專利名稱：放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌細(xì)胞特異性高蓄積的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，還涉及含有該抗體的癌治療藥物和癌診斷藥物。
背景技術(shù)：
癌位居死亡原因的第一位，因而希求新的治療方法。作為癌的治療方法，有外科治療法、放射線治療法、化學(xué)治療法(抗癌劑)，但在外科手術(shù)后也可以采用由抗癌劑進(jìn)行的治療。作為抗癌劑，可以使用烷基化劑、代謝拮抗劑、生物堿類抗癌劑、抗生物質(zhì)抗癌劑、鉬制劑等，但這些抗癌劑的治療效果還不能說是充分的，存在非癌細(xì)胞特異性、副作用發(fā)生 頻率高的問題。從這樣的觀點(diǎn)出發(fā)，希望開發(fā)更優(yōu)異的抗癌劑。另一方面,I丐粘素(Cadherin)是在細(xì)胞表面表達(dá)的Ca2+依賴性的粘合分子。在該鈣粘素中，已知有E鈣粘素、N鈣粘素、P鈣粘素(CDH3)等典型的鈣粘素，此外還有原鈣粘素、橋粒鈣粘素等。已知這些鈣粘素同源結(jié)合而形成粘附、連接，通過細(xì)胞內(nèi)的連環(huán)蛋白與細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)(肌動(dòng)蛋白纖維)連接，據(jù)認(rèn)為通過這樣的機(jī)理控制著細(xì)胞粘合。另外，除了細(xì)胞粘合以外，鈣粘素?fù)?jù)認(rèn)為也參與胚胎發(fā)生、形態(tài)發(fā)生、突觸形成、突觸可塑性，還參與癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。因此，有報(bào)告抗鈣粘素抗體在癌治療中是有用的(專利文獻(xiàn)I 3)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特表2005-522982號公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特表2008-538909號公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :日本特表2009-528257號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題但是，抗鈣粘素抗體的抗癌效果不能說是充分的，因而希望開發(fā)更優(yōu)異的癌治療藥物。因此，本發(fā)明的課題在于提供一種癌組織蓄積性高的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，以其為有效成分的抗癌效果高的癌治療藥物、和在其有效性預(yù)測與治療效果確認(rèn)中可以使用的癌診斷藥物。用于解決課題的方法為此，本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述課題而進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過金屬螯合試劑使放射性金屬元素與抗鈣粘素抗體結(jié)合而得到的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素在荷癌動(dòng)物的癌組織中特異性蓄積，且其抗癌效果相比于抗鈣粘素抗體給藥組格外顯著地提高，從而完成了本發(fā)明。
S卩，本發(fā)明提供一種放射性金屬元素通過金屬螯合試劑結(jié)合而成的抗鈣粘素抗體，還提供以其為有效成分的癌治療藥物和癌診斷藥物。另外，本發(fā)明提供用于在癌治療或癌診斷中使用的上述抗鈣粘素抗體。另外，本發(fā)明提供上述抗鈣粘素抗體在癌治療藥物或癌診斷藥物的制造中的使用。本發(fā)明還提供以投與有效量的上述抗鈣粘素抗體為特征的癌治療方法或癌診斷方法。發(fā)明的效果以本發(fā)明的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體為有效成分的癌治療藥物，向癌組織的 蓄積性高且癌組織縮小效果好，因此，如果使用該藥物，就能夠副作用少且有效地進(jìn)行癌治療。另外，通過使用本發(fā)明的癌診斷藥物，能夠進(jìn)行本發(fā)明的癌治療藥物的有效性的預(yù)測和治療效果的確認(rèn)。


圖I是表示使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的抗體親和性評價(jià)的結(jié)果。圖2是表示投與67Ga-D0TA_PPMX2016抗體(投入比I : 10)96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖3是表示投與67Ga-D0TA_PPMX2016抗體(投入比I : 3)96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖4是表示投與67Ga-D0TA_PPMX2029抗體(投入比I : 10)96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖5是表示投與67Ga-D0TA_PPMX2029抗體(投入比I : 3)96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖6是表示投與67Ga-D0TA_PPMX2025抗體(投入比I : 10)96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖7是表示投與67Ga-D0TA_PPMX2025抗體(投入比I : 3)96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖8 是表示將 67Ga-D0TA-PPMX2025 抗體的 DOTA 投入比設(shè)為 I : 1、1 : 3、1 : 10時(shí)投與96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖9是表示投與mIn-D0TA-PPAT-052-27c抗體(投入比I : 3) 96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖10是表示投與mIn-D0TA-PPAT-052-27c抗體(投入比I : 3)48小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖11是表示投與mIn-D0TA-PPAT-052-28c抗體(投入比I : 3) 48小時(shí)后和96小時(shí)后的體內(nèi)分布。圖12是表示9°Y-D0TA-PPMX2029抗體(投入比I : 3)在異種移植模型中的抗腫瘤效果。圖13是表示9°Y-D0TA-PPAT-052-27c抗體(投入比I : 3)在異種移植模型中的抗腫瘤效果。圖14是表示確認(rèn)⑶H3蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體是放射性金屬元素通過金屬螯合試劑結(jié)合而成的抗鈣粘素抗體，癌治療藥物和癌診斷藥物含有該抗體。抗鈣粘素抗體只要是與鈣粘素特異性結(jié)合的抗體，則沒有特別限制。在這里，作為鈣粘素，可以列舉E鈣粘素、N鈣粘素、P鈣粘素等，但更優(yōu)選P鈣粘素?？光}粘素抗體中包括單克隆抗體和多克隆抗體、以及保持與抗原決定簇特異性結(jié)合的能力的抗體及T-細(xì)胞受體片段等抗體的變種和衍生物。另外，抗鈣粘素抗體的種類沒有特別限制，可以適當(dāng)使用小鼠抗體、人抗體、大鼠抗體、兔抗體、綿羊抗體、駱駝抗體、雞抗體等，和出于使其對人的異種抗原性下降等的目的而人為改變的基因重組型抗體，例如，嵌合抗體、人源化抗體等。基因重組型抗體可以使用已知的方法制造。嵌合抗體是由人以外的哺乳動(dòng)物，例如小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)和人源抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)組成的抗體，可以通過連接編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA和編碼人源抗體恒定區(qū)的DNA，將其重組入表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主中，使其產(chǎn)生而得到(例如，參照 Cabilly S.等，Proc Natl Acad Sci USA. 198481 (11) 3273-7、Morrison 等，Proc Natl Acad Sci USA. 198481 (21) 6851-5、歐洲專利申請公開序號第 171496 號)。人源化抗體也被稱為重構(gòu)(reshaped)人源抗體，是將人以外的哺乳動(dòng)物，例如小鼠抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R〖complementarity determining region)向人源抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)移 植而得到的抗體，其通常的基因重組方法也是已知的。具體而言，通過PCR法，從以使末端部具有重疊序列的方式制得的數(shù)個(gè)寡核苷酸，合成以使小鼠抗體的CDR和人源抗體的構(gòu)架區(qū)(framework region :FR)連接的方式設(shè)計(jì)的DNA序列。將所得到的DNA與編碼人源抗體恒定區(qū)的DNA連接，接著重組入表達(dá)載體中，導(dǎo)入宿主中而使之產(chǎn)生，由此可以得到(參照歐洲專利申請公開序號EP239400、國際專利申請公開序號W096/02576)。通過⑶R所連接的人源抗體的FR，選擇互補(bǔ)性決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合部位的FR。根據(jù)需要，重構(gòu)人源抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)可以取代抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)的氨基酸，以形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato, K. et al. , Cancer Res, 1993, 53, 851-856.)。嵌合化、人源化抗體的氨基酸序列優(yōu)選與來自保藏雜交瘤的表達(dá)cDNA的Vh或Vl區(qū)域的氨基酸序列為100%同一的序列，但也優(yōu)選通過基因工程學(xué)的改變而具有90%以上同一的序列的抗體。在人源化、嵌合化的過程中，一直進(jìn)行著以改善抗原結(jié)合為目的的殘基取代的調(diào)整。這種改變了一部分序列的抗體，可以認(rèn)為基本上是來自原來的雜交瘤的抗體。使用基因工程學(xué)方法制作嵌合化抗體和人源化抗體的方法已經(jīng)是已知的方法。即，將確認(rèn)為基礎(chǔ)的單克隆抗體的Vh、VL序列進(jìn)行基因工程學(xué)的改變后，由通常的方法嵌合化或人源化。另外，人源抗體的獲取方法也是已知的。例如，在體外(in vitro)以所希望的抗原或表達(dá)所希望抗原的細(xì)胞致敏人淋巴細(xì)胞，使致敏淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞，例如U266融合，也能夠得到具有與抗原結(jié)合活性的所希望的人源抗體(參照特公平1-59878)。另外，通過由所希望的抗原免疫具有人源抗體基因全部的庫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，能夠獲取所希望的人源抗體(參照 W093/12227、TO92/03918、TO94/02602、TO94/25585、TO96/34096、TO96/33735)。還已知使用人源抗體文庫，通過淘選獲取人源抗體的技術(shù)。例如，將人源抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，通過噬菌體展示法使之在噬菌體的表面表達(dá)，能夠選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。如果分析所選擇的噬菌體的基因，就能夠決定編碼與抗原結(jié)合的人源抗體可變區(qū)的DNA序列。如果清楚了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，就能夠制作表達(dá)該序列的適當(dāng)?shù)妮d體，獲取人源抗體。這些方法已經(jīng)是周知的，可以參考W092/01047、W092/20791、W093/06213、W093/11236、W093/19172、W095/01438、W095/15388。
另外，這些抗鈣粘素抗體，只要不喪失識(shí)別由鈣粘素基因編碼的蛋白質(zhì)的全長或一部分長度的特性，也可以是抗體片段(fragment)等低分子化抗體和抗體的修飾物等。作為抗體片段的具體例子，例如，可以列舉Fab、Fab，、F (ab，) 2、Fv、Diabody等。在得到這樣的抗體片段時(shí)，可以構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入表達(dá)載體后，在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中使之表達(dá)(例如，參照 Co，M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ；Better, M. and Horwitz, A. H. , Methods EnzymoI. (1989) 178, 476-496 ；Pluckthun, A. andSkerra, A. , Methods EnzymoI. (1989)178, 497-515 ；Lamoyi, E. , Methods EnzymoI. (1986)121, 652-663 ；Rousseaux, J. et al. , Methods EnzymoI. (1986)121, 663-669 ；Bird, R. E. andWalker, B. ff. , Trends Biotechnol. (1991) 9,132-137)。作為抗體的修飾物，也可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。這樣的抗體修飾物可以通過在所得到的抗體上施加化學(xué)修飾而得到。其中，抗體的修飾方法在該領(lǐng)域已經(jīng)被確立。另外，在本發(fā)明中，出于增強(qiáng)細(xì)胞損傷活性的目的等，也能夠使用改變了糖鏈的抗體等。抗體的糖鏈改變技術(shù)已經(jīng)是已知的(例如，W000/61739.W002/31140等)。另外，在本發(fā)明中，也包含對2種以上不同抗原具有特異性的多特異性抗體。通常，這樣的分子是結(jié)合2個(gè)抗原的分子(S卩，雙重特異性抗體)，在本發(fā)明中的“多特異性抗體”是包含對其以上(例如，3種的)抗原具有特異性的抗體的多特異性抗體。多特異性抗體可以是由全長構(gòu)成的抗體，或是那樣的抗體的片段(例如，F(xiàn) (ab’)2 二特異性抗體)?！?br> 本發(fā)明的抗鈣粘素抗體及其抗體片段，能夠通過任意適當(dāng)?shù)姆椒?，例如，以體內(nèi)、培養(yǎng)細(xì)胞、體外翻譯反應(yīng)和重組DNA表達(dá)系統(tǒng)來制造。制造單克隆抗體和抗體產(chǎn)生細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)的方法在該技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的(Campbell. “Monoclonal Antibody Technology:Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，，，Elsevier Science Publishers, Amsterdam, TheNetherlands, 1984: St. Groth et al. , J. Tmmunol. Methods 35:1-21，1980)。將I丐粘素基因所編碼的蛋白質(zhì)或片段作為免疫原使用，對已知生成抗體的任意動(dòng)物(小鼠、兔等)通過皮下或腹腔內(nèi)注射而能夠免疫。在進(jìn)行免疫時(shí)可以使用佐劑，那樣的佐劑在該技術(shù)領(lǐng)域中是周知的。多克隆抗體能夠通過從免疫動(dòng)物分離含有抗體的抗血清，使用ELISA分析、蛋白質(zhì)免疫印跡分析或放射免疫分析等在該技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法，針對具有所希望的特異性的抗體的存在進(jìn)行篩選而得到。單克隆抗體能夠通過從免疫過的動(dòng)物切除脾臟細(xì)胞，使之與多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞融合，制作產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞而得到。使用ELISA分析、蛋白質(zhì)免疫印跡分析或放射免疫分析等在該技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法，選擇產(chǎn)生識(shí)別目的蛋白質(zhì)或其片段的抗體的雜交瘤細(xì)胞。對分泌所希望抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，回收所分泌的抗體，使用在該技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的方法，例如離子交換柱、親和色譜等能夠進(jìn)行純化?；蛘撸部梢允褂棉D(zhuǎn)基因小鼠(XenoMouse)株制造人源型單克隆抗體(參照Green，J.Immunol, Methods 231:11-23，1999;Wells, Eek, Chem Biol 2000Aug:7 (8) :R185_6)。另夕卜，現(xiàn)在也進(jìn)行了基于不進(jìn)行免疫的噬菌體展示的單克隆抗體的制作，本發(fā)明的單克隆抗體，表示使用單一的抗體產(chǎn)生細(xì)胞或編碼由其得到的抗體的DNA而生產(chǎn)的單一分子種類的抗體，使用上述的任意方法制造均可。編碼單克隆抗體的DNA可以通過慣用的方法(例如，使用能夠與編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)而容易地分離并確定序列。雜交瘤細(xì)胞是這樣的DNA優(yōu)選的起始材料。先將其分離，隨即插入表達(dá)DNA的載體中，重組入E. coli細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或者不被轉(zhuǎn)化就不產(chǎn)生免疫球蛋白的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞等宿主細(xì)胞中，從重組的宿主細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體。另外，作為其他的方式，可以使用從由McCafferty等(Nature348:552-554 (1990))記載的技術(shù)制造的抗體噬菌體文庫分離抗體或抗體片段。 在單克隆抗體表達(dá)中使用的宿主細(xì)胞系，優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物起源的細(xì)胞系。能夠選擇最適合想表達(dá)的單克隆抗體的宿主細(xì)胞系。作為一般的宿主細(xì)胞系，可以列舉來自CHO的細(xì)胞株(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系)、CVl (猴腎臟系)、COS (具有SV40T抗原的CVl衍生物)、SP2/0 (小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653 (小鼠骨髓瘤)和293 (人腎臟)、293T (具有SV40T抗原的293衍生物),但不限定于這些。宿主細(xì)胞系可以從商業(yè)設(shè)施或the American TissueCulture Collection (ATCC)或從發(fā)表文獻(xiàn)的發(fā)表機(jī)關(guān)獲得。優(yōu)選的宿主細(xì)胞系是dhfr基因表達(dá)缺陷的來自CHO的細(xì)胞株或SP2/0的任意種類° 分別參照 Urland, G.等，Effect of gamma rays at the dihydrofolate reductaselocus:deletions and inversions, Somat. Cell. MoI. Genet.Vol.12,1986.p5555_566、和 Schulman, M.等，A better cell line for making hybridomas secreting specificantibodies, Nature Vol. 276，1978，p269_270。最優(yōu)選的宿主細(xì)胞系是 DHFR 缺陷 CH0。向宿主細(xì)胞系轉(zhuǎn)染質(zhì)?？梢允褂萌我獾募夹g(shù)進(jìn)行。作為具體的方法，可以列舉轉(zhuǎn)染(包括磷酸鈣法、DEAE法、脂質(zhì)體和電穿孔)、利用仙臺(tái)病毒等的包膜導(dǎo)入DNA的方法、顯微注射和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒等病毒載體的感染，但不受這些方法的限定。參照Current Protocolsin Molecular Biology, Chapter 9Introduction of DNA into Mammalian Cells, JohnWiley and Sons, Inc.。最優(yōu)選的是向通過電穿孔向宿主中導(dǎo)入質(zhì)粒。本發(fā)明的抗鈣粘素抗體的鈣粘素中的識(shí)別部位優(yōu)選序列號2的1-655部分。另外，作為本發(fā)明的抗鈣粘素抗體，優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞PPMX2016、PPMX2025、PPMX2029、PPAT-052-02、PPAT-052-03、PPAT-052-09、PPAT-052-24、PPAT-052-25、PPAT-052-26、PPAT-052-28 和基因?qū)?CHO 細(xì)胞株 PPAT-052_27c、PPAT-052_02c、PPAT-052-03c、 PPAT-052_09c、 PPAT_052_21c、 PPAT_052_24c、 PPAT_052_25c、PPAT-052-26c、PPAT-052-28c、PPAT-052-29c產(chǎn)生的抗體。另外，在本說明中，冠以PPMX和PPAT的序號，可以用于表示抗體生產(chǎn)細(xì)胞或該抗體生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的任何意義。作為與上述抗鈣粘素抗體結(jié)合的放射性金屬，在作為癌治療藥物使用時(shí)，優(yōu)選是細(xì)胞損傷性放射性金屬，作為癌診斷藥物使用時(shí)，優(yōu)選是細(xì)胞非損傷性放射性金屬。作為這樣的細(xì)胞損傷性放射性金屬，例如，可以列舉釔90 (9°Y)、錸186 (186Re)、錸188 (188Re)、銅 67 (67Cu)'鐵 59 (59Fe)、鍶 89 (89Sr)、金 198 (198Au)、汞 203 (2°3Hg)、鉛 212(212Pb)'鏑 165 (165Dy)'釕 103 (103Ru)'秘 212 (212Bi)'秘 213 (213Bi)'欽 166 (166Ho)'衫 153(153Sm)和镥 177 (177Lu)等。在這些放射性金屬中，從半衰期、放射線能量、容易的標(biāo)記反應(yīng)、標(biāo)記率、配位化合物的穩(wěn)定性等方面出發(fā)，優(yōu)選9°Y、153Snu 177Lu。
另一方面，作為在診斷藥物中使用的細(xì)胞非損傷性放射性金屬，可以適合地使用锝 99m (99niTc)、銦 111 (mIn)、銦 113m (113ηιΙη)、鎵 67 (67Ga)'鎵 68 (68Ga)、鉈 201 (201Tl)'鉻 51 (51Cr)'鈷 57 (57Co)'鈷 58 (58Co)'鈷 60 (60Co)'鍶 85 (85Sr)、汞 197 (197Hg)、銅 64(64Cu),但不限定于這些。在使這些放射性金屬元素與抗鈣粘素抗體結(jié)合時(shí)，優(yōu)選使金屬螯合試劑與該抗體反應(yīng)，并使放射性金屬元素與其反應(yīng)，成為配位化合物。這樣操作得到的修飾抗體，放射性金屬元素通過金屬螯合試劑與抗鈣粘素抗體結(jié)合。作為在這樣的配位化合物形成中可以使用的金屬螯合試劑的例子，例如，可以列舉(I) 8-羥基喹啉、8-乙酰氧基喹啉、8-羥基喹哪啶、硫酸氧基喹啉、鄰乙?；感恰⑧彵郊柞；感?、鄰對硝基苯甲?；感恰⒆鳛榫哂朽羌艿泥Z酮類化合物的諾氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、托氟沙星、氟羅沙星、司帕沙星等喹啉衍生物；(2)四氯對苯醌酸、鋁試劑、硫脲、焦沒食子酚、銅鐵試劑、鉍試劑(II) (Bismuthiol II)、沒食子 酰基沒食子酸、硫醇鹽(thiolide)、2-巰基苯并噻唑、四苯基氯化砷鎗等化合物；(3)乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和具有與它們類似的骨架的二羥基乙基甘氨酸、二氨基丙醇四乙酸、乙二胺二乙酸、乙二胺二丙酸鹽酸鹽、羥乙基乙二胺三乙酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)、乙二醇醚二胺四乙酸、六亞甲基二胺四乙酸、羥乙基亞氨基二乙酸、亞氨基二乙酸、二氨基丙烷四乙酸、次氮基三乙酸、次氮基三丙酸、次氮基三(亞甲基膦酸)三鈉鹽、三亞乙基四胺六乙酸、甲基DTPA、環(huán)己基DTPA、氨基芐基EDTA、異硫氰基芐基EDTA、異硫氰基芐基DTPA、甲基異硫氰基芐基DTPA、環(huán)己基異硫氰基芐基DTPA、馬來酰亞胺丙基酰胺芐基EDTA、馬來酰亞胺戊基酰胺芐基EDTA、馬來酰亞胺十二烷基酰胺芐基EDTA、馬來酰亞胺戊基酰胺芐基DTPA、馬來酰亞胺十二烷基酰胺芐基EDTA、馬來酰亞胺十二烷基酰胺芐基DTPA ; (4) 1,4, 7，10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4，7，10-四乙酸(D0TA)、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷_1，4，7-三乙酸(N0TA)、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷_1，4，8，11-四乙酸(TETA)、I, 4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二燒(Cyclem)、l, 4, 8, 11-四氮雜環(huán)十四燒(Cyclam)、異硫氰基節(jié)基DOTA、異硫氰基芐基NOTA等。這些金屬螯合試劑中，從金屬螯合物容易向抗體的導(dǎo)入反應(yīng)、標(biāo)記率、配位化合物的安全性等方面出發(fā)，優(yōu)選異硫氰基節(jié)基D0TA、甲基異硫氰基節(jié)基DTPA、環(huán)己基異硫氰基芐基DTPA。放射性金屬元素與抗鈣粘素抗體的結(jié)合可以按照通常方法進(jìn)行。例如，可以通過使金屬螯合試劑與抗鈣粘素抗體反應(yīng)，預(yù)先制備標(biāo)記前體，接著使放射性金屬元素反應(yīng)而進(jìn)行。在本發(fā)明的癌治療藥物和癌診斷藥物中，抗鈣粘素抗體與金屬螯合試劑的摩爾比在癌細(xì)胞蓄積性和抗癌效果中是很重要的，該摩爾比(抗體螯合試劑)優(yōu)選為I : O. I I 4. 5，更優(yōu)選為I : O. 5 I : 3。在設(shè)為這樣的摩爾比時(shí)，優(yōu)選以I : O. I I :小于5，特別優(yōu)選以I : I I : 3的摩爾比投入使之反應(yīng)?？贵w的螯合物修飾數(shù)能夠通過使用MALDI-T0F質(zhì)量分析法等測定分子量，比較未修飾抗體與修飾抗體的分子量算出(美國專利公報(bào)第 7514078 號，Lu等，J Pharm Sci, 94(4)，2005，p788_797、Tedesco 等，J Clin Onco, 23
(16S)，2005，4765)。另外，抗體的螯合物修飾數(shù)也可以通過螯合物滴定法測定。已知使用堿土類金屬比色試劑(偶氮胂III)的方法(Bradyr等，Nucl Med Biol, 31，795-802，2004、Dadachova 等，Nucl Med Biol, 26，977-982，1999)。本發(fā)明的癌治療藥物和癌診斷藥物，有作為已標(biāo)記制劑提供的方法和作為含有標(biāo)記前體的試劑盒制劑提供的方法，在本發(fā)明中可以是任意方法。在作為已標(biāo)記制劑提供時(shí)，可以將含有完成標(biāo)記的抗鈣粘素抗體的癌治療藥物或癌診斷藥物直接投與使用。在作為試劑盒制劑提供時(shí)，可以在用所希望的放射性金屬元素進(jìn)行標(biāo)記后投與使用。由于放射性金屬元素結(jié)合而成的抗鈣粘素抗體向癌組織的蓄積性高，且癌細(xì)胞損傷活性高，所以，作為對癌組織以外組織的損傷性少、安全性高的癌治療藥物是有用的。另夕卜，相比于抗鈣粘素抗體單獨(dú)的抗癌活性，放射性金屬元素結(jié)合而成的抗鈣粘素抗體的抗癌活性具有顯著高的特征。該抗癌活性在抗體螯合試劑的摩爾比為I : O. I I : 4.5時(shí)特別顯著。本發(fā)明的癌治療藥物可以和其它抗癌劑并用。作為那樣的其它抗癌劑，可以列舉烷基化劑、代謝拮抗劑、微管抑制劑、抗生物質(zhì)抗癌劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、鉬制劑、分子標(biāo)的藥、激素劑、生物制劑等。作為烷基化劑，可以列舉環(huán)磷酰胺等氮芥類抗癌劑、雷莫司汀等亞硝基脲類抗癌劑、達(dá)卡巴嗪等。作為代謝拮抗劑，可以列舉5-FU、UFT、卡莫氟、卡培他濱、 替加氟、TS-1、吉西他濱、阿糖胞苷等。作為微管抑制劑，可以列舉長春新堿等生物堿類抗癌齊U、多西紫杉醇、紫杉醇等紫杉醇類抗癌劑。作為抗生物質(zhì)抗癌劑，可以列舉絲裂霉素C、多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、博萊霉素等。作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，可以列舉具有拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制作用的伊立替康和拓?fù)涮婵怠⒕哂型負(fù)洚悩?gòu)酶II抑制作用的依托泊苷。作為鉬制齊U，可以列舉順鉬、伯爾定、奈達(dá)鉬、奧沙利鉬。作為分子標(biāo)的藥，可以列舉曲妥珠單抗、利妥昔單抗、伊馬替尼、吉非替尼、厄洛替尼、貝伐珠單抗、硼替佐米、舒尼替尼、索拉菲尼等。作為激素劑，可以列舉地塞米松、非那雄胺、他莫昔芬。作為生物制劑，可以列舉干擾素α、β和Y、白介素2。另外，本發(fā)明的治療藥物，既可以與癌治療法并用，也可以與外科手術(shù)以及此外的放射線療法(包括伽瑪?shù)动煼ā⑸洳ǖ?Cyber knife)療法、硼中子捕捉療法、質(zhì)子線治療-重粒子線治療法)、MR引導(dǎo)下聚焦超聲手術(shù)、冷凍療法、無線電波凝固療法、乙醇注入療法、動(dòng)脈塞栓療法等并用。本發(fā)明的癌治療藥物，對包含人的哺乳類的多種癌是有效的，例如，可以列舉咽癌、喉癌、舌癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌，大腸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、腎癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、甲狀腺癌等上皮癌；骨肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、白血病和惡性淋巴瘤、骨髓瘤等非上皮癌等。本發(fā)明的癌治療藥物可以在水性溶液，優(yōu)選在漢克斯溶液、林格氏溶液或生理食鹽緩沖液等生理學(xué)上適合性的緩沖液中溶解。還可以在油性或水性的介質(zhì)中成為懸濁液、溶液或乳濁液等形狀。本發(fā)明的癌治療藥物的給藥量根據(jù)患者的癥狀、給藥途徑、體重、年齡等而不同，例如，成人的I次給藥量優(yōu)選為37 3700MBq。本發(fā)明的癌治療藥物通常以非口服給藥途徑，例如以注射劑(皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射等)、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)肺等給藥。本發(fā)明的癌診斷藥物可以在腫瘤的影像檢查中使用。在體內(nèi)存在表達(dá)⑶H3蛋白的腫瘤時(shí)，本發(fā)明的診斷藥物在腫瘤中蓄積，可以通過使用單光子發(fā)射斷層成像裝置(SPECT)、正電子發(fā)射斷層成像裝置(PET)、閃爍照相機(jī)等儀器檢出放射線而將腫瘤攝像。例如，在投與本發(fā)明的診斷藥物前，可以用于治療效果的預(yù)測。在治療前投與診斷藥物，對腫瘤進(jìn)行影像檢查，蓄積性越高，預(yù)測治療藥物的效果就越高。另外，也可以用于治療效果的判斷。對于不僅接受本發(fā)明的治療藥物，而且還接受過任何治療的患者，投與本發(fā)明的診斷藥物并對腫瘤進(jìn)行影像檢查，觀察蓄積性隨時(shí)間的變化，由此能夠把握腫瘤隨時(shí)間的縮小或增大。在診斷藥物中使用的抗體，希望是識(shí)別與治療藥物競爭的抗原決定簇的抗體，更希望是識(shí)別與治療藥物同一的抗原決定簇的抗體。最希望是與治療藥物同一的抗體。給藥途徑通常從靜脈向血管內(nèi)給藥，但也可以通過動(dòng)脈給藥。給藥量根據(jù)患者的癥狀、給藥途徑、體重、年齡等而不同，例如，成人的I次給藥量優(yōu)選為37 1120MBq。實(shí)施例 接著，列舉實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的任何限定。實(shí)施例I可溶型⑶H3抗原的制作為了制成抗CDH3抗體制作的免疫原，制作使C末端跨膜區(qū)域以后缺失的可溶型CDH3 (sCDH3)蛋白質(zhì)。(I)可溶型⑶H3抗原表達(dá)載體的制作以⑶H3全長cDNA為模板，使用以使相當(dāng)于⑶H3細(xì)胞外區(qū)域的部分(相當(dāng)于序列號2的1-654，以下記作s⑶H3cDNA)被擴(kuò)增的方式所設(shè)計(jì)的正向引物(序列號 3 CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT (hCDH3FullFff))和反向引物(序列號 4 :CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC (hCDH3SolbRV))，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。在反應(yīng)中，使用KOD-Plus (東洋紡社)，以94°C -15秒、55°C -30秒、68°C -90秒、30循環(huán)的反應(yīng)條件進(jìn)行。此后，以瓊脂糖凝膠電泳切出包含目的大小約2. Okbp的條帶的凝膠片段，使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Quiagen公司)，得到目的sCDH3cDNA。為了在表達(dá)用載體pEF4/myc_HisB中插入該s⑶H3cDNA，以2種限制性內(nèi)切酶KpnI和Xba I處理后，在以相同的Kpn I和Xba I處理過的pEF4/myc-HisB中使用T4DNA連接酶按照通常方法插入，得到表達(dá)載體pEF4-s⑶H3-myC-His。(2 )可溶型⑶H3蛋白質(zhì)的表達(dá)以FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑的操作方案為準(zhǔn)，在轉(zhuǎn)染前日，在直徑IOcm的培養(yǎng)皿中接種8X IO5個(gè)CHO細(xì)胞，培養(yǎng)一晚后，在400 μ L的無血清RPMI1640培養(yǎng)基中混合8 μ g的表達(dá)載體pEF4-sCDH3-myc-His和16 μ L的FuGENE6試劑，室溫放置15分鐘后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染次次日，使用選擇試劑(Zeocin)，以有限稀釋法進(jìn)行克隆?？扇苄虲DH3表達(dá)CHO細(xì)胞的選拔，以使用抗c_Myc單克隆抗體(SANTA CRUZBI0TECHN0L0Y公司)的蛋白免疫印跡法進(jìn)行。選擇向培養(yǎng)上清中的分泌量多、增殖良好的細(xì)胞株，結(jié)果得到可溶型⑶H3表達(dá)CHO細(xì)胞株(EXZ1702)。被選擇的可溶型⑶H3表達(dá)CHO細(xì)胞株(EXZ1702)，使用3個(gè)培養(yǎng)面積1500cm2的滾瓶，每個(gè)滾瓶中的無血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM- II (Invitrogen公司)333mL中進(jìn)行72小時(shí)培養(yǎng)，回收培養(yǎng)上清。從得到的培養(yǎng)上清，通過由HisTrap (注冊商標(biāo))HP柱(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCE公司)進(jìn)行的親和色譜和由Superdex (注冊商標(biāo))200pg柱(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCE公司)進(jìn)行的凝膠過濾色譜，得到可溶型⑶H3蛋白質(zhì)。實(shí)施例2⑶H3表達(dá)CHO細(xì)胞株的樹立
為了得到抗⑶H3抗體篩選用細(xì)胞株，進(jìn)行表達(dá)全長⑶H3的CHO細(xì)胞的樹立。(I)⑶H3基因表達(dá)載體的制作為了在哺乳類表達(dá)載體pEF4/myc_HisB( Invitrogen公司)中插入序列號I所示的全長人源CDH3DNA，以2種限制性內(nèi)切酶Kpn I (Takara Bio公司)和Xba I (Takara Bio公司)在37°C處理I小時(shí)后，由通常方法通過T4DNA連接酶(Promega公司)插入以相同的Kpn I 和 Xba I 處理過的 pEF4/myc_HisB,得到表達(dá)載體 pEF4-CDH3-myc_His。(2)⑶H3穩(wěn)定表達(dá)株的獲取以FuGENE (注冊商標(biāo))6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Diagnostics K. K.公司)的操作方案為準(zhǔn)，在轉(zhuǎn)染前日，在直徑IOcm的培養(yǎng)皿中接種8 X IO5個(gè)CHO細(xì)胞，培養(yǎng)一晚后，在400 μ L的無血清RPMI1640培養(yǎng)基(SIGMA-ALDRICH公司)中混合8 μ g表達(dá)載體pEF4-CDH3-myc_His和16 μ L的FuGENE6試劑，室溫放置15分鐘后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染次次日，使用選擇試劑(Zeocin)，以有限稀釋法進(jìn)行克隆。 CDH3全長表達(dá)CHO細(xì)胞的克隆選拔，以使用抗c_Myc單克隆抗體(SANTA CRUZBI0TECHN0L0Y公司)的蛋白免疫印跡法進(jìn)行。其結(jié)果，得到表達(dá)量高且增殖良好的⑶H3全長表達(dá)CHO細(xì)胞株(EXZ1501)。由流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)EXZ1501與市售抗CDH3抗體(R&DSYSTEMS公司)反應(yīng)，確認(rèn)在EXZ1501的細(xì)胞膜上表達(dá)⑶H3蛋白質(zhì)。實(shí)施例3抗⑶H3單克隆抗體的制作(I)以可溶型⑶H3蛋白質(zhì)作為免疫原的單克隆抗體的制作等量混合在生理食鹽水中溶解的50 μ g可溶型⑶H3蛋白質(zhì)和Titer-MAX Gold(注冊商標(biāo))(Titer Max公司)，通過在MRL/Ipr小鼠(日本SLC株式會(huì)社)的腹腔內(nèi)和皮下注射進(jìn)行初次免疫。第2次以后的免疫通過將同樣制備的相當(dāng)于25 μ g蛋白質(zhì)的量的混合可溶型⑶H3蛋白質(zhì)和Titer-MAX Gold混合，在腹腔內(nèi)和皮下注射而實(shí)施。從最終免疫3日后，從小鼠無菌制備脾臟細(xì)胞，按照通常方法，由聚乙二醇法進(jìn)行與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/O-Ag14 或 P3-X63-Ag8. 653 的細(xì)胞融合。(2)抗⑶H3抗體產(chǎn)生雜交瘤的選拔抗⑶H3抗體的選拔以使用表達(dá)全長⑶H3的CHO細(xì)胞株(EXZ1501)的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。g卩，以2mM EDTA-PBS處理表達(dá)全長CDH3的CHO細(xì)胞株(EXZ1501 )，從培養(yǎng)板剝離后，懸濁在FACS溶液中，使其為I X IO6個(gè)/mL。以50 μ L/孔接種在96孔板中，加入雜交瘤培養(yǎng)上清，以4°C使之反應(yīng)60分鐘，以FACS溶液(200 μ L/孔)洗凈2次后，加入AlexaFluor488標(biāo)記抗小鼠IgG-山羊F (ab’)2 (Invitrogen公司)，以4°C使之反應(yīng)30分鐘。此后，以FACS溶液洗凈2次后，實(shí)施流式細(xì)胞術(shù)，選拔產(chǎn)生與CDH3表達(dá)CHO細(xì)胞結(jié)合的抗體的雜交瘤，得到PPMX2016 PPAT-052-28的40個(gè)克隆。選拔的全部雜交瘤與⑶H3表達(dá)CHO細(xì)胞株(EXZ1501)和NCI-H358反應(yīng)，由流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)和CHO細(xì)胞不反應(yīng)?？贵w使用蛋白質(zhì)G柱由雜交瘤的培養(yǎng)上清純化，在以后的實(shí)驗(yàn)中使用。選拔出的雜交瘤中，將PPMX2016(NITEBP-897)、PPMX2025 (NITE BP-898)、PPMX2029 (NITE BP-899)、PPAT-052-02 (NITEBP-1034)、PPAT-052-03(NITE BP-1035),PPAT-052-09(NITE BP-1036),PPAT-052-24CNITEBP-1037)、PPAT-052-25 (NITE BP-1038)、PPAT-052-26 (NITE BP-1039)和 PPAT-052-28(NITE BP-1040)于2010年2月10日和2011年I月18日在國家技術(shù)評估學(xué)會(huì)專利微生物保藏中心保藏(日本國千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)。實(shí)施例4抗體基因的克隆(I)將編碼針對人源⑶H3的小鼠單克隆抗體的V區(qū)的DNA如下克隆化。按照在Gough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbersof cells, Analytical Biochemistry, 173, p93~95 (1988)中記載的方法(但是，取代在該論文中記載的溶解緩沖液，使用另外的TNE緩沖液25mM Tris-HCl, pH7. 5 ；1% NP-40 ；150mMNaCl ；lmM EDTA，pH8. 0)，從小鼠雜交瘤細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)中存在的RNA。作為具體的操作方法，在200 μ L的TNE緩沖液中懸濁5 X IO6個(gè)雜交瘤，溶解細(xì)胞膜后，通過離心除去細(xì)胞核。在得到的約200 μ L細(xì)胞質(zhì)上清中加入200 μ L提取緩沖液(IOmM Tris-HCl，ρΗ7. 5 ；
0.35MNaCl ；1% (w/v)SDS ；10mM EDTA，pH8. 0 ;7M尿素)。以苯酚和氯仿提取該混合物，在得到的RNA溶液中，作為載體加入糖原(Roche，Cat No. 901393)后，以乙醇使之沉淀。接著， 加入10 50 μ L滅菌蒸餾水溶解RNA沉淀物，使細(xì)胞質(zhì)RNA濃度為0. 5 2 μ g/ μ L。(2)由從雜交瘤制備的RNA制作cDNA文庫為了合成單鏈cDNA，制備20 μ L包含0. 5 3 μ g如上所述制備得到的細(xì)胞質(zhì)RNA、50mM Tris-HCl，ρΗ8· 3(室溫)、75mM KCl、3mM MgCl2UOmM DTT、IOOng隨機(jī)引物、0. 5mM dNTP、200單位的Superscript II (逆轉(zhuǎn)錄酶，Invitrogen公司)的反應(yīng)混合液，以42°C孵育50分鐘。將這樣合成的cDNA文庫作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法的模板直接使用。(3)由PCR法擴(kuò)增編碼抗⑶H3抗體可變區(qū)的基因?qū)嶒?yàn)中使用的引物均由Hokkaido System Science Co. ,Ltd合成。A.使用與在用于以PCR法擴(kuò)增編碼小鼠L鏈V區(qū)的基因而使用的引物5’末端的FRl部分具有相同性的DNA引物、和在3’末端具有與小鼠L鏈內(nèi)的J鏈基因具有相同性的4組引物(i )、或者在5’末端與L鏈信號部分(7組引物)和在3’末端具有與KC部分(KVL反義引物)具有相同性的引物組(ii)的2種引物組，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從該cDNA中分離鼠免疫球蛋白L鏈可變區(qū)DNA。引物序列如下。( i )小鼠L鏈可變區(qū)克隆4組正義引物參考 “Phage Display-A Laboratory Manual-, Barbas Burton ScottSilverman” PROTOCOL 9. 5,由 Hokkaido System Science Co. , Ltd 合成 17 種正義引物、3種反義引物。VK正義(FRl部分)將下述17種引物的混合物作為VK正義引物使用5，-GAY ATC CAG CTG ACT CAG CC-3，(簡并度2):序列號 55，-GAYATT GTT CTC WCC CAG TC-3，(簡并度4):序列號 65，-GAYATT GTG MTMACT CAG TC-3，(簡并度8):序列號 75，GAYATT GTGYTRACA CAG TC-3，(簡并度8):序列號 85，GAYATT GTRATGACM CAG TC-3，(簡并度8):序列號 95’ GAYATT MAGATRAMC CAG TC-3’(簡并度16):序列號 105’ GAYATT CAG ATG AYD CAG TC-3’(簡并度12):序列號 115’ GAYATY CAGATGACA CAGAC-3’(簡并度4):序列號 125，GAY ATT GTT CTC AffC CAG TC-3，(簡并度4):序列號 135，GAYATT GffG CTS ACC CAATC-3’(簡并度8):序列號 14
5，GAYATT STRATG ACC CAR TC-3，(簡并度:16):序列號 155，GAY RTT KTGATGACC CARAC-3，(簡并度:16):序列號 165，GAYATT GTG ATG ACB CAG KC-3，(簡并度:12):序列號 175，GAYATT GTGATAACY CAG GA-3’(簡并度:4):序列號 185，GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT-3，(簡并度4):序列號 195，-GAY ATT GTG ATG ACA CAA CC-3，(簡并度2):序列號 205，GAYATT TTG CTG ACT CAG TC-3，(簡并度2):序列號 21
J反義(4組引物)J1/J2 反義引物-(I)5，-GGS ACC AAR CTG GAAATM AAA-3’(簡并度8):序列號 22J4反義引物-(2)5’ -GGG ACAAAG TTG GAAATAAAA-3’ 序列號 23J5反義引物-(3)5，-GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA-3，序列號 24J1/J2、J4、J5反義引物混合物(4)(ii)小鼠L鏈可變區(qū)克隆7組引物VK正義(信號肽部分)該引物以Novagen 公司的小鼠 Ig-引物組(Novagen:Merc k. Cat. No. 69831-3)為基礎(chǔ)，改變堿基序列以除去限制性內(nèi)切酶部位。A組正義引物5，-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3，序列號 25B組正義引物5，-ATGGAGACAGACACACACACTCCTGCTAT-3，序列號 26C組正義引物5’ -ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3’ 序列號 27D組正義引物(使用下述2種引物的混合物)5’ -ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’ 序列號 285，-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3，序列號 29E組正義引物(使用下述3種引物的混合物)5，-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3，序列號 305’ -ATGTGGGGAYCGKITTYAMMCTTTTCAATTG-3’ 序列號 315，-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3，序列號 32F組正義引物(使用下述4種引物的混合物)5，-ATGAGIMMKTCMTTCAITTCYTGGG-3’ 序列號 335’ -ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3’ 序列號 345，-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3，序列號 355’ -ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3’ 序列號 36G組正義引物(使用下述4種引物的混合物)5，-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3，序列號 37
5，-ATGGAITTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3，序列號 385’ -ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3’ 序列號 395，-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3，序列號 40KVL反義引物ACTGGATGGTGGGAAGATGGA :序列號 41B.用于以PCR法擴(kuò)增小鼠H鏈V區(qū)基因而使用的引物使用在5’末端與小鼠H鏈信號部分(4組引物)具有相同性的引物和在3’末端與KC部分具有相同性的引物、或者在5’末端與FRl部分具有相同性的I組引物和在3’末 端與小鼠H鏈的固定恒定區(qū)(IGHC)具有相同性的2種引物組，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從該cDNA中分離小鼠免疫球蛋白H鏈可變區(qū)DNA。引物序列如下。( i )小鼠H鏈可變區(qū)克隆引物VH正義(信號部分4組引物)該引物參考Current Protocols in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.)Unit 2. 12Cloning, Expression, and Modification of Antibody V Regions 的 Table2，12，2 制作。5’ -ATG GRATGS AGC TGK GTMATS CTC TT-3’(簡并度32):序列號 425，-ATG RAC TTC GGGYTGAGC TKG GTT TT-3，(簡并度:8):序列號 435，-ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T-3，序列號 445，-ATG GRC AGR CTTACff TYY-3’(簡并度32):序列號 45(ii)小鼠H鏈可變區(qū)克隆引物VH 正義(FRl 部分)該引物是改變Tan等，“Superhumanized，，Antibodies:Reductionof ImmunogenicPotential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human GermlineSequences!Application to an Anti-CD281,Journal of Immunology 169 (2002)p 1119-1125的正義引物的堿基序列而設(shè)計(jì)的。5，-SAG GTS MAR CTK SAG SAG TCff GG-3’(簡并度:256):序列號 46VH反義(3、4共同的反義引物)將堿基序列簡并而設(shè)計(jì)，以使其能夠與小鼠IgG所有的亞型退火。5，-CAS CCC CAT CDG TCTATC C-3’(簡并度6):序列號 47 實(shí)施例 5 嵌合抗 CDH3免疫球蛋白表達(dá)載體的制作表達(dá)質(zhì)粒的制作通過使用DNA Engine (Peltier Thermal Cycler, MJResearch, Bio-Rad)的PCR法，使用實(shí)施例4中所示的引物分別擴(kuò)增抗CDH3小鼠單克隆抗體L鏈、H鏈的可變區(qū)。將擴(kuò)增得到的DNA片段重組入亞克隆載體pGEM(Promega公司)中，使用與該載體的17、在SP6啟動(dòng)子結(jié)合的通用引物確定堿基序列。以MGT/V-QUEST Searchpage (http://imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest livret=0&0ption=mouseIg)檢索所得到的抗CDH3抗體的L鏈和H鏈的可變區(qū)堿基序列，確認(rèn)抗體基因確實(shí)已克隆。接著，設(shè)計(jì)分別將克隆化的編碼抗CDH3抗體L鏈的V區(qū)的基因與編碼人源Ck區(qū)的基因連接的基因、將編碼H鏈的V區(qū)的基因與編碼人源Ck I區(qū)的基因連接的基因，由GenScript公司人工合成這些L鏈、H鏈嵌合抗體基因的全長。此時(shí)，為了使在生產(chǎn)細(xì)胞中的基因表達(dá)有利，進(jìn)行密碼子使用頻率的最佳化(按照Kim等在Codonoptimization for highlevel expression of human erythropoietin(EPO)in mammaliancells, Gene, 1997，p293_301的方法)進(jìn)行。具體而言，在L鏈時(shí)，為了有效地翻譯，將必須的DNA序列(Kozak, M.，J.，At least six nucleotides preceding the AUG initiator codonenhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol, 196，p947_950, 1987)、小鼠 IGKV的信號肽、抗CDH3抗體的L鏈的V區(qū)、人源Ck區(qū)依次排列基因，在其兩端附加限制性內(nèi)切酶部位(在5’ 一側(cè)是Nhe I，在3’ 一側(cè)是EcoR I)。嵌合H鏈也同樣制作。以Nhe I和EcoR I切斷這些人工合成基因，重組入表達(dá)載體pCAGGS的Nhe I和EcoR I部位中，得到抗CDH3嵌合抗體L鏈表達(dá)載體pCAGGS-IGK、H鏈表達(dá)載體pCAGGS_IGH。實(shí)施例6嵌合抗CDH3免疫球蛋白穩(wěn)定表達(dá)載體的制作為了使用CHO細(xì)胞以高水平表達(dá)經(jīng)過基因操作的抗體基因，與CMV啟動(dòng)子連接，制作重組入具有多聚腺苷酸信號的二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的載體。 為了制作嵌合抗體的穩(wěn)定表達(dá)生產(chǎn)細(xì)胞株,制作重組入dhfr基因的pCAGGS表達(dá)載體。具體而言，在一過性表達(dá)載體PCAGGS-IGH和pCAGGS-IGK中重組入具有CMV啟動(dòng)子和多聚腺苷酸信號的小鼠dhfr基因。將具有CMV啟動(dòng)子、Kozak序列的小鼠dhfr基因、SV40多聚腺苷酸信號分別由PCR法擴(kuò)增，以PCR法連接這些基因的混合物，并且在兩端附加Hind III部位，得到稱為Hind III -CMV啟動(dòng)子-Kozak-dhfr-多聚腺苷酸-Hind III的基因片段。將該片段重組入pCAGGS-IGH或pCAGGS-IGK 的Hind III部位中，得到pCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A 和 pCAGGS-IGK-CMVp-dhfr_A。這些表達(dá)載體可以以 CAG 啟動(dòng)子使嵌合抗體表達(dá)，可以以CMV啟動(dòng)子使dhfr基因表達(dá)，可以有效地利用基因擴(kuò)增生產(chǎn)嵌合抗體。實(shí)施例7嵌合抗⑶H3生產(chǎn)CHO細(xì)胞株的樹立使用CHO dhfr-細(xì)胞(G. Urlaub 等，Isolation of Chinese hamster cellmutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA77,p4216-4220, 1980)，通過2種質(zhì)粒(以氨芐青霉素耐性基因內(nèi)的Pvu I切斷質(zhì)粒，從環(huán)狀質(zhì)粒成為線狀質(zhì)粒)，即，通過用于表達(dá)嵌合抗⑶H3L鏈的pCAGGS-IGK-CMV-dhfr-A載體和用于表達(dá)嵌合抗CDH3H鏈的pCAGGS-IGH-CMV-dhfr-A載體同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。電穿孔以Lonza公司生產(chǎn)的Amaxa進(jìn)行。在3X IO3細(xì)胞的O. ImL的Amaxa電穿孔CHO用緩沖液中加入DNA(L鏈、H鏈各質(zhì)粒為2 μ g/試樣),給予脈沖。在含有10%透析過的FBS、不含HT (H，次黃嘌呤；T，胸苷)的Iscove’s ModifiedDulbecco培養(yǎng)基(MDM)中加入被電穿孔處理過的細(xì)胞。從基因?qū)?日后，將培養(yǎng)基更換為10%透析FBS、2mM L-谷氨酸、不含HT的MDM的培養(yǎng)基，以lmg/mL的G418進(jìn)行neo+轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇，得到嵌合抗體產(chǎn)生陽性細(xì)胞株克隆。接著，使用由G418選擇得到的克隆進(jìn)行基因擴(kuò)增。在250nM、1000nM的2輪甲氨喋呤(MTX)中的擴(kuò)增后，樹立了每I升培養(yǎng)上清生產(chǎn)約50 IOOmg嵌合⑶H3抗體的細(xì)胞株。確立的嵌合抗⑶H3抗體穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞株保藏在國家技術(shù)評估學(xué)會(huì)專利微生物保藏中心。[表I]
權(quán)利要求
1.一種放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 其為放射性金屬元素通過金屬螯合試劑與抗鈣粘素抗體結(jié)合而成的抗體。
2.如權(quán)利要求I所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于抗鈣粘素抗體是能夠與序列號2的1-655部分結(jié)合的抗體。
3.如權(quán)利要求I或2所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于抗鈣粘素抗體是單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 抗鈣粘素抗體是選自嵌合抗體、人源化抗體和人源抗體中的抗體。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 抗鈣粘素抗體是由保藏號為 NITE BP-897.NITE BP-898、NITEBP-899、NITE BP-1034、NITE BP-1035.NITE BP_1036、NITE BP-1037,NITE BP-1038,NITE BP-1039,NITE BP-I040,NITE BP-1041、NITEBP-1042、NITE BP-1043, NITE BP-1044、NITE BP-1045、NITEBP-1046、NITE BP-1047、NITE BP-1048、NITE BP-1049 或 NITEBP-1050 的抗體產(chǎn)生細(xì)胞所生產(chǎn)的單克隆抗體或其基因重組抗體或者其任一種的片段。
6.如權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 抗鈣粘素抗體是由保藏號為 NITE BP-897.NITE BP-898、NITEBP-899、NITE BP-1034、NITE BP-1035、NITE BP-1036,NITE BP-1037,NITE BP-1038,NITE BP-1039或NITE BP-1040的抗體產(chǎn)生細(xì)胞所生產(chǎn)的單克隆抗體或其基因重組抗體或者其任一種的片段。
7.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 抗鈣粘素抗體是改變權(quán)利要求6所述的單克隆抗體而制作的嵌合抗體、人源化抗體或其片段。
8.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 抗鈣粘素抗體是具有由與權(quán)利要求6所述的單克隆抗體的VH和/或VL區(qū)域的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列組成的VH和/或VL區(qū)域的抗體或其片段。
9.如權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 金屬螯合試劑是選自異硫氰基芐基DOTA、甲基異硫氰基芐基DTPA、環(huán)己基異硫氰基芐基DTPA中的金屬螯合試劑。
10.如權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 抗鈣粘素抗體和金屬螯合試劑的摩爾比為I : O. I I : 4. 5。
11.如權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 抗鈣粘素抗體和金屬螯合試劑的摩爾比為I : O. 5 I : 3。
12.如權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 放射性金屬元素是作為癌治療被使用的細(xì)胞損傷性放射性金屬。
13.如權(quán)利要求12所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于細(xì)胞損傷性放射性金屬是選自釔 90 (9°Y)、錸 186 (186Re)、錸 188 (188Re)、銅 67 (67Cu)'鐵 59 (59Fe)'銀89 (89Sr)、金 198 (198Au)、鏑 165 (165Dy)、釕 103 (103Ru)、欽 166 (166Ho)、釤 153 (153Sm)和镥177 (177Lu)中的放射性金屬。
14.如權(quán)利要求12或13所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 細(xì)胞損傷性放射性金屬是釔90 (9°Y)。
15.如權(quán)利要求12 14中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 癌治療對象是表達(dá) 丐粘素的癌。
16.如權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 放射性金屬元素是作為癌診斷被使用的細(xì)胞非損傷性放射性金屬。
17.如權(quán)利要求16所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于細(xì)胞非損傷性放射性金屬是選自锝 99m (99mTc)、銦 111 (mIn)、銦 113m (113mln)、鎵 67 (67Ga)'鎵 68(68Ga)、鉈 201 (201Tl)'鈷 57 (57Co)、鍶 85 (85Sr)和銅 64 (64Cu)中的放射性金屬。
18.如權(quán)利要求16或17所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于 細(xì)胞非損傷性放射性金屬是選自銦111 (111In)和鎵67 (67Ga)的放射性金屬。
19.一種癌治療藥物，其特征在于 以權(quán)利要求12 15中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體為有效成分。
20.一種癌診斷藥物，其特征在于 以權(quán)利要求16 18中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體為有效成分。
21.一種抗體產(chǎn)生細(xì)胞，其特征在于 作為保藏號 NITE BP-897、NITE BP-898、NITE BP-899、NITEBP-1034、NITE BP-1035、NITE BP-1036、NITE BP-1037、NITEBP_1038、NITE BP-1039,NITE BP-1040,NITE BP-1041、NITEBP-1042、NITE BP-1043, NITE BP-1044, NITE BP-1045、NITEBP-1046、NITE BP-1047、NITE BP-1048、NITE BP-1049 或 NITEBP-1050 被保藏。
22.如權(quán)利要求12 15中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于用于癌治療。
23.如權(quán)利要求16 18中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其特征在于用于癌診斷。
24.權(quán)利要求12 15中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體在癌治療藥物的制造中的使用。
25.權(quán)利要求16 18中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體在癌診斷藥物的制造中的使用。
26.一種癌的治療方法，其特征在于 投與有效量的權(quán)利要求12 15中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體。
27.一種癌的診斷方法，其特征在于 投與有效量的權(quán)利要求16 18中任一項(xiàng)所述的放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供一種癌組織特異性高蓄積的放射性金屬抗鈣粘素抗體、抗癌效果高且安全性高的癌治療藥物和癌診斷藥物。一種放射性金屬標(biāo)記抗鈣粘素抗體，其為放射性金屬元素通過金屬螯合試劑與抗鈣粘素抗體結(jié)合而成的抗體。
文檔編號A61K51/00GK102892787SQ201180009219
公開日2013年1月23日 申請日期2011年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者日野明弘, 長野朗夫, 渡邊雅彥, 松浦正, 佐藤廣一, 野村富美子, 見供克之 申請人:富士膠片Ri制藥株式會(huì)社, 株式會(huì)社英仙蛋白質(zhì)科學(xué)