專利名稱：癌癥疫苗的制作方法
癌癥疫苗 本發(fā)明涉及一種疫苗，其用于預(yù)防和治療血癌，例如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。癌癥是一種異常的疾病狀態(tài)，其中一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群的不受控制的增殖干擾正常的生理功能。增殖的變化通常伴隨著細(xì)胞特性的其他變化，包括回復(fù)到一種組織性較差的狀態(tài)。癌細(xì)胞通常被稱為“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化細(xì)胞通常顯示以下幾種特性球形形態(tài)、胎兒抗原的表達(dá)、非依賴性生長因子、缺乏接觸性抑制、非貼附性(anchorage-1ndependence)和高密度生長。癌細(xì)胞形成腫瘤并被稱為“原發(fā)性”或“繼發(fā)性”腫瘤。原發(fā)性腫瘤導(dǎo)致癌細(xì)胞在一個(gè)器官中生長，原發(fā)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在該器官中發(fā)育。癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤逃離并在另一個(gè)器官形成繼發(fā)性腫瘤，從而導(dǎo)致繼發(fā)性腫瘤。這一過程被稱為腫瘤轉(zhuǎn)移，并且這個(gè)過程可以是侵襲性的，例如就肝癌或肺癌而言。 淋巴瘤是起始于淋巴細(xì)胞并在淋巴結(jié)中形成固體腫瘤的癌癥。淋巴瘤是一個(gè)分類大量起源于淋巴細(xì)胞的癌癥的術(shù)語。例如B細(xì)胞腫瘤，例如慢性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom macroglobulinemia)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma) ;T細(xì)胞腫瘤例如T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、NK細(xì)胞白血病、T細(xì)胞大顆粒性淋巴細(xì)胞性白血病、成人T細(xì)胞白血病。此外，淋巴瘤還包括其本身可以被細(xì)分的霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。除上述外，與免疫缺陷相關(guān)的淋巴瘤是普遍存在的，例如與HIV感染相關(guān)的淋巴瘤、移植后淋巴瘤相關(guān)的淋巴瘤和與甲氨蝶呤治療相關(guān)的淋巴瘤。這些后面的淋巴瘤帶來了特別的困難，因?yàn)橐呙缃臃N不是一個(gè)可行的療法。淋巴瘤的治療通常是化學(xué)療法和放射治療，并根據(jù)特定的淋巴瘤和分期，這些療法可以是有效的治療方法。提供一種保護(hù)免疫缺陷受治療者的疫苗是所期望的。目前，還沒有被證實(shí)的和有效的接種疫苗的手段來對(duì)抗這一類癌癥。決定抗體對(duì)其抗原的結(jié)合特異性的抗體區(qū)被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，也被稱為“高變區(qū)”或“獨(dú)特型”。由于抗體的抗原結(jié)合區(qū)由隨機(jī)的氨基酸序列組成，所以其對(duì)于B細(xì)胞的單克隆或少數(shù)克隆是獨(dú)特的。因此這些獨(dú)特的肽序列自身是抗原性的，并且結(jié)合用來組成抗體分子的特有的獨(dú)特型。正如抗原由一定數(shù)量的表位組成，于是獨(dú)特型也由一定數(shù)量的“獨(dú)特型”組成。用特別的獨(dú)特型的純化免疫球蛋白免疫接種可以產(chǎn)生抗此獨(dú)特型的抗體應(yīng)答。有兩個(gè)系統(tǒng)使用免疫球蛋白作為疫苗抗原，目的是誘導(dǎo)抗免疫球蛋白的免疫應(yīng)答。在這兩個(gè)系統(tǒng)中，抗體的高變區(qū)或獨(dú)特型用來引發(fā)免疫應(yīng)答。在兩種情況下，抗體的獨(dú)特型被用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型應(yīng)答(ant1-1d)。第一種情況，抗體的獨(dú)特型是免疫效應(yīng)應(yīng)答的實(shí)際靶點(diǎn)。例如B細(xì)胞淋巴瘤和白血病通常都是來自B細(xì)胞的單一克隆，并且由此可以在這些細(xì)胞表面上表達(dá)對(duì)腫瘤來說是獨(dú)特的或幾乎獨(dú)特的免疫球蛋白?？姑庖咔虻鞍转?dú)特型的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生是接種疫苗的預(yù)期效果，其可以有助于腫瘤細(xì)胞的清除。產(chǎn)生的抗獨(dú)特型應(yīng)答由抗體和T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答組成。免疫球蛋白獨(dú)特型因此可以是腫瘤特異性抗原的最佳實(shí)例之一。第二個(gè)系統(tǒng)采用所謂的“內(nèi)影像的抗獨(dú)特型抗體”以產(chǎn)生抗原交叉反應(yīng)的應(yīng)答，其可以是腫瘤抗原或來自病原體或其他來源的抗原，由于種種原因這些抗原難以純化或直接施用時(shí)是弱免疫原性的。
基于獨(dú)特型的疫苗(包括如上所述的抗獨(dú)特型疫苗)為本領(lǐng)域已知的。然而,這些疫苗存在相關(guān)問題。首先，對(duì)于淋巴瘤患者，疫苗必須單獨(dú)地生產(chǎn)，因?yàn)楠?dú)特型很可能是個(gè)體腫瘤所特有的，并且配制疫苗會(huì)花費(fèi)數(shù)月時(shí)間，其中往往涉及生產(chǎn)分泌所需獨(dú)特型的雜交瘤，純化免疫球蛋白，然后與蛋白載體例如KLH偶聯(lián)。其次，人免疫球蛋白在人體中是內(nèi)在的弱免疫原性的，因此盡管與載體偶聯(lián)增強(qiáng)了對(duì)獨(dú)特型的免疫應(yīng)答，但ant1-1d抗體應(yīng)答有減弱的趨勢(shì)(事實(shí)上，很大比例的對(duì)偶聯(lián)物的應(yīng)答針對(duì)的是高免疫原性的載體蛋白)。第三，已經(jīng)證明，在小鼠和人中，抗獨(dú)特型蛋白的CD4+T細(xì)胞和CD8+CTL應(yīng)答均可能在介導(dǎo)治療應(yīng)答中是重要的并且與載體例如KLH的偶聯(lián)不是產(chǎn)生CTL應(yīng)答的最有效手段。本發(fā)明涉及預(yù)防性和治療性治療淋巴瘤的疫苗和治療方案。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種疫苗，其包含
i)從罹患淋巴瘤的患者中分離出的獨(dú)特型抗原；ii)與所述獨(dú)特型抗原連接的⑶40單克隆抗體佐劑或其⑶40結(jié)合片段；和iii)第二佐劑，其增強(qiáng)對(duì)所連接的獨(dú)特型抗原和CD40單克隆抗體佐劑的免疫應(yīng)答。⑶40單克隆抗體是本領(lǐng)域已知的。例如，US2009/007471(其內(nèi)容通過引用以其整體并入，尤其是所述抗體的可變區(qū)的氨基酸序列并入)公開了適用于根據(jù)本發(fā)明的疫苗的人源化抗人CD40和嵌合抗人CD40，并且公開的序列示于

圖12中。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二佐劑選自由細(xì)胞因子組成的組，細(xì)胞因子選自由GMCSF、干擾素Y、干擾素α、干擾素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF(轉(zhuǎn)化生長因子)、TNF(腫瘤壞死因子)α和TNF0組成的組。在本發(fā)明的進(jìn)一步替代實(shí)施方案中，所述佐劑為TLR激動(dòng)劑，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、單磷?；|(zhì)Α、聚肌苷酸聚胞苷酸[poly1:C]及其衍生物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑為poly1:C。Poly1:C是一種佐劑，其與由B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)的Toll樣受體TLR3結(jié)合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑是細(xì)菌細(xì)胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒狀霉菌酸酯(trehelose dycorynemycolate) (TDM)和/或單磷?；|(zhì)A[MPL]。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑為MPL。佐劑是通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性來增強(qiáng)針對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)或方法。佐劑的實(shí)例包括(僅舉例而言)針對(duì)協(xié)同刺激分子的激動(dòng)性抗體、弗氏佐劑、胞壁酰二肽、脂質(zhì)體、明礬、QS21。因此佐劑是免疫調(diào)節(jié)劑。載體是免疫原性分子，當(dāng)其與第二分子結(jié)合時(shí)增強(qiáng)后者的免疫應(yīng)答。術(shù)語載體按下列方式解釋。載體是一種免疫原性分子，當(dāng)其與第二分子結(jié)合時(shí)，能夠增強(qiáng)后者的免疫應(yīng)答。一些抗原本質(zhì)上是不具有免疫原性的，但當(dāng)其與外源蛋白分子例如匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole-1 impet haemocyanin)或破傷風(fēng)類毒素結(jié)合時(shí)能夠產(chǎn)生抗體應(yīng)答。這種抗原含有B細(xì)胞表位，但沒有T細(xì)胞表位。這類偶聯(lián)物的蛋白部分(“載體”蛋白)提供了 T細(xì)胞表位，其刺激輔助性T細(xì)胞，然后依次刺激抗原特異性的B細(xì)胞以分化成漿細(xì)胞并且產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體。輔助性T細(xì)胞還可以刺激其他免疫細(xì)胞，例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并且載體可以在產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和抗體中起到類似作用。某些缺乏T細(xì)胞表位的抗原例如重復(fù)的B細(xì)胞表位(例如，細(xì)菌多糖)的聚合物，具有有限程度的本質(zhì)上的免疫原性。這些被稱為不依賴性T抗原。這些抗原受益于與載體(例如，破傷風(fēng)類毒素)的結(jié)合，在這種情況下它們引起更強(qiáng)的抗體應(yīng)答。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述獨(dú)特型抗原包含獨(dú)特型免疫球蛋白的Fab或F(ab) 2’ Fd片段或由獨(dú)特型免疫球蛋白的Fab或F(ab) 2’ Fd片段組成。獨(dú)特型抗原可以在免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)內(nèi)，S卩(Fab、F(ab)2’ Fd片段)，或確實(shí)嵌合在重鏈和輕鏈可變區(qū)和另一個(gè)抗體恒定區(qū)之間。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于治療淋巴瘤的疫苗，其包含i)從罹患淋巴瘤的患者中分離出的獨(dú)特型抗原；ii)與所述獨(dú)特型抗原連接的⑶40單克隆抗體佐劑或其⑶40結(jié)合片段；和
iii)第二佐劑，其增強(qiáng)對(duì)所連接的獨(dú)特型抗原和CD40單克隆抗體佐劑的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述淋巴瘤是B細(xì)胞淋巴瘤。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述B細(xì)胞淋巴瘤選自由慢性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、伯基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、骨髓瘤B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤(例如瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥)、脾臟邊緣區(qū)淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤、結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(也被稱為MALT淋巴瘤)、結(jié)性邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(NMZL)、濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴瘤、血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病組成的組。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述淋巴瘤為霍奇金氏淋巴瘤。在本發(fā)明的替代優(yōu)選實(shí)施方案中，所述淋巴瘤為非霍奇金氏淋巴瘤。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述淋巴瘤為免疫缺陷相關(guān)淋巴瘤。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫缺陷相關(guān)淋巴瘤為HIV相關(guān)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫缺陷相關(guān)淋巴瘤為移植相關(guān)。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫缺陷相關(guān)淋巴瘤為甲氨蝶呤治療的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于治療骨髓瘤的疫苗，其包含i)從罹患骨髓瘤的患者中分離出的獨(dú)特型抗原；ii)與所述獨(dú)特型抗原連接的⑶40單克隆抗體佐劑或其⑶40結(jié)合片段；和iii)第二佐劑，其增強(qiáng)對(duì)所連接的獨(dú)特型抗原和⑶40單克隆抗體或其⑶40結(jié)合片段的佐劑的免疫應(yīng)答。施用疫苗或包含本發(fā)明疫苗的藥物組合物時(shí)，可在藥學(xué)上可接受的制劑下施用。這類制劑可常規(guī)地包含藥學(xué)上可接受的濃度的鹽，緩沖劑、防腐劑、兼容載體、補(bǔ)充免疫增效劑以及任選的其它治療劑，例如化學(xué)治療劑，所述其它治療劑可以與本發(fā)明的疫苗分離施用或以組合制劑施用，如果組合物是兼容的。本發(fā)明的疫苗可以通過任意常規(guī)途徑施用，包括注射或隨時(shí)間的漸進(jìn)輸注。施用可以是，例如，口服、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或透皮。以有效量施用本發(fā)明的組合物?！坝行Я俊笔悄軌騿为?dú)，或連同其它劑量一起，產(chǎn)生所期望免疫應(yīng)答的組合物的量。在治療淋巴瘤的情況下，所期望的應(yīng)答是抑制疾病的發(fā)展。其可以包括僅僅暫時(shí)減緩疾病的發(fā)展，但是更優(yōu)選的是，其包括永久性地阻止疾病的發(fā)展。這可以通過常規(guī)的方法進(jìn)行監(jiān)測。在上述方法中所使用的疫苗優(yōu)選是無菌的，并包含用于產(chǎn)生所需應(yīng)答的有效量，適于以重量或體積為單位施用給患者。應(yīng)答，例如，可以通過腫瘤退化、疾病癥狀減輕、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等來測量。疫苗施用的其它方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其中劑量、注射時(shí)間表、注射部位、施用方式(例如，腫瘤內(nèi))等等都與前述不同。向除人以外的哺乳動(dòng)物施用組合物(例如，出于檢測目的或獸醫(yī)治療目的)在與上述基本相同的條件下進(jìn)行。如本文所用的受治療者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人，且包括非人靈長類動(dòng)物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒類動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了一種適用于預(yù)防或治療淋巴瘤的疫苗的制備方法，其包括i)從患有或易感淋巴瘤的受治療者分離出獨(dú)特型抗原；ii)連接所述獨(dú)特型抗原與⑶40單克隆抗體佐劑或其⑶40結(jié)合片段以形成復(fù)合物并且任選分離所連接的復(fù)合物；及iii)形成與至少一種附加佐劑連接的抗原/佐劑復(fù)合物的制劑。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了一種適用于預(yù)防或治療淋巴瘤的疫苗的制造方法，其包括i)提供包含淋巴瘤細(xì)胞的分離的生物樣本；ii)提供產(chǎn)生⑶40單克隆抗體或其⑶40結(jié)合片段的分離的雜交瘤細(xì)胞；iii)形成制劑，其適用于促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞與所述雜交瘤細(xì)胞系融合以形成雜交細(xì)胞；iv)篩選所述雜交細(xì)胞的單克隆抗體，其中所述抗體包括至少兩種免疫球蛋白或其抗原結(jié)合部分，其中一種免疫球蛋白或部分對(duì)CD40是特異的且第二種免疫球蛋白或部分是淋巴瘤獨(dú)特型；及V)形成與至少一種附加佐劑連接的抗原/佐劑復(fù)合物的制劑。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述第二佐劑選自由細(xì)胞因子組成的組，所述細(xì)胞因子選自由GMCSF、干擾素Y、干擾素α、干擾素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素l、TGF、TNFa TNF β組成的組。在本發(fā)明的進(jìn)一步替代方法中，所述佐劑為TLR激動(dòng)劑，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、單磷酰基脂質(zhì)A、poly1:C及其衍生物。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述佐劑為poly1:C。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述佐劑是細(xì)菌細(xì)胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒狀霉菌酸酯(TDM)和/或單磷?；|(zhì)A[MPL]。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述佐劑為MPL。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于治療淋巴瘤的疫苗，其包含i)從罹患淋巴瘤的患者中分離出的獨(dú)特型抗原；及ii)第二佐劑，其增強(qiáng)對(duì)所述獨(dú)特型抗原的免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑選自由細(xì)胞因子組成的組，所述細(xì)胞因子選自由GMCSF、干擾素Y、干擾素β、干擾素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素l、TGF、TNFa TNF β組成的組。在本發(fā)明的進(jìn)一步替代實(shí)施方案中，所述佐劑為TLR激動(dòng)劑，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、單磷?；|(zhì)A、poly1:C及其衍生物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑為poly1:C。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑為細(xì)菌細(xì)胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒狀霉菌酸酯(TDM)和/或單磷?；|(zhì)A[MPL]。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述佐劑為MPL。在本說明書的描述和權(quán)利要求中，“包含”和“含有”以及這些詞的變化形式，例如，“包含(comprising)”和“包含(comprises) ”都是指“包括但不限于”，并且不意圖(也沒有)排除其它部分、添加劑、組分、整數(shù)或步驟。在本說明書的描述和權(quán)利要求中，除非上下文另外要求，否則單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)形式。具體地，當(dāng)使用不 定寇詞時(shí)，除非上下文另外要求，否則說明書應(yīng)被理解為指復(fù)數(shù)以及單數(shù)。結(jié)合本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣鳌⒄麛?shù)、特性、化合物、化學(xué)部分或組都應(yīng)被理解為適用于本文描述的任何其它方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?，除非與它們不相匹配。現(xiàn)在僅示例性地并參考以下附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行說明。圖1 :間隔2個(gè)月給予2個(gè)劑量的疫苗后，小鼠中A20淋巴瘤的腫瘤生長[A]和第60天存活率[B](每組n=5)；圖2 :第二次接種疫苗后14天且腫瘤攻擊前的IgG抗A20抗體反應(yīng)；圖3 :第二次接種疫苗后14天且腫瘤攻擊前的IgG抗A20抗體反應(yīng)；圖4 :單次接種疫苗后14天且腫瘤攻擊前的IgG抗A20抗體反應(yīng)；圖5 :給予單次劑量的ADX40-A20偶聯(lián)物疫苗的IgGl和IgG2a同種型后，小鼠中A20淋巴瘤的腫瘤生長[A]和第60天存活率[B](每組n=5)；圖6 :間隔2周給予2個(gè)劑量的疫苗后，小鼠中A20淋巴瘤的腫瘤生長[A]和第60天存活率[B](每組n=5)；圖7 :間隔2周給予2個(gè)劑量的具有或不具有MPL的疫苗[攻擊5a]后，小鼠中A20淋巴瘤的腫瘤生長[A]和第60天存活率[B](每組n=5)，；圖8 :間隔2周給予2個(gè)劑量的具有或不具有poly-1:C的疫苗[攻擊5b]后，小鼠中A20淋巴瘤的腫瘤生長[A]和存活曲線[B](每組n=10)；圖9 :與GM-CSF 一起給予2個(gè)劑量的疫苗[攻擊6和10]后，小鼠中A20淋巴瘤的腫瘤生長[A，C]和存活曲線[B, D](每組n=10)；圖10 :增加ADX40-A20或KLH-A20偶聯(lián)物的劑量水平[攻擊7和9]后，小鼠中A20淋巴瘤的腫瘤生長[A，C]和存活曲線[B, D](每組n=10)；圖11說明ADX40淋巴瘤疫苗的潛在作用模式，以及圖12a為結(jié)合人⑶40的⑶40單克隆抗體的可變重鏈的核苷酸序列；圖12b為結(jié)合人CD40的CD40單克隆抗體的氨基酸序列；圖12c為包含融合于人IgGl恒定區(qū)重鏈的CD40可變區(qū)的嵌合抗體；圖12d為結(jié)合人CD40的CD40單克隆抗體的可變輕鏈的核苷酸序列；圖12e為結(jié)合人CD40的CD40單克隆抗體的可變輕鏈的氨基酸序列；圖12f為圖12e中提及的全長可變輕鏈。材料與方法用于偶聯(lián)的獨(dú)特型蛋白的制備摻入淋巴瘤或白血病疫苗的腫瘤獨(dú)特型蛋白可以通過兩種廣泛的方法之一得到。在這兩種情況下，腫瘤細(xì)胞首先通過活組織檢查得到。第一種方法是雜交瘤拯救，其中腫瘤細(xì)胞與人/鼠異種雜交瘤或類似無限增殖細(xì)
胞系例如骨髓瘤細(xì)胞系融合以產(chǎn)生其它雜交瘤，然后基于腫瘤獨(dú)特型蛋白的分泌進(jìn)行選擇。然后在組織培養(yǎng)中、通常在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所選的雜交瘤以獲得上清液，獨(dú)特型蛋白從上清液中純化123。第二種方法是重組Id制備。在含有Id的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列中，腫瘤特異性免疫球蛋白是通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法(例如PCR)克隆的。然后將兩條克隆的序列插入到包含共享的免疫球蛋白恒定區(qū)序列的質(zhì)粒，并且完整的質(zhì)粒最終被轉(zhuǎn)導(dǎo)入不同的活寄主例如細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞或煙草植株。Id蛋白隨后從培養(yǎng)上清液或轉(zhuǎn)染細(xì)胞中純化4。偶聯(lián)物的制備從通過PEG融合制備的A20淋巴瘤細(xì)胞和P3X63骨髓瘤細(xì)胞之間的拯救雜交瘤的生物反應(yīng)器上清液中，A20獨(dú)特型蛋白(A20)通過G蛋白親和層析法純化。A20獨(dú)特型蛋白首先與-4_(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸硫代琥珀酰亞胺酯(sulpho-SMCC)反應(yīng)來制備馬來酰亞胺活化的A20。用N-琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)同時(shí)處理鼠IgGl或IgG2a抗CD40單克隆抗體(兩種ADX40, IgGl變體和IgG2a變體)，以引入受保護(hù)的巰基。隨后抗體和羥胺的脫乙?；捎坞x的巰基，其與A20上的馬來酰亞胺基反應(yīng)以形成穩(wěn)定的偶聯(lián)物。同種型-匹配的對(duì)照抗體以類似的方式與A20偶聯(lián)。交聯(lián)通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡確定。小鼠的免疫和攻擊給予6-8周齡雌性的BALB/c小鼠一或兩次免疫原的腹腔內(nèi)注射，隨后在最后一次免疫至少2周后，使用IO5個(gè)A20淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行皮下攻擊。監(jiān)測腫瘤生長到直徑15毫米，此時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行篩選。存活曲線顯示其體內(nèi)腫瘤已達(dá)到15毫米閾值的非存活小鼠。60天存活率表示其中沒有出現(xiàn)可見腫瘤的小鼠的百分比。對(duì)照疫苗接種包括同種型-匹配的偶聯(lián)物、與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)的A20、單獨(dú)A20抗原或磷酸鹽緩沖液(PBS)。體液免疫應(yīng)答通過酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)采用大鼠抗小鼠IgG Fe特異性的檢測抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)測定 A20 的抗 Fab 片段的 IgG。實(shí)施例1兩種疫苗接種的影響(攻擊I)小鼠(每組5只)的腫瘤體積和存活率數(shù)據(jù)分別如圖1A和圖1B所示，該小鼠用ADX40IgGl變體間隔2個(gè)月接種并在第二次接種后20天進(jìn)行攻擊。
在ADX40-A20偶聯(lián)物組中的腫瘤生長暈(outgrowth)顯著比用同種型對(duì)照、KLH-A20偶聯(lián)物或單獨(dú)A20接種的動(dòng)物中的腫瘤生長暈小(P〈0. 01，使用Dunn后檢驗(yàn)校正的Kruskal-Wallis檢驗(yàn))并且也顯著低于PBS組中的腫瘤生長暈(P〈0. 05)。ADX40-A20偶聯(lián)物免疫組的第60天存活率顯著好于同種型對(duì)照免疫組(p=0. 048，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn))而且也高于給予KLH-A20偶聯(lián)物、單獨(dú)A20抗原或PBS的動(dòng)物的存活率，這沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性。圖2顯示在第二次疫苗接種14天后誘導(dǎo)的抗A-20抗體應(yīng)答。同種型對(duì)照偶聯(lián)物就抗體誘導(dǎo)而言是高免疫原性的，但這并沒有轉(zhuǎn)化成降低的腫瘤生長或改善的存活率。對(duì)于ADX40-A20和KLH-A20偶聯(lián)物也可觀察到抗體免疫應(yīng)答，但應(yīng)答水平低于同種型對(duì)照，表明抗體應(yīng)答僅部分反映腫瘤生長暈的預(yù)防。實(shí)施例2
單次疫苗接種的影響(攻擊2)用ADX40 IgGl變體偶聯(lián)物進(jìn)行單次接種并接種后14天進(jìn)行攻擊的小鼠(每組10只)的腫瘤體積和存活率數(shù)據(jù)如圖3A-C所示。在ADX40-A20偶聯(lián)物組中的腫瘤生長暈明顯比在兩個(gè)對(duì)照組中的腫瘤生長暈比且生長緩慢(PBS ρ〈0· 05 ;對(duì)照偶聯(lián)物ρ〈0· 001 ；Dunn檢驗(yàn)后校正的Kruskal-Wallis檢驗(yàn))。然而，ADX40-A20偶聯(lián)物治療組的第60天存活率沒有明顯好于PBS對(duì)照組，盡管在早期時(shí)間點(diǎn)偶聯(lián)物組的存活率比PBS對(duì)照組更好。采用偶聯(lián)物的單次疫苗接種導(dǎo)致ADX40-A20偶聯(lián)物治療組的抗體應(yīng)答略強(qiáng)于對(duì)照動(dòng)物的抗體應(yīng)答(圖4)。實(shí)施例3IgGl和IgG2a ADX40同種型的比較(攻擊3)比較攻擊前14天分別作為單次疫苗接種給予的ADX40 IgGl變體和ADX40 IgG2a變體的腫瘤生長暈和第60天存活率數(shù)據(jù)分別如圖5A和圖5B所示。在ADX40變體或?qū)φ罩g的腫瘤生長暈或第60天存活率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異(Kruskal-Wallis和卡方檢驗(yàn))，但是與PBS對(duì)照組相比，兩種ADX40偶聯(lián)物變體早期有減緩腫瘤生長和增加第60天存活率的趨勢(shì)。實(shí)施例4組合佐劑的評(píng)價(jià)(攻擊4)在一項(xiàng)攻擊研究中，探討了組合的佐劑MPL或poly-1 :C對(duì)ADX40IgGl變體-A20偶聯(lián)物疫苗的影響，其中間隔2個(gè)月對(duì)小鼠(每組5只)接種疫苗2次，然后在兩周后進(jìn)行攻擊。圖6A和圖6B分別顯示腫瘤生長暈和存活率數(shù)據(jù)。與PBS組或KLH偶聯(lián)物組相比，一次或兩次劑量的偶聯(lián)物在腫瘤生長方面均沒有導(dǎo)致顯著性差異。與KLH偶聯(lián)物(ρ〈0· 01)和PBS (ρ〈0. 05)相比，ADX40加MPL顯著減緩腫瘤生長。與PBS組和KLH組相比(Ρ〈0. 01)相比，ADX40加poly1:C顯著減緩腫瘤生長。所有比較通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Dunn后檢驗(yàn)來檢驗(yàn)。與PBS組或KLH組相比，給予一次或兩次的單獨(dú)ADX40沒有明顯改善第60天的存活率。實(shí)施例5
采用MPL (攻擊5a)和poly-1: C (攻擊5b)用較大組的小鼠(每組10只)重復(fù)試驗(yàn)，并且數(shù)據(jù)分別如圖7和圖8所示。ADX40-A20+MPL免疫小鼠與KLH-A20+MPL免疫小鼠相比顯著減緩腫瘤生長(Ρ〈0· 01，Kruskal-Wallis檢驗(yàn))。MPL和ADX40的累加效應(yīng)有明顯的趨勢(shì)，但此時(shí)這沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性。然而，與MPL不同，在第二次攻擊中poly-1: C沒有加強(qiáng)ADX40-A20的抗腫瘤效率，但是當(dāng)與KLH-A20偶聯(lián)物組合時(shí)有佐劑的佐劑效應(yīng)的趨勢(shì)。實(shí)施例6
與“臨床”方案的對(duì)比(攻擊6和IOa)為比較與ADX40偶聯(lián)的A20的效應(yīng)與類似于使用臨床獨(dú)特型淋巴瘤疫苗的方案(即與KLH偶聯(lián)的獨(dú)特性抗原和以GM-CSF為佐劑)，每組10只小鼠給予兩次注射(間隔14天)ADX40-A20、ADX40+GM-CSF和KLH-A20+GM-CSF。疫苗接種當(dāng)天開始以55ng每只小鼠的劑量經(jīng)皮下給予GM-CSF連續(xù)4天(即與臨床方案類似)。圖9A和圖9B分別顯示腫瘤體積和存活率數(shù)據(jù)。在ADX40偶聯(lián)物+GM-CSF組(到21天)和ADX40偶聯(lián)物組(到31天)中，腫瘤生長顯著延遲，表明ADX40偶聯(lián)物優(yōu)于“臨床”疫苗類似物。ADX40偶聯(lián)物和ADX40偶聯(lián)物+GM-CSF相比于PBS組(p=0. 001和p〈0. 03)有顯著的存活優(yōu)勢(shì)。PBS對(duì)照組的中位存活時(shí)間為17天。對(duì)于KLH偶聯(lián)物+GM-CSF組增加到19. 5天，并且對(duì)于在ADX40偶聯(lián)物+GM-CSF組和ADX40偶聯(lián)物組，分別增加到24天和31天。攻擊IOa的數(shù)據(jù)(圖9C和圖9D)支持這些觀察。實(shí)施例7為了優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)的偶聯(lián)物的劑量，向小鼠(每組10只)給予10μ g、20y g或50 μ g的ADX40-A20偶聯(lián)物或KLH-A20偶聯(lián)物。圖10顯示腫瘤體積和存活率數(shù)據(jù)。ADX40-A20偶聯(lián)物的最低劑量(10 μ g)和KLH-A20偶聯(lián)物的中間劑量(20 μ g)被發(fā)現(xiàn)是最有效的。以10 μ g、5 μ g和2. 5 μ g偶聯(lián)物的一次或二次劑量，進(jìn)行ADX40的更低劑量范圍的進(jìn)一步試驗(yàn)。5yg ADX40偶聯(lián)物似乎是最有效的劑量，無論給予一次或二次(圖10)。偶聯(lián)物的兩次劑量(不考慮劑量如何)不令人意外地產(chǎn)生比一次劑量更好的結(jié)果。最后，不同小鼠獨(dú)特型蛋白與ADX40的對(duì)照偶聯(lián)物沒有誘導(dǎo)保護(hù)作用，顯示ADX40疫苗誘導(dǎo)保護(hù)作用的特異性。實(shí)施例8進(jìn)行兩個(gè)治療性的疫苗接種研究，其中在皮下腫瘤移植后，給予ADX40-A20偶聯(lián)物或KLH-A20+GM-CSF 3天(第一個(gè)試驗(yàn))或3和11天(第二個(gè)試驗(yàn))。與對(duì)照相比，任何疫苗方案對(duì)腫瘤生長暈和存活率均沒有顯著性效果(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這些數(shù)據(jù)不令人驚訝，因?yàn)樵谂R床應(yīng)用中，獨(dú)特型疫苗接種通常用于通過化療正在好轉(zhuǎn)的最小殘留病灶的患者。實(shí)施例9不同攻擊試驗(yàn)的存活率數(shù)據(jù)的整合分析(meta-analysis)如表I所示。給予ADX40-A20的小鼠與給予KLH-A20的小鼠相比有顯著改善的存活率(分別為26%比2. 8% ；P=O. 007)。此外，給予ADX40-20的小鼠的60天存活率與給予KLH-A20+GM-CSF (25%)的當(dāng)前臨床方案的小鼠的60天存活率相似，但是釆用2次注射而不是8次注射。最后，證據(jù)表明當(dāng)附加佐劑與ADX40偶聯(lián)物組合時(shí)，可以觀察到協(xié)同效應(yīng)，因?yàn)榻o予ADX40-A20+MPL的動(dòng)物的存活率顯著高于其他組。實(shí)施例10實(shí)施例10說明潛在作用模式。用ADX40-A20+MPL免疫小鼠，并且就在攻擊前耗竭CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞，或兩者都耗竭。僅耗竭CD4細(xì)胞對(duì)腫瘤生長或存活率沒有明顯效果。耗竭CD8T細(xì)胞降低了保護(hù)作用，表明CD8T細(xì)胞在介導(dǎo)ADX40+MPL保護(hù)方面的可能作用。耗竭CD4和CD8細(xì)胞似乎進(jìn)一步降低保護(hù)作用；圖11。參考文獻(xiàn)1. Carrol I WLj Thielemans K, Dilley Jj Levy R. Mouse x humanheterohybridomas as fusion partners with human B cell tumors. J Immunol Methods. 1986; 89:61-72.2. Rodriguez-Calvillo M，Inoges Sj Lopez-Diaz de Cerio A，ZabaleguiNj Villanueva H，Bendandi M. Variations in〃rescuabiIity〃of immunoglobulinmolecules from different forms of human lymphoma:1mplications for ant1-1diotypevaccine development. Crit Rev Oncol Hematol. 2004;52:1-7.3. Kwak LW, Campbell MJj Czerwinski DKj Hart Sj Miller RA, LevyR.1nduction of immune responses in patients with B—cell lymphoma againstthe surface-1mmunoglobulin idiotype expressed by their tumors. N Engl JMed. 1992;327:1209-1215.4. Park HJ，Neelapu SS. Developing idiotype vaccines forlymphoma: from preclinical studies to phase III clinical trial s.Br JHaematol. 2008;142:179-191.
權(quán)利要求
1.一種疫苗，其包含 i)從罹患淋巴瘤或白血病的患者中分離出的獨(dú)特型抗原； )連接至所述獨(dú)特型抗原的⑶40單克隆抗體佐劑或其⑶40結(jié)合片段；和iii)第二佐劑，其增強(qiáng)對(duì)連接的獨(dú)特型抗原和CD40單克隆抗體或其CD40結(jié)合片段佐劑的免疫應(yīng)答。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述第二佐劑選自由細(xì)胞因子組成的組，所述細(xì)胞因子選自由GMCSF、干擾素Y、干擾素α、干擾素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF、TNFa和TNFP組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的疫苗，其中所述佐劑為TLR激動(dòng)劑，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、單磷酰基脂質(zhì)A、poly1:C及其衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其中所述佐劑為poly1:C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中所述佐劑是細(xì)菌細(xì)胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒狀霉菌酸酯(TDM)和/或單磷?；|(zhì)A[MPL]。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其中所述佐劑為MPL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中所述獨(dú)特型抗原包含所述獨(dú)特型抗原的Fab或F(ab)2’片段或由所述獨(dú)特型抗原的Fab或F (ab) 2’片段組成。
8.一種用于治療淋巴瘤或白血病的疫苗，其包含 i)從罹患淋巴瘤或白血病患者中分離出的獨(dú)特型抗原； )連接至所述獨(dú)特型抗原的⑶40的單克隆抗體佐劑或其⑶40結(jié)合片段；和 iii)第二佐劑，其增強(qiáng)對(duì)所連接的獨(dú)特型抗原和CD40單克隆抗體或其CD40結(jié)合片段佐劑的免疫應(yīng)答。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述淋巴瘤或白血病為B細(xì)胞淋巴瘤或白血病。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述B細(xì)胞淋巴瘤選自慢性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、伯基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、伯基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、骨髓瘤、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤(例如，瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥)、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、漿細(xì)胞贅生物、漿細(xì)胞骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤、結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(也稱為MALT淋巴瘤)、結(jié)性邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(NMZL)、濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴瘤、血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述淋巴瘤為免疫缺陷相關(guān)淋巴瘤。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述免疫缺陷相關(guān)淋巴瘤為HIV相關(guān)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述免疫缺陷相關(guān)淋巴瘤為移植相關(guān)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述免疫缺陷相關(guān)淋巴瘤為甲氨蝶呤治療的結(jié)果O
15.一種用于治療骨髓瘤的疫苗，其包含 i)從罹患骨髓瘤的患者中分離出的獨(dú)特型抗原； )連接至所述獨(dú)特型抗原的⑶40單克隆抗體佐劑或其⑶40結(jié)合片段；和iii)第二佐劑，其增強(qiáng)對(duì)所連接的獨(dú)特型抗原和CD40單克隆抗體或其CD40結(jié)合片段佐劑的免疫應(yīng)答。
16.一種適用于預(yù)防或治療淋巴瘤的疫苗的制備方法，其包括 i)從患有或易感淋巴瘤或白血病的受治療者中分離出獨(dú)特型抗原； )連接所述獨(dú)特型抗原與CD40單克隆抗體或其CD40結(jié)合片段佐劑以形成復(fù)合物并且任選分離所連接的復(fù)合物；及 iii)形成與至少一種附加佐劑連接的抗原/佐劑復(fù)合物的制劑。
17.一種適用于預(yù)防或治療淋巴瘤的疫苗的制備方法，其包括 i)提供包含淋巴瘤細(xì)胞的分離的生物樣本； )提供產(chǎn)生CD40單克隆抗體的分離的雜交瘤細(xì)胞； iii)形成制劑，其適用于促進(jìn)所述淋巴瘤細(xì)胞與所述雜交瘤細(xì)胞系的融合以形成雜交細(xì)胞； iv)篩選所述雜交細(xì)胞的單克隆抗體，其中所述抗體包含至少兩種免疫球蛋白，其中一種免疫球蛋白是對(duì)CD40特異的且第二種免疫球蛋白體是淋巴瘤或白血病的獨(dú)特型；及 V)形成與至少一種附加佐劑連接的抗原/佐劑復(fù)合物的制劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述第二佐劑選自由細(xì)胞因子組成的組，所述細(xì)胞因子選自由GMCSF、干擾素Y、干擾素α、干擾素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF、TNFa和TNFP組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述佐劑為TLR激動(dòng)劑，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、單磷?；|(zhì)A、poly1: C及其衍生物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述佐劑為poly1:C。
21.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述佐劑是細(xì)菌細(xì)胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒狀霉菌酸酯(TDM)和/或單磷?；|(zhì)A[MPL]。
22.一種用于治療淋巴瘤的疫苗，其包含 i)從罹患淋巴瘤的患者中分離出的獨(dú)特型抗原；和 )增強(qiáng)對(duì)所述獨(dú)特型抗原的免疫應(yīng)答的佐劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述佐劑選自由細(xì)胞因子組成的組，所述細(xì)胞因子選自由GMCSF、干擾素Y、干擾素a、干擾素β、白介素12、白介素23、白介素17、白介素2、白介素1、TGF、TNF a TNF β組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述佐劑為TLR激動(dòng)劑，例如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、單磷?；|(zhì)A、poly1:C及其衍生物。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述佐劑為poly1:C。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中所述佐劑是細(xì)菌細(xì)胞壁的衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)和/或海藻糖二棒狀霉菌酸酯(TDM)和/或單磷?；|(zhì)A(MPL)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的疫苗，其中所述佐劑為MPL。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少一種佐劑的疫苗，所述疫苗可用于預(yù)防和治療血癌，例如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
文檔編號(hào)A61K39/00GK103003305SQ201180010906
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者A·希思, J·卡爾琳-萊特 申請(qǐng)人:艾助萬提斯有限公司