專利名稱：用于治療性治療腫瘤疾病的來源于成體干細胞的微泡(mv)的制作方法
用于治療性治療腫瘤疾病的來源于成體干細胞的微泡
(MV)本發(fā)明涉及腫瘤疾病的治療性治療(治療性處理，therapeutic treatment)。已知造血干細胞移植在患有實體瘤的患者中發(fā)揮腫瘤抑制作用，以及在轉(zhuǎn)移性乳腺癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。證明了人類骨髓間質(zhì)干細胞(BM-MSC)有助于多種器官的修復(fù)和組織修復(fù)，且實驗性研究表明，MSC的移植可對包括心臟、肝臟和腎的幾種器官的功能和結(jié)構(gòu)恢復(fù)具有有益的作用。干細胞微環(huán)境通過提供抑制增殖和促進分化的信號，似乎在預(yù)防癌發(fā)生中起到重要作用。 然而，由于已經(jīng)報道了這種干細胞治療的潛在的致瘤的風(fēng)險，干細胞在治療適應(yīng)癥中的應(yīng)用是不太可取的(Amariglio N et al. Donor-derived brain tumor followingneural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoSMed. 2009 Feb 17;6(2))。細胞來源的微泡(microvesicle, MV)是通過表達細胞特有的抗原的細胞而釋放的小泡，其中它們起源于細胞且攜帶細胞膜和細胞質(zhì)成分，且已經(jīng)被描述為細胞通訊的新的機制。最近，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)證明了，來源于人類內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells) (EPC)、BM-MSC和肝臟的肝干細胞的微泡可用作遺傳材料(mRNA)的轉(zhuǎn)移的媒介物，其中所述遺傳材料能重編程靶分化細胞，如內(nèi)皮細胞、管狀上皮細胞(小管上皮細胞，tubular epithelial cell)和肝細胞(DeregibusMC et al.Endothelial progenitor cell derived microvesicles activate anangiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA.Blood. 2007 Oct I;110(7):2440-8;Bruno S et al.Mesenchymal stem cell-derivedmicrovesicles protect against acute tubular injury. J Am Soc Nephrol. 2009May;20(5):1053-67;Herrera MB et al. Human liver stem cell-derived microvesiclesaccelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats. J Cell Mol Med. 2009Jul24)，且有助于組織再生和修復(fù)。國際專利申請W02009/087361公開通過將誘導(dǎo)物應(yīng)用于未分化細胞的第一群(落)而生產(chǎn)分化的細胞，然后從分化的細胞分離微泡。參見W02009/087361第30頁上那個方面中的第一完整段落。未分化的細胞的第一個群是例如骨髓間質(zhì)干細胞。然而，W02009/087361沒有公開直接從未分化的細胞獲得微泡。本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，來源于成體干細胞，優(yōu)選來源于骨髓或腎小球間質(zhì)干細胞(glomerular mesenchymal stem cell)或來源于非卵肝干細胞(non-oval liverstem cells)的微泡，在體內(nèi)和體外表現(xiàn)顯著的抗腫瘤活性，因此代表用于癌癥的治療性治療的相應(yīng)的整個干細胞范圍內(nèi)有利的可替換物。在體外通過測量微泡在多種人類癌細胞系的增殖和凋亡上以及它們在毛細管樣結(jié)構(gòu)的形成上的作用，證明依照本發(fā)明來源于成體干細胞的微泡的抗腫瘤活性。在體內(nèi)小鼠模型中通過測量MV治療(處理)對腫瘤生長的作用也證實了微泡的抗腫瘤活性。在現(xiàn)有技術(shù)上，完全想不到來源于成體干細胞的微泡的觀察到的抗腫瘤活性。實際上已知間質(zhì)干細胞(MSC)的制劑對某些組織發(fā)揮再生作用。例如，已知骨髓來源的MSC通過分泌許多營養(yǎng)分子自然地支持造血作用，所述營養(yǎng)分子包括可溶解的細胞外基質(zhì)糖蛋白、細胞因子和生長因子。此外，在W02009/050742中顯示來源于內(nèi)皮干細胞的微泡在體外和體內(nèi)促進血管生成和抵抗凋亡。在W02009/057165中，已知來源于干細胞的微泡誘導(dǎo)受損的組織或器官的內(nèi)皮和上皮再生。在W02009/105044中，推測性地說來源于間質(zhì)干細胞的微泡適合于用于多數(shù)和多種疾病的治療。沒有提供關(guān)于癌癥治療的實驗證據(jù)、理論解釋和具體方法。因此，本發(fā)明的第一方面是用于治療性治療(治療性處理，therapeutictreatment)腫瘤疾病的來源于成體干細胞的微泡。關(guān)于這一點，應(yīng)該理解，微泡不一定來源于應(yīng)該將微泡給予他們的相同患者的成體干細胞。更確切地，它們可來源于不同的受試者，以藥劑的形式制備和維持，然后給予需要其的患者。這是所謂的異源的途徑。在優(yōu)選的實施方式中，成體干細胞是人類間質(zhì)干細胞(human mesenchymal stemcell)或人類肝干細胞。優(yōu)選的人類肝干細胞是表達在WO 2006/126219中公開的間質(zhì)和胚胎干細胞標(biāo)記的人類非卵肝干細胞(human non-oval liver stem cell) (HLSC)0這種細胞系具體的表征是，它是從成體組織分離的非卵人類肝多能性祖細胞系，其中所述成體組織表達肝細胞標(biāo)記且能夠分化成成熟的肝細胞、胰島素生產(chǎn)細胞、骨原細胞和上皮細胞，且優(yōu)選地表達選自包含白蛋白、a -胎蛋白、CK18、⑶44、⑶29、⑶73、⑶146、⑶105、⑶90的組的標(biāo)記，且優(yōu)選不表達選自包含⑶133、⑶117、CK19、⑶34、細胞色素P450的組的標(biāo)記。
在另一個優(yōu)選的實施方式中，人類間質(zhì)干細胞來源于人類成體骨髓(BM-MSC)。在另一個優(yōu)選的實施方式中，人類間質(zhì)干細胞來源于人類成體去被膜的腎小球(human adultdecapsulated glomeruli) (G1-MSC),如歐洲專利申請?zhí)?08425708. 8 中公開的。此外，這些細胞的表征是，它們是⑶133陰性的、⑶146陽性的和⑶34陰性的且它們能夠分化成足細胞(podocyte)、內(nèi)皮細胞和系膜細胞(mesangial cell),且它們也優(yōu)選表達選自包含CD24、Pax-2、CD31、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、nanog (一種干細胞轉(zhuǎn)錄因子)、musashi (一種轉(zhuǎn)錄抑制因子)、波形蛋白、巢蛋白的組的標(biāo)記，且優(yōu)選地不表達選自包含a -SMA、Oct-4、CD45、細胞角蛋白、CD80、CD86、CD40 的組的標(biāo)記。依照本發(fā)明的一個實施方式，腫瘤疾病選自由肝腫瘤(例如，肝細胞瘤)、上皮性腫瘤(例如，卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma))、乳腺腫瘤(breast tumor)(例如，乳腺癌)、肺腫瘤、前列腺腫瘤、胃腫瘤(gastric tumour)、結(jié)腸腫瘤(colon tumour)和卵巢腫瘤組成的組。本發(fā)明的另一個方面是如上述限定的來源于成體干細胞的微泡在制備用于如上述定義的腫瘤疾病的治療性治療的藥劑中的應(yīng)用。在一個實施方式中，治療性治療包括一種或多種細胞毒素劑或細胞抑制劑的給予。適當(dāng)?shù)募毎舅貏┖图毎种苿┌?，例如，紫杉醇、來那度?Lenalidomide)、泊馬度胺(Pomalidomide)、表柔比星(Epirubicin)、5FU、舒尼替尼(Sunitinib)、拉帕替尼(La-patinib)、卡奈替尼(Canertinib)、環(huán)磷酰胺、多柔比星(doxorubicin)、來那度胺 / 地塞米松(Lenalidomiden/Dexamethason)、泊馬度胺 / 地塞米松(Ponalidomide/Dexamethasone)> 卡 白(CarbopIatin)、雷中白霉素(Rapamycin)> 米托惠酉昆(mitoxantron)、奧沙利鉬(oxaliplatin)、多西紫杉醇(多西他賽，docetaxel)、長春瑞濱(vinorelbin)、長春新堿(vincristine)和它們的任何組合。高度優(yōu)選的是給予多柔比星和/或長春新堿與來源于成體干細胞的MV的組合，因為已經(jīng)顯示了這樣的組合發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)(參見

圖13)。局部地或系統(tǒng)地(全身性地,systemically)將微泡給予需要其的患者。適于局部的和系統(tǒng)給藥的藥物劑型是例如可注射的劑型。借助于實例，在實體瘤中通過局部的腫瘤內(nèi)(i. t.)注射，或在實體瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤的兩種情況中，通過靜脈內(nèi)注射或灌輸給予微泡。待給予的適當(dāng)?shù)腗V劑量取決于多種因素，但是通常包含在0. I至200微克/kg接受者體重之間，優(yōu)選1-150微克/kg接受者體重，甚至更優(yōu)選地3-120微克/kg接受體體重。如本文中使用的表述“來源于成體干細胞的微泡(MV)”涉及至少部分來源于成體干細胞的膜顆粒。依次，術(shù)語“成體干細胞”包括能夠增殖(自我更新(self-renewal))和分 化(可塑性)的任何未分化或部分未分化的細胞，因此替代已經(jīng)達到它們的生命周期的末端的特定的細胞譜系的成熟細胞。如本說明書中使用的術(shù)語“成體干細胞”包括具有無限的自我更新能力和多能性可塑性的兩種干細胞、和具有多能可塑性(multipotent plasticity)且在某些情況中有限的更新能力能力的祖細胞。在優(yōu)選的實施方式中，具有多能性或多能可塑性的“成體干細胞”意味著，它們能夠分化成至少兩個、更優(yōu)選至少三個不同類型專門的完全分化的成熟細胞。在本說明書的背景內(nèi)，與從胚泡的內(nèi)細胞團分離的“胚胎干細胞”形成對比，表述“成體干細胞”用于指從成體組織分離的干細胞。成體干細胞(adult stem cell)也稱為“體干細胞(somatic stem cell)”。在本說明書的背景內(nèi)，表述“來源于成體干細胞的微泡(MV)”用于指微泡直接來源于未分化的干細胞。在本說明書的背景內(nèi)，表述“直接”是指微泡來源于在獲得微泡之前沒有進行或發(fā)生任何分化步驟的未分化的成體干細胞。
本發(fā)明中使用的來源于成體干細胞的微泡在外形上通常是球形且具有在IOOnm至5 y m范圍內(nèi)的直徑，更典型地在0. 2至I y m之間的直徑。如果顆粒在外形上不是球形，則上述提及的值是指顆粒的最大尺寸。如本說明書的實驗部分中描述的，可以分離從其獲得用于本發(fā)明中微泡的干細胞。然后，例如，如本說明書的實驗部分中公開的通過超速離心法，可從分離的干細胞的上清液獲得微泡(MV)。然后,在具有一種或多種低溫防護劑(cryoprotecting agent)的懸浮液中，在非常低的溫度下，例如，在-80° C下，通過冷凍存儲分離的MV，直到使用。適當(dāng)?shù)牡蜏胤雷o劑是例如二甲亞砜(DMSO)和甘油。使用細胞懸浮液的體積的1%的濃度的DMSO保證細胞的良好的保存、和對再灌輸患者的有限的毒性作用。可稱作低溫防護劑的其他物質(zhì)是細胞外低溫防護劑，即，在細胞表面上擔(dān)當(dāng)形成減少細胞內(nèi)脫水作用的緊密屏障(tightbarrier)的高分子量物質(zhì)。從下列實施例將更加清晰地看出本發(fā)明的進一步的目的和優(yōu)勢，所述實施例僅為了說明而提供。在實施例中，參考下列附圖。圖IA和B顯示，與利用單獨的媒介物孵育的對照細胞相比，利用不同劑量的微泡(MV)對H印G2細胞(圖1A)和KS細胞(圖1B)的孵育顯著地抑制了增殖。在利用經(jīng)RNA酶(RNase)預(yù)處理或不經(jīng)RNA酶預(yù)處理的來自BM-MSC或來自Gl-MSC的不同劑量的MV (1,10和 30 u g/ml)鮮育 48 小時之后，通過 BrdU 慘入法(BrdU incorporation assay)評價 HepG2和KS細胞的增殖。以3次實驗的平均值土SD表示結(jié)果。圖2A和B顯示，與利用單獨的媒介物和以同樣方式的多柔比星刺激孵育對照相t匕，利用MV對HepG2和KS細胞的孵育顯著地促進凋亡。以在利用(經(jīng)RNA酶預(yù)處理或不經(jīng)RNA酶預(yù)處理的)來自BM-MSC或Gl-MSC的不同劑量的MV的孵育24小時和/或48小時后，凋亡細胞的百分數(shù)，通過Tunel法評價H印G2和KS細胞的凋亡。以3次實驗的平均值土 SD
表不結(jié)果。圖3A和3B顯示，與利用單獨的媒介物孵育的對照細胞相比，利用來自BM-MSC的30 u g/ml MV對MCF-7細胞(圖3A)和SK0V-3細胞(圖3B)孵育48小時顯著地抑制增殖。在利用來自BM-MSC或來自Gl-MSC的30 u g/ml MV孵育48小時之后，通過BrdU摻入法評價MCF-7和SK0V-3細胞的增殖。以3次實驗的平均值土SD表示結(jié)果。 圖4顯示，來自BM-MSC的MV誘導(dǎo)G0/G1階段細胞的增加，特別是SK0V-3細胞。在利用10%FCS、耗盡FCS (饑餓(缺乏，starvation))和在有30 u g/ml的MV存在的情況下培養(yǎng)24小時的SK0V-3細胞中測量DNA含量。觀察在有MV存在的情況下G0/G1階段中的細胞數(shù)目的增加。圖5A和5B顯示進行評價MV對體外血管生成的作用的實驗結(jié)果。評價HUVEC和TEC在基質(zhì)膜(基質(zhì)膠，Matrigel)內(nèi)形成毛細管樣結(jié)構(gòu)的能力。圖6顯示進行評價MV對體外凋亡的作用的實驗結(jié)果。以在利用不同劑量的MV孵育48小時之后凋亡細胞的百分比，通過Tunel法評價HUVEC和TEC的凋亡。圖7顯示進行評價MV對TEC的增殖作用的實驗結(jié)果。在利用經(jīng)RNA酶預(yù)處理或不經(jīng)RNA酶預(yù)處理的來自BM-MSC的不同劑量的MV (10和30 y g/ml)孵育48小時之后，通過BrdU摻入法評價TEC的增殖。以2次實驗的平均值土SD表示結(jié)果。圖8顯示，腫瘤內(nèi)給予具有HepG2異種移植腫瘤的SCID小鼠，經(jīng)RNA酶處理或不經(jīng)RNA酶處理的MV的體內(nèi)抗腫瘤活性。通過植入物的兩個垂直的直徑的測徑法每周測定腫瘤塊(tumor mass)。以腫瘤塊的增量的百分比顯示結(jié)果按照慣例將在第一次治療的腫瘤塊(在H印G2注射之后的I周)固定為100%值。圖9顯示來源于BM-MSC的MV減少體內(nèi)腫瘤生長。A)利用(右側(cè))或不利用(左側(cè))來自BM-MSC的MV治療的具有HepG2腫瘤的小鼠的典型實例。B)利用(右側(cè))或不利用(左偵D來自BM-MSC的MV治療的離體的HepG2腫瘤的典型實例。C)利用(右側(cè))或不利用(左偵D來自BM-MSC的MV治療的HepG2腫瘤的蘇木精和曙紅染色。圖10顯示具有RNA酶的MV的預(yù)處理取消來源于BM-MSC的MV的抗腫瘤活性。A)利用MV-RNA酶處理的離體的HepG2腫瘤的典型實例。B)利用MV-RNA酶處理的HepG2腫瘤的蘇木精和曙紅染色。圖11是顯示H印G2上的BrdU-基礎(chǔ)的增殖實驗的結(jié)果的圖。在單獨的DMEM中或利用來源于HLSC的不同劑量的MV補充的DMEM中培養(yǎng)H印G2。在3天后，利用BrdU摻入法量化H印G2增殖。圖12是顯示在HepG2細胞上凋亡實驗的結(jié)果的圖。在只有DMEM中，或在具有10%FCS 和利用長春新堿(100ng/ml)、或 MV-HLSC (30 u g/ml )、或 MV-HLSC (利用 RNA 酶預(yù)處理的，30 u g/ml)補充的DMEM中培養(yǎng)H印G2細胞。在24小時之后進行分析。圖13是顯示在基礎(chǔ)條件下的IfepG2細胞，或利用長春新堿、多柔比星、MV-HLSC、或利用長春新堿加MV-HLSC以及多柔比星加MV-HLSC處理的IfepG2細胞上凋亡實驗的結(jié)果的圖。圖14 是顯示在 MV-HLSC (n = 3)、媒介物(n = 2)或 MV-HLSC (n = 3) RNA 酶處理、i.t.處理之后，在小鼠處死時，通過測量重獲的H印G2腫瘤的腫瘤體積獲得的數(shù)據(jù)的圖。每周通過利用測徑器測量植入物的兩個垂直直徑來測定腫瘤體積。圖15顯示了示出通過HLSC-MV治療的體內(nèi)腫瘤生長的抑制和誘導(dǎo)的腫瘤內(nèi)凋亡的顯微照片。A)顯示在4周之后重獲的IfepG2腫瘤的凋亡、PCNA和蘇木精和曙紅染色的典型的顯微照片。B)顯示來自MV治療的小鼠重獲的HepG2腫瘤的凋亡、PVNA和蘇木精和曙紅染色的典型的顯微照片。C)顯示來自MV-RNA酶處理的小鼠重獲的IfepG2腫瘤的凋亡、PVNA和蘇木精和曙紅染色的典型的顯微照片。 圖16是顯示通過利用不同濃度的HLSC-MV孵育MCF-7細胞進行體外增殖試驗的結(jié)果的圖。在利用來源于HLSC細胞的2、10、15和30 ii g/ml的MV孵育48小時之后，通過BrdU摻入法評價MCF-7細胞的增殖。一式三份進行實驗。P〈0. 05。圖17顯示通過利用不同濃度的HLSC-MV孵育卡波西細胞(Kaposi cell) (KS)進行體外增殖試驗的結(jié)果的圖。在利用來源于HLSC細胞的2、10、15和30 ii g/ml的MV孵育48小時之后，通過BrdU摻入法評價卡波西細胞的增殖。一式三份進行實驗。P〈0. 05。圖18是顯示通過利用HLSC-MV孵育MCF-7細胞和卡波西細胞進行體外凋亡試驗的結(jié)果的圖。以在利用不同劑量的MV (2 ；10 ；15 ;和30 u g/ml和30 u g/ml的RNA酶處理的MV)孵育48小時之后凋亡細胞的百分比，通過TUNEL法評價凋亡。多柔比星用作凋亡誘導(dǎo)的陽性對照。在陰性對照中，利用單獨的媒介物處理MCF-7細胞和卡波西細胞。一式三份進行實驗。P〈0. 05。I.來自間質(zhì)干細胞(MSC)的微泡(MV)I. IMSC的分離和表征在蔗聚糖(Ficoll)梯度上將骨髓細胞分層(密度1022g/ml ；Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)，且在1500rpm下離心30分鐘。在有間質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MSCBM，Lonza)存在的情況下培養(yǎng)單核的細胞。在培養(yǎng)5天后，更換培養(yǎng)基。為了展開分離的細胞，在37° C下通過胰酶處理5分鐘分離粘連的單層，在15天用于第一次傳代和每隔7天用于后續(xù)的傳代。以10，000個細胞/cm2的密度接種細胞，且使用不晚于傳代6次的細胞。如在 Bruno S et al. Isolation and characterization of residentmesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 2009; 18:867-880 中描述的，從外科去除的腎的皮層的正常部分獲得來自腎小球的MSC群(G1-MSC)。在皮層解剖之后，利用標(biāo)準(zhǔn)建立的技術(shù)收集腎小球懸浮液在通過分級系列的網(wǎng)眼(60目和120目)之后，在120網(wǎng)眼篩的頂部重獲腎小球。然后在通過自發(fā)的沉淀(室溫下10分鐘)在圓錐管的底部收集腎小球，且通過利用IOml吸液管吸入/排出的幾個循環(huán)機械地且通過利用膠原酶I(Sigma, St. Louis, MO)消化2分鐘酶促地剝離腎小囊(Bowman’ s capsule)的臟層。然后在通過自發(fā)沉淀以便去除細胞和腎小囊的圓錐管的底部收集腎小球，和將其轉(zhuǎn)移到纖連蛋白涂覆的 T25 燒瓶中(Falcon, BD Bioscience, Two Oak Park, Bedford, MA)。在有間質(zhì)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MSCBM，Lonza)存在的情況下培養(yǎng)腎小球。使細胞靜置，以便在傳代之前達到匯合；傳代之間的間隔不同(3-7天)直到傳代4次，從那時起其在約7天建立。在每一次傳代，對細胞計數(shù)且通過細胞突光測定分析(cytofIuorimetricanalysis)和免疫突光對免疫表型進行分析。利用下列抗體進行細胞突光測定分析，結(jié)合抗-CD105、-CD29、-CD31、-CD146、-CD44、-CD90 (Dakocytomation, Copenhagen, Denmark) ;_CD73、-CD34、-CD45、-CD80、-CD86、-CD166、HLA-I (Becton DickinsonBiosciences Pharmingen, San Jose, CA) ;_CD133 (Miltenyi Biotec, Auburn) ；KDR (R&DSystems, Abington,U. K. )；-HLA-II (Chemicon International Temecula, CA) ；-CD40(Immunotech, Beckman Coulter)、-CD154 (Serotec, Raleigh, NC USA)單克隆抗體的所有的藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸突光素(FITC)。小鼠IgG同型對照來自Dakocytomation。在4° C上，在含有0. 1%牛血清蛋白和0. 1%疊氮化鈉的100 ill磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進行所有的孵育。對于每一個樣品，在FACSCalibur細胞計數(shù)器(BD Biosciences Pharmingen)上分析10，000個細胞?；陉幮詫φ諛?gòu)造選通(gating)且所有進行的分析中都包括補償 對照。利用Cell Quest軟件(BD Biosciences Pharmingen)產(chǎn)生關(guān)于每次實驗的選通群的群百分比和數(shù)目。在腔室載玻片(NalgenNunc International, Rochester, NY, USA)上培養(yǎng)的、在含有2%蔗糖的4%多聚甲醛中固定的且如果需要利用Ifepes-Triton X 100緩沖液(Sigma, St. Louis, MO)滲透的MSC上進行間接的免疫熒光。使用下列抗體小鼠單克隆抗波形蛋白(Sigma)和兔多克隆抗血管假性血友病因子(anti-von Willebrand factor)(Dakocytomation)。在適當(dāng)?shù)那闆r下，排除初級抗體或利用非免疫的兔或小鼠IgG的代替用作對照。Alexa Fluor 488抗兔和抗小鼠德克薩斯紅(Texas Red) (MolecularProbes, Leiden,荷蘭)用作第二抗體。利用 Zeiss LSM 5 Pascal Model ConfocalMicroscope (Carl Zeiss International, Germany)進行共聚焦顯微鏡法分析。添加Hoechst 33258染料(Sigma),用于核染色。BM-MSC和GL-MSC制劑不表達造血標(biāo)記如⑶45、⑶14和⑶34。它們兩者都不表達共刺激分子(co-stimulatory molecules) (CD80、CD86 和 0040)和內(nèi)皮標(biāo)記(0031、血管假性血友病因子、KDR)。在培養(yǎng)的不同傳代上的所有的細胞制劑表達典型的MSC標(biāo)記⑶105、CD73、CD44、CD90、CD 166 和 CD146。它們也表達 HLAI 類。如在 Pittenger MF, Martin BJ. Mesenchymal stem cells and their potentialas cardiac therapeutics. Circ. Res 2004; 95:9-20 中描述的測定 MSC 的脂肪形成、成骨形成和軟骨形成的分化能力。簡單地說,利用Adipogenic Medium (Lonza)培養(yǎng)MSC 3周。為了評價分化，利用4%多聚甲醛在室溫下固定細胞20分鐘，且利用在甲醇(Sigma)中的0. 5%0il Red 0 (Sigma)在室溫下將細胞染色20分鐘。通過在Osteogenic Medium(Lonza)中培養(yǎng)的MSC評估成骨形成的分化。每周更換培養(yǎng)基兩次持續(xù)3周。為了評價分化，利用4%多聚甲醛固定細胞20分鐘，且利用AlizarinRed, pH 4. I (Lonza)在室溫下染色細胞20分鐘。對于成骨形成分化，在15-ml圓錐形的聚丙烯管(Falcon BD Bioscience)中，以150g將2. 5X IO5MSC離心5分鐘，且利用DMEM洗滌兩次。在利用10ng/ml轉(zhuǎn)移生長因子￠3 (Lonza)補充的軟骨形成培養(yǎng)基(Chondrogenic medium) (Lonza)中培養(yǎng)(細胞)球粒(沉淀物，pellets)。每隔3天更換培養(yǎng)基,持續(xù)28天。在4%多聚甲醒中固定粒料過夜,和利用0. 1%番紅精0 (Sigma)對石臘包埋的切片(paraffin-embedded section)染色糖胺聚糖，和利用1%阿爾藍(alcian blue)染色硫酸化蛋白多糖。I. 2來源于MSC的MV的分離和表征從BM-MSC或GL-MSC的上清液中獲得微泡(MV)，其中在缺少FCS的RPMI和利用0. 5%的BSA (Sigma)補充的RPMI中培養(yǎng)如上述描述獲得的BM-MSC或GL-MSC。以2，OOOg離心過濾20分鐘以便去除碎片之后，以100，OOOg (Beckman Coulter Optima L-90K超速離心機)在4° C下將無細胞的上清液離心I小時，在含有N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid) (HEPES) 25mM (Sigma)的無-血清的培養(yǎng)基199中洗滌，且在相同的條件下進行第二次離心。通過鱟試驗(Limulustest)根據(jù)制造商的說明(Charles River Laboratories, Inc.，Wilmington, MA, USA)排除MV的內(nèi)毒素污染物，且將MV貯藏在-80° C。 在選擇性實驗中，利用lU/ml RNA 酶(Ambion Inc.，Austin, TX, USA)在 37。C 將MV處理I小時，通過添加10U/ml RNA酶抑制劑(Ambion Inc.)終止反應(yīng)，且通過超速離心洗滌MV。I. 3利用來源于MSC的MV講行的體外實齡癌細胞系培養(yǎng)。在含有10%的胎牛血清(FCS，Euroclone)、100U/ml青霉素、IOOmg/ml鏈霉素和1%谷氨酰胺(所有的都來自Sigma)的低葡萄糖DMEM (Euroclone)中培養(yǎng)人肝癌細胞系(HepG2)、人乳腺癌細胞系(MCF-7)和人卵巢癌細胞系(SK0V-3)，且維持在具有5%C02的潮濕氣氛的37° C的培養(yǎng)箱中。從在免疫抑制治療下的具有腎異源移植的患者的皮膚傷口中獲得卡波西肉瘤細胞(KS細胞)的初級培養(yǎng)，且在利用10%FCS、IOOii g/ml青霉素、和100 u g/ml鏈霉素補充的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。腫瘤內(nèi)皮細胞(TEC):分離和培養(yǎng)。利用MACS系統(tǒng)(MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA),使用通過磁性細胞分選耦合到磁性珠上的抗-⑶105Ab，從透明細胞類型腎細胞癌的樣本中分離TEC。建立TEC細胞系，且維持在利用表皮生長因子(10ng/ml)、氫化可的松(lmg/ml)、牛腦提取物(所有的都來自Lonza)和10%FCS補充的內(nèi)皮基礎(chǔ)完全培養(yǎng)基(EBM)中。通過形態(tài)學(xué)、關(guān)于vWF抗原、⑶105、⑶146和血管內(nèi)皮細胞隹丐依粘連蛋白(血管內(nèi)皮I丐黏蛋白，vascular endothelial-cadherin)的陽性染色、和關(guān)于細胞角蛋白和結(jié)蛋白陰性染色將TEC表征為內(nèi)皮細胞(Bussolati B et al. Alteredangiogenesis and survival in endothelial cells derived from renal carcinoma.FASEB J 2003;17:1159-1161)。人胳靜脈內(nèi)皮細胞(HumbelicalVein Endothelial Cells) (HUVEC):分離和培養(yǎng)。如先前描述的(Bussolati B et al. Vascular endothelial growth factorreceptor-1 modulates vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesisvia nitric oxide. Am J Pathol. 2001Sep; 159 (3) : 993-1008)，從胳靜脈獲得人胳靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，且維持在EBM和10%FCS中。在第二次或第三次傳代的HUVEC上進行實驗。細胞增殖。以2，000 或 4，000 個細胞 / 孔將 IfepG2、MCF-7、SK0V-3、KS 細胞或 HUVEC接種到96孔板中，其中所述96孔板處在具有經(jīng)RNA酶預(yù)處理或不經(jīng)RNA酶預(yù)處理的不同濃度的微泡的缺乏FCS的DMEM (Sigma)中。在培養(yǎng)48小時之后以將5-溴_2’_脫氧-尿苷(BrdU)摻入到細胞DNA中的方式，探測DNA合成。然后利用0. 5M乙醇/HCl固定細胞和利用核酸酶孵育，以便消化DNA。利用抗BrdU過氧化物酶-結(jié)合的mAb探測到DNA的BrdU摻入，且利用可溶解的發(fā)色體基質(zhì)(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)顯現(xiàn)。利用ELISA讀取器在405nm處測量光學(xué)密度。細胞周期分析。利用30 U g/ml的MV的不同制劑刺激人類癌細胞系24小時，通過胰酶分離且在冷的80%乙醇中固定。將細胞維持在-20° C至少24小時，然后在PBS中洗滌。然后，在含有RNA酶(200 ii g/ml) (Sigma)和0. 5%的諾乃洗滌劑P40 (Nonidet P40)(Sigma)的溶液中，利用碘化丙唳(50 ii g/ml) (Sigma),在室溫下孵育細胞I小時，以便染色DNA。對于每個樣品，在FACSCalibur血細胞計數(shù)器(BD Biosciences Pharmingen)上分析50，000個細胞。凋亡試驗。將H印G2、MCF-7、SK0V-3、KS細胞、HUVEC或TEC以8，000個細胞/孔接種到96孔板中，其中所述96孔板處在具有10%FCS和存在多柔比星(100ng/ml，Sigma) 或經(jīng)或不經(jīng)RNA酶預(yù)處理的不同濃度的MV (10和30 ii g/ml)的DMEM (Sigma)中。通過TUNEL 法評估凋亡(ApopTag Oncor, Gaithersburg, MD, USA)。在處理 24 小時或 48 小時后，利用PBS洗滌細胞，在pH 7. 41%多聚甲醛中在4° C下將細胞固定15分鐘，在PBS中洗滌兩次，然后在預(yù)冷的乙醇-乙酸2:1在-20° C下將細胞后固定5分鐘。利用酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TdT)處理樣品。然后利用熱的結(jié)合突光素的抗地高辛(anti-digoxigenin)處理細胞，且在室溫下孵育30分鐘。在含有Iu g/ml的碘化丙啶的培養(yǎng)基中制作樣品，且通過免疫熒光分析細胞。以綠色熒光發(fā)射細胞(凋亡的細胞)相對于紅色熒光發(fā)射細胞(總的細胞)的百分比表示結(jié)果。體外血管形成。在4° C下利用生長因子-誘導(dǎo)的基質(zhì)膜(BD Biosciences)涂覆24孔板，且在37° C，5%C02,潮濕的氣氛中孵育30分鐘。以5X IO4個細胞/孔的密度，在存在或在缺少經(jīng)RNA酶處理或不經(jīng)RNA酶處理的不同濃度的MV的情況下，將HUVEC或TEC接種在處在具有5%FCS的RPMI或EBM中的基質(zhì)膜涂覆的孔上。在孵育6小時之后，在尼康倒置的顯微鏡(Nikon)下觀察細胞，且記錄實驗結(jié)果。以利用縮微圖像分析系統(tǒng)(CastImaging)測量，以任意單位表達且在3個不同實驗的副本孔中20X放大倍率下在5個不同的視場中評價的管狀長度的平均值表示結(jié)果。統(tǒng)計分析。以平均值土SD表示不同的實驗進程的所有數(shù)據(jù)。在適當(dāng)?shù)那闆r下，通過具有Newmann-Keuls多重比較試驗的ANOVA進行統(tǒng)計分析。I. 4體外結(jié)果I. 4. I來源于腫瘤細胞系上的BM-MSC和GL-MSC的MV的體外牛物學(xué)效應(yīng)在體外通過測量它們對于H印G2、MCF-7、SK0V_3和KS細胞系的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的能力，評估來源于人類BM-MSC的MV的抗腫瘤活性。圖I顯示了與利用單獨的媒介物孵育的對照細胞相比利用不同劑量的MV對H印G2細胞(圖1A)和KS細胞(圖1B)孵育48小時顯著地抑制增殖。圖2顯示了與利用單獨的媒介物和以相同方式的多柔比星刺激的孵育對照細胞相比利用MV對H印G2細胞(圖2A)和KS細胞(圖2B)孵育24小時和48小時顯著地促進凋亡。
當(dāng)利用RNA酶孵育MV以便誘導(dǎo)有MV運輸(shuttle)的RNA的完全的降解時，減少由MV引出的對H印G2和KS細胞的抗增殖和促凋亡作用(圖I和圖2)。MV的RNA酶的處理本身不干擾由多柔比星誘導(dǎo)的癌細胞系的凋亡(圖2)。相反，與利用單獨的媒介物孵育的對照細胞相比，利用來自BM-MSC的30 U g/mlMV對MCF-7細胞和SK0V-3細胞孵育48小時顯著地抑制增殖(圖3A和3B)，但是不促進凋亡。在這兩種腫瘤細胞系中，發(fā)明人還已經(jīng)利用碘化丙啶染色技術(shù)研究了細胞周期，以便與S和G2階段中的細胞的比較，評價G0/G1階段中的細胞百分比。發(fā)明人已經(jīng)觀察到，來自BM-MSC的MV誘導(dǎo)G0/G1階段中的細胞的增加，特別是在SK0V-3細胞中(圖4)，其可解釋利用BrdU摻入觀察的增殖的抑制。發(fā)明人還檢驗了來源于Gl-MSC的MV對腫瘤細胞系的增殖和凋亡的作用。Gl-MSCs不影響HepG2細胞系的增殖和凋亡。相反，來源于Gl-MSC的MV抑制KS細胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡(圖I和圖2)。此外，與利用單獨的媒介物孵育的對照細胞相比，利用來源于Gl-MSC的30 u g/mlMV對MCF-7和SK0V-3細胞孵育48小時抑制增殖(圖3)，但是不促進凋亡。
I. 4. 2來源于人成纖維細朐的MV來源于人成纖維細胞的MV不抑制不同的癌細胞系的增殖且不誘導(dǎo)凋亡(數(shù)據(jù)沒有示出)。I. 4. 3來源于BM-MSC的MV對內(nèi)皮細朐的體外作用發(fā)明人也已經(jīng)研究了，來源于BM-MSC的MV對HUVEC和腫瘤內(nèi)皮細胞(TEC)的增殖、凋亡和毛細管樣(capillary-like)形成的體外作用。MV處理不影響HUVEC的增殖(數(shù)據(jù)沒有示出)和毛細管樣形成能力(圖5A)。另外，利用不同劑量的MV對HUVEC孵育48小時不誘導(dǎo)凋亡(圖6)。相反，與利用單獨的媒介物孵育的對照細胞相比，利用不同劑量的MV對TEC孵育48小時顯著地抑制增殖(圖7)和促進凋亡(圖6)。在利用經(jīng)RNA酶預(yù)處理或不經(jīng)RNA酶預(yù)處理的來自BM-MSC的不同劑量的MV (10和30 u g/ml)孵育48小時之后，通過BrdU摻入法評價TEC的增殖。以2次實驗的平均值土 SD表示圖7中的結(jié)果。當(dāng)利用RNA酶孵育MV時，顯著地減少通過MV引出的對TEC的凋亡作用。利用不同劑量的MV，對接種在基質(zhì)膜上的TEC的孵育顯著地抑制TEC在體外形成管狀結(jié)構(gòu)的能力。利用RNA酶的MV的預(yù)處理取消了 MV對細管形成的抑制作用(圖5B)。I. 5利用來源于MSC的MV的體內(nèi)試驗?zāi)[瘤形成。收集3X IO6個H印G2細胞且皮下地植入SCID小鼠(CharlesRiver, Jackson Laboratories, BarHarbor, ME)。利用膜酶-EDTA 收獲的培養(yǎng)細胞，利用PBS洗滌，在微型血細胞計數(shù)器腔室中計數(shù)，且在100 ill DMEM和100 ill基質(zhì)膜基質(zhì)(Matrigel Matrix) (Becton Dickinson)中重懸。在冰上冷凍細胞，且通過26號針利用1-ml注射器皮下地注入SCID小鼠的左后方。每天監(jiān)視動物的活性和身體狀態(tài)，且每隔3天進行體重的測定和腫瘤塊的測量。以植入物的兩個垂直的直徑通過測徑器測量法測定腫瘤塊，且利用式l/2ax b2計算腫瘤塊，其中a是長直徑，和b是短直徑(Hou J etal. Experimental therapy of hepatoma with artemisin and its derivatives:in vitroand in vivo activity, chemosensitization and mechanism of action. Clin CancerResearch. 2008; 14:5519-5530))。在I周后，當(dāng)植入的腫瘤達到大約15mm3體積時，發(fā)明人開始每周一次的MV的腫瘤內(nèi)注射。第一次治療利用IOOiigMV (經(jīng)或不經(jīng)RNA酶處理)，以20 ill的最大體積進行；隨后的腫瘤內(nèi)注射利用50 ii g的MV (經(jīng)或不經(jīng)RNA酶處理)，以20iU的最大值進行。在對照小鼠中，發(fā)明人腫瘤內(nèi)注射相同體積的單獨的媒介物。將小鼠隨機化分成三個治療組a)利用MV腫瘤內(nèi)注射的組(n = 8);b)利用經(jīng)RNA酶處理的MV腫瘤內(nèi)注射的組(n = 8);和c)利用相同體積的單獨的媒介物注射的對照組(n = 5)。在基質(zhì)膜注射三周之后，處死小鼠，且重獲腫瘤，且處理腫瘤用于組織學(xué)。I. 6體內(nèi)結(jié)果I. 6. I來源于BM-MSC的MV對HEPG2腫瘤牛長的體內(nèi)牛物學(xué)效應(yīng)在SCID小鼠中，通過來源于BM-MSC的MV抑制腫瘤形成和生長。為了測定來源于BM-MSC的MV在體內(nèi)對腫瘤形成和生長的作用，在有基質(zhì)膜存在的情況下利用 H印G2皮下地注射SCID小鼠。在注射后一周，當(dāng)腫瘤的體積大約是15mm3時，發(fā)明人開始利用MV(經(jīng)RNA酶處理或不經(jīng)RNA酶處理)，以20iU的最大體積，每周一次地對小鼠腫瘤內(nèi)注射。第一次治療利用100 ii g的MV ;隨后的腫瘤內(nèi)注射利用50 ii g的MV。在對照的小鼠中，發(fā)明人腫瘤內(nèi)注射20 u I單獨的媒介物。在基質(zhì)膜注射三周后，重獲所有的腫瘤且進行分析。在HepG2異種移植模型中，MV腫瘤內(nèi)注射顯示對腫瘤生長的抑制劑作用(圖8)。在利用MV治療的SCID小鼠中腫瘤的大小和體積顯著更小(圖9A和B)，組織學(xué)分析顯示利用MV治療的HepG2腫瘤中的壞死的區(qū)域(圖9C)。利用經(jīng)RNA酶預(yù)處理的MV注射的腫瘤在大小和組織學(xué)方面與對照腫瘤沒有不同(圖 IOA 和 B)。2.來自肝干細胞的微泡(MV)2. I成人肝干細胞(HLSC)的分離和表征從來自Cambrex Bio Science Verviers S. p. r. I. (Verviers, Belgium)獲得的人類冷藏保存的正常肝細胞分離HLSC，將其培養(yǎng)在利用L-谷氨酰胺(5mM)、Hepes (12mM, pH7. 4)、青霉素(50IU/ml)、鏈霉素(50ii g/ml)(所有都來自 Sigma, St. Louis)、FCS (10%)補充的最小的基本培養(yǎng)基/內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基-I中(a -MEM/EBM) (3:1) (Gibco/Cambrex)。將展開的細胞轉(zhuǎn)移到T-75燒瓶中，且當(dāng)它們接近匯合(confluence)時進行分析。在含有10%胎牛血清(FBS)的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(低葡萄糖)中培養(yǎng)肝瘤細胞系H印G2。2. 2來源于HLSC的MV的分離從在利用2%胎牛血清(FBS)補充的MEM-a中培養(yǎng)的HLSC的上清液中獲得MV。通過臺盼藍拒染法(trypan blue exclusion)探測在沒有血清的情況下孵育過夜的細胞的生存能力。在以2000g離心20分鐘以便去除碎片后，以100，OOOg (Beckman CoulterOptima L-90K超速離心機)在4° C下將無細胞的上清液離心lh，在含有N-2-羥乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸(HEPES) 25mM (Sigma)的無血清培養(yǎng)基199中洗滌，且在相同的條件下進行第二次超速離心。為了跟蹤在體外和體內(nèi)通過熒光顯微鏡法或FACS分析的MV，利用插入脂質(zhì)雙分子層PKH26染料(Sigma)的紅色熒光脂肪族發(fā)色團標(biāo)來自干細胞的MV。在標(biāo)記之后，洗滌MV，且以100，OOOg在4° C下超速離心lh。在培養(yǎng)基199中懸浮MV粒料，且通過布拉德福德方法(BioRad, Hercules, CA)量化蛋白質(zhì)含量。通過當(dāng)試驗根據(jù)制造商的說明(Charles River Laboratories, Inc.，Wilmington, MA)排除 MV 的內(nèi)毒素污染物，且將 MV貯藏在-80° C。在利用碘化丙啶著色之后，在MV懸浮液上進行形態(tài)學(xué)分析，不顯示凋亡小體的存在。在選擇性試驗中，利用lU/ml RNA酶(Ambion Inc.，Austin, TX)，在37° C將來自HLSC的MV處理lh，通過加入10U/ml RNA酶抑制劑(Ambion Inc.)來終止反應(yīng)，且通過超速離心洗漆MV。在利用TRIZOL試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)進行RNA提取之后,通過總的抽出的RNA的分光光度計分析評價RNA酶處理的功效(未處理的1. 3±0. 2 μ g RNA/mg蛋白質(zhì)MV ；RNA酶處理的〈0. 2 μ g RNA/mg蛋白質(zhì)MV)。另外，通過寡dT驅(qū)動的逆轉(zhuǎn)錄(retrotranscription)標(biāo)記從經(jīng)RNA酶處理的和未經(jīng)RNA酶處理的MV提取的RNA,且在O. 6%瓊脂糖凝膠上分析，以便顯示通過RNA酶處理的RNA的完全的降解。作為對照，利用lU/ml DNA 酶(Ambion Inc.)在 37° C 將 MV 處理 lh。2. 3利用從HLSC分離的MV講行的體外實齡增殖分析。根據(jù)制造商的說明，利用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Chemicon, Temecula, CA),以將5_溴-2-脫氧尿苷(BrdU)摻入到細胞DNA中的方式,探測DNA合成。簡要地，在洗滌之后，利用lOmol/1 BrdU在37° C、5% CO2、潮濕的氣氛中將細胞孵育6至12小時，利用O. 5mol/L乙醇/HCl固定細胞，且利用核酸酶孵育以便消化DNA。利用抗BrdU過氧化物酶結(jié)合的單克隆抗體探測摻入到DNA中的BrdU，且利用可溶解的發(fā)色基質(zhì)顯現(xiàn)。利用酶聯(lián)免疫吸附測定讀取器在405nm下測量光學(xué)密度。凋亡分析。利用終端dUTP缺口末端標(biāo)記實驗(terminal dUTP nickend labelingassay) (ApoTag; Oncor, Gaithersburg, MD)評價凋亡。在 96 孔板中培養(yǎng)細胞(8X IO3/ 孔)，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中懸浮細胞，且在pH7. 4的PBS中的1%多聚甲醛中在4° C將細胞固定15分鐘,接著通過預(yù)冷卻的乙醇/乙酸(2:1)在-20° C下固定5分鐘。利用終端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶處理細胞，且在潮濕的腔室中在37° C下孵育I小時，然后利用加溫的異硫氰酸突光素-結(jié)合的抗地高辛(antidigoxigenin)在室溫下處理30分鐘。在洗漆之后， 在含有l(wèi)g/ml的碘化丙啶的培養(yǎng)基中制作樣品，且通過免疫熒光法分析細胞。統(tǒng)計分析。以平均值土SD表示不同的實驗進程的所有的數(shù)據(jù)。在適當(dāng)?shù)那闆r下，通過具有Newmann-Keuls多重比較檢驗的ANOVA進行統(tǒng)計分析。2. 4體外結(jié)果2. 4. I來源于HLSC的MV對HepG2肝瘤細胞系增殖的影響發(fā)明人評價來源于HLSC的MV對!fepG2增殖的影響。簡要地，利用原樣或經(jīng)RNA酶處理3天的不同劑量(10、20和30 μ g/ml)的HLSC來源的MV孵育H印G2細胞。在孵育的最后，對H印G2培養(yǎng)物計數(shù)，或在O. 5M乙醇/HCl中固定，且利用核酸酶孵育以便消化DNA。利用抗-BrdU過氧化物酶-結(jié)合的mAb探測摻入到DNA中的BrdU，且利用可溶解的發(fā)色基質(zhì)顯現(xiàn)。利用ELISA讀取器在405nm下測量光學(xué)密度。如圖11顯示的，來源于HLSC的MV能夠顯著地抑制IfepG2增殖。這也適用于RNA酶處理的MV。 2. 4. 2來源于HLSC的MV對HepG2肝瘤細胞系凋亡的影響評價HLSC來源的MV誘導(dǎo)H印G2凋亡的能力。簡要地，以8，000個細胞/孔的密度將H印G2接種到處在具有10%FCS的DMEM中的96孔板中，且在沒有FCS的情況下通過培養(yǎng)，通過利用長春新堿(100ng/ml)，或多柔比星(50ng/ml)，在癌癥化學(xué)療法中使用的兩個有絲分裂抑制劑處理，或通過MV處理(30 μ g/ml)誘導(dǎo)凋亡。作為對照，也利用lU/mlRNA酶18 (Ambion, Austin, TX)在37。C將MV處理I小時，以便評價對于癌細胞生長的抑制的貢獻是否依賴于通過MV傳遞給癌細胞的mRNA的橫向轉(zhuǎn)移。在24和72小時下，利用TUNEL法分析評價凋亡。如圖12顯示的，與通過長春新堿誘導(dǎo)的相比，來源于HLSC的MV能夠誘導(dǎo)HepG2凋亡。相反，RNA酶處理不能誘導(dǎo)凋亡。另外，如圖13示出的，利用長春新堿加MV-HLSC或多柔比星加MV-HLSC的H印G2的處理導(dǎo)致累加效應(yīng)(additive effect)。2. 5利用從HLSC分離的MV講行體內(nèi)實齡細胞培養(yǎng)。在利用10%胎牛血清、100 μ g/ml青霉素、和100 μ g/ml鏈霉素補充的DMEM中培養(yǎng)人類肝瘤細胞IfepG2，且維持在37° C下具有5%C02的潮濕氣氛的培養(yǎng)箱中。在利用10%胎牛血清、100 μ g/ml青霉素、和100 μ g/ml鏈霉素補充的a -MEM/EBM (3:1)中培養(yǎng)人類肝干細胞(HLSC)。利用hEGF (人類上皮生長因子)、氫化可的松(Hydrocortisone)、GA (慶大霉素)、BBE (腦牛提取物)重新構(gòu)建EBM。來自HLSC的微泡(MV)的分離。從在利用2%胎牛血清補充的a -MEM培養(yǎng)基中·培養(yǎng)的HLSC的上清液中獲得MV。以2，OOOg離心20分鐘以便去除碎片后，以100，OOOg在4° C下將無細胞的上清液離心lh，在含有N-2-羥乙基哌嗪-N’ -2-乙磺酸(HEPES) 25mM的無血清培養(yǎng)基199中洗滌，且在相同的條件下經(jīng)受第二次超速離心。在O. 1%的DMSO中的培養(yǎng)基199中懸浮MV粒料，且利用布拉德福德(Bradford)方法量化蛋白質(zhì)含量。實驗設(shè)計。從Charles River實驗室獲得雌性4至5個月大的SCID小鼠。所有的小鼠都住在干凈的設(shè)施中且保持I周，以便使其適應(yīng)新環(huán)境。在第O天，進行3X106個HepG2腫瘤細胞的兩次注射，其中所述腫瘤細胞重懸在1:1的比率的具有基質(zhì)膜基礎(chǔ)膜基質(zhì)的無血清的DMEM中。將細胞懸浮液以0. 2ml的總體積注入SCID小鼠的左腹股溝區(qū)域。將所有的小鼠隨機地分成三個治療組20μ I腫瘤內(nèi)(i. t. )MV注射(η = 3);20μ I i. t. PBS注射(η = 2)和20 μ I i.t. MV-RNA酶處理的注射(η = 3)。在第7天，開始后腫瘤細胞移植處理。從第7天時起腫瘤成為可覺察的；在腫瘤移植之后7、12、14、和18天，注射懸浮在利用0. 1%DMS0補充的M199中的50或100 μ gMV。當(dāng)腫瘤漂洗大約15mm3的體積時開始處理。每天監(jiān)視動物的行動和身體狀態(tài)，且每隔3天做出體重的測定和腫瘤塊的測量。利用測徑器測量腫瘤。通過測徑器探測腫瘤塊，在移植物的兩個垂直的直徑中測量，且利用式l/2a X b2計算，其中a是長直徑和b是短直徑。在第28天處死動物，且收集腫瘤用于進一步的分析。形態(tài)學(xué)研究。在10%緩沖的中性福爾馬林中固定腫瘤，常規(guī)地進行處理，包埋在石蠟中，以5 μ m切割，且利用H&E染色，以便微觀檢查。利用抗PCNA單克隆抗體進行用于增殖探測的免疫組織化學(xué)。封閉切片且利用抗小鼠HRP 二抗(1:300稀釋)標(biāo)記。省略初級抗體或利用非免疫的小鼠IgG的取代用作對照。在石蠟包埋的腫瘤切片中通過TUNEL評價凋亡。在630X放大倍率下計算十個非連續(xù)的切片的凋亡陽性的腫瘤細胞。添加Hoechst33258染料，用于核染色。統(tǒng)計分析。以平均值土SD表示不同的實驗進程的所有的數(shù)據(jù)。在適當(dāng)?shù)那闆r下，通過具有Newmann-Keuls多重比較檢驗的ANOVA進行統(tǒng)計分析。2. 6體內(nèi)結(jié)果2. 6. I通過來源于SCID小鼠中肝細胞瘤異體移棺樽型中的HLSC的MV抑制腫瘤牛長和增殖
為了確定來源于HLSC的MV對體內(nèi)腫瘤生長的作用，利用人類肝癌細胞系！fepG2皮下植入SCID小鼠。在注射HepG2后的一周和兩周，當(dāng)腫瘤體積是大約15mm3時，利用MV的腫瘤內(nèi)注射(50或100μ g)，以最大量20μ I的體積治療小鼠。在對照小鼠中，利用20μ I單獨的媒介物對腫瘤注射。在HepG2注射的三周和四周之后，重獲所有的腫瘤且進行分析。在這種異體移植模型中，MV的腫瘤內(nèi)注射(圖14)顯示對腫瘤生長的抑制劑作用。另外，組織學(xué)分析顯示利用MV治療的腫瘤中壞死的區(qū)域(圖15B)，和利用PCNA染色觀察抗增殖作用(圖 15B)。2.6. 2通過來源于SCID小鼠中的肝細胞瘤異體移植模型中的HLSC的MV的凋亡的歷為了確定在腫瘤內(nèi)凋亡中的作用，通過TUNEL分析來自利用MV治療的腫瘤的石蠟切片。與利用單獨的媒介物處理的腫瘤相比，MV治療誘導(dǎo)凋亡(圖15A)。2. 7來源于HLSC的MV對MCF-7乳腺癌和卡波西肉瘤(KS)細朐的體外牛物學(xué)效應(yīng)2. 7. I材料和方法 細胞培養(yǎng)。在利用10%胎牛血清、100 μ g/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素補充的α -ΜΕΜ/ΕΒΜ (3:1)中培養(yǎng)人類非卵肝干細胞(HLSC)。利用hEGF (人上皮生長因子)、氫化可的松、GA (慶大霉素)、BBE (腦牛提取物)重新構(gòu)建EBM。從American Type Culture Collection (Manassas, VA)獲得 MCF-7 乳腺癌細胞系，且在利用10%FCS、100 μ g/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素補充的DMEM中培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細胞系，且維持在37° C下具有5%C02的潮濕的氣氛的培養(yǎng)箱中。從在免疫抑制力治療下的具有腎異源移植的患者的皮膚傷口中獲得卡波西肉瘤細胞(KS細胞)的初級培養(yǎng)，且在利用10%FCS、100 μ g/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素補充的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MV的分離。從在利用2%胎牛血清(FBS)補充的MEM- α中培養(yǎng)18個小時的HLSC的上清液中獲得MV。在選擇性的實驗中，在沒有FBS存在的情況下收集MV。通過臺盼藍拒染法探測在2%的FBS和沒有血清時過夜孵育的細胞的生存能力(大于90%，數(shù)據(jù)沒有顯示)。在以 2，OOOg 離心 20 分鐘以便去除碎片后，以 100，OOOg (Beckman Coulter Optima L-90K超速離心機)在4° C將無細胞的上清液離心lh，在含有N-2-羥乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸(HEPES) 25mM的無血清培養(yǎng)基199中洗滌，且在相同的條件下進行第二次超速離心。在培養(yǎng)基199中懸浮MV粒料，且通過布拉德福德方法量化蛋白質(zhì)含量。將MV貯藏在-80° C。在利用碘化丙啶染色之后，在MV懸浮液上進行形態(tài)學(xué)分析，不顯示凋亡小體的存在。RNA酶處理。在選擇性實驗中，利用lU/ml RNA酶在37。C下將來自HLSC的MV處理lh。通過加入10U/ml的RNA酶抑制劑而終止反應(yīng)，且通過超速離心法洗滌MV。細胞增殖。為了研究來源于HLSC的MV是否對來源于各種腫瘤的細胞系發(fā)揮它們的抗腫瘤活性，將MCF-7乳腺癌細胞和卡波西肉瘤細胞以8，000個細胞/孔接種到分別處于DMEM和RPMI中的96孔板中，具有不同的MV濃度(2 ; 10 ; 15 ;和30 μ g/ml和30 μ g/mlRNA酶處理的MV)。在培養(yǎng)48小時之后以將5-溴_2’_脫氧-尿苷(BrdU)摻入到細胞DNA中的方式，探測DNA合成。然后利用0. 5M乙醇/HCl固定細胞和利用核酸酶孵育，以便消化DNA。利用抗BrdU過氧化物酶-結(jié)合的mAb探測到DNA的BrdU摻入，且利用可溶解的發(fā)色基質(zhì)顯現(xiàn)。利用ELISA讀取器在405nm處測量光學(xué)密度。
凋亡實驗。將MCF-7和KS細胞以8，000個細胞/孔接種到處于具有10%FCS的低葡萄糖DMEM中且在存在多柔比星(100ng/ml)或不同濃度的MV (2 ；10 ；15 ;和30 μ g/ml和30 μ g/ml的RNA酶處理的MV)的96孔板中。利用TUNEL法評價凋亡。2. 7. 2結(jié)果來源于HLSC的MV抑制MCF-7細朐和KS細朐的體外增葙與利用單獨的媒介物孵育的對照細胞相比，利用2、10、15和30μ g/ml的來源于HLSC-6B細胞的MV (圖16和17)，對MCF-7乳腺癌細胞和卡波西肉瘤細胞孵育48小時顯著地抑制細胞增殖。這些結(jié)果顯示，組織固有的干細胞的抗腫瘤作用并非特異性地對抗來源于相同組織的腫瘤。此外，與利用單獨的媒介物孵育的對照細胞相比，利用2、10、15和 30 μ g/ml的來源于HLSC-6B細胞的MV (圖18)，對MCF-7乳腺癌細胞和卡波西肉瘤細胞孵育48小時可誘導(dǎo)凋亡，具有類似于多柔比星，一種化學(xué)治療藥物的作用。這進一步證實，組織固有的干細胞的抗腫瘤作用并非特異性地對抗來源于相同組織的腫瘤。
權(quán)利要求
1.一種來源于成體干細胞的微泡(MV)，用于治療性治療腫瘤疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微泡(MV)，其中，所述成體干細胞選自由間質(zhì)干細胞和肝干細胞組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微泡(MV)，其中，所述成體干細胞選自由來源于骨髓的人類間質(zhì)干細胞(BM-MSC)、來源于去被膜的腎小球的人類間質(zhì)干細胞(Gl-MSC)和人類非卵肝干細胞(HLSC)組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的微泡(MV)，其中，所述腫瘤疾病選自由肝腫瘤、上皮腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤、胃腫瘤、結(jié)腸腫瘤和卵巢腫瘤組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的微泡(MV)，其中，腫瘤疾病的治療性治療包括給予需要其的患者MV劑量，所述MV劑量包括在O. I至200微克/kg患者體重之間，優(yōu)選1-150微克/kg患者體重，甚至更優(yōu)選3-120微克/kg患者體重。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的微泡(MV)，所述微泡處于適合于局部或系統(tǒng)給藥的藥物劑型。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的微泡(MV)，其中，所述治療性治療包括一種或多種細胞毒素劑和/或細胞抑制劑的給予。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微泡(MV)，其中，所述細胞毒素劑和/或細胞抑制劑選自由紫杉醇、來那度胺、泊馬度胺、表柔比星、5FU、舒尼替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、環(huán)磷酰胺、多柔比星、來那度胺/地塞米松、泊馬度胺/地塞米松、卡鉬、雷帕霉素、米托蒽醌、奧沙利鉬、多西紫杉醇、長春瑞濱、長春新堿和它們的任何組合組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微泡(MV)，其中，所述細胞毒素劑和/或細胞抑制劑是多柔比星或長春新堿。
10.一種治療性治療腫瘤疾病的方法，包括給予需要其的患者治療有效量的來源于成體干細胞的微泡。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述成體干細胞是間質(zhì)干細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述成體干細胞是來源于骨髓的人類間質(zhì)干細胞(BM-MSC)或來源于去被膜的腎小球的人類間質(zhì)干細胞(G1-MSC)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述成體干細胞是肝干細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述肝干細胞是非卵肝干細胞(HLSC)。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至14中任一項所述的方法，其中，所述腫瘤疾病選自由肝腫瘤、上皮腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤、胃腫瘤、結(jié)腸腫瘤和卵巢腫瘤組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述腫瘤疾病的治療性治療包括給予需要其的患者MV劑量，所述MV劑量包括在O. I至200微克/kg患者體重之間，優(yōu)選1-150微克/kg患者體重，甚至更優(yōu)選3-120微克/kg患者體重。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述微泡(MV)通過局部或系統(tǒng)途徑給予。
18.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述治療性治療還包括一種或多種細胞毒素劑和/或細胞抑制劑的給予。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述細胞毒素劑和/或細胞抑制劑選自由紫杉醇、來那度胺、泊馬度胺、表柔比星、5FU、舒尼替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、環(huán)磷酰胺、多柔比星、來那度胺/地塞米松、泊馬度胺/地塞米松、卡鉬、雷帕霉素、米托蒽醌、奧沙利鉬、多西紫杉醇、長春瑞濱、長春新堿和它們的任何組合組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述細胞毒素劑和/或細胞抑制劑是多柔比星或長春新堿。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤的治療性治療的領(lǐng)域。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予患有腫瘤疾病的患者時，來源于成體干細胞的微泡發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用。優(yōu)選的微泡來源于骨髓間質(zhì)干細胞、腎小球間質(zhì)干細胞或非卵肝干細胞。
文檔編號A61K35/12GK102781454SQ201180011925
公開日2012年11月14日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者喬瓦尼·卡穆西, 奇羅·泰塔, 斯特凡尼亞·布魯諾, 瑪利亞·比阿特麗斯·赫雷拉桑切斯, 瓦倫丁娜·豐薩托 申請人:弗雷森紐斯醫(yī)療護理德國有限責(zé)任公司