(xì)胞或培育出新的心臟器官，通過(guò)細(xì)胞注射或器官移植來(lái)治療一些心臟病，將給廣大心血管疾病患者帶來(lái)希望，造福于人類社會(huì)，間接促進(jìn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。iPS細(xì)胞來(lái)源的干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)如下1)因心臟病發(fā)作導(dǎo)致?lián)p傷后，iPS能夠使心肌性能得到恢復(fù)。2)終止心臟結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步損傷。3)在心臟損傷位置組織再生。iPS細(xì)胞的成功獲得，為許多重大疾病的治療和再生醫(yī)學(xué)發(fā)展提供了一個(gè)誘人的前景。iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)可以用于心肌梗死等心臟中組織缺損疾病的治療。2009年7月，研究人員利用普通的成纖維細(xì)胞重新誘導(dǎo)將其轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞，治療心肌梗死造成的損傷，首次將誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于心臟疾病治療上。近期，以色列研究人員將皮膚細(xì)胞重新編碼后誘導(dǎo)成多功能干細(xì)胞，培育出可以跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。此外，哈佛大學(xué)干細(xì)胞研究所研究人員試圖通過(guò)兩種方法來(lái)治療心肌損傷相關(guān)疾病“其一是用一層心室肌肉細(xì)胞覆蓋心臟破損區(qū)域，讓它們逐漸生長(zhǎng)成為能正常工作的心臟組織；其二是把細(xì)胞注射進(jìn)破損區(qū)域，然后讓它們自行生長(zhǎng)?！蓖瑫r(shí)，他們計(jì)劃一年內(nèi)在不同動(dòng)物身上進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)，并預(yù)計(jì)五年內(nèi)應(yīng)用于臨床。但是，目前所使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPS細(xì)胞具有致癌風(fēng)險(xiǎn)。這一點(diǎn)極大地增加了 iPS的臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)，并限制了 iPS在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，并可能產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥狀。

發(fā)明內(nèi)容
如本文中所使用地，術(shù)語(yǔ)“iPS”與“誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞”可互換地使用，二者具有相同的含義。如本文中所使用地，術(shù)語(yǔ)“miRNA”與“microRNA”可互換地使用，二者具有相同的含義。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種microRNA-421抑制劑。
本發(fā)明的又一個(gè)目的在于，提供一種采用microRNA-421抑制劑制備多功能干細(xì)胞的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于，提供miciORNA-421抑制劑在制備用于治療心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途。 本發(fā)明的目的還在于，提供用于治療心臟疾病的新的藥物制劑或試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供microRNA-421抑制劑在體外誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞中的用途。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種microRNA-421抑制劑，所述mi croRNA-421抑制劑為包含mi croRNA-421反義核酸序列的核酸鏈或者其生物活性功能片段或變體，其核酸鏈堿基結(jié)構(gòu)中的核糖是2’ -甲氧基修飾的，并且其中所述的·microRNA-421反義核酸序列是5’ -GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU-3，。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，所述的核酸鏈的序列為5’ -GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU-3，。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備多功能干細(xì)胞的方法，所述方法包括使用上述microRNA-421抑制劑誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述microRNA-421抑制劑的濃度為120 200nM，優(yōu)選地為160nM。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，所述microRNA-421抑制劑同時(shí)調(diào)控0CT4、KLF4、S0X2和C-MYC四種轉(zhuǎn)錄因子。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了由上述方法制備的多功能干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了上述多功能干細(xì)胞在制備用于治療心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途。優(yōu)選地，所述心臟疾病是有心肌細(xì)胞壞死或心臟組織缺損癥狀的心臟疾病，優(yōu)選地，所述的心臟疾病選自心肌梗死和心力衰竭疾病。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了上述的microRNA-421抑制劑在制備用于治療心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途。優(yōu)選地，所述心臟疾病是有心肌細(xì)胞壞死或心臟組織缺損癥狀的心臟疾?。贿M(jìn)一步優(yōu)選地，所述的心臟疾病選自心肌梗死和心力衰竭疾病。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種用于治療心臟疾病的藥物制劑或試劑盒，其中包含治療有效量的上述多功能干細(xì)胞；優(yōu)選地，所述的藥物制劑或試劑盒中，多功能干細(xì)胞的含量為I X IO6 I X IO8個(gè)，優(yōu)選地為I X IO6個(gè)。此外，本發(fā)明提供了上述microRNA-421抑制劑在體外誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞中的用途。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)將microRNA-421抑制劑在注射至心肌梗死部位,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞梗死面積明顯減少，部分心肌功能得以恢復(fù)。microRNA (miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。到目前為止，在動(dòng)植物以及病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有4361個(gè)miRNA分子(Release 910，0ctober2006)。大多數(shù)miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇(cluster)的形式存在于基因組中(Lagos-Quintana et al, 2001 ；Lau et al, 2001)。本發(fā)明從一個(gè)全新的角度出發(fā)，利用Target scan、RNA22、RNA hybrids RNA base等軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)，分析出同時(shí)調(diào)控于小鼠誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞四種全能性因子0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC的microRNA(見(jiàn)圖2B中的熒光素酶檢測(cè)的結(jié)果)即當(dāng)加入microRNA-421抑制劑時(shí)，四種因子在細(xì)胞中的表達(dá)量上升，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生重編程過(guò)程。心臟中細(xì)胞分為心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞。而心肌成纖維細(xì)胞在非心肌細(xì)胞中占大部分。因此，我們利用microRNA-421抑制劑將心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成多功能干細(xì)胞，以此實(shí)現(xiàn)治療心肌梗死和心力衰竭疾病的目的。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)將心肌成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)成誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞，直接注射至心臟梗死的部位。誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞是將體細(xì)胞誘導(dǎo)成多功能干細(xì)胞,理論上,通過(guò)添加microRNA-抑制劑后會(huì)使體細(xì)胞中四種全能性因子0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC的表達(dá)量提高，出現(xiàn)重編程的過(guò)程。首先，本發(fā)明先利用miciORNA-421抑制劑將成年小鼠心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成多功能干細(xì)胞，避免了 iPS細(xì)胞移植至體內(nèi)致癌、致瘤的風(fēng)險(xiǎn)。
其次，本發(fā)明將miciORNA-421抑制劑注射至小鼠心肌梗死的部位，發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死面積減少。取6周大成年小鼠,制備心梗模型。注射microRNA-421抑制劑,每天注射一次，每次注射量為64mg/kg (按照小鼠重量注射)。注射三天后，首先，進(jìn)行超聲心動(dòng)檢測(cè)，測(cè)定小鼠心臟功能恢復(fù)程度。其次，取心臟，制備組織切片，計(jì)算小鼠心肌梗死面積變化。以上兩方面是本發(fā)明的重大創(chuàng)新之處，本發(fā)明提供的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞對(duì)心肌梗死的治療效果明顯提高。此外，本發(fā)明的microRNA-421抑制劑具有良好穩(wěn)定性及穿透細(xì)胞膜的特性，利用microRNA-421抑制劑治療心肌梗死疾病也具有明顯的療效，在臨床疾病治療上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。具體而言，本發(fā)明還包括以下幾方面的內(nèi)容I.利用miciORNA-421抑制劑將心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞將分離得到成年小鼠的心肌成纖維細(xì)胞傳代至24孔板中，每孔加入120-200nM，優(yōu)選地160nM的microRNA-421抑制劑，誘導(dǎo)iPS細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)步驟參考四種因子誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的步驟(Kazutoshi Takahashi 等人，2007, Nature protocols, 2 (12) :3081-3089)。通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miciORNA-421抑制劑誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞克隆數(shù)比四種因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)得到的iPS細(xì)胞克隆數(shù)明顯提高。2. microRNA-421抑制劑同時(shí)調(diào)控四種全能性因子0CT4、S0X2、KLF4、C_MYC來(lái)治療心肌梗死本發(fā)明具有以下的意義I)在臨床上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，可以通過(guò)將microRNA-421抑制劑制備成藥物來(lái)治療心肌梗死和心力衰竭等疾病。2)使用microRNA-421抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生多功能干細(xì)胞，不但避免了 iPS細(xì)胞的致癌、致瘤風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)使得誘導(dǎo)效率也明顯提高。四種因子病毒誘導(dǎo)得到的iPS細(xì)胞中，由于將四種外源的病毒介導(dǎo)入細(xì)胞，使四種因子在整合在宿主的基因組中，穩(wěn)定長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)，達(dá)到重編程的目的。3)本實(shí)驗(yàn)中，microRNA-421抑制劑是通過(guò)調(diào)控體內(nèi)的四種因子的表達(dá)量增高，避免了病毒對(duì)細(xì)胞的致癌、致瘤風(fēng)險(xiǎn)。4)本發(fā)明所使用的microRNA-421抑制劑具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及穿過(guò)細(xì)胞膜的能力，因此適用于注射等方式給藥。與一般的干細(xì)胞誘導(dǎo)劑相比，其可以在較低的給予量下，有效地達(dá)到干細(xì)胞誘導(dǎo)的效果。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖I為利用microRNA-421抑制劑將心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞的圖片。圖IA為對(duì)照組，未加入microRNA-421抑制劑。圖IB為加入microRNA-421抑制劑誘導(dǎo)后的細(xì)胞用堿性磷酸酶染色結(jié)果(顯藍(lán)色)。
圖2A為利用microRNA-421抑制劑誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞克隆數(shù)與四種病毒因子誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞克隆數(shù)的比較(6孔培養(yǎng)板)，其中I表示利用microRNA-421抑制劑誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的試驗(yàn)組，2表示利用四種病毒因子誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的試驗(yàn)組。圖2B為熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)microRNA-421調(diào)控四種因子的3’ -UTR區(qū)，圖中I為空白對(duì)照組，加入了 microRNA-421表達(dá)載體、pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒(購(gòu)買自PiOmega公司，貨號(hào)E2241)，螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值很低；圖2為陰性對(duì)照組，加入了 microRNA-421表達(dá)載體、pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒和PGL3空載體后，螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值(未加入四種因子)；圖中3表示加入了 pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒、mi croRNA-421表達(dá)載體和pGL3_0CT4載體的實(shí)驗(yàn)組；圖中4表示加入了 pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒、mi croRNA-421表達(dá)載體和pGL3_KLF4載體的實(shí)驗(yàn)組；圖中5表示加入了 pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒、mi croRNA-421表達(dá)載體和pGL3_S0X2載體的實(shí)驗(yàn)組；圖中6表示加入了 pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒、microRNA-421表達(dá)載體和pGL3_C_MYC載體的實(shí)驗(yàn)組。圖3是反映了 mi-iPS細(xì)胞(microRNA誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞)治療心肌梗死的能力的圖，其中圖中給出了 mi-iPS細(xì)胞治療小鼠心肌梗死疾病的FS(% )值。其中，“I/R”為缺血后再灌注，制備小鼠心肌梗死模型的方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)有兩個(gè)組，注射NC(陰性對(duì)照組，即Negative control)和注射mi_iPS細(xì)胞組，“Pre-1/R”組為制備缺血再灌模型前,兩組小鼠左心室短軸縮短率值，屬于正常范圍；“Post-I/R”表示，制備小鼠缺血再灌模型后，注射NC (陰性對(duì)照組)和注射mi-iPS細(xì)胞后，兩組小鼠的左心室短軸縮短率值，結(jié)果顯示，注射mi-iPS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的小鼠左室短軸縮短率明顯高于陰性對(duì)照組(NC組)，說(shuō)明注射mi-iPS細(xì)胞可顯著修復(fù)由心肌梗死導(dǎo)致的小鼠心肌損傷，提高小鼠心臟功能。圖4是反映了 microRNA-421抑制劑治療小鼠心肌梗死能力的圖。其中圖4a顯示小鼠心臟左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)，心梗建模后，注射抑制劑的實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照未注射抑制劑的對(duì)照組的LVIDd值小，說(shuō)明心肌梗死一定程度上被microRNA抑制劑修復(fù)；圖4b顯示了心梗建模后，注射抑制劑的實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照未注射抑制劑的對(duì)照組的小鼠左室收縮末期內(nèi)徑值變小，顯示小鼠心臟功能得以修復(fù)；圖4c顯示心梗建模后，加入抑制劑實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的心臟左室短軸縮短率FS%升高，心臟功能較對(duì)照組有明顯改善。其中，“I/R”為缺血后再灌注，制備小鼠心肌梗死模型的方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)有兩個(gè)組，注射NC(陰性對(duì)照組)和miR-421抑制劑組，“Pre_I/R”組為制備缺血再灌模型前，兩實(shí)驗(yàn)組正常小鼠左心室短軸縮短率值；“Post-I/R”表示，制備小鼠缺血再灌模型后，分別注射NC和miR-421抑制劑對(duì)小鼠心肌梗死修復(fù)后的左心室短軸縮短率值。圖中結(jié)果顯示，加入miR-421抑制劑的實(shí)驗(yàn)組小鼠左室短軸縮短率明顯高于陰性對(duì)照組(NC組中小鼠的心肌明顯損傷，F(xiàn)S%< 25% )，說(shuō)明miR-421抑制劑可以明顯修復(fù)由心肌梗死導(dǎo)致的小鼠心肌損傷，提聞左室心肌收縮功能。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。主要試劑與材料胎牛血清(FCS) ,DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于GIBCO公司；胰蛋白酶、EDTA、明膠、硫酸魚(yú)精蛋白(Protamine sulfate)購(gòu)于Sigma公司；小鼠白血病抑制因子(Mouse Lif因子)購(gòu)于Millipore 公司;TUNEL 及細(xì)胞凋亡檢測(cè)(Cell Death Detection) ;microRNA 抑制劑由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成并修飾。pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒購(gòu)自Promega公司，腺病毒表達(dá)載體(pAdeasy-lTM)購(gòu)于 Stratagene 公司。0CT4、KLF4、S0X2、C-MYC 四種因子的病毒載體購(gòu)自Addgene生物公司。Fugene HD transfect reagent購(gòu)自Roche生物公司。DAPI染色 液購(gòu)買自碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)C1006。堿性磷酸酶染液購(gòu)自Millipore公司，貨號(hào)SCR066。突光素酶檢測(cè)試劑盒(Dual-luciferase reporter assay system 試劑盒)購(gòu)買自Promega公司，貨號(hào)為T(mén)M040。pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒購(gòu)買自Promega公司，貨號(hào)E2241。采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為成年C57/BL小鼠，得自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。其余試劑均為可任意商購(gòu)的分析純。實(shí)施例I microRNA-421抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞本實(shí)施例從小鼠心臟組織中，分離心肌成纖維細(xì)胞，采用microRNA-421抑制劑來(lái)誘導(dǎo)該心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下取成年小鼠，在無(wú)菌條件下開(kāi)胸剪取心臟3顆，將心臟用pH 7. 4的PBS漂洗三次，然后，置于冰上，加入ImL的O. 08%胰酶和I %膠原酶的DMEM消化液，50mL的DMEM消化液包含2mL的O. 08%胰酶和2mL的1%膠原酶II (胰酶和膠原酶II分別訂購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司及sigma公司)先用剪刀和刀片將組織切碎成l_2mm的小塊。然后加入5mL消化液(50mL的DMEM消化液包含2mL的O. 08%胰酶和2mL的I %膠原酶II)消化，37°C下，在搖床中恒溫消化4-6分鐘(搖床轉(zhuǎn)速為60r/min),然后用槍頭勻速反復(fù)輕微吹打兩次,室溫靜置2min，將上清移至新的50mL離心管中(預(yù)先加入2mL的FBS)，再按相同的方法將剩余的組織塊消化完，收集并合并所有的上清，800rpm/min離心10分鐘，棄上清，用20% FBS的DMEM培養(yǎng)液洗滌一次，離心后，去上清，用適量8-10mL含20 % FBS的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，200目的細(xì)胞篩篩選后，混勻鋪至IOcm培養(yǎng)皿上，置于含37°C培養(yǎng)箱中在5% CO2下培養(yǎng)。2小時(shí)后，換液此時(shí)，成纖維細(xì)胞由于貼壁較快，心肌細(xì)胞貼壁慢，換液后，培養(yǎng)皿中主要是心肌成纖維細(xì)胞，然后過(guò)夜培養(yǎng)，至3-4天細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用于做誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備好6孔板，鋪O. 1%的明膠(稱取O. Ig的明膠，溶解于IOOmL的水中，0.25 μ m的細(xì)胞濾膜過(guò)濾后使用)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，置于超凈臺(tái)中吹干，再將心肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞傳代至6孔板中，使用20 %的DMEM培養(yǎng)基，置于5 % CO2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，每孔加入 160nM 的 microRNA-421 抑制劑(序列為 5’-GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU_3’，堿基的核糖是2’-甲氧基化修飾的，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)。誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生，具體實(shí)驗(yàn)步驟參見(jiàn) Kazutoshi Takahashi 等人，2007, Nature protocols, 2 (12) :3081-3089 誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞即mi-iPS細(xì)胞產(chǎn)生，該組為實(shí)驗(yàn)組(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1B)，對(duì)照組中為加入 microRNA-421 抑制劑的陰性對(duì)照(negative control)(見(jiàn)圖 1A)。圖2A為利用microRNA-421抑制劑誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞克隆數(shù)與四種病毒因子誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞克隆數(shù)的比較；圖中I為四種因子誘導(dǎo)的iPSC克隆數(shù)四種因子誘導(dǎo)iPSC是通過(guò)加入0CT4、KLF4、S0X2、C-MYC四種因子的病毒(病毒為載體包裝所得，步驟如下。載體購(gòu)自Addgene生物公司)誘導(dǎo)得到 。四種因子的病毒是在293T細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，用FugeneHD transfect reagent (購(gòu)自Roche生物公司)將四種因子的載體和病毒包裝載體分別共轉(zhuǎn)染，48h后，收集病毒上清，獲得四種因子的病毒(Kazutoshi Takahashi等人.2007)。圖中2為microRNA-421抑制劑誘導(dǎo)的iPSC克隆形成。誘導(dǎo)試驗(yàn)與圖IA中實(shí)驗(yàn)條件相同，通過(guò)兩組試驗(yàn)中形成的iPSC克隆數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)加入microRNA-421抑制劑的實(shí)驗(yàn)組中iPSC克隆數(shù)目明顯提高(見(jiàn)圖2A)。圖2B為熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)microRNA-421對(duì)四種因子的3’ -UTR區(qū)的調(diào)控(實(shí)驗(yàn)步驟參考 Promega 公司 Dual-luciferase reporter assay system 試劑盒，貨號(hào)為T(mén)M040)。圖2B其中橫坐標(biāo)I為對(duì)照組，加入了 microRNA-421表達(dá)載體、pRL_tk內(nèi)參質(zhì)粒，螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值很低；2為陰性對(duì)照組，加入了 miciORNA-421表達(dá)載體、pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒和pGL3空載體后所測(cè)得的，螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值(未加入四種因子)；圖28中3表示加入了 pRL-tk內(nèi)參質(zhì)粒、microRNA-421表達(dá)載體和pGL3-0CT4載體的實(shí)驗(yàn)組；圖中4表示加入了 pRL_tk內(nèi)參質(zhì)粒、mi croRNA-421表達(dá)載體和pGL3-KLF4載體的實(shí)驗(yàn)組；圖中5表示加入了 pRL_tk內(nèi)參質(zhì)粒、mi croRNA-421表達(dá)載體和pGL3_S0X2載體的實(shí)驗(yàn)組；圖中6表示加入了 pRL_tk內(nèi)參質(zhì)粒、microRNA-421表達(dá)載體和PGL3-C-MYC載體的實(shí)驗(yàn)組。圖2B中3_6的螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值明顯降低，miRNA-421通過(guò)抑制0CT4、KLF4、S0X2、C-MYC基因的3’ -UTR區(qū)而抑制四種基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-421同時(shí)調(diào)控0CT4、KLF4、S0X2、C-MYC四種全能性因子。實(shí)施例2小鼠心肌梗死模型的制備和鑒定本實(shí)施例制備并鑒定了小鼠心肌梗死模型。I)采用阻塞左冠狀動(dòng)脈法誘導(dǎo)小鼠發(fā)生心肌梗死，由此建立小鼠心肌梗死模型。小鼠麻醉后背位固定于實(shí)驗(yàn)用木板上。心電圖監(jiān)測(cè)。頸部正中切開(kāi)氣管并插管，連動(dòng)物人工呼吸機(jī)，于第四肋間開(kāi)胸，小心提起心包并剪開(kāi)，充分暴露心臟、血管。在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，于左心耳根部下方處進(jìn)針，進(jìn)針深度O. 5mm ；以6/0縫線穿過(guò)心肌表層，在肺動(dòng)脈圓椎旁出針；待心電圖恢復(fù)穩(wěn)定后，予以結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)。以I、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高大于O. ImV并持續(xù)O. 5h以上作為結(jié)扎成功的標(biāo)志。清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭注射器抽吸氣體關(guān)閉胸腔。一定時(shí)間后(本實(shí)驗(yàn)采用術(shù)后缺血45min再灌注)再灌注，來(lái)制備小鼠心肌梗死模型(小鼠缺血再灌模型簡(jiǎn)稱I/R模型)。2)小鼠心肌梗死模型鑒定檢測(cè)心臟功能的方法(I)測(cè)定心肌梗死面積切取心臟標(biāo)本，將左室沿心臟縱軸均勻切成薄片(7μπι)，置于NBT液(氯化硝基四氮唑藍(lán)0. 06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存)中37°C水浴15分鐘。壞死區(qū)因無(wú)脫氫酶不染色，未壞死區(qū)因含有脫氫酶而染成藍(lán)色。在解剖顯微鏡下小心將染色區(qū)與未染色區(qū)分離并分別用電子天平稱重，梗死面積大小用梗死區(qū)重量與左室重量百分比表/Jn ο(2)測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡情況運(yùn)用TUNEL、細(xì)胞凋亡ELISA檢測(cè)試劑盒(Cell Death Detection ELISA)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡用蛋白酶K消化(消化樣品為取自心肌梗死模型小鼠心臟的組織切片，用來(lái)觀察心肌細(xì)胞凋亡情況。蛋白酶K的使用濃度20 μ g/mL,使用IOmMTris-HCl溶解，pH為7. 4-8. 0，購(gòu)買自Hoffmann-La Roche有限責(zé)任公司。組織切片脫蠟后，使用蛋白酶K消化，樣品置于21°C -37°C處理15min-30min即可)以暴露DNA，在末端轉(zhuǎn)移酶(末端轉(zhuǎn)移酶Terminal transferase, TdT (購(gòu)買自碧云天生物技術(shù)研究所)，是一種無(wú)需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA分子的3'羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNA分子均可作為T(mén)dT的底物)的介導(dǎo)下進(jìn)行，其中用熒光素標(biāo)記的dUTP摻入到凋亡細(xì)胞的雙鏈或單鏈DNA的3’ OH末端(使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，·按照試劑盒廠商提供的產(chǎn)品說(shuō)明來(lái)進(jìn)行，所述的試劑盒用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-0H末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，呈深棕色，特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA斷裂，因而沒(méi)有3’-0H形成，很少能夠被染色。)，在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記了熒光素-dUTP的細(xì)胞(試驗(yàn)中使用的是激光共聚焦顯微鏡，拍攝照片的激發(fā)波長(zhǎng)是790nm，放大100倍)。凋亡細(xì)胞核為綠色熒光，正常細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。計(jì)算各組細(xì)胞凋亡指數(shù)(Al)，Al =凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)(每個(gè)高倍鏡視野)，每張玻片取5個(gè)高倍鏡視野，取其平均值。制備組織切片，然后進(jìn)行TUNEL染色，使用激光共聚焦顯微鏡，觀察并拍攝細(xì)胞凋亡狀況，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)Al =凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。(3)測(cè)定心臟功能有兩種檢測(cè)心臟功能的方法I.超聲心動(dòng)圖參數(shù)的測(cè)定M-型超聲心動(dòng)圖檢查心底波群及心室波群測(cè)定左心房?jī)?nèi)徑(LA)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、室間隔厚度(IVSd)。計(jì)算出每搏輸出量(SV)、每分輸出量(CO)、心臟左室射血分?jǐn)?shù)(EF)及短軸縮短率(FS%，左室短軸縮短率(FS% )是左心室收縮功能指標(biāo)參數(shù))。心臟左室短軸縮短率FS%大小與心臟的左室收縮功能成正比，可以直接指示心臟的功能強(qiáng)弱。 FS%= [ (LVIDd-LVIDs) /LVIDd] X 1002.在心尖四腔切面上，分別將取樣容積置于二尖瓣口、左室流出道口，測(cè)量二尖瓣口舒張?jiān)缙谘髁魉貳峰、舒張晚期血流流速A峰并計(jì)算出E峰/A峰比值。檢測(cè)的樣品是注射了 I X IO6個(gè)mi-iPS細(xì)胞/64mg/kg microRNA-421抑制劑的心肌梗死模型小鼠，用超聲心動(dòng)儀測(cè)量E峰與A峰。結(jié)合心電圖測(cè)量左室等容舒張時(shí)間(IVRT)、左室等容收縮時(shí)間(IVCT)、左室射血時(shí)間(ET)。計(jì)算Tei指數(shù)=IVRT+IVCT/ET。計(jì)量資料連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。Tei指數(shù)又稱為心肌做功指數(shù)(Myocardial performance index,MPI),能綜合反映心室收縮機(jī)舒張功能，主要用于研究擴(kuò)張型心肌病左室功能的研究。
本文主要通過(guò)左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)計(jì)算出左室短軸縮短率FS%來(lái)檢測(cè)給藥前后小鼠心肌梗死的修復(fù)程度及心臟的功能情況。實(shí)施例3使用mi-iPS細(xì)胞治療小鼠心肌梗死疾病，觀察小鼠心肌梗死面積變化及心臟功能修復(fù)程度。選取六周大的C57小鼠，具體按照實(shí)施例2步驟(I)，制備心肌梗死模型小鼠。以五只小鼠作為對(duì)照組，以及用五只小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，在模型小鼠制備24小時(shí)候，在實(shí)驗(yàn)組的小鼠中的心肌梗死處注射I X IO6個(gè)mi-iPS細(xì)胞。I周后及I個(gè)月后，分別小鼠心肌梗死的面積變化及使用超生心動(dòng)儀檢測(cè)小鼠心肌功能修復(fù)程度。一個(gè)月后小鼠心臟功能的變化(FS%{t)見(jiàn)圖 3。圖3中提供的數(shù)據(jù)是一個(gè)月后的觀察結(jié)果。實(shí)施例4使用microRNA-421抑制劑來(lái)治療心肌梗死。觀察小鼠心肌梗死面積變化及心臟功能修復(fù)程度。 準(zhǔn)備對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組六周大的C57小鼠各5只，使用超聲心動(dòng)儀檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。將實(shí)驗(yàn)組小鼠制備缺血再灌心梗模型(見(jiàn)實(shí)施例2步驟)，24h后，將microRNA-421抑制劑(64mg/kg)注射至心臟梗死處。每天注射一次，注射三天，三周后制備切片觀察小鼠心肌梗死的面積變化及使用超生心動(dòng)儀檢測(cè)小鼠心肌功能修復(fù)程度。通過(guò)超聲心動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及短軸縮短率(FS%)，觀察microRNA-421抑制劑對(duì)小鼠心肌梗死疾病的修復(fù)程度，見(jiàn)圖4。以上所有數(shù)據(jù)均為平均值土SEM，4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種microRNA-421抑制劑，所述microRNA-421抑制劑為包含microRNA-421反義核酸序列的核酸鏈或者其生物活性功能片段或變體，其結(jié)構(gòu)中的核糖是2’ -甲氧基修飾的，并且其中所述的microRNA-421反義核酸序列是5， -GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU-3，。
2.如權(quán)利要求I所述的miciORNA-421抑制劑，其中所述的核酸鏈的序列為5， -GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU-3，。
3.一種制備多功能干細(xì)胞的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的microRNA-421抑制劑將心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成多功能干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中所加入的microRNA-421抑制劑的濃度為120 200nM，優(yōu)選地為160nM。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述microRNA-421抑制劑同時(shí)調(diào)控 0CT4、KLF4、SOX2和C-MYC四種轉(zhuǎn)錄因子。
6.按照權(quán)利要求3-5任一所述的方法得到的多功能干細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6所述的多功能干細(xì)胞在制備用于治療心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途；優(yōu)選地所述心臟疾病是有心肌細(xì)胞壞死或心臟組織缺損癥狀的心臟疾?。贿M(jìn)一步優(yōu)選地，所述的心臟疾病選自心肌梗死和心力衰竭疾病。
8.權(quán)利要求I或2所述的miciORNA-421抑制劑在制備用于治療心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途；優(yōu)選地，其中所述心臟疾病是有心肌細(xì)胞壞死或心臟組織缺損癥狀的心臟疾??；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的心臟疾病選自心肌梗死和心力衰竭疾病。
9.一種用于治療心臟疾病的藥物制劑或試劑盒，其特征在于所述藥物制劑或者試劑盒包含治療有效量的權(quán)利要求4所述的多功能干細(xì)胞；優(yōu)選地，所述藥物制劑或試劑盒中多功能干細(xì)胞的含量為I X IO6 I X IO8個(gè)，優(yōu)選地為I X IO6個(gè)。
10.權(quán)利要求I或2所述的microRNA-421抑制劑在體外誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種采用microRNA-421抑制劑，利用其制備多功能干細(xì)胞的方法，其所制備的多功能干細(xì)胞，該抑制劑和干細(xì)胞在制備治療心臟疾病的藥物中的應(yīng)用，以及所述抑制劑在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞中的用途。本發(fā)明避免了以往利用病毒誘導(dǎo)iPS細(xì)胞所導(dǎo)致的致癌、致瘤風(fēng)險(xiǎn)；首先，使用microRNA抑制劑誘導(dǎo)出mi-iPS細(xì)胞，并用其治療小鼠心肌梗死疾病，使梗死后的小鼠心臟功能得以修復(fù)，避免了以往病毒誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞治療所導(dǎo)致的致癌、致瘤風(fēng)險(xiǎn)。其次，本發(fā)明首次使用microRNA抑制劑來(lái)治療小鼠心肌梗死疾病，取得了較顯著的治療效果，將microRNA抑制劑開(kāi)發(fā)成藥物來(lái)治療小鼠心肌梗死疾病將在臨床具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，這也是本發(fā)明的重大創(chuàng)新之處。
文檔編號(hào)A61K35/12GK102888401SQ20111045931
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者李培峰, 李娜, 龍波, 王昆 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所