專利名稱：銀蓮花屬植物中一種抗腫瘤皂苷及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及從銀蓮花屬植物中提取分離得到一種具有抗腫瘤活性的化合物，及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是一種常見且發(fā)病率和死亡率都在逐年上升的疾病。然而目前尚無(wú)有效的方法和藥物可以治愈，因此通過開發(fā)天然產(chǎn)物尋找一種安全毒副作用小的抗癌藥物成為目前的熱點(diǎn)。銀蓮花屬(Anemone)為毛茛科(Ranunculaceae)中最大的一個(gè)屬，共有植物150 余種，世界各地均有分布。銀蓮花屬植物在我國(guó)共有50余種，除海南島外，其他各省均有分布。銀蓮花屬植物在我國(guó)有悠久的藥用歷史，在民間該屬植物的藥用種類較多，功效廣泛。常用種類如下阿爾泰銀蓮花(Anemone altaica),黑水銀蓮花(A. amurensis), 西南銀蓮花(A. davidii),細(xì)莖銀蓮花(A. rossii),毛果銀蓮花(A. bacalensis),展毛銀蓮花(A. demissa), 二歧銀蓮花(A. dichotoma),林蔭銀蓮花(A. flaccida),打破碗花花(A. hupehensis)，秋牡丹(A. hupehensis var. japonica)，多被銀蓮花(A. raddeana)， 反萼銀蓮花(A. refIexa),草玉梅(A. rivularis),小花草玉梅(A. rivularis var. flore-minore)，大火草(A. tomentosa)，條葉銀蓮花(A. trullifolia var. linearis),野棉花(A. vitifolia)等。銀蓮花屬植物所含的化學(xué)成分主要有三萜皂苷類、香豆素類、黃酮類、甾體類、酚類及有機(jī)酸類等。其中三萜及其苷類在銀蓮花屬植物中廣泛大量存在，是銀蓮花屬植物中研究最為深入的一類。其苷元主要為齊墩果酸，常春藤皂苷元，夾竹桃酸等。 本屬植物主要功效有祛風(fēng)濕，消癰腫，抗炎，解熱，鎮(zhèn)痛，抗腫瘤，抗驚厥等?，F(xiàn)有的研究資料表明這些植物大多含有三萜皂苷類成分。目前已經(jīng)從銀蓮花屬植物中分離得到100余個(gè)三萜皂苷類化合物，進(jìn)一步的藥理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，其中大多數(shù)都具有很好的抗腫瘤效果O

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種銀蓮花屬植物中一種抗腫瘤皂苷及其制備方法和用途， 從銀蓮花屬多種植物中提取制備AR17的方法及其在治療腫瘤疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種抗腫瘤皂苷，其分子式為C47H76O16，化學(xué)名稱為3-0-α -L-鼠李糖基-(I — 2)-[i3_D-葡萄糖基-(I — 4)]-a-L_阿拉伯糖基-齊墩果酸(oleanolic ac id-3-0- a -L-rhamanopyranosyI- (I — 2) - [ β -D-glucopyranosyl-(I — 4) ] - a -L-arabinopyr anoside)。簡(jiǎn)稱 AR17。本發(fā)明還涉及一種通過堿水解的方式從毛茛科銀蓮花屬多種植物中提取制備具有抗腫瘤活性的一種化合物AR17的方法。本發(fā)明中AR17的提取制備工藝步驟如下(I)將銀蓮花屬多種藥用植物的根及根莖、地上的莖、葉、花或果實(shí)等藥材部位粉碎，粉碎粒度為5-30目。所述的銀蓮花屬植物選自多被銀蓮花(Anemone raddeana)、黑水銀蓮花(A. amurensis)、細(xì)莖銀蓮花(A. rossii)、毛果銀蓮花(A. bacalensis)、西南銀蓮花(A. davidii)或凍地銀蓮花(A. rupestris)等。(2)藥材在提取前用提取溶劑乙醇，水或者乙醇?jí)A溶液，堿水溶液按照藥材溶劑 =Ikg 4-12L進(jìn)行浸泡l_12h，其中乙醇濃度為20% -90 %，堿濃度為0. 05-2. 0M，所用堿為NaOH或KOH或Na2CO3或K2CO3或Na2S或K2S或NH4OH的水溶液。(3)藥材經(jīng)常壓冷凝加熱回流提取2-4次，每次l-3h，合并各次提取液。(4)藥材的乙醇提取液回收乙醇或水提取液濃縮至一定體積，加入上述堿溶液，加熱并不斷攪拌水解1-6小時(shí)，加入2%-3%鹽酸調(diào)節(jié)PH值至中性，或者此步不調(diào)中性，然后按藥材樹脂重量比為I : 2-3上大孔樹脂柱HPD300，HPD400，HPD450或DlOl型，靜態(tài)吸附
4-10h，再用蒸餾水，以Ikg藥材20-25L蒸餾水，洗脫速度為O. 8-lL/h進(jìn)行洗脫除雜，然后再以50% -90%乙醇洗脫，所用乙醇量為以Ikg藥材20-25L乙醇，洗脫速度為O. 5-0. 8L/ h進(jìn)行洗脫除雜收集乙醇洗脫液,回收乙醇。(5)藥材也可以采用直接堿乙醇液或堿水提取，堿乙醇提取液回收乙醇，或者堿水提取液濃縮至一定體積，加入2%-3%鹽酸調(diào)節(jié)PH值至中性，或者此步不調(diào)中性，然后按4) 項(xiàng)相同操作。(6)將4)或5)所得產(chǎn)物通過硅膠柱色譜進(jìn)一步分離純化，以乙酸乙酯甲醇水比例6-11 O. 5-2 O. 05-0. 2為流動(dòng)相洗脫，通過TLC檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物AR17，所用TLC條件為展開劑為氯仿甲醇水=13 7 I時(shí)目標(biāo)產(chǎn)物Rf為O. 35-0. 5，收集洗脫液，回收溶劑。(7)也可將3)所得的提取液回收溶劑后直接上硅膠柱色譜，按6)操作。(8)將上述各種不同提取分離方法得到的產(chǎn)物用乙酸乙酯甲醇水= 6-11 O. 5-2 O. 05-0. 2，或者乙醇甲醇=8-12 3-1 或者甲醇水=8-10 2-0.1 或者乙醇水=1-9 9-1重結(jié)晶，得到純度高于90%的AR17。此處需要說明的是，本發(fā)明的關(guān)鍵之處在于堿水解，經(jīng)本研究表明，堿水解可以適用于樣品提取、富集或純化中的任一步驟，所用堿為NaOH或KOH或Na2CO3或K2CO3或Na2S 或K2S或NH40H的水溶液，水解用的堿水或堿乙醇溶液的堿濃度為0. 05-2. 0M。本發(fā)明的特點(diǎn)是，在所采用的AR17提取制備工藝參數(shù)下，AR17收率高，而且經(jīng)過關(guān)鍵性的堿水解步驟后AR17的含量顯著增加。在治療腫瘤疾病時(shí)，本發(fā)明制備得到的AR17可以單獨(dú)使用，也可以和其它藥物輔料混合后配制成不同劑型再使用。本發(fā)明的藥理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，AR17對(duì)人肝癌細(xì)胞H印G2，人食管癌細(xì)胞 Eca_109，人口腔表皮樣癌細(xì)胞KB，人肝癌細(xì)胞H印3B，人肺癌A549，人膀胱癌細(xì)胞5637等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，提示可以用于腫瘤治療。該方法簡(jiǎn)單易行，穩(wěn)定可靠，收率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)，并且采用本方法藥材經(jīng)過直接堿水解提取或常規(guī)提取再經(jīng)過堿水解以后，能夠使藥材中其他皂苷轉(zhuǎn)化為AR17，從而使得目標(biāo)皂苷AR17含量大幅增高近5倍。體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AR17對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用?？梢宰鳛榭鼓[瘤藥物制劑的原料。


圖I 為 ARl7 的 1H-NMR 譜圖。圖2 為 ARl7 的 13C-NMR 譜圖。圖3 為 ARl7 的 DEPT 譜圖。圖4 為 AR17 的 H-Hcosy 譜圖。圖5 為 ARl7 的 HMBC 譜圖。圖6 為 ARl7 的 HMQC 譜圖。
具體實(shí)施例方式一、AR17 制備皂苷AR17制備實(shí)例一粉碎500g多被銀蓮花根莖，過10目篩，加入8倍量O. 2M的65%乙醇?xì)溲趸c堿溶液，浸泡6h后，回流提取三次(每次加醇量8倍，8倍，8倍)，每次I. 5h，合并提取溶液， 回收至無(wú)醇味，藥液用蒸餾水適當(dāng)稀釋，用HPD-400大孔樹脂吸附5h，所用樹脂量為lkg，先用12L蒸餾水，以lL/h速度洗脫除雜，再用12L 80%乙醇以O(shè). 8L/h速度洗脫，收集80%乙醇洗脫部分，旋干，上硅膠柱，以乙酸乙酯甲醇水=65 30 8洗脫，此步洗脫過程通過TLC監(jiān)測(cè)，收集AR17部分，旋干，用乙醇甲醇=6 I重結(jié)晶，所得產(chǎn)物AR17 4.7g，純度為95. 6%。皂苷AR17制備實(shí)例二粉碎500g多被銀蓮花藥材，過10目篩，加入6倍量O. 3M的50%乙醇?xì)溲趸c堿溶液，浸泡IOh后，回流提取三次出倍，6倍，6倍)，每次2h，合并提取溶液，以2 %鹽酸調(diào)中性，回收至無(wú)醇味，藥液用蒸餾水適當(dāng)稀釋，用DlOl大孔樹脂吸附吸附3h，所用樹脂量為 2kg，先用IOL蒸餾水，以O(shè). 8L/h速度洗脫除雜，洗至無(wú)色，再用12L 80%乙醇以O(shè). 5L/h速度洗脫，收集80%乙醇洗脫部分，旋干，上硅膠柱，以乙酸乙酯甲醇水=70 : 30 : 7洗脫，此步洗脫過程通過TLC監(jiān)測(cè)，收集AR17部分，旋干，用乙醇甲醇=3 I重結(jié)晶，所得產(chǎn)物AR17 6. 0g，純度為92. 3%。皂苷AR17制備實(shí)例三粉碎500g黑水銀蓮花根莖，過16目篩，加入5倍量80%乙醇溶液，浸泡12h后， 回流提取三次(5倍，5倍，5倍)，每次lh，合并提取溶液，回收至無(wú)醇味，加入NaOH，制成
I.5MNa0H提取液，80度加熱3h，并不斷攪拌。藥液用蒸餾水適當(dāng)稀釋，用HPD-300大孔樹脂吸附8h，所用樹脂量為I. 5kg，先用IlL蒸餾水，以O(shè). 9L/h速度洗脫除雜，再用12. 5L 80% 乙醇以O(shè). 6L/h速度洗脫，收集80%乙醇洗脫部分，旋干，上硅膠柱，以乙酸乙酯甲醇水 =6 O. 5 I洗脫，收集洗脫部分，所得產(chǎn)物AR17 5. 8g，純度為91.6%。皂苷AR17制備實(shí)例四粉碎500g多被銀蓮花藥材，過10目篩，加入10倍量O. 5M的KOH水溶液，浸泡IOh 后，加熱提取三次(10倍，10倍，10倍)，每次2h，合并提取溶液，以2%鹽酸調(diào)中性，減壓除去藥液中部分水后，用DlOl大孔樹脂吸附吸附3h，所用樹脂量為2. 5kg，先用12L蒸餾水， 以O(shè). 8L/h速度洗脫除雜，洗至無(wú)色，再用12L 80%乙醇以O(shè). 5L/h速度洗脫，收集80%乙醇洗脫部分，旋干，上硅膠柱，以乙酸乙酯甲醇水=80 20 7洗脫，此步洗脫過程通過 TLC監(jiān)測(cè)，收集AR17部分，旋干，用乙醇水=6 I重結(jié)晶，所得產(chǎn)物AR17 5.5g，純度為 90. 3%。皂苷AR17制備實(shí)例五粉碎500g細(xì)莖銀蓮花根莖，過10目篩，加入12倍量水溶液，浸泡IOh后，回流提取三次(12倍，12倍，12倍)，每次2h，合并提取溶液，減壓除去藥液中部分水后，加入Κ0Η, 制成1MK0H藥液，80度加熱3h，用HPD400大孔樹脂吸附吸附5h，所用樹脂量為2kg，先用 12L蒸餾水，以lL/h速度洗脫除雜，洗至無(wú)色，再用IOL 80%乙醇以0.6L/h速度洗脫，收集80%乙醇洗脫部分，旋干，上硅膠柱，以乙酸乙酯甲醇水=90 10 7洗脫，此步洗脫過程通過TLC監(jiān)測(cè)，收集AR17部分，旋干，用乙醇水=6 I重結(jié)晶，所得產(chǎn)物AR17
5.2go 純度為 93.8%。皂苷AR17制備實(shí)例五粉碎500g多被銀蓮花根莖，過20目篩，加入8倍量O. 2M的70%乙醇?xì)溲趸c堿溶液，浸泡6h后，回流提取三次(每次加醇量8倍，8倍，8倍)，每次I. 5h，合并提取溶液，回收至無(wú)醇味，藥液以2%鹽酸調(diào)中性，蒸干，上硅膠柱，以乙酸乙酯甲醇水=65 30 8 洗脫，此步洗脫過程通過TLC監(jiān)測(cè)，收集AR17部分，旋干，用乙醇甲醇=6 I重結(jié)晶，得到產(chǎn)物5. Ig AR17，純度為92. 6%。皂苷AR17的核磁共振光譜數(shù)據(jù)如下表I 皂苷 AR17 的 13C-NMR 波譜數(shù)據(jù)(δ in C5D5N)
權(quán)利要求
1.銀蓮花屬植物中一種抗腫瘤皂苷，其特征在于該皂苷的化學(xué)名稱為3-0-a -L-鼠李糖基-(I — 2)_[ β -D-葡萄糖基-(I — 4)]-a -L-阿拉伯糖基_齊墩果酸，以下簡(jiǎn)稱 AR17，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示
2.一種如權(quán)利要求I所述的抗腫瘤皂苷的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)將銀蓮花屬藥用植物的根及根莖、地上的莖、葉、花或果實(shí)等藥材部位粉碎；2)藥材在提取前用提取溶劑進(jìn)行浸泡l_12h，所述的提取溶劑為乙醇，水或者乙醇?jí)A溶液，堿水溶液，藥材溶劑的比例為Ikg 4-12L，其中乙醇濃度為20%-90%，堿濃度為O.05-2. OM ；3)浸泡后的藥材經(jīng)常壓冷凝加熱回流提取2-4次，每次l_3h，合并各次提取液；4)將3)所得的提取液回收溶劑后直接上硅膠柱色譜，進(jìn)一步分離純化，以乙酸乙酯 甲醇水比例6-11 O. 5-2 O. 05-0. 2為流動(dòng)相洗脫，通過TLC檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物AR17，收集洗脫液，回收溶劑；5)將產(chǎn)物重結(jié)晶，即得。
3.—種如權(quán)利要求I所述的抗腫瘤皂苷的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)將銀蓮花屬藥用植物的根及根莖、地上的莖、葉、花或果實(shí)等藥材部位粉碎；2)藥材在提取前用提取溶劑進(jìn)行浸泡l_12h，所述的提取溶劑為乙醇?jí)A溶液，堿水溶液，藥材溶劑的比例為Ikg 4-12L，其中乙醇濃度為20% _90%，堿濃度為:0. 05-2. OM ；3)浸泡后的藥材經(jīng)常壓冷凝加熱回流提取2-4次，每次l_3h，合并各次提取液；4)藥材的堿乙醇提取液回收乙醇或堿水提取液濃縮至一定體積，加入2%-3%鹽酸調(diào)節(jié)PH值至中性，或者此步不調(diào)中性，然后按藥材樹脂重量比為I : 2-3上大孔樹脂柱， 靜態(tài)吸附4-10h，再用蒸餾水，以Ikg藥材20-25L蒸餾水，洗脫速度為O. 8-lL/h進(jìn)行洗脫除雜，然后再以50% -90%乙醇洗脫，所用乙醇量為以Ikg藥材20-25L乙醇，洗脫速度為O.5-0. 8L/h進(jìn)行洗脫收集乙醇洗脫液，回收乙醇；5)將4)所得產(chǎn)物通過硅膠柱色譜進(jìn)一步分離純化，以乙酸乙酯甲醇水比例 6-11 O. 5-2 O. 05-0. 2為流動(dòng)相洗脫，通過TLC檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物AR17，收集洗脫液，回收溶劑；6)將產(chǎn)物重結(jié)晶，即得。
4.一種如權(quán)利要求I所述的抗腫瘤皂苷的制備方法，其特征在于，包括如下步驟I)將銀蓮花屬藥用植物的根及根莖、地上的莖、葉、花或果實(shí)等藥材部位粉碎；2)藥材在提取前用提取溶劑進(jìn)行浸泡l_12h，所述的提取溶劑為乙醇或水，藥材溶劑的比例為Ikg 4-12L，其中乙醇濃度為20% -90% ；3)浸泡后的藥材經(jīng)常壓冷凝加熱回流提取2-4次，每次l_3h，合并各次提取液；4)藥材的乙醇提取液回收乙醇或水提取液濃縮至一定體積，加入堿溶液，堿濃度為O.05-2. 0M，加熱并不斷攪拌水解1-6小時(shí)，加入2% -3%鹽酸調(diào)節(jié)PH值至中性，或者此步不調(diào)中性，然后按藥材樹脂重量比為I : 2-3上大孔樹脂柱，靜態(tài)吸附4-10h，再用蒸餾水，以Ikg藥材20-25L蒸餾水，洗脫速度為O. 8-lL/h進(jìn)行洗脫除雜，然后再以50% -90% 乙醇洗脫，所用乙醇量為以Ikg藥材20-25L乙醇，洗脫速度為O. 5-0. 8L/h進(jìn)行洗脫除雜收集乙醇洗脫液，回收乙醇。5)將4)所得的堿水解提取液回收溶劑后直接上硅膠柱色譜，或堿水解液過大孔樹脂后的的洗脫液回收溶劑后上硅膠柱色譜，進(jìn)一步分離純化，以乙酸乙酯甲醇水比例 6-11 O. 5-2 O. 05-0. 2為流動(dòng)相洗脫，通過TLC檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物AR17，收集洗脫液，回收溶劑；6)將產(chǎn)物重結(jié)晶，即得。
5.如權(quán)利要求2-4任何一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述的銀蓮花屬藥用植物選自多被銀蓮花Anemone raddoana、黑水銀蓮花A. &11111代11818、細(xì)莖銀蓮花A. rossii、毛果銀蓮花A. bacalensis、西南銀蓮花A. davidii或凍地銀蓮花A. rupestris。
6.如權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中所述的大孔樹脂柱為HPD300，HPD400，HPD450或DlOl型；所述的TLC條件為展開劑為氯仿甲醇水= 13 : 7 : I。
7.如權(quán)利要求2-4任何一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述的重結(jié)晶所選用的溶劑為乙酸乙酯甲醇水=6-11 O. 5-2 O. 05-0. 2，或者乙醇甲醇=8-12 3-1或者甲醇水=8-10 2-0. I或者乙醇水=1-9 9-1。
8.如權(quán)利要求2-4任何一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述堿選自NaOH、Κ0Η、 Na2C03、K2CO3> Na2S, K2S 或 NH4OH 的水溶液。
9.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求I所述的抗腫瘤皂苷和藥學(xué)上接受的賦型劑，并可制備臨床上接受的片劑、注射劑、散劑、滴丸劑、膠囊劑、微囊、膏劑。
10.權(quán)利要求I所述的銀蓮花屬植物中一種抗腫瘤皂苷和權(quán)利要求9所述的藥用組合物在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及銀蓮花屬植物中一種三萜皂苷類化合物的的制備方法和在醫(yī)藥方面的用途，特別是在抗腫瘤方面的用途。該化合物分子式為C47H76O16，化學(xué)名稱為3-O-α-L-鼠李糖基-(1→2)-[β-D-葡萄糖基-(1→4)]-α-L-阿拉伯糖基-齊墩果酸，即oleanolic acid-3-O-α-L-rhamanopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-α-L-arabinopyranosid。本發(fā)明公開的該化合物的提取制備工藝，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，并且通過堿水解的方法，能夠使藥材中其他皂苷類化合物轉(zhuǎn)化為該皂苷，從而使得目標(biāo)皂苷化合物含量大幅提高。體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，該化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，并且對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)基本無(wú)抑制毒害作用，可用于腫瘤疾病治療。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102603856SQ20111046233
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者呂重寧, 林楊, 王晶, 薛嬌, 賈凌云, 路金才 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué), 沈陽(yáng)藥科大學(xué)(本溪)醫(yī)藥科技有限公司