專利名稱：可耐受的微創(chuàng)性皮膚電穿孔裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明尤其涉及電穿孔裝置和其用于促進(jìn)將生物分子引入哺乳動物的皮膚組織細(xì)胞中的用途。 背景對DNA疫苗的免疫反應(yīng)幅度時?？赡苋Q于三個主要標(biāo)準(zhǔn)-最佳化的載體設(shè)計、使用合適的佐劑和成功地將質(zhì)粒輸送至目標(biāo)組織并且隨后在目標(biāo)組織中表達(dá)質(zhì)粒。已證明體內(nèi)電穿孔在有效地將DNA免疫原輸送至肌肉和皮膚方面是非常有效的，事實上一些裝置已進(jìn)入人臨床試驗中。出于許多原因，將藥物輸送至皮組織(皮內(nèi)，ID)是在臨床環(huán)境下的一種引人注意的方法。皮膚是人體最大的器官，最可接近、最易于監(jiān)測并且具有高免疫能力。然而，皮膚的不透性屏障功能一直是有效進(jìn)行透皮藥物輸送的主要障礙。人皮膚延展達(dá)到大約2m2的面積并且平均厚度大約為2. 5mm,使其成為人體的最大器官。通常，皮膚具有兩種廣義的組織類型，表皮和真皮。表皮是不斷地發(fā)生角質(zhì)化的復(fù)層上皮。皮膚的最外層是角質(zhì)層(SC)并且起到皮膚的主要屏障功能。SC是無生存力但具有生化活性的角化細(xì)胞的15-30個細(xì)胞厚度的層。表皮的其它三個層(顆粒層(S. granulosum)、棘層(S. spinosum)、基底層(S.basale))都含有處于不同分化階段的角質(zhì)細(xì)胞(ketatinocytes)以及免疫朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cell)以及真皮樹突狀細(xì)胞。用于透皮藥物輸送和基因輸送的物理及化學(xué)方法已在世界范圍內(nèi)由諸多團(tuán)體進(jìn)行了詳細(xì)地研究。離子電滲療法、脂質(zhì)輸送以及基因槍是這些方法的實例。臨時增加皮膚通透性的另一種物理方法是電穿孔。電穿孔涉及施加短暫的電脈沖，從而在哺乳動物細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜中產(chǎn)生含水通路。這使得包括DNA的大分子能夠越過細(xì)胞膜傳遞，否則細(xì)胞膜的通透性將較低。因此，電穿孔增加了吸收，以及將藥物和DNA輸送至其目標(biāo)組織的程度。為了進(jìn)行電穿孔來引起孔隙的形成，需要實現(xiàn)閾值能量，并且由電泳效應(yīng)產(chǎn)生的移動取決于電場和脈沖長度。在DNA疫苗的情況下，電穿孔已被證明可在數(shù)量上增強免疫反應(yīng)，增大這些免疫反應(yīng)的范圍，以及改善劑量的效率。皮膚輸送的諸多優(yōu)點都是引人注意的，這些優(yōu)點中最顯著的是存在多種免疫相關(guān)細(xì)胞、作為免疫目標(biāo)器官容易在臨床上接近，以及輸送的深度最小(微創(chuàng))；然而，一直存在關(guān)于實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染率以及隨后出現(xiàn)加強免疫反應(yīng)的能力的問題。裸DNA通過標(biāo)準(zhǔn)的肌肉內(nèi)(頂)注射的輸送在嚙齒類動物模型以外進(jìn)行實施是出了名地低效的。這導(dǎo)致了在大型哺乳動物和人類中無法實現(xiàn)強大的免疫反應(yīng)。已開發(fā)出一些策略以便增強基于DNA的疫苗的表達(dá)，所述策略如密碼子最佳化、RNA最佳化、添加前導(dǎo)序列和開發(fā)最佳化的共有序列。盡管在載體設(shè)計和分子佐劑的使用方面有所改進(jìn)，但是仍然對于施用DNA疫苗的有效方法存在需要，所述方法引起質(zhì)粒在所需組織的所需細(xì)胞類型中的高水平表達(dá)，所需組織最常見的是肌肉、腫瘤或皮膚。此外，仍然需要一種電穿孔裝置和輸送疫苗的方法，所述裝置和方法既可有效地產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)又具有可耐受性(或接近無痛)。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面是電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織層的角質(zhì)層與基底層之間，從而導(dǎo)致所述組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括電壓發(fā)生器；以及，具有與電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列。多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開；電壓發(fā)生器通過電極將大約O. I伏至大約50伏的電勢輸送至表皮組織；并且，電極的遠(yuǎn)端具有鈍的尖端，所述尖端具有鋒利的尖頭從而允許電極穿透表皮組織層到達(dá)角質(zhì)層與基底層之間，并且所述尖端將電勢從電壓發(fā)生器輸送至表皮組織。
本發(fā)明的另一個方面是電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述表皮組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括電壓發(fā)生器；以及，具有與電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列。多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開；電壓發(fā)生器通過電極將大約O. I伏至大約50伏的電勢輸送至表皮組織；并且電極被調(diào)適成以O(shè). Imm或更小的深度穿透表皮組織。本發(fā)明的另一個方面是電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括電壓發(fā)生器；以及，具有與電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列。多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開；電壓發(fā)生器將大約O. I伏至大約50伏的電場輸送至所述陣列；并且，其中電極將通過視覺類比量表測量為接近無痛的可耐受的電勢輸送至表皮組織細(xì)胞。本發(fā)明的另一個方面是電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括電壓發(fā)生器；以及，具有與電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列。多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開；電壓發(fā)生器將大約O. I伏至大約50伏的電場輸送至所述陣列；并且，其中電極將由表皮組織細(xì)胞的最小程度損傷所證明的可耐受的電勢輸送至所述表皮組織細(xì)胞。本發(fā)明的另一個方面是通過使用本文所述的電穿孔裝置的電穿孔輔助輸送將生物分子輸送至受試者的表皮組織細(xì)胞的可耐受方法，所述方法包括將生物分子施用至細(xì)胞；使電極與表皮組織接觸以使得電極穿透角質(zhì)層并且位于基底層上方的層中；以及，通過電極將可耐受的電勢從電壓發(fā)生器輸送至表皮層細(xì)胞。附圖
簡述本領(lǐng)域技術(shù)人員參考附圖可以對本發(fā)明的無數(shù)目標(biāo)和優(yōu)點進(jìn)行更好地理解，附圖中圖I示出微創(chuàng)EP裝置(“MIED”)的組件的一個實施方案的工程圖。圖2示出MIED的一個實施方案的各部件的三維圖?！癮”示出一次性無菌陣列外殼，“b”示出耐用外殼并且“c”示出一次性陣列(2a)內(nèi)的電極外殼。圖3示出MIED的一個實施方案的三維圖，其為具有可拆卸陣列(用于滅菌)的由電池供電的手持式裝置，“a”示出外部視圖?！癰”示出內(nèi)部視圖(包括電池)。圖4示出MIED的實施方案的圖片。 圖5示出使用MIED來施行GFP表達(dá)構(gòu)建體的由電穿孔促進(jìn)的輸送之后，用于檢測GFP表達(dá)的豚鼠皮膚組織的熒光圖像。圖6示出使用MIED來施行GFP表達(dá)構(gòu)建體的由電穿孔促進(jìn)的輸送之后，用于檢測GFP表達(dá)的各種動物皮膚組織的熒光圖像。圖7示出展示在小鼠中針對流感激發(fā)的保護(hù)作用的免疫原性結(jié)果的圖表。圖8示出展示在豚鼠中針對流感激發(fā)的保護(hù)作用的免疫原性結(jié)果的圖表。圖9示出展示在非人靈長類動物中針對流感激發(fā)的保護(hù)作用的免疫原性結(jié)果的圖表。發(fā)明詳述給出以下簡略或簡短的定義以便幫助了解本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。在此給出的簡略定義并非詳盡無遺的，也不與如在本領(lǐng)域或字典含義中所理解的定義相矛盾。本文給出的簡略定義用來補充或更明確地界定本領(lǐng)域已知的定義。本文使用術(shù)語“恒定電流”來定義在輸送至組織的電脈沖的持續(xù)時間內(nèi)由同一組織或界定所述組織的細(xì)胞所接收或者經(jīng)歷的電流。電脈沖由本文所述的電穿孔裝置來輸送。因為本文提供的電穿孔裝置具有優(yōu)選具備即時反饋的反饋元件，所以此電流在所述組織中在電脈沖的持續(xù)時間內(nèi)保持在恒定的電流強度下。反饋元件可以在整個脈沖持續(xù)時間內(nèi)測量組織(或細(xì)胞)的電阻并且導(dǎo)致電穿孔裝置改變其電能輸出(例如，增加電壓)，以使得同一組織中的電流在整個電脈沖期間(大約幾微秒)以及在不同脈沖之間保持恒定。在一些實施方案中，反饋元件包括控制器。所描述的由本文中的裝置輸送的電流強度值優(yōu)選為恒定電流強度值。本文使用術(shù)語“恒定電壓”來定義在輸送至組織的電脈沖的持續(xù)時間內(nèi)由同一組織或界定所述組織的細(xì)胞所接收或者經(jīng)歷的電壓或電勢。電脈沖由本文所述的電穿孔裝置來輸送。因為本文提供的電穿孔裝置具有優(yōu)選具備即時反饋的反饋元件，所以此電壓在所述組織中在電脈沖的持續(xù)時間內(nèi)保持在恒定的電壓下。反饋元件可以在整個脈沖持續(xù)時間內(nèi)測量組織(或細(xì)胞)的電阻并且導(dǎo)致電穿孔裝置改變其電能輸出，以使得同一組織中的電壓在整個電脈沖期間(大約幾微秒)以及在不同脈沖之間保持恒定。在一些實施方案中，反饋元件包括控制器。所描述的由本文中的裝置輸送的電壓值優(yōu)選為恒定電壓值。術(shù)語“反饋”或“電流反饋”可以互換使用，并且意思是所提供皮膚EP裝置的有源響應(yīng)，該響應(yīng)包括測量電極之間的組織中的電流和相應(yīng)地改變EP裝置輸送的能量輸出以便使電流保持在恒定水平。這一恒定水平是在啟動脈沖序列或電療之前由使用者預(yù)設(shè)的。優(yōu)選地，反饋由皮膚EP裝置的電穿孔部件(例如控制器)來完成，因為所述皮膚EP裝置中的電路能夠連續(xù)地監(jiān)測電極之間的組織中的電流并且將所監(jiān)測的電流(或組織內(nèi)的電流)與預(yù)設(shè)電流比較并且連續(xù)地進(jìn)行能量輸出調(diào)整以便將所監(jiān)測的電流保持在預(yù)設(shè)水平。在一些實施方案中，反饋回路是瞬時的，因為該反饋是一種模擬的閉環(huán)反饋。本文使用的術(shù)語“生物分子”是指核酸序列、蛋白質(zhì)、脂類、微泡(如載有藥物的小泡)和藥品。優(yōu)選地，生物分子是疫苗，更優(yōu)選地，生物分子是DNA疫苗，甚至更優(yōu)選是DNA質(zhì)粒疫苗。
如本文可以互換使用的術(shù)語“電穿孔”、“電通透作用”或“電動力學(xué)增強”(“EP”)是指使用跨膜電場脈沖以便在生物膜中誘導(dǎo)微觀通路(孔隙)；所述微觀通路的存在允許如質(zhì)粒、寡核苷酸、siRNA、藥物、離子和水的生物分子從細(xì)胞膜的一側(cè)傳遞到另一側(cè)。本文使用術(shù)語“分散電流”來定義從本文所述的電穿孔裝置的各種針狀電極陣列中輸送的電流的型式，其中所述型式最大限度地減少或優(yōu)選消除被電穿孔的組織的任何區(qū)域上的電穿孔相關(guān)的熱應(yīng)力的發(fā)生。本文使用的術(shù)語“反饋機制”是指由軟件或硬件(或固件)執(zhí)行的過程，這一過程接收所需組織的阻抗(在輸送能量脈沖之前、期間和/或之后)并且將該阻抗與優(yōu)選為電流的預(yù)設(shè)值比較，并且調(diào)整所輸送的能量脈沖以便實現(xiàn)預(yù)設(shè)值。本文在討論反饋機制時使用術(shù)語“阻抗”，并且阻抗可以根據(jù)歐姆定律來轉(zhuǎn)換成電流值，從而使得可與預(yù)設(shè)電流進(jìn)行比較。在優(yōu)選的實施方案中，“反饋機制”由模擬閉環(huán)電路執(zhí)行?！と绫疚氖褂玫男g(shù)語“微創(chuàng)”是指由所提供的電穿孔裝置的針狀電極所進(jìn)行的有限穿透，并且可以包括非侵入性電極(或非穿透性針)。優(yōu)選地，穿透達(dá)到穿過角質(zhì)層的程度，優(yōu)選進(jìn)入到最外層的活組織層即顆粒層中，但不穿透基底層。穿透深度不超過O. 1mm，優(yōu)選深度在大約O. OlOmm至大約O. 040mm范圍內(nèi)變化，以便穿透角質(zhì)層。優(yōu)選地，這種穿透使用具有套管末端的電極來完成，所述套管末端經(jīng)過研磨以便提供鋒利的尖頭，從而允許穿透角質(zhì)層但避免深層穿透。術(shù)語“可耐受”或者“接近無痛”在本文中可以互換使用，并且在提及電穿孔時，術(shù)語的意思是與現(xiàn)有的電穿孔裝置的典型情況相比，與電穿孔相關(guān)的疼痛水平大致降低。更具體地說，可耐受(或者接近無痛)的電穿孔是使用本文所述的避免對肌肉進(jìn)行電穿孔的MIED與將較低電場輸送至表皮層的角質(zhì)層與基底層之間相結(jié)合的結(jié)果。優(yōu)選地，電場包括低電壓水平，即例如O. OlV至70V，優(yōu)選地IV至15V。在使用VAS測量時，經(jīng)歷根據(jù)本文提供的方法所進(jìn)行的MIED電穿孔的受試者感受到的疼痛水平在從其無痛或者沒有疼痛的得分算起的20%以內(nèi)(全量表的20%以內(nèi))，例如，在0-10分全量表的情況下在2分范圍內(nèi)，優(yōu)選在從其無痛得分算起的10%以內(nèi)。本發(fā)明的一個方面是電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織層的角質(zhì)層與基底層之間，從而導(dǎo)致所述組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括電壓發(fā)生器；以及，具有與電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列。多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開；電壓發(fā)生器通過電極將大約O. I伏至大約50伏的電勢輸送至表皮組織；并且，電極的遠(yuǎn)端具有鈍的尖端，所述尖端具有鋒利的尖頭，從而允許電極穿透表皮組織層到達(dá)角質(zhì)層與基底層之間，并且所述尖端將電勢從電壓發(fā)生器輸送至表皮組織。在一些情況下，電極的遠(yuǎn)端具有尖端，該尖端通常是鈍的，但是具有一個鋒利的尖頭，或者換句話說，鋒利的尖頭后毗鄰較淺或較鈍的角度。例如，電極可以具有為套管尖端的遠(yuǎn)端末端，該套管尖端具有離軸10°達(dá)到幾乎與針軸垂直的磨針(grind)。本發(fā)明的另一個方面是電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述表皮組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括電壓發(fā)生器；以及，具有與電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列。多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約
2.5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開；電壓發(fā)生器通過電極將大約O. I伏至大約50伏的電勢輸送至表皮組織；并且電極被調(diào)適成以O(shè). Imm或更小的深度穿透表皮組織。本發(fā)明的另一個方面是電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述組織的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括電壓發(fā)生器；以及，具有與電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列。多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開；電壓發(fā)生器將大約O. I伏至大約50伏的電場輸送至陣列；并且，其中電極將通過視覺類比量表測量為接近無痛的可耐受的電勢輸送至表皮組織細(xì)胞。本發(fā)明的另一個方面是電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括電壓發(fā)生器；以及，具有與電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列。多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約
2.5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開；電壓發(fā)生器將大約O. I伏至大約50伏的電場輸送 至所述陣列；并且，其中電極將由表皮組織細(xì)胞的最小程度損傷所證明的可耐受的電勢輸送至所述表皮組織細(xì)胞。在一些實施方案中，所述裝置具有被調(diào)適成以O(shè). Imm或更小的深度并且優(yōu)選以大約O. Olmm至大約O. 04mm的深度穿透表皮組織的電極。優(yōu)選地，電極以大約I. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開。此外優(yōu)選地，電壓發(fā)生器將大約I伏至大約15伏，更優(yōu)選大約15伏的電勢輸送至表皮組織。在一些實施方案中，裝置輸送可耐受的電勢，輸送所述電勢歷經(jīng)的持續(xù)時間在在大約5msec至大約250msec范圍內(nèi)變化，以及歷經(jīng)介于所述范圍之中的持續(xù)時間范圍與時間。在一些實施方案中，裝置輸送的可耐受的電勢產(chǎn)生由所述受試者通過視覺類比量表測量所得到的接近無疼痛的疼痛評估。VAS是IOOmm長的水平線，該水平線上的Omm表示無疼痛，并且IOOmm表示最嚴(yán)重的疼痛。接近無痛是使用VAS方法產(chǎn)生的平均得分為大約< 20mm (95%置信區(qū)間內(nèi))，優(yōu)選< IOmm (95%置信區(qū)間內(nèi))的得分。在一些實施方案中，裝置輸送的可耐受的電勢是在受試者的所述細(xì)胞中產(chǎn)生最小程度的組織損傷，并且優(yōu)選根據(jù)組織的組織病理學(xué)分析是不可見的組織損傷的電勢?？梢岳媒M織學(xué)分析來評估視覺損傷。組織學(xué)分析表明在表皮上層中的轉(zhuǎn)染組織病理學(xué)分析是由豚鼠皮膚組織來進(jìn)行。每個圖面都示出已經(jīng)通過MID電穿孔的組織。所有載玻片均已經(jīng)用蘇木精和伊紅染色，并且在熒光顯微鏡(X20的物鏡)下觀察，以便觀測GFP陽性。示出了治療之后3天將動物處死后皮膚組織的組織病理學(xué)分析沒有發(fā)現(xiàn)在用微創(chuàng)裝置電穿孔后的相關(guān)組織損傷。換句話說，經(jīng)過電穿孔的組織的組織病理學(xué)分析顯示與未經(jīng)過電穿孔的組織類似的結(jié)果。本發(fā)明的另一個方面是通過使用本文所述的電穿孔裝置的電穿孔輔助輸送將生物分子輸送至受試者的表皮組織細(xì)胞的可耐受方法，所述方法包括將生物分子施用至細(xì)胞；使電極與表皮組織接觸以使得電極穿透角質(zhì)層并且位于基底層上方的層中；以及通過電極將可耐受的電勢從電壓發(fā)生器輸送至表皮層細(xì)胞。在一些實施方案中，所述方法包括操縱電極以便以O(shè). Imm或更小的深度并且優(yōu)選以大約O. Olmm至大約O. 04mm的深度穿透表皮組織。所述陣列可在注射部位被手動地來回調(diào)整(或擺動)，以確保良好的接觸并且導(dǎo)致電極尖端穿破角質(zhì)層。優(yōu)選地，輸送步驟包括輸送可耐受的電勢，所述可耐受的電勢產(chǎn)生由所述受試者通過視覺類比量表測量所得到的接近無疼痛的疼痛評估。此外，優(yōu)選地，輸送步驟包括輸送可耐受的電勢，所述可耐受的電勢在受試者的所述細(xì)胞中產(chǎn)生最小程度的組織損傷。輸送步驟優(yōu)選地將大約O. I伏至大約15伏的電勢輸送至細(xì)胞。在一些實施方案中，所述方法包括輸送步驟，該輸送步驟包括歷經(jīng)在大約5msec至大約250msec范圍內(nèi)變化的持續(xù)時間，以及歷經(jīng)介于所述范圍之中的持續(xù)時間范圍與時間，并優(yōu)選歷經(jīng)IOOmsec來輸送電勢。通用的電穿孔裝置
提供電穿孔裝置發(fā)生器或控制器，其可以在產(chǎn)生可耐受的電穿孔的低電場下將電能脈沖輸送至表皮組織的角質(zhì)層與基底層之間。優(yōu)選地，電穿孔主要或唯一地在顆粒層發(fā)生。裝置通過所提供的MIED，通過能夠穿透角質(zhì)層的針狀電極來輸送能量脈沖。在一些實施方案中，優(yōu)選在所治療的組織中保持恒定電流的本發(fā)明MIED的響應(yīng)是通過皮膚EP裝置中的反饋機制來完成，所述反饋機制防止組織受熱、減少組織損傷、疼痛，并且有助于所提供的皮膚電穿孔技術(shù)的整體成功。在一些實施方案中，MIED可以進(jìn)一步包括控制器；與控制器電連通的波形發(fā)生器；與控制器電連通的波形記錄儀；以及，電連接至波形發(fā)生器的電池?？刂破骺梢越邮帐褂谜叩妮斎?，根據(jù)輸入來指示波形發(fā)生器將能量脈沖輸送至所需組織，并且根據(jù)所輸送的能量脈沖將數(shù)據(jù)傳送至波形記錄儀；并且，其中電池將電荷發(fā)送至波形發(fā)生器，電池是鋰離子、鎳金屬氫化物、鉛酸和鎳鎘電池。優(yōu)選地，MIED(圖3)是便攜式的。便攜式裝置可以通過電池組來操作，并且適合于出于治療或免疫目的的大規(guī)模免疫。MIED可以是所提供的電極陣列和施配器以及各種電場發(fā)生(或者電脈沖發(fā)生)部件或發(fā)生器的組合。在一些實例中，發(fā)生器可以選自已知電穿孔裝置中的一種電穿孔裝置，包括但是不限于以下裝置在標(biāo)題為“Constant Current Electrode Assembly forElectroporation”的美國專利號7，245，963中，以及尤其是美國專利號5，273，525、美國專利號6，110，161、美國專利號6，261，281、美國專利號6，958，060以及美國專利號6，939，862中描述的電穿孔裝置。在更優(yōu)選的實例中，發(fā)生器是用于CELLECTRA B EP裝置和ElgenEP 裝置(均來自 Inovio Pharmaceuticals, Inc.，Blue Bell, PA)的發(fā)生器。上述專利參考文件通過引用整體結(jié)合在此。電穿孔針各種已知的能夠輸送電荷的電穿孔針可以并入MIED中。電穿孔針是微創(chuàng)的，其包括非侵入性針。優(yōu)選地，所述針是鋒利的，例如一些實施例使用套管磨針以使得其可以穿透角質(zhì)層并且到達(dá)顆粒層。套管末端可以經(jīng)過研磨以便形成鋒利的尖頭，該尖頭允許穿透角質(zhì)層但是避免深層穿透。在一些實施例中，電極的遠(yuǎn)端具有尖端，該尖端通常是鈍的，但是具有一個鋒利的尖頭，或者換句話說，鋒利的尖頭后毗鄰較淺或較鈍的角度。例如，電極可以具有為套管尖端的遠(yuǎn)端末端，該套管尖端具有離軸10°達(dá)到幾乎與針軸垂直的磨針。陣列多種已知的針陣列形成物可以與當(dāng)前MIED—起使用。所涵蓋的這些針陣列形成物包括呈大體平面布置的任何數(shù)量的電極、任何幾何型式的電極。優(yōu)選地，電極經(jīng)過布置均勻地分布在電極陣列上(或在電極所連接的基座或襯底上)。更優(yōu)選地，針狀電極以正方形樣布置形式來進(jìn)行布置，其中每個相鄰的針狀電極以大約相同的距離間隔開(除正方形邊緣上的電極以外)。在一些實施方案中，陣列由以三角形型式等距離間隔開的至少三個針、以圓形型式等距離間隔開的至少四個針，或者以2X2、3X3、4X4、5X5或更大的方形型式來布置的針。或者，所述型式可以是長方形或菱形。優(yōu)選地，針狀電極以4X4針陣列布置形式來布置。4X4針陣列的實施例不于圖I中。圖2不出了 MIED外殼、陣列外殼和電極外殼的實施例。每個針狀電極都可以150mm或更小、IOOmm至lmm、50mm至1 mm、40mm至lmm、30mm至1mm、20mm 至 1mm、10mm 至 1mm、5mm 至 1mm、5mm 至 2mm> 5mm 至 2mm 并且優(yōu)選 2mm 并且更優(yōu)選地I. 5mm的距離與每個相鄰的針狀電極間隔開。 電脈沖(所輸送的電勢)與典型EP方法相比，所提供的裝置在更低的電壓和電流下操作以便增強耐受性， 同時維持生物分子的成功轉(zhuǎn)染(如由表達(dá)和隨后免疫反應(yīng)所證明的)。裝置通常是與被設(shè)計來根據(jù)需要輸送恒定電壓、電流或兩者組合的脈沖發(fā)生器一起使用。由MIED用于實現(xiàn)皮膚組織中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染的電脈沖是提供用于產(chǎn)生可耐受電穿孔所需低電能的任何已知的脈沖型式。在一些實施方案中,MIED以O(shè). OlV至70V、0. OlV至50V、0. OlV至40V、0. OlV至30V、0. OlV 至 20V、0. OlV 至 15V、0. IV 至 70V、0. IV 至 50V、0. IV 至 40V、0. IV 至 30V、0. IV 至20V、0. IV至15V并且優(yōu)選IV至15V的電壓水平將電脈沖輸送至所需組織。更優(yōu)選地，當(dāng)MIED的相鄰電極間隔開大約2mm并且優(yōu)選I. 5mm時，電壓水平為15V。在一些實施方案中，MIED輸送可耐受的電能，該電能的特征為電脈沖將以下電流輸送至所需組織0. 2mA 至 100mA、0. ImA 至 100mA、0. 5mA 至 100mA、ImA 至 100mA、ImA 至80mA、ImA 至 60mA、ImA 至 50mA、ImA 至 40mA、ImA 至 30mA、但是優(yōu)選 ImA 至 IOOmA,并且更優(yōu)選ImA至30mA,并且更優(yōu)選10mA。與MIED相關(guān)的可耐受電脈沖的特征都是每次脈沖的短持續(xù)時間，該短持續(xù)時間包括以下脈沖長度5msec 至 250msec、IOmsec 至 250msec 脈沖、20msec 至 250msec、40msec至 250msec、60msec 至 250msec、80msec 至 250msec、IOOmsec 至 250msec、20msec 至 200msec、40msec 至 200msec、60msec 至 200msec、80msec 至 200msec、IOOmsec 至 200msec、20msec 至150msec、40msec 至 150msec、60msec 至 150msec、80msec 至 150msec、IOOmsec 至 150msec、IOOmsec 至 140msec、IOOmsec 至 130msec、IOOmsec 至 120msec、IOOmsec 至 110msec,并且更優(yōu)選 100msec。與MIED相關(guān)的可耐受電脈沖的特征還有低重復(fù)脈沖。重復(fù)進(jìn)行由MIED輸送的脈沖以便針對每次疫苗接種來輸送以下數(shù)量的脈沖1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，并且優(yōu)選I至6次脈沖，并且更優(yōu)選2次脈沖。施用疫苗+EP的組織MIED用于將實現(xiàn)電穿孔的電能輸送至皮膚組織細(xì)胞以便輔助將生物分子輸送至所述組織中的細(xì)胞，并且優(yōu)選地輔助用DNA疫苗進(jìn)行的疫苗接種。優(yōu)選地，電極僅僅穿透作為恰好位于角質(zhì)層下方并且位于基底層上方的活組織層的皮膚組織；并且優(yōu)選地僅進(jìn)入顆粒層中。通常使用Mantoux技術(shù)將生物分子輸送至目標(biāo)組織。在手柄中具有電子元件的電池供電型式(參見圖3)
MIED可為便攜式EP裝置。提供便攜式獨立MIED裝置，其中所述裝置是手持式的并且其中電脈沖的電能來源是至少一個具有I. 5V與12V之間的電壓電位的電池。便攜式MIED可包括外殼，該外殼中含有所述電池、包括與所述電池電連通并且由所述電池供電的電路的電路板，以及至少一個能夠保持IOOOuF與lOOOOOuF(微法拉)之間的電容的電容器。在相關(guān)的實施方案中，各部件(即，電池、電路以及電容器)通常在所述外殼中以線性或并排布置形式在空間上進(jìn)行放置，以使得所述外殼可具有能夠握在操作裝置的人的手中的大體上長方形或圓柱形形狀。例如，所述外殼具有近端和遠(yuǎn)端以使得所述長方形的圓柱體或較長部分位于所述近端與所述遠(yuǎn)端之間，并且其中所述電池位于所述外殼的所述近端內(nèi)并且可經(jīng)由可移除的罩蓋從此末端來接近。在所述外殼的遠(yuǎn)端可安置有電導(dǎo)管，該電導(dǎo)管與所述電路電連通并且充當(dāng)用于連接至用以完成電路的至少一個陰極和至少一個陽極的連接器，所述電路包括通過所述電容器與電路由所述電池來供電的電穿孔脈沖。所述外殼的遠(yuǎn)端還可包含與所述外殼相關(guān)聯(lián)或作為所述外殼一部分的用于半永久性或永久性地連接頭部組件和/或?qū)⑺鲱^部組件拆卸的機構(gòu)，所述頭部組件本身包括以下任何一個用于容納液體治療劑的儲槽；與所述儲槽流體連通的孔口，所述液體可穿過所 述孔口被引導(dǎo)至身體組織；將來自所述儲槽的所述液體移動穿過所述孔口的能量來源；以及，至少一個電極，該至少一個電極包括至少一個陽極和一個陰極。在一些實施方案中，便攜式MIED能夠向哺乳動物的皮膚組織輸送能夠?qū)λ鼋M織內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔的電脈沖，所述電脈沖具有通常介于0. IV與70V之間、優(yōu)選0. IV至50V、更優(yōu)選IV至15V的電壓。此外，裝置能夠輸送所述場強度的電穿孔脈沖歷經(jīng)介于5毫秒與250毫秒之間，并且更通常介于10毫秒與100毫秒之間、更通常介于30毫秒與70毫秒之間并且更優(yōu)選50毫秒的時間。另外，裝置能夠經(jīng)由其微處理器來輸送電穿孔電能的雙極脈沖或單極脈沖，所述雙極或單極脈沖可包括預(yù)定序列的多次脈沖，和/或電壓成形脈沖，或甚至指數(shù)放電脈沖。這種可變脈沖能力提供電穿孔過程的潛在最佳化，包括電穿孔脈沖的電壓、脈沖波形、持續(xù)時間以及極性的最佳化。
實施例本發(fā)明進(jìn)一步在以下實施例中說明。應(yīng)理解，這些實施例雖然指示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但只是為了說明而給出。從以上討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的本質(zhì)特征，并且在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可作出本發(fā)明的各種變化和修改以便使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，根據(jù)以上描述，除了本文示出和描述的修改方案以夕卜，本發(fā)明的各種修改方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易知的。這些修改方案也意圖落入附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)?？蛇M(jìn)行試驗來評估由本文所述的電穿孔裝置產(chǎn)生的耐受性或減少的疼痛。在施行電穿孔時，研究人員可對每位患者起動秒表。每位患者將在經(jīng)過訓(xùn)練的研究人員的監(jiān)督下執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)疼痛評估，并且患者將這些評估記錄在日記冊中，記錄時間為電穿孔后5、10、15,20,30和45分鐘、一小時以及一個半小時，然后在電穿孔后12小時內(nèi)每小時記錄一次，并且在電穿孔后16小時和24小時進(jìn)行記錄?；颊呤褂梅诸惲勘砗蚔AS來測量疼痛強度。如之前的說明，分類量表包括四個類別O =無疼痛，I =輕度疼痛，2 =中度疼痛，以及3 =重度疼痛。
VAS是IOOmm長的水平線，該水平線上的Omm表示無疼痛，并且IOOmm表示最嚴(yán)重的疼痛。使用這種IOOmm量表，接近無疼痛的得分是從指示無疼痛(無疼痛感覺)的得分算起20mm內(nèi)的得分。在一些情況下，接近無疼痛是從無疼痛得分算起IOmm的得分。方法以下方法用于以下每個實施例中，在適當(dāng)情況下進(jìn)行討論。微創(chuàng)裝置設(shè)計-構(gòu)造由以I. 5mm間隔的直徑為O. 0175英寸的4X4鍍金套針組成的電極陣列以便與 ELGEN1000 (Inovio Pharmaceuticals, Inc.，Blue Bell, PA)脈沖發(fā)生器或電池供電低壓電路結(jié)合使用。質(zhì)粒制劑-gWizGFP質(zhì)粒購自Aldevron (Fargo ND)。NP質(zhì)粒編碼源自波多黎各8 (HlNl)流感菌株的全長NP。M2質(zhì)粒編碼源自新加勒多尼亞/99 (HlNl)流感菌株的全長M2 ο構(gòu)建體具有突變的核祀向信號并且通過GeneArt (Germany)來最佳化與合成。所有質(zhì) 粒在注射之前在I XPBS中進(jìn)行稀釋。將SYNC0N (合成DNA構(gòu)建體)流感疫苗質(zhì)?；旌衔?100微克/質(zhì)粒)在注射之前在IXPBS中進(jìn)行稀釋，所述混合物含有pGX2005(SYNC0N 疫苗構(gòu)建體，其編碼HlHA的共有序列)和pGX2009 (SYNC0N 疫苗構(gòu)建體，其編碼豬HlHA的共有序列)。動物-雌性Hartley豚鼠(品系代碼051)、雌性New Zealand兔和雌性Balb C小鼠購自Charles River實驗室。雌性Wistar大鼠購自Charles River實驗室。雌性約克郡豬購自S&S Farm’ s (Ramona, CA)。豚鼠、大鼠、兔和小鼠豢養(yǎng)于BioQuant (San Diego,CA)。雄性(4)和雌性(4)稱猴(穆拉托稱猴(Macaca mulatto))單獨豢養(yǎng)于BIOQUAL, Inc.(Rockville, MD)，并且自由取用食物和水。在實驗之前，使獼猴在檢疫中適應(yīng)新環(huán)境至少30天。所有動物根據(jù)機構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會(Institutional Animal Care and UseCommittee ;IACUC)的標(biāo)準(zhǔn)來豢養(yǎng)和操作。動物預(yù)備-毛發(fā)去除之后，對Hartley豚鼠觀察到的GFP報道基因結(jié)果與先前實驗中對IAF無毛豚鼠觀察到的結(jié)果相同。由于毛發(fā)去除似乎對于所得轉(zhuǎn)染沒有影響并且由于成本方面的考慮，我們選擇在Hartley動物中進(jìn)行其余部分的研究。在治療之前24小時，將Hartley豚鼠剃毛并且將殘巷通過脫毛霜(dilapatory cream) (VEET)來去除。將小鼠、大鼠、兔、豬和獼猴在治療之前剃毛。DNA注射-獼猴通過注射氯胺酮來鎮(zhèn)靜。所有其它動物通過吸入異氟醚來鎮(zhèn)靜。向所有動物皮內(nèi)注射(Mantoux方法-29號胰島素針)50 μ I的含有所需劑量質(zhì)粒的I XPBS。向小鼠肌肉內(nèi)注射50 μ I的含有所需劑量質(zhì)粒的IXPBS至四頭肌。向獼猴肌肉內(nèi)注射400 μ I的含有所需劑量質(zhì)粒的IXPBS至四頭肌。添加空載體以便維持每一組的相等DNA量。皮膚裝置電穿孔-注射DNA之后立即將皮膚裝置施加至皮膚注射部位。將陣列在注射部位處“擺動”以便確保良好接觸并且通過來自Elgen 1000或低電壓電池電路的脈沖發(fā)生來實現(xiàn)電轉(zhuǎn)移。所使用的參數(shù)是IOOrns持續(xù)時間的三次15伏特脈沖。肌肉電穿孔-M注射之后立即通過將具有4mm電極間距的27G、2針陣列插入被注射的肌肉部位來執(zhí)行電穿孔。使用Elgen 1000來輸送各自持續(xù)60ms的兩次125V/cm脈沖。對皮膚進(jìn)行成像-在終止之后，從死后的動物中取出皮膚樣品或活檢并且存放在冰上直到在480nm下用OV 100成像顯微鏡(Anti Cancer Inc. , San Diego, CA)成像。
組織病理學(xué)-在終止之后，從死后的動物中取出皮膚樣品或活檢并且立即保存在10%中性緩沖福爾馬林中并且送至Pacific Pathology, San Diego, CA進(jìn)行處理和組織病理學(xué)分析。將適當(dāng)組織予以修整、處理、包埋于石蠟中、以大約5μπι進(jìn)行切片，并且用蘇木精和伊紅染色。所得載玻片由委員會認(rèn)證的病理學(xué)家來檢查。在Burnham Institute, SanDiego, CA，使用具有IOX物鏡的Zeiss Axioplan顯微鏡觀測切片。檢測經(jīng)過免疫的小鼠血清中的NP抗體-針對NP的抗體反應(yīng)是通過ELISA，使用來自經(jīng)過免疫的小鼠的血清來評估。將小鼠在最后一次免疫之后兩周做眼球后放血。在4°C下，用 NP (5 μ g/mL, Imgenex IMR-274)涂布 Nunc Maxi-Sorp Immuno 板過夜。未結(jié)合的抗原通過使用具有O. 05%吐溫-20的PBS的自動板清洗液來從板上清洗掉。在37°C下，通過添加具有O. 5%834的200此PBS來針對非特異性結(jié)合將板阻斷一小時。如上清洗之后，將血清在具有O. 2% BSA和O. 05%吐溫-20的PBS中I : 50稀釋并且添加至第一孔中。通過對每個孔I : 3至I : 5稀釋來進(jìn)行連續(xù)稀釋。在清洗之前，在37°C下將血清孵育兩小時。將抗小鼠 IgG-生物素(B9904-5ml ；Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) I 10000 稀釋并且將50 μ L添加至每個孔并且在清洗之前，在37°C下孵育一小時。隨后將I : 1000稀釋的50μ L鏈霉抗生物素蛋白-HRP (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)添加至每個孔，并 且在清洗之前在37°C下孵育一小時。通過添加50 μ L HRP底物(Ρ-9187，Sigma-Aldrich)并且在室溫下在黑暗中孵育10分鐘，然后在450nm下讀取光密度(OD)來完成最終步驟。如果OD比來自原始小鼠血清的OD高三倍，那么讀數(shù)被認(rèn)為是陽性的。結(jié)果以終點效價來表示，即OD大于或等于比原始血清高三倍的最后一次稀釋。ELISpot分析-免疫之后兩周，將來自每一組小鼠的脾細(xì)胞分離。使用RBC溶解緩沖液(eBioscience)將單一細(xì)胞混懸液中的紅細(xì)胞予以清除。ELISP0T分析試劑盒購自R&DSystems。用抗小鼠干擾素(IFN)I單克隆抗體涂布96孔ELISP0T板(Millipore)。在4°C下孵育過夜之后，根據(jù)來自R&D Systems的實驗方案將孔清洗并用阻斷緩沖液來阻斷。將來自每一組的匯集脾細(xì)胞添加至孔中并且用I μ g/mLNP147 (TYQRTRALV Biosynthesis Inc.)孵育48h。然后遵循如制造商描述的實驗方案將板清洗并顯影。通過Cellular TechnologyLtd對點計數(shù)并分析。鼻內(nèi)流感激發(fā)-將每組10只小鼠的各組中的Balb/c小鼠在第0、3和6周進(jìn)行免疫。將小鼠免疫在第O周進(jìn)行初免30+30ug，在第3周進(jìn)行加強30+30ug，在第10周進(jìn)行加強100+100ug。在第12周，使用BSL IV實驗方案，在The National Microbiology實驗室，Public Health Agency of Canada, Winnipeg, MB, Canada 根據(jù)其倫理委員會的倫理準(zhǔn)則進(jìn)行流感激發(fā)實驗。將100XLD50劑量的H5N1A/越南/1203/04菌株用于鼻腔激發(fā)。然后，在激發(fā)之后每天監(jiān)測小鼠的存活和體重進(jìn)行21天。HAI分析-將動物放血并且立即將血清樣品存放于干冰上，然后裝運至BI0QUAL，Rockville,MD以便處理。將血清用受體破壞酶通過將I份血清用3份酶稀釋來進(jìn)行處理，并且在37°C水浴中孵育過夜。將酶在56°C下孵育30分鐘來滅活，隨后添加6份磷酸鹽緩沖鹽水以便進(jìn)行1/10的最終稀釋。HAI分析如前所述使用4個血凝單位的病毒和1%紅細(xì)胞，在V形底部96孔微量滴定板中執(zhí)行。用于HAI分析的病毒從CDC的流感分支獲得。實施例I使用微創(chuàng)裝置的電穿孔產(chǎn)生加強的報道基因轉(zhuǎn)染
微創(chuàng)電極裝置(MIED)被設(shè)計來供DNA疫苗輸送使用。這種新型施配器由呈4X4陣列型式的以I. 5_間隔的具有套管研磨部分的鍍金不銹鋼針狀電極組成(電極的遠(yuǎn)端具有鈍的尖端，所述尖端具有鋒利的尖頭)(圖4a和圖4c)。四個電極的交替行可以相反極性進(jìn)行發(fā)射(fired):陽性比陰性。電極被接納于塑料手柄內(nèi)的電插座中，以使得每個電極可被單獨地定址以便實現(xiàn)交替的發(fā)射模式。裝置被設(shè)計來只接觸皮膚表面并且不直接穿透組織。在適當(dāng)接觸后，電極的銳度可使得裝置陣列破壞角質(zhì)層屏障層，確保一致的阻抗測量值，從而產(chǎn)生可重復(fù)的電穿孔治療。原型裝置構(gòu)建有連接線繩以便連接至脈沖發(fā)生器(圖4b)。研究了使用這種新型微創(chuàng)式針狀電極裝置(MIED)進(jìn)行成功轉(zhuǎn)染和免疫反應(yīng)所需的電壓參數(shù)的下限。使用Mantoux技術(shù)用50 μ I的lmg/ml GFP質(zhì)粒注射豚鼠側(cè)腹上的獨立皮膚部位，并且立即使用設(shè)定在低至15V的電壓下的MIED進(jìn)行脈沖處理(圖5A)。在治療之后8小時，可見加強和可重現(xiàn)的GFP轉(zhuǎn)染，而在第3天則達(dá)到最高點。在單獨GFP質(zhì)粒注射之后，可檢測到最小程度的轉(zhuǎn)染或檢測不到GFP轉(zhuǎn)染(數(shù)據(jù)未示出)。雖然一系列電參數(shù)和電壓產(chǎn)生了 GFP轉(zhuǎn)染，但是15伏下的脈沖更具有可重現(xiàn)性(數(shù)據(jù)未示出)。遵循標(biāo)準(zhǔn) 化條件下的熒光顯微術(shù)通過正性像素計數(shù)來量化和評估可重現(xiàn)性。在10-15伏特參數(shù)下獲得被界定區(qū)域內(nèi)的最一致的像素計數(shù)量。實際GFP轉(zhuǎn)染型式表現(xiàn)為在與每個電極進(jìn)行接觸的點周圍的明顯不同的“島”(圖5b)。在低電壓下，有效EP較淺并且高度定位于電極尖端周圍，因此，在表皮的基底層下方不存在有意義的轉(zhuǎn)染。為了確保加強的轉(zhuǎn)染并非豚鼠特異性現(xiàn)象，在一系列物種中進(jìn)行了 GFP定位。小鼠、兔、大鼠和豬上的皮膚部位用50 μ I (在小鼠中30 μ I)的lmg/ml GFP質(zhì)粒注射并且立即使用MIED進(jìn)行脈沖處理。在電穿孔之后，所有物種表明了加強的皮膚GFP轉(zhuǎn)染，而在單獨GFP質(zhì)粒注射之后檢測到最小程度的轉(zhuǎn)染或檢測不到轉(zhuǎn)染(圖6)。在所有物種中，在所有電穿孔皮膚樣品中檢測到強GFP陽性。然而，只有兔樣品表明與在豚鼠樣品中觀察到型式明顯不同的“島”型式(圖5)。大鼠、小鼠和豬皮膚上的GFP定位表現(xiàn)得更具有擴散性。大鼠、兔與豬之間的實際轉(zhuǎn)染面積是相似的(大約4_2)，因為該面積隨著注射微泡大小而變。由于注射體積較小，因此小鼠皮膚上的轉(zhuǎn)染面積稍微較小。在小鼠圖面中，示出小鼠的整個皮膚以使得可了解到相對大小。GFP陽性細(xì)胞只在大鼠、兔和豬樣品中的皮膚表面上被檢測到。在這些樣品的下方未觀察到GFP信號。小鼠皮膚的下方似乎具有陽性GFP信號。然而，這似乎是與皮膚樣品的薄度相關(guān)。此數(shù)據(jù)暗示出MIED可在較小和較大動物模型中有效地將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至皮膚。實施例2使用微創(chuàng)裝置的電穿孔-組織學(xué)分析表明在表皮上層中的轉(zhuǎn)染為了研究通過MIED進(jìn)行的電穿孔在細(xì)胞水平下的效果，執(zhí)行組織學(xué)分析。豚鼠上的部位用50ul的lmg/ml GFP質(zhì)粒注射并且立即使用MIED進(jìn)行脈沖處理的。活檢樣品在治療后3天加以取出、固定、做石蠟切片并且進(jìn)行H&E染色(未示出載玻片)。在用微創(chuàng)裝置進(jìn)行電穿孔之后，病理學(xué)分析未顯示相關(guān)的組織損傷。高功率顯微術(shù)顯示大部分GFP轉(zhuǎn)染在表皮的顆粒層細(xì)胞層中發(fā)生(未示出載玻片)。還在基底層中檢測到GFP陽性細(xì)胞。相比之下，只在接受單獨GFP質(zhì)粒注射的活檢樣品中檢測到少許GFP陽性細(xì)胞。這與已經(jīng)接受電穿孔的組織的活檢樣品中觀察到的加強信號形成直接對比。基于相對于單獨DNA的GFP陽性細(xì)胞的數(shù)量，表達(dá)增強的視覺估算將超過100-1000倍。實施例3使用微創(chuàng)裝置的電穿孔-在小鼠中產(chǎn)生加強的細(xì)胞反應(yīng)并且提供針對致死激發(fā)的100%保護(hù)將小鼠用編碼NP和M2流感抗原的DNA進(jìn)行免疫在第O周進(jìn)行初免30+30ug，在第3周進(jìn)行加強30+30ug，在第10周進(jìn)行加強100+100ug。來自波多黎各/39菌株的匹配NP抗原和來自新加勒多尼亞/99菌株 的匹配M2抗原最佳化,合成,然后克隆至臨床認(rèn)可的哺乳動物表達(dá)載體PMB76. 5的骨架中。選擇NP和M2e抗原以便主要評估細(xì)胞免疫性。這些蛋白質(zhì)未能夠誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)。小鼠群組用微創(chuàng)皮膚裝置或用Elgen 1000肌肉內(nèi)裝置(InovioPharmaceuticals, Inc.，Blue Bell, PA)進(jìn)行電穿孔。在所有小鼠中觀察到小鼠模型中的有效力的細(xì)胞和體液反應(yīng)的誘導(dǎo)，如抗原特異性T細(xì)胞ELISPot分析和抗體效價所測量。對于MIED，抗原特異性CTL反應(yīng)是針對NP的200+/-57. 9SFU/10~6個脾細(xì)胞，并且對于頂，抗原特異性CTL反應(yīng)是針對NP的85+/-36. 3SFU/10~6個脾細(xì)胞(圖7A)。經(jīng)過皮內(nèi)電穿孔的那些動物顯示較高效價和細(xì)胞反應(yīng)，但是在統(tǒng)計學(xué)上是不顯著的。為了嘗試確定是否誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠影響感染，經(jīng)由鼻內(nèi)(i.n.)接種用致命劑量的流感A/H5N1/越南/1203/04來激發(fā)小鼠(圖7B)。流感的VN/1203/04 (H5N1)菌株已知可引起快速發(fā)病和死亡。雖然在第11天100%的雛期小鼠出現(xiàn)感染，但是100%的用MIED免疫的小鼠受到針對發(fā)病和死亡的保護(hù)直至第15天(實驗結(jié)束)。同樣地，在第15天，90 %的IM免疫的陽性對照動物存活。實施例4使用微創(chuàng)裝置的電穿孔產(chǎn)生體液免疫原性和保護(hù)性HI效價豚鼠由于極薄的皮膚結(jié)構(gòu)和緊鄰下方肌肉，因此很難以將小鼠的真皮作為目標(biāo)。出于這個原因，通常在小鼠中誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是皮膚和肌肉的組合。因此，在具有界限更分明的皮膚結(jié)構(gòu)的較大動物模型-豚鼠中測試MIED。通過經(jīng)由MIED的皮內(nèi)電穿孔，用之前描述的共有SYNC0N 流感疫苗對豚鼠進(jìn)行免疫。用在IXPBS中稀釋的體積為50 μ I的疫苗質(zhì)?；旌衔?100微克/質(zhì)粒)對動物進(jìn)行疫苗接種，所述混合物含有PGX2005 (SYNC0N 疫苗構(gòu)建體，其編碼HlHA的共有序列)和PGX2009 (SYNC0N 疫苗構(gòu)建體，其編碼豬HlHA的共有序列)。兩次免疫之后兩周，每個動物顯現(xiàn)超過I : 40的針對HlNl大流行性墨西哥/2009菌株，和針對Α/Η3Ν2布里斯班菌株，以及在一定程度上針對Α/Η5Ν1越南/2005菌株的加強的HAI效價(圖8)。獼猴通過皮內(nèi)(MIED)或肌肉內(nèi)電穿孔(Elgen 1000)，用體積為50 μ I的之前描述的共有流感疫苗質(zhì)?；旌衔?iooyg/質(zhì)粒)對獼猴進(jìn)行疫苗接種，所述混合物含有PGX2005 (SYNC0N 疫苗構(gòu)建體，其編碼HlHA的共有序列)和pGX2009 (SYNC0N 疫苗構(gòu)建體，其編碼豬HlHA的共有序列)。在用MIED皮內(nèi)免疫時，在兩次免疫之后，四只動物中的四只都顯現(xiàn)超過I : 40的針對HlNl/墨西哥/2009菌株，和針對A/H1N1/新加勒多尼亞菌株的HAI效價(圖9)。
實施例5微創(chuàng)裝置的耐受性研究為了評估EP的疼痛水平，將微創(chuàng)EP裝置施加至表皮層的角質(zhì)層與基底層之間。用經(jīng)過麻醉的動物進(jìn)行測試的視覺反應(yīng)不會產(chǎn)生在使用較高功率脈沖或侵入性電極陣列時所觀察到的肌肉抽搐，同時表明報道基因的有效轉(zhuǎn)染和抗原性質(zhì)粒的免疫反應(yīng)。高達(dá)15V的脈沖電壓和高達(dá)大約30mA的電流只產(chǎn)生輕度感覺，同時在豚鼠和恒河猴中誘導(dǎo)針對流感的保護(hù)性免疫反應(yīng)。與肌肉內(nèi)裝置的侵入性陣列相比，使用侵入性皮膚裝置陣列來施加體內(nèi)EP已經(jīng)展示明顯減少的疼痛。預(yù)期MIED引起疼痛的甚至更大的減少。在ID注射O. 9%鹽水至顆粒層中之后，使用MIED陣列施加體內(nèi)EP。向患者的顆粒層中注射O. 15mL鹽水，然后使用CELLECTRA 2000(適應(yīng)性恒定電流裝置(AdaptiveConstant Current Device)或替代地，Elgen 1000 裝置，Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA)來執(zhí)行EP。EP參數(shù)為15V、100msec脈沖，總共3次脈沖。對于每個受試者，注射部位疼痛將通過使用在EP之后立即確定的視覺類比得分(VAS)來評估。
權(quán)利要求
1.一種電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織層的角質(zhì)層與基底層之間，從而導(dǎo)致所述組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括 電壓發(fā)生器；以及 具有與所述電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列； 其中所述多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開； 所述電壓發(fā)生器通過所述電極將大約O. I伏至大約50伏的電勢輸送至所述表皮組織；并且 所述電極的遠(yuǎn)端具有鈍的尖端，所述尖端具有鋒利的尖頭從而允許所述電極穿透表皮組織層到達(dá)角質(zhì)層與基底層之間，并且所述尖端將所述電勢從所述電壓發(fā)生器輸送至所述表皮組織。
2.一種電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述表皮組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括 電壓發(fā)生器；以及 具有與所述電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列； 其中所述多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開； 所述電壓發(fā)生器通過所述電極將大約O. I伏至大約50伏的電勢輸送至所述表皮組織；并且 所述電極被調(diào)適成以O(shè). Imm或更小的深度穿透所述表皮組織。
3.一種電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述表皮組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括 電壓發(fā)生器；以及 具有與所述電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列； 其中所述多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開； 所述電壓發(fā)生器將大約O. I伏至大約50伏的電場輸送至所述陣列；并且其中所述電極將通過視覺類比量表測量為接近無痛的可耐受的電勢輸送至所述表皮組織的所述細(xì)胞。
4.一種電穿孔裝置，其能夠?qū)⒖赡褪艿碾妱葺斔椭潦茉囌叩谋砥そM織，從而導(dǎo)致所述表皮組織中的細(xì)胞電穿孔，所述電穿孔裝置包括 電壓發(fā)生器；以及 具有與所述電壓發(fā)生器電連通的多個電極的陣列； 其中所述多個電極中的每個電極以大約O. 5mm至大約2. 5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開； 所述電壓發(fā)生器將大約O. I伏至大約50伏的電場輸送至所述陣列；并且其中所述電極將由所述表皮組織的所述細(xì)胞的最小程度損傷所證明的可耐受的電勢輸送至所述表皮組織細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1、3和4中任一項所述的裝置，其中所述電極被調(diào)適成以O(shè).Imm或更小的深度穿透所述表皮組織。
6.如權(quán)利要求I至4中任一項所述的裝置，其中所述電極被調(diào)適成以大約O.Olmm至大約O. 04mm的深度穿透所述表皮組織。
7.如權(quán)利要求1、2和4中任一項所述的裝置，其中所述可耐受的電勢產(chǎn)生由所述受試者通過視覺類比量表測量所得到的接近無疼痛的疼痛評估。
8.如權(quán)利要求I至3中任一項所述的裝置，其中所述可耐受的電勢是在所述受試者的所述細(xì)胞中產(chǎn)生最小程度組織損傷的電勢。
9.如權(quán)利要求I至8中任一項所述的裝置，其中所述電極以大約I.5mm的距離與每個相鄰的電極間隔開。
10.如權(quán)利要求I至9中任一項所述的裝置，其中所述電壓發(fā)生器將大約I伏至大約15伏的電勢輸送至所述表皮組織。
11.如權(quán)利要求I至10中任一項所述的裝置，其中所述電壓發(fā)生器以在大約ImA至大約50mA范圍內(nèi)變化電流將電勢輸送至所述表皮組織。
12.如權(quán)利要求I至10中任一項所述的裝置，其中所述電壓發(fā)生器歷經(jīng)在大約5msec至大約250msec范圍內(nèi)變化的持續(xù)時間將電勢輸送至所述表皮組織。
13.—種通過使用如權(quán)利要求I所述的電穿孔裝置的電穿孔輔助輸送將生物分子輸送至受試者的表皮組織細(xì)胞的可耐受方法，所述方法包括 將所述生物分子施用至所述細(xì)胞； 使所述電極與所述表皮組織接觸以使得所述電極穿透所述角質(zhì)層并且位于所述基底層上方的層中；以及 通過所述電極將可耐受的電勢從所述電壓發(fā)生器輸送至所述表皮層的所述細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述接觸步驟包括操縱所述電極以便以O(shè).Imm或更小的深度穿透所述表皮組織。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述接觸步驟包括操縱所述電極以便以大約.O.Olmm至大約O. 04mm的深度穿透所述表皮組織。
16.如權(quán)利要求13至15中任一項所述的方法，其中所述輸送步驟包括輸送可耐受的電勢，所述可耐受的電勢產(chǎn)生由所述受試者通過視覺類比量表測量所得到的接近無疼痛的疼痛評估。
17.如權(quán)利要求13至15中任一項所述的方法，其中所述輸送步驟包括輸送可耐受的電勢，所述可耐受的電勢在所述受試者的所述細(xì)胞中產(chǎn)生最小程度組織損傷。
18.如權(quán)利要求13至17中任一項所述的方法，其中所述輸送步驟包括將大約O.I伏至大約15伏的電勢輸送至所述細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求13至18中任一項所述的方法，其中所述輸送步驟包括以在大約ImA至大約50mA范圍內(nèi)變化的電流將電勢輸送至所述細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求13至19中任一項所述的方法，其中所述輸送步驟包括歷經(jīng)在大約5msec至大約250msec范圍內(nèi)變化的持續(xù)時間來輸送電勢。
全文摘要
一種用于輸送疫苗的新型電穿孔裝置，該裝置可有效地產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)和對受試者的可耐受輸送(或接近無疼痛)；以及，使用所述裝置以接近無疼痛的方式針對各種傳染病和癌癥類型對受試者進(jìn)行疫苗接種的方法。
文檔編號A61N1/32GK102905755SQ201180011473
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者K.布羅德里克, J.麥科伊, S.V.坎梅雷, 林峰, R.克杰肯 申請人:因諾維奧制藥公司