專利名稱：流感病毒核酸分子及由其制備的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的流感病毒疫苗、用于誘導(dǎo)抗流感的免疫反應(yīng)的改進(jìn)的方法、用于診斷已接種了和感染了流感病毒的哺乳動物宿主及用于預(yù)防性和/或治療性免疫個體以對抗流感病毒的改進(jìn)的方法。
背景技術(shù)：
流感，通常稱為流行性感冒，是由正粘病毒科(family Orthomyxoviridae)的RNA病毒引起的傳染病。流感或流行性感冒病毒感染鳥類和哺乳動物。正粘病毒科的5個屬中的3個屬是流感病毒甲型流感病毒、こ型流感病毒和丙型流感病毒。在這些流感病毒中，甲型流感病毒最常見。流感病毒通常以咳嗽或打噴嚏產(chǎn)生的氣霧形式通過空氣傳播或通過與含有病毒 的體液或已污染的表面直接接觸傳播。流感的季節(jié)性流行在世界范圍發(fā)生并且導(dǎo)致每年數(shù)十萬人的死亡。在一些年份，大范圍流行病發(fā)生并且導(dǎo)致數(shù)百人死亡。此外，家畜，特別是禽類和豬也對每年一次的流行病和引起大量動物死亡和金錢損失的偶然的大范圍流行病易感。在結(jié)構(gòu)上，流感病毒是相似的，通常具有約80_120nm的由相似分子組分組成的球狀或絲狀病毒顆粒。包含病毒蛋白質(zhì)和病毒RNA的中心核心被由兩種不同糖蛋白構(gòu)成的病毒包膜和來源于其中產(chǎn)生病毒顆粒的細(xì)胞的脂質(zhì)包衣(lipid coat)覆蓋。兩種額外的不同糖蛋白錨定在病毒包膜內(nèi)并且包括在表面上向外突出的部分。流感病毒RNA基因組通常提供為8個不同的單鏈負(fù)義RNA區(qū)段，它們一起組成基因組的編碼 11 種蛋白質(zhì)(HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2)的 11 個病毒基因。8個RNA區(qū)段為1)HA，其編碼血凝素(產(chǎn)生ー個病毒體需要約500個血凝素分子)；
2)NA，其編碼神經(jīng)氨酸酶(產(chǎn)生ー個病毒體需要約100個神經(jīng)氨酸酶分子)；3)NP，其編碼核蛋白；4)M，其通過使用來自相同RNA區(qū)段的不同讀框編碼2種基質(zhì)蛋白(Ml和M2)(產(chǎn)生ー個病毒體需要約3000個基質(zhì)蛋白分子)；5)NS，其通過使用來自相同RNA區(qū)段的不同讀框編碼兩種不同的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS I和NEP) ;6)PA，其編碼RNA聚合酶；7)PBl，其通過使用來自相同RNA區(qū)段的不同讀框編碼RNA聚合酶和PB1-F2蛋白(誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)；和8)PB2，其編碼RNA聚合酶。在這11種蛋白質(zhì)中，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)是錨定在病毒包膜中并且存在于病毒顆粒的外表面上的兩種大糖蛋白。此類蛋白質(zhì)用作針對流感病毒的免疫反應(yīng)的免疫原。HA(其編碼介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合和病毒基因組進(jìn)入靶細(xì)胞的凝集素)表達(dá)為單個基因產(chǎn)物ΗΑ0，隨后被宿主蛋白酶加工，從而產(chǎn)生兩個亞基HAl和HA2，它們一起在流感病毒顆粒的表面上形成復(fù)合物。NA參與在感染的細(xì)胞中產(chǎn)生的新產(chǎn)生的成熟病毒顆粒的釋放。存在16個已知的HA血清型和9個已知的針對甲型流感病毒的NA血清型。存在病毒顆粒中的不同血清型的鑒定通常用于描述病毒。例如,HlNl是具有HA血清型Hl和NA血清型NI的流感病毒；H5N1是具有HA血清型H5和NA血清型NI的流感病毒。只有H1、H2和H3血清型以及NI和N2血清型通常感染人。流感病毒株通常具有種或?qū)偬禺愋裕患纯筛腥矩i(豬流感病毒)的流感病毒株通常不感染人或鳥類；可感染鳥類(禽流感病毒)的流感病毒株不感人或豬；以及可感染人(人流感病毒)的流感病毒株不感染鳥類或豬。然而，流感病毒株可突變并且使對于ー個物種的感染性變成對于另ー個物種的感染性。例如，僅感染豬的病毒株(豬流感病毒)可突變或重組變成可以僅感染人或感染豬和人的病毒株。通常稱為“豬流感病毒”的流感病毒為流感病毒株，例如HlNl株，其可感染人并且來源于先前對于豬是特異性的病毒株(即豬流感病毒是豬來源的人流感病毒或豬源性人流感病毒)。通常稱為“鳥流感病毒”的流感病毒是流感病毒株，例如H5N1株，其可感染人并且來源于先前對于鳥類是特異性的病毒株(即禽流感病毒是禽類來源人流感病毒或禽類源性人流感病毒)。季節(jié)性地給發(fā)達(dá)國家的許多人以及有時給家畜接種針對流感的疫苗。使用的疫苗在其保護(hù)結(jié)果上是有限的，因為由疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)對于病毒的某些亞型是特異性的。 毎年基于哪種類型和病毒株的病毒將在給定的年份傳播的國際監(jiān)測和科學(xué)家的估計來開發(fā)和施用不同的流感疫苗。病毒通過區(qū)段的突變、重組和再分布產(chǎn)生顯著的改變。因此，一年中提供的疫苗被認(rèn)為不具有抗下一年廣泛傳播的季節(jié)性病毒株的保護(hù)作用。通常由美國疾病控制和預(yù)防中心推廣的“流感疫苗注射(flu shot)”通常包括三種殺死的/滅活的流感病毒一種甲型(H3N2)病毒、一種甲型(HlNl)病毒和一種こ型病毒。因此，很明顯接種受限于亞型的預(yù)測以及針對該該亞型的特異性疫苗的可獲得性(availability)。直接施用核酸序列以接種抗動物和人疾病的疫苗一直已來都在進(jìn)行研究并且許多努力集中在核酸遞送的有效和高效方式以產(chǎn)生期望抗原的必要表達(dá)，從而導(dǎo)致免疫源應(yīng)答和最終獲得該技術(shù)的成功。DNA疫苗具有許多優(yōu)于更常規(guī)的接種方法例如基于活減毒病毒和重組蛋白的疫苗的概念性優(yōu)勢。DNA疫苗是安全、穩(wěn)定、容易產(chǎn)生的并且在人中能被良好耐受，臨床前試驗顯示幾乎無質(zhì)粒整合的證據(jù)[Martin, T.,等人，質(zhì)粒DNA拒疾疫苗肌內(nèi)注射后用于基因組整合的潛能(Plasmid DNA malaria vaccine the potential forgenomicintegration after intramuscular injection). Hum Gene Ther,1999.10 (5)p. 759-68 ；Nichols, ff. ff.，等人，整合入宿主細(xì)胞基因組的潛在DNA疫苗(Potential DNAvaccine integration into host cell genome). Ann N Y Acad Sci, 1995. 772 :p. 30-9」。此外，DNA疫苗因疫苗的功效不受針對載體的預(yù)先存在的抗體滴度影響的事實而十分適合用于重復(fù)施用[Chattergoon, M.，J. Boyer和D. B. Weiner，基因免疫疫苗和免疫治療的新令貨城(Genetic immunization a new era in vaccines and immune therapeutics).FASEB J,1997.11(10) :p. 753-63]。然而，DNA疫苗的臨床采用的ー個主要障礙一直以來是當(dāng)移至更大的動物時平臺的免疫原性的減弱[Liu，Μ. Α.和J. B. Ulmer，質(zhì)粒DNA疫苗的人臨床性狀(Human clinical trials of plasmid DNA vaccines). Adv Genet, 2005. 55 p. 25-40]。DNA疫苗免疫原的工程的最近技術(shù)進(jìn)展，例如密碼子最優(yōu)化、RNA最優(yōu)化和免疫球蛋白前導(dǎo)序列的添加[Andre, S.,等人,利用具有最優(yōu)化密碼子選擇的合成gpl20序列的DNA接種引發(fā)的增強(qiáng)的免疫反應(yīng)(Increased immune response elicited by DNAvaccination with a synthetic gp 120 sequence with optimized codon usage). JVirol, 1998. 72(2) p. 1497-503 ；Deml, L.，等人，密碼子選擇最優(yōu)化對編碼I型人免疫缺陷病毒Gag蛋白的DNA候選疫苗的表達(dá)和免疫原性的多個影響(Multiple effects ofcodon usage optimization on expres sion and immunogenicity of DNA candidatevaccines encoding the human immunodeficiency virus type I Gag protein). J Virol,2001.75(22) p. 1099ト1001 ；Laddy, D. J.，等人，抗禽流感的基于共有序列的新型DNA疫苗的免疫原性(immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines againstavian influenza). Vaccine, 2007. 25 (16) :p. 2984-9 ;Frelin, L.,等人，密碼子最優(yōu)化和mRNA擴(kuò)增有效地增強(qiáng)丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)3/4基因的免疫原性(Codon optimization andmRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis しvirus nonstructural 3/4A gene). Gene Ther, 2004. 11 (6) :p. 522-33]以及質(zhì)粒遞送技術(shù)的最近開發(fā)的技術(shù)例如電穿孔[Hirao，LA.，等人，利用電穿孔的真皮內(nèi)/皮下免疫增進(jìn)了質(zhì)粒疫苗在豬和恒河稱猴中的遞送和潛能(Intradermal/subcutaneous immunizationby electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques). Vaccine, 2008. 26 (3) :p. 440-8 ；Luckay, A.,等人，質(zhì)粒 DNA 疫苗的設(shè)計和體內(nèi)電穿孔對恒河稱猴的所產(chǎn)生的疫苗特異性免疫反應(yīng)的效應(yīng)(Effect of plasmid DNAvaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine—speciiicimmune responses in rhesus macaques). J Virol,2007. 81 (10) p. 5257-69 ；Ahlen,G.，等人，體內(nèi)電穿孔通過增加的局部DNA攝取、蛋白質(zhì)表達(dá)、炎癥和⑶3+T細(xì)胞的浸潤增強(qiáng)丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)3/4A DNA的免疫原性(In vivo electroporation enhancesthe immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increasedlocal DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+Tcells). J Immunol, 2007. 179(7) p. 4741-53]已提高了 DNA 疫苗的表達(dá)和免疫原性。此夕卜，研究已表明共有免疫原的使用與単獨的天然抗原相比較能夠増加細(xì)胞免疫反應(yīng)的廣度[Yan，J.，等人，由基于共有序列的工程HIV-IB亞型包膜DNA疫苗引發(fā)的增強(qiáng)的細(xì)胞免沒反應(yīng)(Ennanced cellular immune responses elicited Dy an engineered HIV-Isubtype B consensus-based envelope DNA vaccine). Mol Ther,2007. 15(2) :p.411-21 ；Rolland, M.,等人，I型祖先樹中心人免疫缺陷病毒蛋白的重建和功能(Reconstructionand function of ancestral center-of-tree human immunodeiiciency virus type 丄proteins). J Virol,2007. 81(16) :p.8507-14]。用于遞送核酸序列例如質(zhì)粒DNA的ー個方法是電穿孔(EP)技術(shù)。所述技術(shù)已在人臨床試驗中被用于遞送抗癌藥物例如博來霉素以及用于關(guān)于許多動物物種的臨床前研究。仍然存在對免疫原性流感病毒共有血凝素蛋白，對編碼這樣的蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體和對用于誘導(dǎo)抗多株流感病毒的免疫反應(yīng)的組合物的需要。仍然存在對用于治療個體的跨許多流感病毒亞型的經(jīng)濟(jì)有效的抗流感病毒的有效疫苗的需要。發(fā)明概述本文中提供的是包含核酸序列的分離的核酸分子，所述核酸序列選自SEQ IDNO :1;與SEQ ID NO :1具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :1的片段；與SEQ ID NO 1的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 3 ;與SEQ ID NO 3具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :3的片段；與SEQ ID NO :3的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ IDNO 6 ;與SEQ ID NO :6具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 6的片段；與SEQ ID NO 6的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :9 ;與SEQ ID NO :9具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 9的片段；與SEQ ID NO 9的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQID NO 11 ;與SEQ ID NO :11具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :11的片段；與SEQ IDNO : 11的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO: 13;與SEQ ID NO: 13具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :13的片段；與SEQ ID NO 13的片段具有95%同源性的核酸序列；和SEQ ID NO 15 ;與SEQ ID NO 15具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :15的片段；與SEQ ID NO 15的片段具有95%同源性的核酸序列。還提供了組合物，其包含a)選自SEQ ID NO :1;與SEQ ID NO :1具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 1的片段；與SEQ ID NO 1的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 3 ;與SEQ ID NO 3具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 3的片段；與SEQID NO :3的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :6;與SEQ ID NO :6具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 6的片段；與SEQ ID NO 6的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 9 ;與SEQ ID NO 9具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 9的片段；與SEQ ID NO :9的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID N0:11;與SEQ ID N0:11具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO 11的片段；與SEQ ID NO 11的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :13 ;與SEQ ID NO :13具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :13的片段；與SEQ ID NO :13的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :15 ;與SEQ ID NO 15具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :15的片段；與SEQ ID NO 15的片段具有95%同源性的核酸序列中的ー種或多種的第一核酸序列；和b)編碼蛋白質(zhì)的第二核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自:甲型流感病毒111、!12、!13、!14、冊、冊、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、!115、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、こ型流感病毒血凝素、神經(jīng)氨酸酶及其片段中的ー種或多種。本發(fā)明的ー些方面提供了誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其包括步驟給個體施用此類核酸分子和/或組合物。本發(fā)明的其它方面提供了保護(hù)個體免受感染的方法。所述方法包括步驟給所述個體施用預(yù)防有效量的包含此類核酸序列或組合物的核酸分子；其中所述核酸序列在所述個體的細(xì)胞中表達(dá)并且針對由所述核酸序列編碼的蛋白質(zhì)的保護(hù)性免疫反應(yīng)被誘導(dǎo)。在一些實施方案中，免疫反應(yīng)是抗豬來源的人流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的ー些方面，提供了用于治療已被流感病毒感染的個體的方法。所述方法包括給所述個體施用治療有效量的此類核酸分子和/或組合物的步驟。在一些實施方案中，免疫反應(yīng)是抗豬來源的人流感病毒的免疫反應(yīng)。附圖
簡述圖I是2999堿基對主鏈載體質(zhì)粒pVAXl (茵維特羅根(Invitrogen)，卡爾斯巴德(Carlsbad)加利福尼亞州(CA))的圖譜。CMV啟動子位于堿基137-724。T7啟動子/引發(fā)位點位于堿基664-683。多克隆位點位于堿基696-811。牛GH多腺苷酸化信號位于堿基829-1053。卡那霉素抗性基因位于堿基1226-2020。pUC來源位于堿基2320-2993?；诳蓮囊鹁S特羅根公司獲得的pVAXl的序列，在用作pGX2009的主鏈的pVAXl的序列中發(fā)現(xiàn)下列突變
C>G 241在CMV啟動子中OT 1942主鏈，牛生長激素多腺苷酸化信號(bGHpolyA)的下游A > -2876主鏈，卡那霉素基因的下游OT 3277在pUC復(fù)制起始區(qū)(Ori)中，高拷貝數(shù)突變(參見Nucleic AcidResearch 1985)G > C 3753正好在pUC Ori的末端，RNASeH位點的上游堿基對2、3和4在主鏈中CMV啟動子的上游被從ACT改變成CTG。
圖2顯示質(zhì)粒pGX2009的兩個圖譜，所述質(zhì)粒也稱為ρΗ1ΗΑ09。質(zhì)粒pGX2009的核酸序列(SEQ ID NO 5)包括共有Hl蛋白構(gòu)建體的編碼序列(由SEQ ID NO 3編碼的氨基酸SEQ ID NO :4)，所述共有Hl蛋白包括連接于共有Hl氨基酸序列(由SEQ ID NO :I編碼的氨基酸SEQ ID NO 2)的N末端的IgE前導(dǎo)(氨基酸SEQ ID NO : 17)，所述共有Hl氨基酸序列在其C末端上連接于HA標(biāo)簽(SEQ ID N0:18)。共有Hl蛋白(由SEQ ID NO :3編碼的氨基酸SEQ ID NO 4)為標(biāo)記的SwiHum Con HA和H1HA09。圖3顯示質(zhì)粒pGX2006的圖譜。質(zhì)粒pGX2006的核酸序列(SEQ ID NO 8)包括共有H2蛋白(由SEQ ID NO: 6編碼的氨基酸SEQ ID NO 7)的編碼序列，所述共有H2蛋白為標(biāo)記的H2HA。圖4顯示來自利用經(jīng)免疫的雪貂的血清進(jìn)行的血凝抑制測定的數(shù)據(jù)。圖5顯示利用新型HlNl株攻擊經(jīng)免疫的和未經(jīng)免疫的雪貂的結(jié)果。詳述提供了甲型Hl和H2流感病毒的各自的共有氨基酸序列(在本文中分別稱為“共有HI” (SEQ ID NO: 2)和“共有H2” (SEQ ID NO : 7))，以及新型合成雜交體共有甲型Hl流感病毒血凝素氨基酸序列(在本文中稱為“共有U2” (SEQ ID NO :10))和こ型流感病毒血凝素的共有氨基酸序列(在本文中稱為“共有BHA”(SEQ ID NO : 13))，其可為哺乳動物提供抗流感病毒的保護(hù)作用。此外，提供了包含共有Hl氨基酸序列、共有H2氨基酸序列、共有U2氨基酸序列和/或共有BHA氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在ー些方面，提供了核酸序列，所述核酸序列編碼包含共有Hl氨基酸序列(例如(SEQ ID NO 1)或(SEQ ID NO :3))、共有H2氨基酸序列(例如(SEQ ID NO :6))、共有U2氨基酸序列(例如(SEQ ID NO 9)或(SEQID NO 11))和/或共有BHA氨基酸序列(例如(SEQ ID NO: 13)或(SEQ ID NO :15))的蛋白質(zhì)。然而不受科學(xué)理論束縛，可用于引發(fā)廣泛地抗多種流感病毒亞型的免疫反應(yīng)(體液、細(xì)胞或兩者)的疫苗可包括如下的ー種或多種1)編碼包含共有Hl氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列；2)包含共有Hl氨基酸序列的蛋白質(zhì)；3)編碼包含共有H2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列；4)包含共有H2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；5)編碼包含共有U2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列；6)包含共有U2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；7)編碼包含共有BHA氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列；和8)包含共有BHA氨基酸序列的蛋白質(zhì)?？蛇M(jìn)行免疫方法以及可制備使用和/或組合下列組分的兩種或更多種的疫苗1)編碼包含共有Hl氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列；2)包含共有Hl氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
3)編碼包含共有H2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，4)包含共有H2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；5)編碼包含共有U2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，6)包含共有U2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，7)編碼包含共有BHA氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，和8)包含共有BHA氨基酸序列的蛋白質(zhì)。對于基于更廣泛的抗流感病毒的治療，可進(jìn)行免疫方法，并且可制備疫苗，所述疫苗使用和/或組合一種或多種其它流感病毒蛋白質(zhì)例如甲型H1-H16流感病毒、甲型N1-N9流感病毒、こ型流感病毒血凝素、こ型流感病毒神經(jīng)氨酸酶和/或編碼此類蛋白質(zhì)的基因以及如下組分的ー種或多種1)編碼包含共有Hl氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列；2)包含共有Hl氨基酸序列的蛋白質(zhì)；3)編碼包含共有H2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，
4)包含共有H2氨基酸序列的蛋白質(zhì)；5)編碼包含共有U2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，6)包含共有U2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，7)編碼包含共有BHA氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列，和8)包含共有BHA氨基酸序列的蛋白質(zhì)。I.定義·本文中使用的術(shù)語僅為了描述特定的實施方案并且不g在限制。如本說明書中和所附權(quán)利要求中所用，除非上下文中另外明確指定，否則單數(shù)形式“ー種/ ー個(a) ”、“ー種/ ー個(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指示物。 對于本文的數(shù)字范圍的引述，明確地包括具有相同精度的介于其間的每個介入數(shù)字。例如，對于6-9的范圍，除了 6和9外還包括數(shù)字7和8，對于范圍6. 0-7. 0，明確地包括數(shù)字 6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9 和 7. O。a.佐劑如本文中所用，“佐劑”意指添加至本文中描述的DNA質(zhì)粒疫苗以增強(qiáng)由所述DNA質(zhì)粒和下文中描述的編碼核酸序列編碼的抗原的免疫原性。b.抗體如本文中所用，"抗體"意指種類IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗體及其片段或衍生物，包括Fab、F (ab' ) 2、Fd和單鏈抗體、雙鏈抗體(diabody)、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物?？贵w可以是從哺乳動物的血清樣品分離的抗體、多克隆抗體、親和純化的抗體或顯示對于期望的表位或從其衍生的序列的充分結(jié)合特異性的其混合物。c.編碼序列如本文中所用，“編碼序列”或“編碼核酸”意指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列還可包括有效地連接于調(diào)控元件(包括能夠在已對其施用了所述核酸的個體或哺乳動物的細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動子和多腺苷酸化信號)的起始和終止信號。d.互補(bǔ)如本文中所用，“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)的”意指可進(jìn)行核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的沃爾森-克里克(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基配對的核酸。e.共有區(qū)或共有序列如本文中所用，“共有區(qū)”或“共有序列”意指基于多個亞型的特定流感病毒抗原的比對的分析的多肽序列?？芍苽渚幋a共有多肽序列的核酸序列。包含含有共有序列的蛋白質(zhì)和/或編碼此類蛋白質(zhì)的疫苗可用于誘導(dǎo)抗多個亞型或血清型的特定流感病毒抗原的廣泛免疫。共有流感病毒抗原可包括甲型流感病毒共有血凝素氨基酸序列(包括例如共有H1、共有H2)或こ型流感病毒共有血凝素氨基酸序列。f.恒定電流
如本文中所用，“恒定電流”意指由組織或定義所述組織的細(xì)胞在遞送至相同組織的電脈沖的持續(xù)過程中接收或經(jīng)歷的電流。從本文中描述的電穿孔設(shè)備遞送電脈沖。該電流在電流沖的壽命過程中在所述組織中保持恒定的安培數(shù)，因為本文中提供的電穿孔設(shè)備具有反饋元件(優(yōu)選具有瞬時值反饋(instantaneous feedback))。所述反饋元件可測量整個脈沖持續(xù)過程中組織(或細(xì)胞)的電阻并且引起電穿孔設(shè)備改變其電能輸出(例如，升高電壓)，以便相同組織中的電流在整個電泳沖(在微秒級上)中以及電脈沖之間保持恒定。在一些實施方案中，反饋元件包括控制器。g.電流反饋或反饋“電流反饋”或“反饋”可互換使用并且意指提供的電穿孔設(shè)備的主動反應(yīng)，其包括測量電極之間的組織中的電流和相應(yīng)地改變由EP設(shè)備遞送的 能量輸出以使電流維持在恒定水平。該恒定水平是在起始脈沖序列或電處理之前由用戶預(yù)先設(shè)定的。反饋可通過電穿孔組件例如電穿孔設(shè)備的控制器來實現(xiàn)，因為本文中的電路能夠連續(xù)監(jiān)測電極之間的組織中的電流并且將該監(jiān)測的電流(或組織內(nèi)的電流)與預(yù)設(shè)電流相比較，以及連續(xù)調(diào)整能量輸出以將監(jiān)測的電流維持在預(yù)設(shè)水平。反饋環(huán)可以是瞬時的，因為其是模擬閉環(huán)反饋。h.分散電流如本文中所用，“分散電流”意指來源于本文中描述的電穿孔設(shè)備的各種針電極陣列的電流的模式，其中所述模式最小化或優(yōu)選消除電穿孔相關(guān)的熱應(yīng)激在被電穿孔的組織的任何區(qū)域上的發(fā)生。i.電穿孔如本文中可互換使用的，“電穿孔”、“電透化(electro-permeabilization) ”或“電動カ增強(qiáng)(electro-kinetic enhancement)” ( “EP”)意指跨膜電場脈沖在生物膜中誘導(dǎo)極微小通道(孔)的用途；它們的存在允許生物分子例如質(zhì)粒、寡核苷酸、SiRNA、藥物、離子和水從細(xì)胞膜的ー側(cè)通過至另ー側(cè)。j.反饋機(jī)制如本文中所用，“反饋機(jī)制”意指通過軟件或硬件(或固件)進(jìn)行的過程，所述過程(在遞送能量脈沖之前、期間和/或之后)接收期望組織的阻抗并且將其與預(yù)設(shè)值(優(yōu)選電流)相比較，然后調(diào)整所遞送的能量脈沖以達(dá)到預(yù)設(shè)值?？赏ㄟ^模擬閉合電路進(jìn)行反饋機(jī)制。k.片段如本文中所用，關(guān)于核酸序列的“片段”意指核酸序列或其部分，所述核酸序列或其部分編碼能夠引起哺乳動物的免疫反應(yīng)的多肽，所述多肽與全長野生型病毒株的流感病毒抗原(包括例如甲型Hl流感病毒血凝素、甲型H2流感病毒血凝素或こ型流感病毒血凝素)交叉反應(yīng)。片段可以是選自編碼共有氨基酸序列的多個核苷酸序列中的至少ー個和包含這樣的序列(包括SEQ ID N0:l、3、6、9、ll、13和15)的構(gòu)建體的DNA片段。DNA片段可包括免疫球蛋白前導(dǎo)序列例如IgE或IgG前導(dǎo)序列的編碼序列。DNA片段在長度上可以為30或更多個核苷酸，45或更多個，60或更多個，75或更多個，90或更多個，120或更多個，150或更多個，180或更多個，210或更多個，240或更多個，270或更多個，300或更多個，360或更多個，420或更多個，480或更多個，540或更多個，600或更多個，660或更多個，720或更多個，780或更多個，840或更多個，900或更多個，960或更多個，1020或更多個，1080或更多個，1140或更多個，1200或更多個，1260或更多個，1320或更多個，1380或更多個，1440或更多個，1500或更多個，1560或更多個，1620或更多個，1680或更多個，1740或更多個，1800或更多個，1860或更多個，1820或更多個，1880或更多個，1940或更多個，2000或更多個，2600或更多個，2700或更多個，2800或更多個，2900或更多個，2910或更多個，2920或更多個，2930或更多個，2931或更多個，2932或更多個，2933或更多個，2934或更多個，2935或更多個，2936或更多個，2937或更多個或2938或更多個核苷酸。DNA片段可少于10個核苷酸，少于20個，少于30個，少于40個，少于50個，少于60個，少于75個，少于90個，少于120個，少于150個，少于180個，少于210個，少于240個，少于270個，少于300個，少于360個，少于420個，少于480個，少于540個，少于600個，少于660個，少于720個，少于780個，少于840個，少于900個，少于960個，少于1020個，少于1080個，少于1140個，少于1200個，少于1260個，少于1320個，少于1380個，少于1440個，少于1500個，少于1560個，少于1620個，少于1680，或少于1740個核苷酸，少于1800，少于1860個，少于1820，少于1880個，少于1940個，少于2000個，少于2600個，少于2700個，少于2800個，少于2900個，少于2910個，少于2920個，少于2930個，少于2931個，少于2932個，少于2933個，少于2934個，少于2935個，少于2936個，少于2937個或少于2938個核苷酸。 關(guān)于多肽序列的“片段”意指能夠引發(fā)哺乳動物的免疫反應(yīng)的多肽，所述多肽與全長野生型病毒株流感病毒抗原例如甲型Hl流感病毒血凝素、甲型H2流感病毒血凝素或こ型流感病毒血凝素交叉反應(yīng)。片段可以是選自本發(fā)明的多個多肽序列(包括SEQ ID NO2、4、7、10、12、14和16)中的至少ー個的多肽片段?？煞治龆嚯钠我越佑|至少ー個由公共可獲得的數(shù)據(jù)庫例如洛斯阿拉莫斯國家實驗室的HA(Los Alamos National Laboratory’sHA)序列數(shù)據(jù)庫提供的抗原表位。多肽HA片段還可包含免疫球蛋白前導(dǎo)序列(例如IgE或IgG前導(dǎo)序列)的氨基酸序列。多肽片段在長度上可以為30或更多個氨基酸，在長度上為45或更多個，60或更多個，75或更多個，90或更多個，120或更多個，150或更多個，180或更多個，210或更多個，240或更多個，270或更多個，300或更多個，360或更多個，420或更多個，480或更多個，540或更多個，600或更多個，660或更多個或710個氨基酸或更多個氨基酸。多肽片段在長度上可少于10個氨基酸，少于20個，少于30個，少于40個，少于50個,少于60個，少于75個，少于90個，少于120個，少于150個，少于180個，少于210個，少于240個，少于270個，少于300個，少于360個，少于420個，少于480個，少于540個，少于600個，少于660個，少于700個，少于701個，少于702個，少于703個，少于704個，少于705個，少于706個，少于707個，少于708個，少于709個或少于710個氨基酸。I.基因構(gòu)建體如本中所用，術(shù)語“基因構(gòu)建體”是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA或RNA分子。編碼序列包括有效地連接于調(diào)控元件(包括能夠在已對其施用了核酸分子的個體的細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動子和多腺苷酸化信號)的起始和終止信號。如本文中所用，術(shù)語“可表達(dá)形式”是指基因構(gòu)建體，所述基因構(gòu)建體包含有效地連接于編碼蛋白質(zhì)的編碼序列的必需調(diào)控元件，以便當(dāng)存在于個體的細(xì)胞中時編碼序列可被表達(dá)。m.同一的如本文中所用，在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中，"同一的"或"同一性"意指序列具有指定的在指定的區(qū)域范圍中為相同的殘基的百分比。可如下計算百分比最佳地對齊兩個序列，在指定的區(qū)域范圍內(nèi)比較兩個序列，確定在其上相同殘基存在于兩個序列中的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以指定區(qū)域中位置的總數(shù)，將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。在其中兩個序列具有不同長度或比對產(chǎn)生一個或多個交錯末端并且指定的比較區(qū)域只包括單個序列的情況下，單個序列的殘基包括在計算的分母中而非分子中。當(dāng)比較DNA與RNA時，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被認(rèn)為是等同的?？扇斯せ蛲ㄟ^使用計算機(jī)序列算法例如BLAST或BLAST 2. O進(jìn)行同一性。η.阻抗當(dāng)討論反饋機(jī)制時可使用“阻杭”，其可按照歐姆定律被轉(zhuǎn)化成電流值，從而使得能夠與預(yù)設(shè)電流相比較。O.免疫反應(yīng)
如本文中所用，“免疫反應(yīng)”意指宿主的免疫系統(tǒng)，例如哺乳動物的免疫系統(tǒng)響應(yīng)抗原例如流感病毒血凝素共有抗原的引入的激活。免疫反應(yīng)可以以細(xì)胞反應(yīng)或體液反應(yīng)或兩者的形式存在。p.核酸本文中所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共價連接在一起的至少兩種核苷酸。單鏈的描述也確定互補(bǔ)的鏈的序列。因此，核酸還包括描述的單鏈的互補(bǔ)鏈。核酸的許多變體可用干與給定的核酸相同的目的。因此，核酸還可包括大體上相同的核酸和其互補(bǔ)序列。單鏈提供了可在嚴(yán)格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還包括在嚴(yán)格雜交條件下雜交的探針。核酸可以是單鏈或雙鏈的，或可包含雙鏈和單鏈序列的部分。核酸可以是DNA，基因組和cDNA、RNA或雜交體，其中核酸可包含脫氧核糖和核糖-核酸苷酸的組合以及堿基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥嘌呤)的組合。核酸可通過化學(xué)合成法或通過重組法獲得。q.有效連接的如本文中所用，“有效連接的”意指基因的表達(dá)處于與其空間上連接的啟動子的控制之下。啟動子可定位在處于其控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。啟動子與基因之間的距離可與在該啟動子所源自的基因中該啟動子與其控制的基因之間的距離大致相同。如本領(lǐng)域中是已知的，該距離的變化可被容納而不喪失啟動子功能。r.啟動子如本文中所用“啟動子”意指能夠在細(xì)胞中賦予核酸的表達(dá)、激活或增強(qiáng)所述表達(dá)的合成或天然來源的分子。啟動子可以包括ー個或多個特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以進(jìn)ー步增強(qiáng)所述基因的表達(dá)和/或改變所述基因的空間表達(dá)和/或時間表達(dá)。啟動子還可包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻遏物元件，所述元件可位于遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點多達(dá)數(shù)千個堿基對。啟動子可來源于包括病毒、細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲和動物的來源。啟動子對于其中表達(dá)發(fā)生的組織或器官，對于表達(dá)發(fā)生所處的發(fā)育階段或響應(yīng)外部刺激例如生理應(yīng)激、病原體、金屬離子或誘導(dǎo)劑，可組成型地或差異地調(diào)控基因組件的表達(dá)。啟動子的代表性實例包括噬菌體T7啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、Iac操縱子-啟動子、tac啟動子、SV40晩期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子，CMV IE啟動子、SV40早期啟動子或SV40晩期啟動子和CMV IE啟動子。s.嚴(yán)格雜交條件如本文中所用，“嚴(yán)格雜交條件”意指在其下第一核酸序列(例如，探針)將與第二核酸序列(例如，靶)例如在核酸的復(fù)雜混合物中雜交的條件下。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同的環(huán)境中是不同的。嚴(yán)格條件可經(jīng)選擇比特定離子強(qiáng)度pH下特定序列的熱解鏈溫度(thermal melting point) (Tm)低約5_10°C。Tm可以是(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)50%的與靶互補(bǔ)的探針與靶序列平衡雜交時所處的溫度(當(dāng)靶序列過量存在時，在Tm下，50%的探針被平衡地占據(jù))。嚴(yán)格條件可以是這樣的條件，其中在pH 7. O至8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離子，例如約O. 01-1. OM的鈉離子濃度(或其它鹽)并且溫度為至少約30°C (對于短探針，例如約10-50個核苷酸)和至少約60°C (對于長探針，例如大于至少約50個核苷酸)。嚴(yán)格條件還可通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來獲得。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號可為本底雜交的至少2至10倍。示例性嚴(yán)格雜交條件包括下列條件在42°C下于50%甲酰胺、5x SSC和1% SDS中溫育，或在65°C下于5xSSC，I % SDS中溫育，和在65°C下于O. 2x SSC和0.1% SDS中洗滌。t.大體上互補(bǔ)
如本文中所用，“大體上互補(bǔ)”意指第一序列與第二序列的互補(bǔ)序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070或更多個核苷酸或氨基酸的區(qū)域范圍內(nèi)具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 的同一性，或兩個序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。u.大體同一的如本文中所用，“大體上同一的”意指第一序列與第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070或更多個核苷酸或氨基酸的區(qū)域范圍內(nèi)具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 的同一性，或就核酸而言，如果第一序列與第二序列的互補(bǔ)序列大體上互補(bǔ)，則第一序列與第二序列大體上同一。V.亞型或血清型“亞型”或“血清型”如本文中所用，可互換，并且當(dāng)提及流感病毒時，意指流感病毒的遺傳性變型(genetic variant)，以便一個亞型免疫系統(tǒng)識別而與不同亞型相區(qū)分。w.變體如本文中所用，關(guān)于核酸的“變體”意指⑴參照核苷酸序列的部分或片段；(ii)參照核苷酸序列或其部分的互補(bǔ)序列；(iii)與參照核酸或其互補(bǔ)序列大體上同一的核酸；或(iv)在嚴(yán)格條件下與參照核酸、其互補(bǔ)序列或與其大體上同一的序列雜交的核酸?！白凅w”是指在氨基酸序列上相異在于氨基酸的插入、缺失或保守置換但保持至少ー種生物活性的肽或多肽。變體還可以指其氨基酸序列與參考的蛋白質(zhì)的氨基酸序列大體上同一的蛋白質(zhì)，其保留至少ー種生物活性。氨基酸的保守置換，即用具有相似性質(zhì)(例如，親水性、帶電荷區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本領(lǐng)域通常被認(rèn)為包括小的變化。這些小的變化可部分地通過考慮氨基酸的親水指數(shù)來鑒定，如本領(lǐng)域中所理解的。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157 :105-132 (1982)。氨基酸的親水指數(shù)基于其疏水性和電荷的考慮。在本領(lǐng)域中已知具有相似親水指數(shù)的氨基酸可被置換并且仍然保留蛋白質(zhì)功能。在ー個方面，具有±2的親水指數(shù)的氨基酸被置換。氨基酸的親水性還可用于揭示可產(chǎn)生保留生物功能的蛋白質(zhì)的置換。在肽的上下文中氨基酸的親水性的考慮允許計算該肽的最大局部平均親水性，已報道與抗原性和免疫原性相關(guān)的有用的測量。美國專利No. 4，554，101，通過引用完全并入本文。具有相似親水性值的氨基酸的置換可產(chǎn)生保留生物活性例如免疫源性的肽，這在本領(lǐng)域中是被理解的?？衫镁哂性凇?內(nèi)的親水性值的氨基酸彼此進(jìn)行置換。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性值受該氨基酸的具體側(cè)鏈影響。與該觀察一致，應(yīng)理解與生物功能相容的氨基酸置換依賴于氨基酸的相似性，特別地所述氨基酸的側(cè)鏈的相似性，如通過疏水性、親水性、電荷、大小和其它性質(zhì)顯示的。X.載體如本文中所用，"載體"意指包含復(fù)制起始位點的核酸序列。載體可以是載體、噬菌體、細(xì)菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RNA載體。載體可以自主復(fù)制的染色體外載體，優(yōu)選地為DNA質(zhì)粒。2.流感病毒抗原本文中提供的是能夠在引發(fā)哺乳動物中的抗ー個或多個流感病毒血清型的免疫反應(yīng)的抗原。所述抗原能夠引發(fā)哺乳動物中的抗ー個或多個流感病毒血清型的免疫反應(yīng)，包括抗ー個或多個大范圍流行病的病毒株，例如2009 HlNl豬源的流感病毒。所述抗原能夠引發(fā)哺乳動物中的抗ー個或多個流感病毒血清型的免疫反應(yīng)，包括抗豬來源的人流感病毒的ー個或多個病毒株?？乖砂砦?，所述表位可使它們成為可針對其誘導(dǎo)抗流感病毒的免疫反應(yīng)的特別有效的免疫原?？乖砂ㄈL翻譯產(chǎn)物ΗΑ0、亞基HA1、亞基HA2、其變體、其片段或其組合。流感病毒血凝素抗原可以是來源于甲型流感病毒血清型Hl的多個病毒株的共有序列，來源于甲型流感病毒血清型H2的多個病毒株的共有序列，包含來源于不同組的甲型流感病毒血清型Hl的多個病毒株的兩個不同共有序列的部分的雜交體序列或來源于こ型流感病毒的多個病毒株的共有序列。流感病毒血凝素抗原可來自こ型流感病毒。抗原可包含至少ー個抗原性表位，所述表位對于可針對其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的特定流感病毒免疫原是有效的?？乖商峁┐嬖谟谕暾鞲胁《局械拿庖咴晕恢煤捅砦坏耐耆珟??？乖梢允枪灿醒乜乖蛄?，所述序列可來源于來自ー個血清型的多個甲型流感病毒株例如血清型Hl或血清型H2的多個甲型流感病毒株的血凝素抗原序列?？乖梢允请s交共有血凝素抗原序列，其可通過組合兩個不同的共有血凝素抗原序列或其部分衍生而來。兩個不同共有血凝素抗原序列的每ー個可來源于不同組的ー個血清型的多個甲型流感病毒株例如血清型Hl的多個甲型流感病毒株?？乖梢允强蓙碓从趤碜远鄠€こ型流感病毒株的血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列。共有血凝素抗原可以是包含SEQ ID NO :2 (共有Hl氨基酸序列)的蛋白質(zhì)，其中氨基酸1-343相應(yīng)于前體HAO共有Hl氨基酸序列的HAl亞基并且氨基酸344-566相應(yīng)于HAO共有Hl氨基酸序列的HA2亞基。共有血凝素抗原可以是包含SEQ ID N0:7(共有H2氨基酸序列)的蛋白質(zhì)。共有血凝素抗原可以是合成雜交共有Hl序列，其包含各自來源于彼、此不同的組的序列的兩個不同共有Hl序列。作為合成雜交共有Hl蛋白的共有HA抗原的實例是包含SEQ ID NO : 10 (U2氨基酸序列)的蛋白質(zhì)。共有血凝素抗原可以是來源于こ型流感病毒株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，例如包含SEQ ID NO :14(共有BHA氨基酸序列)的蛋白質(zhì)。共有血凝素抗原還可包含ー種或多種額外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原還可在其N末端上包含IgE或IgG的前導(dǎo)氨基酸序列。IgE前導(dǎo)氨基酸序列可以是SEQ IDNO :17。共有血凝素抗原還可包含作為可通過容易獲得的抗體檢測的獨特免疫原性表位的免疫原性標(biāo)簽。這樣的免疫原性標(biāo)簽的實例為9個氨基酸的流感病毒HA標(biāo)簽，其可連接于共有血凝素的C端。HA標(biāo)簽氨基酸序列可以是SEQ ID NO 180在一些實施方案中，共有血凝素抗原還可在其N末端上包含IgE或IgG前導(dǎo)氨基酸序列并且其C末端上包含HA標(biāo)簽。共有血凝素抗原可以是由共有流感病毒氨基酸序列或其片段和變體組成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非-流感病毒蛋白質(zhì)序列和流感病毒蛋白質(zhì)序列 或其片段和變體的共有血凝素蛋白。共有Hl蛋白的實例包括可由共有Hl氨基酸序列(SEQ ID NO 2)組成的所述蛋白質(zhì)或還包含額外元件例如IgE前導(dǎo)序列或HA標(biāo)簽或IgE前導(dǎo)序列和HA標(biāo)簽兩者的所述蛋白質(zhì)。包括IgE前導(dǎo)序列和HA標(biāo)簽的共有Hl蛋白的實例為SEQ ID NO :4，其包含在其N末端連接于IgE前導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO 17)并且在其C末端連接于HA標(biāo)簽(SEQ IDNO: 18)的共有Hl氨基酸編碼序列(SEQ ID NO :2)。共有H2蛋白的實例包括可由共有H2氨基酸序列(SEQ ID NO 7)組成的所述蛋白質(zhì)或還包含IgE前導(dǎo)序列或HA標(biāo)簽或IgE前導(dǎo)序列和HA標(biāo)簽的所述蛋白質(zhì)。雜交共有Hl蛋白的實例包括可由共有U2氨基酸序列(SEQ ID NO 10)組成的所述蛋白質(zhì)或還包含IgE如導(dǎo)序列、HA標(biāo)簽或IgE如導(dǎo)序列和HA標(biāo)簽的所述蛋白質(zhì)。共有U2蛋白的實例為SEQ IDNO : 12，其包含在其N末端連接于IgE前導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO:17)和在其C末端連接于HA標(biāo)簽(SEQ ID NO: 18)的共有U2氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。雜交共有B型流感病毒凝血素蛋白的實例包括可由共有BHA氨基酸序列(SEQ IDNO 14)組成的所述蛋白質(zhì),或其可包含IgE前導(dǎo)序列或HA標(biāo)簽或IgE前導(dǎo)序列和HA標(biāo)簽。共有BHA蛋白的實例為SEQ ID NO : 16，其包含在其N末端連接于IgE前導(dǎo)氨基酸序列(SEQID NO: 17)和在其C末端連接于HA標(biāo)簽(SEQ ID NO: 18)的共有BHA氨基酸序列(SEQ IDNO 14)。共有血凝素蛋白可由共有血凝素核酸、其變體或片段編碼。與可以是來源于來自不同株和變體的多個不同的血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指編碼共有蛋白質(zhì)序列的核酸序列，并且所使用的編碼序列可與用于編碼所述共有血凝素蛋白序列所源自的多個不同血凝素序列中特定氨基酸序列的編碼序列不同。共有核酸序列可以進(jìn)行密碼最優(yōu)化和/或RNA最優(yōu)化。共有血凝素核酸序列可在5’非翻譯區(qū)中包含Kozak’s序列。共有血凝素核酸序列可包含編碼前導(dǎo)序列的核酸序列。N末端前導(dǎo)序列的編碼序列為血凝素編碼序列的5’。N末端前導(dǎo)序列可促進(jìn)分泌。N前導(dǎo)序列可以是IgE前導(dǎo)序列或IgG前導(dǎo)序列。共有血凝素核酸序列可包含編碼免疫原性標(biāo)簽的核酸序列。免疫原性標(biāo)簽可在蛋白質(zhì)的C端上并且編碼其的序列為HA編碼序列的3’。免疫原性標(biāo)簽提供了可容易獲得針對其的抗體的獨特表位，以便此類抗體可用于檢測和確認(rèn)蛋白質(zhì)的表達(dá)的測定。免疫原性標(biāo)簽可以是蛋白質(zhì)的C端上的H標(biāo)簽。共有血凝素核酸可具有編碼包含SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:10或SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的多核苷酸序列。編碼SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :7、SEQ IDN0:10或SEQ ID NO :14的共有血凝素核酸可以分別為SEQ ID NO USEQ ID NO :6、SEQ IDNO :9或SEQ ID NO : 13。共有血凝素核酸還可包含編碼IgE前導(dǎo)氨基酸序列的多核苷酸或編碼HA標(biāo)簽氨基酸序列的多核苷酸或兩者。SEQ ID NO: 17為IgE前導(dǎo)多肽序列。SEQ IDNO : 18為HA標(biāo)簽多肽序列。還包含編碼IgE前導(dǎo)序列和HA標(biāo)簽的多核苷酸序列的血凝素共有核酸的實例包括核酸分子，所述核酸分子編碼包括SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :12或SEQID NO :16的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。編碼SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :12或SEQ ID N0:16的共有血凝素核酸可以分別為SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15。3.基因構(gòu)建體和質(zhì)粒本文中提供的是可包含編碼血凝素抗原的核酸序列的基因構(gòu)建體?；驑?gòu)建體可 以以包含編碼血凝素抗原的核酸的功能性染色體外分子的形式存在于細(xì)胞中。包含編碼血凝素抗原的核酸的基因構(gòu)建體可以是包含著絲粒、端粒的線性微型染色體或質(zhì)?；蛘沉??；驑?gòu)建體還可以重組病毒載體(包括重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組牛痘)的基因組的部分?；驑?gòu)建體可以是存在于細(xì)胞中的減毒活微生物的遺傳物質(zhì)或重組微生物載體的部分?；驑?gòu)建體可包含用于血凝素核酸的基因表達(dá)的調(diào)控元件。調(diào)控元件可以是啟動子、增強(qiáng)子、起始密碼子、終止密碼子或多腺苷酸化信號。組合物可包含第一核酸序列(其編碼選自甲型流感病毒共有血凝素Hl抗原、甲型流感病毒共有血凝素H2抗原、甲型流感病毒共有血凝素U2抗原和こ型流感病毒共有血凝素蛋白BHA中的一種或多種的血凝素共有抗原)，并且還可包含ー種或多種額外的核酸序列(所述核酸序列編碼選自甲型流感病毒血凝素蛋白HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、!19、!110、!111、!112、!113、!114、!115、!116、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶附、吧州3、財、陽、恥、町、N8、N9、こ型流感病毒血凝素(BHA)和こ型流感病毒神經(jīng)氨酸酶(BNA)中的ー種或多種蛋白質(zhì))。第一和額外的核酸序列可存在于相同核酸分子或不同核酸分子上。第一和額外的核酸序列可處于在人細(xì)胞中起作用的調(diào)控元件的控制之下。額外的編碼序列可編碼ー種或多種來自ー個或多個流感病毒株的 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、BHA和BNA，或為來源于具有相同血清型的多個病毒株的共有序列，或為包括來自兩種或更多種共有序列的序列的雜交體。核酸序列可組成可以是載體的基因構(gòu)建體。載體可以能夠在哺乳動物的細(xì)胞中以有效地引發(fā)哺乳動物的免疫反應(yīng)的量表達(dá)共有血凝素抗原。載體可以是重組的。載體可包含編碼共有血凝素抗原的異源核酸。載體可以是質(zhì)粒。載體對于用編碼共有血凝素抗原的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞是有用的，將所述轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在其中共有血凝素抗原的表達(dá)發(fā)生的條件下進(jìn)行培養(yǎng)和維持。載體包含編碼共有血凝素抗原的異源核酸并且還可包含起始密碼子(其可位于共有血凝素編碼序列的上游)和終止密碼子(其可位于共有血凝素編碼序列的下游)。起始和終止密碼子可以與共有血凝素編碼序列存在于讀框中。載體還可包含有效地連接于共有血凝素編碼序列的啟動子。有效地連接于共有血凝素編碼序列的啟動子可以是來自猴病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動子例如牛免疫缺陷病毒(BIV)長末端重復(fù)(LTR)啟動子、莫洛尼病毒啟動子、禽類白血病病毒(ALV)啟動子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子例如CMV立即早期啟動子、EB病毒(Epstein Barrvirus) (EBV)啟動子或Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子。啟動子還可以是來自人基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或人金屬硫蛋白的啟動子。啟動子還可以是組織特異性啟動子，例如肌肉或皮膚特異性啟動子，天然或合成的。此類啟動子的實例描述于美國專利申請公布no. US20040175727 (將其內(nèi)容通過弓I用整體并入本文)中。載體還可包含多腺苷酸化信號，其可位于HA編碼序列的下游。多腺苷酸化信號可以為SV40多原苷酸信號、LTR多腺苷酸信號、牛生長激素(bGH)多腺苷酸化信號或人β-珠蛋白多腺苷酸化信號。SV40多腺苷酸化信號可以是來自pCEP4載體(茵維特羅根公司，圣地亞哥市，加利福尼亞州)的多腺苷酸化信號。載體還可在共有血凝素編碼序列的上游包含增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以是DNA表達(dá)所必需的。增強(qiáng)子可以是人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或病毒增強(qiáng)子例如來自CMV、HA、RSV或EBV的增強(qiáng)子。多腺苷酸功能增強(qiáng)描述于美國專利No. 5，593，972、 5，962，428和WO 94/016737，將所述專利和申請的每ー個的內(nèi)容通過引用整體并入本文。載體還可包含哺乳動物復(fù)制起始位點以在染色體外維持載體并且在細(xì)胞中產(chǎn)生多個拷貝的載體。載體可以是來自茵維特羅根公司(圣地亞哥市，加利福尼亞州)的PVAXI (圖I)、pCEP4或pREP4，其可包含EB病毒復(fù)制起始位點和核抗原EBNA-I編碼區(qū)，其可產(chǎn)生高拷貝附加型復(fù)制而無整合。載體可以是具有變化例如參考上文中附圖簡述部分的圖I的段落中描述的變化的pVAXl。載體的主鏈可以是pAV0242。載體可以是復(fù)制缺陷型腺病毒5型(Ad5)載體。載體還可包含調(diào)控序列，其可以非常適用于在已將載體施入其中的哺乳動物或人細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)。共有血凝素編碼序列可包含密碼子，所述密碼子可允許編碼序列在宿主細(xì)胞中的更高效轉(zhuǎn)錄。載體可以是pSE420(茵維特羅根公司，圣地亞哥市，加利福尼亞州)，其可用于在大腸桿菌(Escherichia coli) (E. coli)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。載體還可以是pYES2 (茵維特羅根)，圣地亞哥市，加利福尼亞州)，其可用于在酵母的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。載體還可具有MAXBAC 完全桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(茵維特羅根，圣地亞哥市，加利福尼亞州)，其可用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。載體還可以是PcDNA I或pcDNA3(茵維特羅根，圣地亞哥市，加利福尼亞州)，其可用于在哺乳動物細(xì)胞例如中國倉鼠卵巣(CHO)細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。載體可以是利用常規(guī)技術(shù)和可容易獲得的起始材料(包括Sambrook等人,分子克隆和實驗室手冊■,第2版,冷泉港(Cold Spring Harbor)(1989)(將其通過引用并入本文))來產(chǎn)生蛋白質(zhì)的表達(dá)載體或系統(tǒng)。載體可以是pGX2009或pGX2006，其可用于表達(dá)共有血凝素抗原。載體pGX2009(4739bp，圖2 ;SEQ ID NO 5)為經(jīng)修飾的pVAXl質(zhì)粒，其具有編碼共有Hl蛋白(由SEQ ID NO :3編碼的氨基酸SEQ ID NO 4)酸的核酸序列，所述共有Hl蛋白包含連接于共有Hl氨基酸序列(由SEQ ID NO :I編碼的氨基酸SEQ ID NO 2)的IgE前導(dǎo)序列(由SEQID NO : 11 編碼的氨基酸 SEQ ID N0:12)。載體 pGX2006 (4628 bp ;圖 3，SEQ ID NO 8)為P VAXI質(zhì)粒，其具有編碼共有H2蛋白(由SEQ ID NO 6編碼的氨基酸SEQ ID NO 7)的核酸序列的質(zhì)粒。本文中公開的包括共有血凝素編碼序列的基因構(gòu)建體和組分可用于表達(dá)其它流感病毒蛋白質(zhì)例如甲型流感病毒111、!12、!13、!14、冊、冊、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、こ型流感病毒血凝素或神經(jīng)氨酸酶蛋白，由此包括替代共有血凝素編碼序列的甲型流感病毒蛋白H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、こ型流感病毒血凝素或神經(jīng)氨酸酶蛋白的編碼序列。4.藥物組合物本文中提供的是根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其包含約I納克至約IOmg的DNA。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 納克，或至少 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、 165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895·900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995 或 1000 微克，或至少 I. 5、2,2. 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5 或 IOmg 或更多；和 2)達(dá)到并且包括 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 納克，或達(dá)到并且包括 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885,890,895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995 或 1000 微克，或達(dá)到并且包括 I. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7. 5、8、8. 5、9、9. 5或10mg。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約IOmg的DNA。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約25納克至約5mg的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約50納克至約Img的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約O. I至約500微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約I至約350微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約5至約250微克的DNA。在ー些實施方案中，藥物組合物包含約10至約200微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約15至約150微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約20至約100微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約25至約75微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約30至約50微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約35至約40微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約10微克至約100微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約20微克至約80微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約25微克至約60微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約30納克至約50微克的DNA。在一些實施方案中，藥物組合物包含約35納克至約45微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含約O. I至約500微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含約I至約350微克的DNA。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含約25至約250微克的DNA。在ー些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA.根據(jù)待使用的施用模式配制根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在其中藥物組合物是可注射的藥物組合物的情況下，它們是無菌、無熱原和無顆粒的。優(yōu)選使用等滲制劑。通常，用于等滲性的添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖、山梨醇和乳糖。在一些情況下，等滲溶液例如磷酸緩沖鹽溶液是優(yōu)選的。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中，將血管添 加劑添加至制劑。優(yōu)選藥物組合物是疫苗，更優(yōu)選是DNA疫苗。本文中提供的是能夠在哺乳動物中產(chǎn)生抗ー種或多種流感病毒血清型的免疫反應(yīng)。疫苗可包含上述的基因構(gòu)建體。疫苗可包含多種載體，所述載體各自針對ー種或多種甲型流感病毒血清型例如H1-H16こ型流感病毒血凝素或其組合。疫苗可包含編碼ー種或多種共有血凝素抗原的ー個或多個核酸序列。當(dāng)疫苗包含超過ー種共有血凝素核酸序列吋，所有此類序列可存在于單個核酸分子上或每ー種這樣的序列可存在于不同的核酸分子上。或者，包含超過ー個的共有血凝素核酸序列的疫苗可包含具有單個共有血凝素核酸序列的核酸分子和具有超過ー個的共有血凝素核酸序列的核酸分子。此外，包含ー個或多個共有血凝素核酸序列的疫苗還可包含一種或多種選自HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9 和こ型流感病毒神經(jīng)氨酸酶的蛋白質(zhì)的編碼序列。在一些實施方案中，疫苗可包含蛋白質(zhì)。一些疫苗可包含ー種或多種共有血凝素抗原例如H1、H2、U2和BHA。疫苗可包含一種或多種選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9 和こ型流感病毒神經(jīng)氨酸酶的其它蛋白質(zhì)。疫苗可包含與一種或多種其它蛋白質(zhì)組合的ー種或多種共有血凝素抗原，所述其它蛋白質(zhì)選自 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、こ型流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶。疫苗可以是DNA疫苗。DNA疫苗可包含多個相同或不同的包含ー個或多個共有血凝素核酸序列的質(zhì)粒。DNA疫苗可包含ー個或多個編碼ー種或多種共有血凝素抗原的核酸序列。當(dāng)DNA疫苗包含超過ー個的共有血凝素核酸序列時，所有此類序列可存在于單個質(zhì)粒上，或每ー個此類序列可存在于不同質(zhì)粒上，或一些質(zhì)?？砂瑔蝹€共有血凝素核酸序列，然而其它質(zhì)粒具有超過ー個的共有血凝素核酸序列。此外，DNA疫苗還可包含一種或多種蛋白質(zhì)的ー個或多個共有編碼序列，所述蛋白質(zhì)選自甲型流感病毒H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、こ型流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶。此類額外的編碼序列彼此可存在于相同或不同的質(zhì)粒上和來自包含ー種或多種共有血凝素核酸序列的質(zhì)粒。在一些實施方案中，疫苗可包含編碼與流感病毒抗原組合的流感病毒抗原的核酸序列。在一些實施方案中，核酸序列編碼ー種或多種共有血凝素抗原例如H1、H2、U2和BHA。在一些實施方案中，核酸序列編碼ー種或多種選自甲型流感病毒Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、こ型流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，疫苗包含ー種或多種共有血凝素抗原例如H1、H2、U2和BHA。在一些實施方案中，疫苗包含ー種或多種選自甲型流感病毒H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、こ型流感病毒 血凝素和神經(jīng)氨酸酶的其它蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，疫苗包含3個或更多個共有血凝素核酸序列(包括編碼H1、H2、U2和BHA中的ー種或多種的核酸序列)的組合。在一些實施方案中，疫苗包含3個或更多個血凝素核酸序列(包括編碼共有U2、共有BHA和H3血凝素的核酸序列)的組合。在一些實施方案中，疫苗包含3個或更多個血凝素核酸序列(包括編碼共有BHA、Hl血凝素和H3血凝素的核酸序列)的組合。在一些實施方案中，疫苗包含一個或更多個編碼美國系列No. 12/375，518(將所述美國系列申請通過引用并入本文)和/或美國系列No. 12/269,824(將所述美國系列申請通過引用并入本文)中公開的ー種或多種流感病毒抗原的核酸序列。在一些實施方案中，疫苗包含編碼疫苗包含編碼SEQ ID NO :20(其為美國系列No. 12/375，518中公開的Hl血凝素，在該美國系列申請中分別為SEQ ID NO 36和SEQ ID NO :37)的核酸序列SEQ ID NO : 19和/或編碼SEQ ID NO :22 (其為在美國系列No. 12/269，824中公開的Hl血凝素，在該美國系列申請中分別為SEQ ID NO :9和SEQ IDNO 10)的核酸序列SEQ ID N0:21。在一些實施方案中，疫苗包含編碼SEQ ID NO :24(其為美國系列No. 12/269，824中公開的H3血凝素，在該美國系列申請中分別為SEQ ID NO
11和 SEQ ID NO 12)的核酸序列 SEQ ID NO :23。在一些實施方案中，疫苗包含3種或更多種共有血凝素蛋白(包括H1、H2、U2和BHA的ー種或多種)的組合。在一些實施方案中，疫苗包含3種或更多種血凝素蛋白(包括共有U2、共有BHA和H3血凝素)的組合。在一些實施方案中，疫苗包含3種或更多種血凝素蛋白(包括共有BHA、Hl血凝素和H3血凝素)的組合。在一些實施方案中，疫苗包含I種或更多種來自美國系列No. 12/375，518和/或美國系列No. 12/269，824的抗原。在一些實施方案中，疫苗包含SEQ ID NO 20和/或SEQ ID NO 22和/或SEQ ID NO :24。在一些實施方案中，疫苗包含I)共有血凝素U2蛋白和/或編碼所述共有血凝素U2蛋白的核酸序列，2)共有血凝素BHA蛋白和/或編碼所述共有血凝素BHA蛋白的核酸序列，和3) SEQ ID NO: 24中公開的血凝素H3蛋白的組合。在一些實施方案中，疫苗包含I)共有血凝素BHA蛋白和/或編碼所述共有血凝素BHA蛋白的核酸序列，2)具有SEQ ID NO: 20和/或SEQ ID NO :22的血凝素Hl蛋白和/或血凝素Hl蛋白編碼核酸序列SEQ ID N019和/或SEQ ID N0:21，和3)具有SEQ ID NO 24的血凝素H3蛋白和/或編碼在其中的核酸序列SEQ ID NO 23的血凝素H3蛋白的組合。DNA 疫苗公開于美國專利 No. 5，593，972,5, 739，118,5, 817，637,5, 830，876、5，962，428,5, 981，505,5, 580，859,5, 703，055 和 5，676，594(將所述專利通過引用整體并入本文)中。DNA疫苗還可包含抑制其整合入染色體的元件或試劑。疫苗可以是血凝素抗原的RNA?？蓪NA疫苗引入細(xì)胞。疫苗可以是包含上述的基因構(gòu)建體或抗原的重組疫苗。疫苗還可包含以ー種或多種蛋白質(zhì)亞基的形式存在的ー種或多種共有血凝素抗原，包含ー種或多種共有血凝素抗原的一種或多種殺死的流感病毒顆?；虬`種或多種共有血凝素抗原的一種或多種減毒的流感病毒顆粒。減毒的疫苗可以是減毒的活疫苗、殺死的疫苗和使用重組載體遞送編碼ー種或多種共有血凝素抗原的外源基因的疫苗，以及亞基和糖蛋白疫苗。減毒的活疫苗、使用重組載體遞送外來抗原的疫苗、亞基疫苗和糖蛋白疫苗描述于美國專利No. :4，510，245 ;4，797，368 ;4，722，848 ;4，790，987 ;4，920，209 ;5，017，487 ;5，077，044 ；5，110, 587 ;5，112，749 ;5，174，993 ;5，223，424 ;5，225，336 ;5，240, 703 ;5，242，829 ；5，294，441 ;5，294，548 ;5，310，668 ;5，387，7 44 ;5，389，368 ;5，424，065 ;5，451，499 ；5，453，364 ;5，462，734 ;5，470，734 ;5，474，935 ;5，482，713 ;5，591，439 ;5，643，579 ；5，650，309 ;5，698，202 ;5，955，088 ;6，034，298 ;6，042，836 ;6，156，319 和 6，589，529 (將所述專利各自通過引用并入本文)中。疫苗可包含針對來自世界特定地區(qū)例如亞洲的甲型流感病毒血清型的載體和/或蛋白質(zhì)。疫苗還可抗目前感染人的豬來源的甲型流感病毒血清型。疫苗可包含針對來自世界特定地區(qū)的こ型流感病毒的載體和/或蛋白質(zhì)。疫苗還可抗感染人的こ型流感病毒。疫苗可包含針對甲型和/或こ型流感病毒的ー個或多個病毒株的一種或多種載體和/或一種或多種蛋白質(zhì)。提供的疫苗還可用于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，包括治療性或預(yù)防性免疫反應(yīng)?？僧a(chǎn)生針對共有血凝素抗原，并且還廣泛地跨多個亞型的流感病毒的抗體和/或殺傷T細(xì)胞?？煞蛛x此類抗體和細(xì)胞。疫苗還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是功能性分子如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑(transfectionfacilitating agent)，其可包括表面活性劑例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐齊IJ、LPS類似物(包括單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰肽、醌類似物、囊泡例如角鯊烯和角鯊烯、透明質(zhì)酸)、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽離子或納米顆?；蚱渌阎霓D(zhuǎn)染促進(jìn)劑。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑為聚陰離子、聚陽離子，包括聚-L-谷氨酸鹽(LGS)或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑為聚-L-谷氨酸，和更優(yōu)選，聚-L-谷氨酸以低于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑還可包括表面活性劑例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰肽、醌類似物及囊泡例如角鯊烯和角鯊烯和透明質(zhì)酸)，還可將所轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑與基因構(gòu)建體結(jié)合施用。在一些實施方案中，DNA載體疫苗還可包括轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體(包括卵磷脂脂質(zhì)體或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它脂質(zhì)體，如DNA-脂質(zhì)體混合物(參見例如W09324640))、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽離子或納米顆?；蚱渌阎霓D(zhuǎn)染促進(jìn)劑。優(yōu)選，轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑為聚陰離子、聚陽離子(包括聚-L-谷氨酸鹽(LGS)或脂質(zhì))。疫苗中轉(zhuǎn)染劑的濃度低于4mg/ml，低于2mg/ml，低于lmg/ml，低于O. 750mg/ml，低于 O. 500mg/ml,低于 O. 250mg/ml,低于 O. 100mg/ml,低于 O. 050mg/ml 或低于 O. 010mg/ml。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是佐劑。佐劑可以是在替代性質(zhì)粒中表達(dá)的或以蛋白質(zhì)形式與疫苗中的上述質(zhì)粒組合地遞送的其它基因。佐劑可選自α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、Y-干擾素、血小板衍生生長因子PDGF)、TNFa、Τ,β、GM_CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細(xì)胞吸引趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達(dá)趨化因子(TECK)、粘膜相關(guān)上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86 (包括缺失信號序列和任選地包括來自IgE的信號肽的IL-15)。佐劑可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF α、Τ,β、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 或其組合?？梢允怯杏玫淖魟┑钠渌虬ň幋a如下物質(zhì)的基因MCP-l、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-I、Mac-Ι、ρ150· 95、PECAM、ICAM-U I CAM-2, I CAM-3, CD2、LFA-3、M-CSF, G-CSF, IL-4,IL-18的突變體形式、⑶40、⑶40L、血管生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF 受體、Flt、Apo-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LA RD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、天胱蛋白酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、滅活的 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素反應(yīng)基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl、TAP2 及其功能片段。疫苗還可包含1994年4月I日提交的美國系列No. 021，579 (將其通過引用并入本文)中描述的基因疫苗促進(jìn)劑。5.遞送的方法本文中提供的是用于遞送藥物制劑(優(yōu)選疫苗)，以用來提供包含表位的血凝素抗原的基因構(gòu)建體和蛋白質(zhì)的方法，所述表位使得所述血凝素抗原成為可對其誘導(dǎo)針對流感病毒感染的免疫反應(yīng)的特別有效的免疫原?？商峁┻f送疫苗或接種的方法以誘導(dǎo)治療和/或預(yù)防性免疫反應(yīng)。接種方法可在哺乳動物中產(chǎn)生抗多個流感病毒亞型(包括HlNl血清型例如2009豬源的H1N1)或其它季節(jié)性和/或大范圍流行病的變種的免疫反應(yīng)?？蓪⒁呙邕f送至個體以調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫系統(tǒng)的活性和增強(qiáng)免疫反應(yīng)。疫苗的遞送可以轉(zhuǎn)染以核酸分子的形式在細(xì)胞中表達(dá)并且被遞送至細(xì)胞表面的HA抗原，免疫系統(tǒng)可識別所述HA抗原并且誘導(dǎo)細(xì)胞、體液或細(xì)胞及體液反應(yīng)。疫苗的遞送可用于通過給哺乳動物施用本文中論述的疫苗來誘導(dǎo)或引發(fā)哺乳動物中的抗多種流感病毒的免疫反應(yīng)。在將疫苗遞送至哺乳動物，從而將載體遞送入哺乳動物的細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將表達(dá)和分泌相應(yīng)的流感病毒蛋白質(zhì)，包括共有抗原中的至少ー種，優(yōu)選地H1、H2、U2和BHA。此類分泌的蛋白質(zhì)或合成抗原將被免疫系統(tǒng)識別為外來物，其將引發(fā)免疫反應(yīng)，包括針對抗原產(chǎn)生的抗體和特異性針對抗原的T細(xì)胞反應(yīng)。在一些實例中，用本文中論述的疫苗接種的哺乳動物將有已接觸抗原的免疫系統(tǒng)并且當(dāng)用流感病毒株攻擊時，已接觸抗原的免疫系統(tǒng)將使得能夠快速消除隨后的流感病毒，無論是通過體液、細(xì)胞還是通過兩者?？蓪⒁呙邕f送至個體以調(diào)節(jié)個體的免疫系統(tǒng)的活性，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)?？梢訢NA疫苗的形式遞送疫苗，遞送DNA疫苗的方法描述于美國專利No. 4，945，050和5，036, 006 (將所述兩個專利通過引用整體并入本文)中?？山o哺乳動物施用疫苗以引發(fā)哺乳動物中的免疫反應(yīng)。哺乳動物可以為人、非人靈長類動物、牛、豬、綿羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、?？苿游?、鹿、刺猬、象、駱馬、羊駝、小鼠、大鼠或雞、并且優(yōu)選地為人、牛、豬或雞。a.聯(lián)合治療可將藥物組合物(優(yōu)選疫苗)與一種或多種其它流感病毒蛋白質(zhì)或編碼甲型流感病毒 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、NS、N9、こ型流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的基因聯(lián)合施用?？蓪⒁呙缗c蛋白質(zhì)或編碼佐劑的基因聯(lián)合施用，所述佐劑包括α -干擾素(IFN- α )、β -干擾素(IFN- β )、Y -干擾素、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNFa、Τ,β、GM_CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-U IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-U VLA-U Mac-U pl50. 95、PECAM、ICAM-U I CAM-2, ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變體形式、⑶40、⑶40L、血管生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo_3、 AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、天胱蛋白酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、滅活的 NIK、SAP K、SAP-1、JNK,干擾素反應(yīng)基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl或TAP2或其功能片段。b.施用途徑可通過不同途徑包括ロ服、胃腸外、舌下、經(jīng)皮膚、經(jīng)直腸、經(jīng)粘膜、局部、通過吸入、通過頰部施用、胸膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、鞘內(nèi)以及關(guān)節(jié)內(nèi)或其組合施用疫苗。對于獸醫(yī)學(xué)使用，可按照正常的獸醫(yī)學(xué)操作將組合物作為適當(dāng)?shù)乜山邮艿闹苿┦┯?。獸醫(yī)可容易地確定最適合于特定動物的給藥方案和施用途徑?？衫贸Ｒ?guī)注射器、無針注射設(shè)備、"微粒轟擊基因槍(microprojectile bombardment gone gun)"或其它物理方法例如電穿孔(“EP”)、“水動力學(xué)法”或超聲施用疫苗?？衫脦追N公知的技術(shù)包括DNA注射(也稱為DNA接種)(利用和不利用體內(nèi)電穿孔)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的、納米顆粒促進(jìn)的、重組載體例如重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組牛痘將疫苗的載體遞送至哺乳動物?？赏ㄟ^DNA注射連同體內(nèi)電穿孔一起遞送HA抗原。c.電穿孔可使用電穿孔設(shè)備來實現(xiàn)通過疫苗的質(zhì)粒的電穿孔施用疫苗，所述電穿孔設(shè)備可被構(gòu)造成將有效地引起可逆的孔在細(xì)胞膜上形成的能量脈沖遞送至哺乳動物的期望的組織，并且優(yōu)選地能量脈沖是與由用戶預(yù)設(shè)的電流輸入相似的恒定電流。電穿孔設(shè)備可包括電穿孔組件和電極部件或操作部件(handle assembly)。電穿孔組件可包括和整合電穿孔設(shè)備的各種元件中的ー個或多個元件，包括控制器、電流波形發(fā)生器、阻抗檢測器、波形記錄器、輸入元件、狀態(tài)報告元件、通信端ロ、存儲器組件(memory component)、電源和電源開關(guān)。電穿孔可使用體內(nèi)電穿孔設(shè)備例如CEL.LECTRA EP系統(tǒng)(VGX制藥公司(VGX Pharmaceuticals)，布魯貝爾市(Blue Bell),賓夕法尼亞州)或Elgen電穿孔儀(electroporator) (Genetronics,圣地亞哥市，加利福尼亞州)來實現(xiàn)以有利于質(zhì)粒對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。電穿孔組件可用作電穿孔設(shè)備的ー個元件，并且其它元件是與電穿孔組件是與與穿孔組件連通的獨立元件(或組件)。電穿孔組件可用作電穿孔設(shè)備的超過ー個的元件，其可與電穿孔設(shè)備的與電穿孔組件分開的其它元件連通。作為ー個電機(jī)或機(jī)器設(shè)備的部件存在的電穿孔設(shè)備的元件可以不受限制，因為所述元件可用作一個設(shè)備或用作彼此連通的獨立元件。電穿孔組件可以能夠?qū)⑦f送在期望的組織中產(chǎn)生恒定電流并且包括反饋機(jī)制的能量脈沖。電極部件可包括在空間排列中具有多個電極的電極陣列，其中電極裝配件接收來自電穿孔組件的能量脈沖并且將所述能量脈沖通過電極遞送至期望的組織。多個電極的至少ー個在能量脈沖的遞送過程中是中性的并且測量期望組織的阻杭，將阻抗通信傳送至電穿孔組件。反饋機(jī)制可接收測量的阻抗并且可調(diào)整通過電穿孔組件遞送的能量脈沖以維持恒定電流。多個電極可以以分散模式遞送能量脈沖。多個電極可通過在編程序列(programmed sequence)下控制電極來以分散模式遞送能量脈沖，并且所述編程序列由用 戶輸入至電穿孔組件。編程序列可包括多個按順序遞送的泳沖，其中利用至少兩個有源電極(具有ー個測量阻抗的中性電極)遞送多個脈沖的每ー個脈沖，并且其中利用至少兩個有源電極(具有ー個測量阻抗的中性電極)中的不同電極遞送多個脈沖的后續(xù)脈沖。反饋機(jī)制可利用硬件或軟件來進(jìn)行。反饋機(jī)制可通過模擬閉環(huán)電路來進(jìn)行。反饋姆50 ys、20 ys、10 ys或Iys發(fā)生一次,但優(yōu)選實時反饋或瞬時反饋(即，大體上同時，如通過用于測定反應(yīng)時間的可獲得的技術(shù)測量的)。中性電極可測量期望的組織中的阻抗和將阻抗通信傳送至反饋機(jī)制，并且反饋機(jī)制對阻抗作出反應(yīng)并且調(diào)節(jié)能量脈沖以將恒定電流維持在與預(yù)設(shè)電流相似的值上。反饋機(jī)制可在能量脈沖的遞送過程中連續(xù)和即時地維持恒定電流。可幫助本發(fā)明的DNA疫苗遞送的電穿孔設(shè)備和電穿孔方法的實例包括Draghia-Akli等人的美國專利No. 7，245，963、由Smith等人提交的美國專利公布2005/0052630(將所述專利和專利公布的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中描述的電穿孔設(shè)備和方法?？捎糜趲椭鶧NA疫苗的遞送的其它電穿孔設(shè)備和電穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未決和共同擁有的美國專利申請系列No. 11/874072(其根據(jù)35USC119(e)要求2006年10月17日提交的美國專利申請系列No. 60/852, 149和2007年10月10日提交的美國專利申請系列No. 60/978，982的利益)(將所述申請均通過引用整體并入本文)中提供的電穿孔設(shè)備和電穿孔方法。Draghia-Akli等人的美國專利No. 7，245，963描述了標(biāo)準(zhǔn)電極系統(tǒng)及它們用于幫助將生物分子引入身體或植物中的選定組織的細(xì)胞的用途。標(biāo)準(zhǔn)電極系統(tǒng)可包括多個針電極；皮下針頭；提供從可編程的恒定電流脈沖控制器至多個針電極的導(dǎo)電油墨的電接插件(electrical connector);和電源。操作者可抓住安裝在支持結(jié)構(gòu)上的多個針電極,并且將它們牢固地插入身體或植物的選定組織。隨后通過皮下針頭將生物分子遞送入選定組織。激活可編程的恒定電流脈沖控制器，并且將恒定電流電脈沖施加至多個針電扱。施加的恒定電流電脈沖幫助將生物分子引入多個電極之間的細(xì)胞。將美國專利No. 7，245，963的全部內(nèi)容通過引用并入本文。由Smith等人提交的美國專利公布2005/0052630描述了可用于有效地幫助將生物分子引入身體或植物的選定組織的細(xì)胞內(nèi)的電穿孔設(shè)備。電穿孔設(shè)備包括其操作由軟件或固件指定的電動設(shè)備("EKD設(shè)備")。EKD設(shè)備基于用戶控制和脈沖參數(shù)的輸入在陣列中的電極之間產(chǎn)生一系列可編程的恒定電流脈沖模式，并且允許貯存和獲取電流波形數(shù)據(jù)。電穿孔設(shè)備還包括具有針電極的陣列的可替換電極盤、用于注射針頭的中央注射通道和可移動的導(dǎo)盤。將美國專利公布2005/0052630的全部內(nèi)容通過引用并入本文。可將美國專利No. 7，245，963和美國專利公布2005/0052630中描述的電極陣列和方法改造以適用于不僅深入穿透組織例如肌肉，而且還深入穿透其它組織或器官。由于電極陣列的構(gòu)型的原因，因此也將注射針(遞送選擇的生物樣品)完全插入靶器官，并且在用電極預(yù)先界定的區(qū)域中垂直于靶組織進(jìn)行注射。美國專利No. 7，245，963和美國專利公布2005/005263中描述的電極優(yōu)選為20mm長并且為21規(guī)。此外，在一些實施方案中涉及整合電穿孔設(shè)備及其用途，存在為下列專利中描述的設(shè)備的電穿孔設(shè)備1993年12月28日發(fā)布的美國專利5，273，525、2000年8月29日發(fā)布的美國專利6，110，161、2001年7月17日發(fā)布的6，261，281以及2005年10月25日發(fā)布的6，958，060和2005年9月6日發(fā)布的美國專利6，939，862。此外，在本文中涉及覆蓋 2004年2月24日發(fā)布的美國專利6，697，669 (其涉及使用多種設(shè)備的任一設(shè)備遞送DNA)和2008年2月5日提交的美國專利7，328，064 (涉及注射DNA的方法)中提供的主題的專利。將上述專利通過引用整體并入本文。d.制備疫苗的方法本文中提供的是用于制備包含本文中論述的DNA疫苗的DNA質(zhì)粒的方法。在最終亞克隆入哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒的步驟后，可使用本領(lǐng)域已知的方法將DNA質(zhì)粒用于在大規(guī)模發(fā)酵罐中接種細(xì)胞培養(yǎng)物?？墒褂靡阎O(shè)備和技術(shù)的組合配制或制備與本發(fā)明的EP設(shè)備一起使用的DNA質(zhì)粒，但優(yōu)選使用在2007年5月23日提交的批準(zhǔn)的共同未決的美國臨時申請美國系列No. 60/939, 792中描述的最優(yōu)化質(zhì)粒制備技術(shù)制備它們。在一些實施例中，可以以大于或等于10mg/mL的濃度配制這些研究中使用的DNA質(zhì)粒。除了美國系列No. 60/939792中描述的設(shè)備和方案(包括在2007年7月3日發(fā)布的批準(zhǔn)的專利美國專利No. 7，238，522中描述的設(shè)備和方案)タト，制備技術(shù)還包括或整合對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說通常是已知的各種設(shè)備和方案。通過將上述申請和專利(分別地美國系列No. 60/939，792和美國專利No. 7，238，522)通過引用整體并入本文。
實施例還在下列實施例中對本發(fā)明進(jìn)行了舉例說明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例雖然表示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅以舉例說明的方式給出。根據(jù)上文中的論述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的基本特征，并且在不背離其精神和范圍下，可對本發(fā)明進(jìn)行任何改變和變動以使之適合于各種用法和條件。因此，根據(jù)上述說明，除了本文中顯示和描述的變動外的本發(fā)明的各種變動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很顯然的。此類變動也意欲落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實施例IpGX2009 (ρΗ1ΗΑ09)-編碼2009H1N1流感病毒(豬流感病毒)血凝素抗原的質(zhì)粒
pGX2009 (H1HA09)的主鏈為處于巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動子控制之下的經(jīng)修飾的表達(dá)載體PVAXl (茵維特羅根公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)。原始pVAXl購自茵維特羅根公司(目錄編號V260-20)并且于_20°C下維持。如上文中所指出的，序列分析顯示用作pGX2009的主鏈的pVAXl的序列與可從茵維特羅根公司獲得的pVAXl序列之間的差
異。差異不于上文中。質(zhì)粒PGX2009 (也稱為ρΗ1ΗΑ09)包含編碼共有2009H1N1流感病毒(豬流感病毒)血凝素分子的核酸序列。用于產(chǎn)生共有序列的79個基本序列選自流感病毒序列數(shù)據(jù)庫。編碼各種甲型流感病毒血凝素Hl蛋白的核苷酸序列以及由所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列的登錄號在GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)于下列登錄號。不在括號中的登錄號公開了核苷酸序列和由它們編碼的額外列的氨基酸序列。括號內(nèi)的登錄號表示GenBank的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)氨基酸序列的條目。 登錄號如下GQ323579.I (ACS72657. I)、GQ323564. I (ACS72654. I)、GQ323551. I(ACS72652. I)、GQ323530. I(ACS72651. I)、GQ323520. I(ACS72650. I)、GQ323495. I(ACS72648. I)、GQ323489. I(ACS72647. I)、GQ323486. I(ACS72646. I)、GQ323483. I(ACS72645. I)、GQ323455. I(ACS72641. I)、GQ323451. I(ACS72640. I)、GQ323443. I(ACS72638. I)、GQ293077. I(ACS68822. I)、GQ288372. I(ACS54301. I)、GQ287625. I(ACS54262. I)、GQ287627. I(ACS54263. I)、GQ287623. I(ACS54261. I)、GQ287621. I(ACS54260. I)、GQ286175. I(ACS54258. I)、GQ283488. I(ACS50088. I)、GQ280797. I(ACS45035. I)、GQ280624. I(ACS45017. I)、GQ280121. I(ACS45189. I)、GQ261277. I(ACS34968. I)、GQ253498. I(ACS27787. I)、GQ323470. I(ACS72643. I)、GQ253492. I(ACS27780. I)、FJ981613. I(ACQ55359. I)、FJ971076. I(ACP52565. I)、FJ969540. I(ACP44189. I)、FJ969511. I(ACP44150. I)、FJ969509. I(ACP44147. I)、GQ255900. I(ACS27774. I)、GQ255901. I(ACS27775. I)、FJ966974. I(ACP41953. I)、GQ261275. I(ACS34967. I)、FJ966960. I(ACP41935. I)、FJ966952. I(ACP41926. I)、FJ966082. I(ACP41105. I)、GQ255897. I(ACS27770. I)、CY041645. I(ACS27249. I)、CY041637. I(ACS27239. I)、CY041629 (ACS27229. I)、GQ323446. I(ACS72639. I)、CY041597. I (ACS27189. I)、CY041581. I (ACS14726. I)、CY040653. I (ACS14666. I)、CY041573. I (ACS14716. I)、CY041565. I (ACS14706. I)、CY041541. I (ACS14676. I)、GQ258462. I (ACS34667. I)、CY041557. I(ACS14696. I)、CY041549. I (ACS14686. I)、GQ283484. I (ACS50084. I)、GQ283493. I (ACS50095. I)、GQ303340. I (ACS71656. I)、GQ287619. I (ACS54259. I)、GQ267839. I (ACS36632. I)、GQ268003. I (ACS36645. I)、CY041621. I (ACS27219. I)、CY041613. I (ACS27209. I)、CY041605. I (ACS27199. I)、FJ966959. I (ACP41934. I)、FJ966982. I (ACP41963. I)、CY039527.2 (ACQ45338. I)、FJ981612. I (ACQ55358. I)、FJ981615. I(ACQ55361. I)、FJ982430. I (ACQ59195. I)、FJ998208. I (ACQ73386. I)、GQ259909. I (ACS34705. I)、GQ261272. I(ACS34966. I)、GQ287621. I (ACS54260. I)、GQ290059. I (ACS66821. I)、GQ323464. I (ACS72642. I)、GQ323473. I (ACS72644. I)、GQ323509. I (ACS72649. I)、GQ323560. I (ACS72653. I)、GQ323574. I (ACS72655. I)和 GQ323576. I (ACS72656. I)。從 NCBI 序列數(shù)據(jù)庫下載氨基酸序列，使用Clustal X產(chǎn)生比對和共有序列。將高效前導(dǎo)序列(IgE前導(dǎo)序列)在讀框內(nèi)融合至起始密碼子的上游以幫助表達(dá)。為了具有高水平的表達(dá)，使該融合基因的密碼子使用(codon usage)適合于智人基因的密碼子偏性。此外，也進(jìn)行RNA最優(yōu)化避免具有極高(>80%)或極低(く 30% )GC含量的區(qū)域和順式作用序列基序例如內(nèi)部TATA盒、chi位點和核糖進(jìn)入位點的區(qū)域。在Geneart (雷根斯堡市(Regensburg),德國)合成產(chǎn)生完整序列。合成的工程化H1HA09基因在長度上為1818bp(SEQ ID NO 1)并且由Geneart將其在BamHI和XhoI位點克隆入pVAXl (圖2)。實施例2利用A/Mexico/InDRE4487/2009攻擊流感病毒pGX2009免疫的雪貂使用雪貂(優(yōu)選的流感模型)進(jìn)行攻擊實驗。使用質(zhì)粒PGX2009免疫雪貂。動物4組x5只動物/組+ —個具有4只動物的對照組=總共24只雪貂(雄性)持續(xù)時間18周(包括攻擊) 劑量2mg質(zhì)粒方案概述將雪貂隨機(jī)分配至DNA疫苗組中。在研究的第O天、第28天和第56天免疫動物。按照批準(zhǔn)的麻酔方案用氯胺酮/咪達(dá)唑侖混合物、異氟醚或等同物麻醉動物，利用流感病毒DNA疫苗組合進(jìn)行IM接種。使用CELLECTRA 適應(yīng)性恒定電流電穿孔(EP)設(shè)備以O(shè). 5Amp, 52毫秒的脈沖,脈沖之間O. 2秒,4秒的點火延遲(firing delay),總共3個脈沖，對組I和2立即進(jìn)行電穿孔。對照動物是首次接觸實驗的對照(無質(zhì)粒，無EP)。使雪貂在它們的籠中從麻醉恢復(fù)，密切監(jiān)控其24小時以確保完全恢復(fù)。在整個實驗期間食物和水可隨意獲得。在第84天,通過利用ImlMXlO (A/Mexico/InDRE4487/2009 ；5x 105PFU/ml)的鼻內(nèi)感染攻擊動物。使用已建立和批準(zhǔn)的評分表每天監(jiān)測動物的臨床體征(體重、溫度等)。在轉(zhuǎn)染后第1、3、6、9和15天進(jìn)行鼻洗滌，收集直腸拭子。在第15天收集肺。將樣品貯存在RNAlater中(以在進(jìn)行實時PCR時，用于病毒上樣)，貯存在培養(yǎng)基中(用于感染性病毒(TCDI50))和貯存在福爾馬林中(以當(dāng)適當(dāng)時進(jìn)行組織學(xué)分析)。圖4顯示利用經(jīng)免疫的雪貂(3次免疫)的血清進(jìn)行的血凝抑制測定。大于I : 40的滴度被認(rèn)為是“陽性的”。虛線表示I : 40標(biāo)志。所有動物在3次免疫后高于I : 40標(biāo)志。圖5顯示利用新型HlNl株MX10(A/Mexico/InDRE4487/2009)攻擊經(jīng)免疫的和未經(jīng)免疫的雪貂的結(jié)果。全部經(jīng)免疫的雪貂都存活，然而75%的首次接觸實驗的雪貂在15天的時間內(nèi)死亡。
權(quán)利要求
1.一種包含一個或多個核酸序列的分離的核酸分子，所述核酸序列選自 a)選自SEQID NO :1，與SEQ ID NO : I具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的片段具有95%同源性的核酸序列； b)核酸序列選自SEQID NO :3，與SEQ ID NO :3具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 3的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 3的片段具有95%同源性的核酸序列； c)核酸序列選自SEQID NO :6，與SEQ ID NO :6具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 6的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 6的片段具有95%同源性的核酸序列； d)核酸序列選自SEQID NO :9，與SEQ ID NO :9具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 9的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 9的片段具有95%同源性的核酸序列； e)核酸序列選自SEQID NO: 11，與SEQ ID NO : 11具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO : 11的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO : 11的片段具有95%同源性的核酸序列； f)核酸序列選自SEQID NO:13，與SEQ ID NO :13具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 13的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 13的片段具有95%同源性的核酸序列；和 g)核酸序列選自SEQID NO:15，與SEQ ID NO :15具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 15的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 15的片段具有95%同源性的核酸序列。
2.權(quán)利要求I所述的分離的核酸分子，其包含選自SEQID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :15 的核酸序列。
3.權(quán)利要求I所述的分離的核酸分子，其包含核酸序列，所述核酸序列選自與SEQIDNO: I具有95%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO :3具有95%同源性的核酸序列，與SEQ IDNO :6具有95%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO :9具有95%同源性的核酸序列，與SEQ IDNO: 11具有95%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO : 13具有95%同源性的核酸序列和與SEQID NO 15具有95%同源性的核酸序列。
4.權(quán)利要求I所述的分離的核酸分子，其包含核酸序列，所述核酸序列選自與SEQIDNO: I具有98%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO :3具有98%同源性的核酸序列，與SEQ IDNO :6具有98%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO :9具有98%同源性的核酸序列，與SEQ IDNO: 11具有98%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO : 13具有98%同源性的核酸序列和與SEQID NO 15具有98%同源性的核酸序列。
5.權(quán)利要求I所述的分離的核酸分子，其包含選自SEQID NO 1, SEQ ID NO 6, SEQID NO 9, SEQ ID NO :13和SEQ ID NO :15的核酸序列和編碼IgE前導(dǎo)序列的核酸序列。
6.一種表達(dá)載體，其包含有效地連接于調(diào)控元件的根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸序列。
7.—種表達(dá)載體，其包含有效地連接于在人細(xì)胞中具有功能的調(diào)控元件的根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體為質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體為pGX2009。
10.一種組合物，其包含 a)多種一個或多個包含一個或多個核酸序列的核酸分子，所述核酸序列選自 i)選自SEQID NO :1，與SEQ ID NO : I具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: I的片段具有95%同源性的核酸序列； ii)核酸序列選自SEQID NO :3，與SEQ ID NO :3具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 3的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 3的片 段具有95%同源性的核酸序列； iii)核酸序列選自SEQID NO :6，與SEQ ID NO :6具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 6的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 6的片段具有95%同源性的核酸序列； iv)核酸序列選自SEQID NO :9，與SEQ ID NO :9具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 9的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 9的片段具有95%同源性的核酸序列； V)核酸序列選自SEQ ID NO: 11，與SEQ ID NO : 11具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO : 11的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO : 11的片段具有95%同源性的核酸序列； vi)核酸序列選自SEQID NO:13，與SEQ ID NO :13具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 13的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO 13的片段具有95%同源性的核酸序列；和 vii)核酸序列選自SEQID NO:15，與SEQ ID NO :15具有95%同源性的核酸序列；包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO : 15的片段，和與包含至少60個核苷酸的SEQ ID NO: 15的片段具有95%同源性的核酸序列；和 b)一個或多個編碼一種或多種蛋白質(zhì)的額外核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自如下的一種或多種甲型流感病毒血凝素Hl、甲型流感病毒血凝素H2、甲型流感病毒血凝素H3、甲型流感病毒H4、甲型流感病毒血凝素H5、甲型流感病毒血凝素H3、甲型流感病毒血凝素H5，甲型流感病毒NI......甲型流感病毒血凝素H6、甲型流感病毒血凝素H7、甲型流感病毒血凝素H5、甲型流感病毒血凝素H6、甲型流感病毒血凝素H7、甲型流感病毒血凝素HS、甲型流感病毒血凝素H9、甲型流感病毒血凝素HlO、甲型流感病毒血凝素HlI、甲型流感病毒血凝素H12、甲型流感病毒H13、甲型流感病毒血凝素H14、甲型流感病毒血凝素H15，甲型流感病毒血凝素H16、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶NI、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N2、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N3、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N4、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N5、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N6、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N7、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶NS、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N9、乙型流感病毒血凝素和乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶。
11.權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述一個或多個額外的核酸序列存在于多種一個或多個不同的核酸分子上，所述不同的核酸分子來自部分a)中所示的多種核酸分子。
12.權(quán)利要求10所述的組合物，其中部分a)中所示的所述多種核酸分子包括一個或多個選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 11、SEQ IDNO 13和SEQ ID NO :15的核酸序列。
13.權(quán)利要求10所述的組合物，其中部分a)中所示的所述多種核酸分子包括一個或多個核酸序列，所述核酸序列選自與SEQ ID NO: I具有95%同源性的核酸序列，與SEQ IDNO :3具有95%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO :6具有95%同源性的核酸序列，與SEQ IDNO :9具有95%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO :11具有95%同源性的核酸序列，與SEQID NO :13具有95%同源性的核酸序列和與SEQ ID NO :15具有95%同源性的核酸序列。
14.權(quán)利要求10所述的組合物，其中部分a)中所示的所述多種核酸分子包括一個或多個核酸序列，所述核酸序列選自與SEQ ID NO : I具有98%同源性的核酸序列，與SEQ IDNO :3具有98%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO :6具有98%同源性的核酸序列，與SEQ IDNO :9具有98%同源性的核酸序列，與SEQ ID NO :11具有98%同源性的核酸序列，與SEQID NO :13具有98%同源性的核酸序列和與SEQ ID NO :15具有98%同源性的核酸序列。
15.權(quán)利要求10所述的組合物，其中a)和b)中所示的所述核酸序列各自有效地連接于調(diào)控元件。
16.權(quán)利要求10所述的組合物，其中a)和b)中所示的所述核酸序列各自有效地連接于在人細(xì)胞中具有功能的調(diào)控元件。
17.權(quán)利要求10所述的組合物，其中a)和b)中所示的所述核酸序列為一種或多種表達(dá)載體的部分。
18.權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述一種或多種表達(dá)載體為質(zhì)粒。
19.權(quán)利要求10所述的組合物，其包含pGX2009和/或pGX2006。
20.權(quán)利要求10所述的組合物，其包含如下序列中的一個或多個 包含SEQ ID NO 1的核酸序列； 包含SEQ ID NO 6的核酸序列； 包含SEQ ID NO 9的核酸序列； 包含SEQ ID NO 13的核酸序列； 編碼甲型流感病毒血凝素Hl的核酸序列；和 編碼甲型流感病毒血凝素H3的核酸序列。
21.權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述編碼甲型流感病毒血凝素Hl的核酸序列包含SEQ ID NO :21并且所述編碼甲型流感病毒血凝素H3的核酸序列包含SEQ ID NO :23。
22.權(quán)利要求20所述的組合物，其包含 包含SEQ ID NO 9的核酸分子； 包含SEQ ID NO 13的核酸分子；和 包含SEQ ID NO 23的核酸分子。
23.權(quán)利要求22所述的組合物，其中 所述包含SEQ ID NO 9的核酸分子為質(zhì)粒； 所述包含SEQ ID NO 13的核酸分子為質(zhì)粒；和 所述包含SEQ ID NO 23的核酸分子為質(zhì)粒。
24.一種誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括給個體施用包含權(quán)利要求I所述的核酸序列的核酸分子的步驟。
25.一種誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括給個體施用包含權(quán)利要求10所述的組合物的步驟。
26.一種誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，包括給個體施用包含權(quán)利要求23所述的組合物的步驟。
27.一種保護(hù)個體免受豬來源的人甲型流感病毒株的感染的方法，包括以下步驟 給所述個體施用預(yù)防有效量的包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列選自SEQ ID NO :1， 與SEQ ID NO 1具有95%同源性的核酸序列； SEQ ID NO 1 的片段， 與SEQ ID NO 1的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :9， 與SEQ ID NO 9具有95%同源性的核酸序列； SEQ ID NO 9的片段，和 與SEQ ID NO 9的片段具有95%同源性的核酸序列； 其中所述核酸序列在所述個體的細(xì)胞中表達(dá)并且誘導(dǎo)了針對所述蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)是抗豬來源的人甲型流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
28.一種保護(hù)個體免受豬來源的人甲型流感病毒株的感染的方法，包括以下步驟 給所述個體施用預(yù)防有效量的組合物，所述組合物包含 a)第一核酸序列，其選自SEQ ID NO :1， 與SEQ ID NO 1具有95%同源性的核酸序列； SEQ ID NO 1 的片段， 與SEQ ID NO : I的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :9， 與SEQ ID NO 9具有95%同源性的核酸序列； SEQ ID NO 9的片段，和 與SEQ ID NO 9的片段具有95%同源性的核酸序列；和 b)一個或多個編碼一種或多種蛋白質(zhì)的額外核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自甲型流感病毒血凝素Hl、甲型流感病毒血凝素H2、甲型流感病毒血凝素H3、甲型流感病毒H4、甲型流感病毒血凝素H5、甲型流感病毒血凝素H3、甲型流感病毒血凝素H5、甲型流感病毒NI...甲型流感病毒血凝素H6、甲型流感病毒血凝素H7，甲型流感病毒血凝素H5、甲型流感病毒血凝素H6、甲型流感病毒血凝素H7、甲型流感病毒血凝素HS、甲型流感病毒血凝素H9、甲型流感病毒血凝素HlO、甲型流感病毒血凝素HlI、甲型流感病毒血凝素Hl2、甲型流感病毒H13、甲型流感病毒血凝素H14、甲型流感病毒血凝素H15、甲型流感病毒血凝素H16、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶NI、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N2、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N3、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N4、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N5、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N6、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N7、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶NS、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N9、乙型流感病毒血凝素和乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶； 其中所述第一核酸序列在所述個體的細(xì)胞中表達(dá)并且誘導(dǎo)了針對所述第一蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)是抗豬來源的人甲型流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)，所述一個或多個額外的核酸序列在所述個體的細(xì)胞中表達(dá)并且誘導(dǎo)了抗所述一種或多種第二蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述組合物包含如下序列中的一個或多個 包含SEQ ID NO 1的核酸序列； 包含SEQ ID NO 9的核酸序列； 包含SEQ ID NO 13的核酸序列； 編碼甲型流感病毒血凝素Hl的核酸序列；和 編碼甲型流感病毒血凝素H3的核酸序列。
30.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述編碼甲型流感病毒血凝素Hl的核酸序列包含SEQ ID NO :21并且所述編碼甲型流感病毒血凝素H3的核酸序列包含SEQ ID NO :23。
31.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述組合物包含如下分子中的一個或多個 包含SEQ ID NO 9的核酸分子； 包含SEQ ID NO 13的核酸分子；和 包含SEQ ID NO 23的核酸分子。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中 所述包含SEQ ID NO 9的核酸分子為質(zhì)粒； 所述包含SEQ ID NO 13的核酸分子為質(zhì)粒；和 所述包含SEQ ID NO 23的核酸分子為質(zhì)粒。
33.一種治療已被豬來源的人甲型流感病毒株感染的個人的方法，包括以下步驟 給所述個體施用治療有效量的包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列選自SEQ ID NO :1， 與SEQ ID NO 1具有95%同源性的核酸序列； SEQ ID NO 1 的片段， 與SEQ ID NO : I的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :9， 與SEQ ID NO 9具有95%同源性的核酸序列； SEQ ID NO 9的片段，和 與SEQ ID NO 9的片段具有95%同源性的核酸序列； 其中所述核酸序列在所述個體的細(xì)胞中表達(dá)并且誘導(dǎo)了針對所述蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)是抗豬來源的人甲型流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
34.一種治療已被豬來源的人甲型流感病毒株感染的個人的方法，包括以下步驟 給所述個體施用治療有效量的組合物，所述組合物包含 a)第一核酸序列，其選自SEQ ID NO :1， 與SEQ ID NO 1具有95%同源性的核酸序列； SEQ ID NO 1 的片段， 與SEQ ID NO : I的片段具有95%同源性的核酸序列；SEQ ID NO :9，與SEQ ID NO 9具有95%同源性的核酸序列； SEQ ID NO 9的片段，和 與SEQ ID NO 9的片段具有95%同源性的核酸序列；和 b)一個或多個編碼一種或多種蛋白質(zhì)的額外核酸序列，所述蛋白質(zhì)選自甲型流感病毒血凝素H1、甲型流感病毒血凝素H2、甲型流 感病毒血凝素H3、甲型流感病毒H4、甲型流感病毒血凝素H5、甲型流感病毒血凝素H3、甲型流感病毒血凝素H5、甲型流感病毒NI......甲型流感病毒血凝素H6、甲型流感病毒血凝素H7、甲型流感病毒血凝素H5、甲型流感病毒血凝素H6、甲型流感病毒血凝素H7、甲型流感病毒血凝素HS、甲型流感病毒血凝素H9、甲型流感病毒血凝素H10、甲型流感病毒血凝素H11、甲型流感病毒血凝素H12，甲型流感病毒H13、甲型流感病毒血凝素H14、甲型流感病毒血凝素H15，甲型流感病毒血凝素H16、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶NI、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N2、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N3、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N4、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N5、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N6、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N7、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶NS、甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶N9、乙型流感病毒血凝素和乙型流感病毒神經(jīng)氨酸酶； 其中所述第一核酸序列在所述個體的細(xì)胞中表達(dá)并且誘導(dǎo)了針對所述第一蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)是抗豬來源的人甲型流感病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)，所述一個或多個額外的核酸序列在所述個體的細(xì)胞中表達(dá)并且誘導(dǎo)了抗所述一種或多種第二蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述組合物包含如下序列中的一個或多個 包含SEQ ID NO 1的核酸序列； 包含SEQ ID NO 9的核酸序列； 包含SEQ ID NO 13的核酸序列； 編碼甲型流感病毒血凝素Hl的核酸序列；和 編碼甲型流感病毒血凝素H3的核酸序列。
36.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述編碼甲型流感病毒血凝素Hl的核酸序列包含SEQ ID NO :21并且所述編碼甲型流感病毒血凝素H3的核酸序列包含SEQ ID NO :23。
37.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述組合物包含如下分子中的一個或多個 包含SEQ ID NO 9的核酸分子； 包含SEQ ID NO 13的核酸分子；和 包含SEQ ID NO 23的核酸分子。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中 所述包含SEQ ID NO 9的核酸分子為質(zhì)粒； 所述包含SEQ ID NO 13的核酸分子為質(zhì)粒；和 所述包含SEQ ID NO 23的核酸分子為質(zhì)粒。
全文摘要
本文中提供的是編碼HA血凝素的新型共有氨基酸序列的核酸序列，以及表達(dá)所述序列的基因構(gòu)建體/載體和疫苗。本文中還提供的是用于使用所提供的疫苗產(chǎn)生抗一種或多種甲型流感病毒血清型的免疫反應(yīng)的方法。
文檔編號A61K48/00GK102753200SQ201180007288
公開日2012年10月24日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者D·B·韋納, M·P·莫羅, 嚴(yán)健 申請人:賓夕法尼亞大學(xué)托管會