專利名稱：生產(chǎn)過敏原提取物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)純化的過敏原提取物的方法以及用于診斷和治療過敏癥的多種藥物組合物和疫苗。
背景技術(shù)：
過敏是免疫系統(tǒng)的一種獲得性超敏失調(diào)并且由暴露于被稱為過敏原的無害環(huán)境物質(zhì)所引發(fā)。I型超敏反應(yīng)是過敏反應(yīng)的特征并且會引起過量的IgE抗體產(chǎn)生,這些IgE抗體反過來會使嗜堿細胞和肥大細胞活化，從而引起炎性反應(yīng)。這些效應(yīng)可能是全身性的，如血管舒張、粘液分泌、神經(jīng)刺激以及平滑肌收縮，從而引起一種過敏反應(yīng)(anaphylaxisreaction),或者可能局限于身體的某一特定區(qū)域，例如呼吸系統(tǒng)。
食物過敏是一個日益顯現(xiàn)的主要公共健康問題，影響了約6%的學(xué)齡期兒童和約4%的成人,并且可能會造成嚴重的后果,包括致命的過敏反應(yīng)(anaphylactic reaction)(1)。因此，過敏可能會顯著影響生活品質(zhì)的諸多社會心理方面，超出了患者的過敏性癥狀的直接臨床效果⑵和家庭的諸多日常活動。目前，針對這一類過敏的護理標(biāo)準包括了嚴格避免諸多攻擊性過敏原以及用腎上腺素進行治療?；ㄉ^敏是一種因花生中的膳食物質(zhì)引起免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)，而出現(xiàn)的I型超敏性(由IgE介導(dǎo)的)免疫反應(yīng)。美國的哮喘和過敏基金會估計，在美國，花生過敏是最常見的與食物相關(guān)的死亡原因，且據(jù)估計，它影響著0.4%-0.6%的人口。樹堅果(如美洲山核桃、開心果、松子以及核桃)也是常見的堅果過敏原。至今已從花生(落花生(Arachis hypogea))鑒別出^ 種過敏原(Ara hi到Ara h 11)并且這些過敏原中有許多已被測序并且克隆?；趪H免疫學(xué)會聯(lián)合會(International Union of Immunological Societies, IUIS)命名法，這些過敏原包括Ara h I, 一個64kDa的Cupin蛋白(豌豆球蛋白型，7S球蛋白)；Ara h 2, 一個17kDa的藍豆蛋白(2S白蛋白)；Ara h 3,—個60kDa的Cupin蛋白(豆球蛋白型，IlS球蛋白，大豆球蛋白)；Ara h 4, 一個37kDa的Cupin蛋白(豆球蛋白型，11S,大豆球蛋白)；Ara h 5,—個15kDa的肌動蛋白抑制蛋白(Profilin) ；Ara h 6, 一個15kDa的藍豆蛋白(2S白蛋白)；Arah 7，一個15kDa的藍豆蛋白(2S白蛋白)；Ara h 8，一個17kDa的病程相關(guān)蛋白PR-10 ；Arah 9,—個9. 8kDa的非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白I ;Ara h 10,—個16kDa的油體蛋白；以及Arah 11, 一個14kDa油體蛋白。對貓過敏是極為常見的，見于高達25%的患有過敏的人。對貓過敏比對狗的皮屑過敏更為常見，這可能涉及貓的毛發(fā)和皮屑作為過敏原的潛在性，以及一般不給貓洗澡的事實。產(chǎn)生大量貓過敏原，特別是雄性未被閹割過的貓，因為這個過敏原部分受到激素控制。皮屑常通過空氣傳播，有粘性，并且見于公共場所，甚至在沒有貓時也有。這是因為皮屑被攜帶在有貓的人的衣服上，然后在公共場所中脫落。因此，貓過敏原是房屋粉塵的一種組分，甚至在從未有貓生活過的家中。貓皮屑顆粒的大小是極小的，并且會被深深地吸入肺中。因此，貓皮屑是過敏性哮喘的一種常見病因，并且對貓過敏的貓主人更傾向于發(fā)展諸多哮喘癥狀(8'9)。主要的貓和狗的過敏原可以在毛發(fā)/皮屑提取物和唾液中見到，并且因此被認為是上皮過敏原。已在貓中鑒別出八種不同的過敏原，并且這些過敏原中有許多已被測序并且克隆?；贗UIS網(wǎng)站i，這些過敏原包括Fel d 1，一個14kDa和4kDa的子宮珠蛋白；Feld 2，一個69kDa的白蛋白；Fel d 3，一個IlkDa的胱抑素；Fel d 4，一個22kDa的脂質(zhì)運載蛋白；Fel d 5，一個400kDa的免疫球蛋白A ;Fel d 6，一個800kDa_1000kDa的免疫球蛋白 M ;Fel d 7, 一個 17，5kDa 的馮埃布納腺(von Ebner gland)蛋白；Fel d 8, 一個 24kDa的Latherin樣蛋白。主要的貓過敏原Fel d I已通過蛋白和免疫化學(xué)技術(shù)來廣泛地進行了表征，并且最近被表達為一種重組過敏原。Fel d I代表一種約36kDa的二聚體,它是由兩個17kd的亞基組成(1Q)。草過敏是最常見并且普遍的過敏形式之一，它在某些季節(jié)影響著具有該過敏病史的人。它在晚春和初夏的幾個月內(nèi)在空氣中存在，此可能引起過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎以及哮喘。因坐在草地上或修剪草坪而使皮膚與草直接接觸可能會弓丨起皮膚瘙癢、蕁麻疹以 及特異性皮炎。最有代表性的物種之一是梯牧草(Phleum pratense)，被選為草組的主導(dǎo)品種。已鑒別出這個物種梯牧草的九種不同的過敏原?；谶^敏原網(wǎng)站1，這些過敏原包括Phl p 1，一個27kDa 的擴展蛋白；Phl p 2，一個 10kDa_12kDa 的草組 II/III ;Phl p 4，一個 55kDa 的蛋白；32kDa 的 Phl p 5 ;llkDa 的 Phl p 6 ;Phl p 7, 一個 6kDa 的I丐結(jié)合蛋白；Phl p 11，一個20kDa的Ole e I相關(guān)蛋白；Phl p 12，一個14kDa的肌動蛋白抑制蛋白；以及Phl p 13,—個55kDa的聚半乳糖醒酸酶。蘆華屬(Phragmites)是一種屬于草組的屬。已描述了若干物種，包括蘆華(P. australis)或普通蘆葦(P. communis)。據(jù)報導(dǎo)，普通蘆葦?shù)幕ǚ墼诓煌貐^(qū)是致敏的。授粉發(fā)生在夏秋之間，取決于緯度和海拔。已在蘆華屬中鑒別出具有IgE結(jié)合能力的五種不同的蛋白?；贏llergome網(wǎng)站1，這些過敏原包括30kDa的擴展蛋白；60kDa的屬于第4草組的蛋白；35kDa的核糖核酸酶；14kDa的肌動蛋白抑制蛋白(profilun);以及最后的聚半乳糖醒酸酶。豚草(豚草屬(Ambrosia))是主要生長在中歐的野草。一株植物僅存活一季，但該植物會產(chǎn)生高達上千個花粉粒。日出之后的曖度、濕度以及微風(fēng)會有助于釋放這些花粉粒。直到現(xiàn)在，三個不同的物種已與過敏癥狀有關(guān)(豚草(Amborsia artemisiifolia)(短豚草)、多年生豚草(A-psilostachya)(西方豚草)、以及三裂葉豚草(A. trifida)(巨豚草))。已在短豚草中鑒別出十種不同的過敏原，并且這些過敏原中有許多已被測序并且克隆。在豚草的情況下，根據(jù)過敏原的國際命名法，這些過敏原被稱為Amb a I到Amb a10?；贗UIS網(wǎng)站1，這些過敏原包括Amb a 1，一個38kDa的果膠裂解酶；Amb a 2，一個38kDa的果膠裂解酶；Amb a 3, 一個IlkDa的質(zhì)體藍素(plastocyanine) ；Amb a 4, 一個30kDa的防御素樣蛋白；5kDa的Amb a 5 ；Amb a 6, 一個IOkDa的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白；Amb a 7,一個12kDa的質(zhì)體藍素；Amb a 8, 一個14kDa的肌動蛋白抑制蛋白；Amb a 9, 一個IOkDa的Polcalcin (Polcancin);以及 Amb a 10, 一個 18kDa 的 Polcalcin 樣蛋白。對于多年生膝草，僅已描述了具有未知生物功能的過敏原Amb p 5。也僅已描述了三裂葉豚草中的一種5kDa的過敏原。野草可以根據(jù)其分類的過敏原性提取物而被分成多個同源組。豚草屬被選為這一組植物的主導(dǎo)品種之一。由于這個原因，由這種花粉提取物所獲得的結(jié)果可以被外推到其
他野草i。過敏可以通過多種已知的方法來進行治療，這些方法包括過敏原免疫療法、特異性免疫療法(SIT)、或特異性過敏疫苗接種(SAV)，該特異性過敏疫苗接種是一種用于過敏性失調(diào)的免疫療法形式，其中用劑量逐漸增大的一種過敏原提取物對患者進行疫苗接種，目的在于誘導(dǎo)免疫耐受性。過敏原免疫療法調(diào)節(jié)針對過敏原的免疫反應(yīng)，而不是減輕由一種過敏反應(yīng)所誘發(fā)的癥狀，并且可以減少對藥物的需求，降低癥狀的嚴重程度亦或完全消除超敏。雖然大量證據(jù)表明，除了避開過敏原以外，過敏原免疫療法是僅有的用于在病因上治療由吸入了的過敏原和由膜翅目(Hymenoptera)組的有刺昆蟲所引起的、IgE介導(dǎo)的過敏性失調(diào)的手段，但是用過敏原提取物進行的免疫療法并不典型地用于食物過敏治療。僅有兩項最近的研究已證明，在分別用榛子和桃敏化的個體中，使用舌下免疫療法有適度的臨床療效(3’4)。 在先前的研究中，已嘗試了通過先用極少量的花生對兒童進行喂食，接著使喂食量逐漸變得越來越大，來誘導(dǎo)低劑量耐受性，以建立免疫系統(tǒng)(4’6)。雖然早期的臨床試驗數(shù)據(jù)表明，花生過敏可以使用免疫療法來減輕(7)，但目前不存在確定的可用于預(yù)防或治愈對花生的過敏反應(yīng)的治療，其中僅有的用于特應(yīng)性個體的有效選項是避開包含或沾染有完整花生、花生顆粒以及花生油的食物并且提供可自行注射的腎上腺素的快捷途徑。免疫療法的風(fēng)險之一是注射敏原到敏化的患者體內(nèi)可能會引起嚴重的過敏反應(yīng)或過敏癥。因為首先在20世紀初使用了過敏原免疫療法，所以已作出很多努力來進一步改進它的安全性和療效。一種方法是使用過敏原性已被降低，但維持免疫原性的過敏原疫苗。US 5，770，698和EP0662080披露了一種用于去除物質(zhì)和其他低分子量材料，以便純化過敏原提取物并且增加最終的過敏原/蛋白含量的方法。該方法由以下步驟組成在一定條件下破壞靜電力、疏水力或其他物理力，以致使非過敏原性化合物從過敏原活性蛋白脫粘附。該方法可以由以下步驟組成通過使PH值降低到相應(yīng)過敏原蛋白的pi值以下來進行一種溫和酸處理。降低過敏原性的不同方式之一由以下步驟組成使用醛，主要是使用甲醛和戊二醛對天然過敏原提取物進行改性化學(xué)改性，從而產(chǎn)生類過敏原。這種醛處理會導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物(主要是聚合物)(這些產(chǎn)物已失去了它們的部分過敏原性(即展現(xiàn)出IgE反應(yīng)性B細胞表位的減少))減少過敏性副作用。同時，過敏原的天然免疫原性因T細胞表位沒有發(fā)生變化而被保留下來。這一過敏原改性途徑已經(jīng)由一些過敏原疫苗制造商進行了選擇，以基于這一原理來開發(fā)出可商購的產(chǎn)品?？偟膩碚f，有一種趨向是進一步純化過敏原提取物，從而小心地選擇最重要并且臨床上相關(guān)的過敏原。EP1834649和EP1834648披露了多種用于生產(chǎn)過敏原提取物的方法；然而，這些方法并沒有充分地去除污染性的低分子量蛋白。對于通過優(yōu)化過敏原純化方法以確保消除污染性的低分子量蛋白、刺激物以及毒性組分來進一步改進用于過敏性失調(diào)的免疫療法中的藥物的安全性和療效存在需要
發(fā)明內(nèi)容
諸位發(fā)明人已開發(fā)了在聚合之前進行的一個中間步驟，來進一步改進聚合過程并且在使用戊二醛進行處理之前降低某些提取物(例如螨、花粉(包括草、野草以及樹木)、上皮過敏原以及食物過敏原)的過敏原性。本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于制備包括過敏原的提取物的方法，以及用于治療過敏的多種藥物組合物和疫苗。另一個目的是提供一種最佳有效的過敏原提取物，該過敏原提取物具有降低的IgE結(jié)合能力，但保留了它的免疫原性能力。根據(jù)本發(fā)明的一個第一方面，提供了一種用于生產(chǎn)過敏原提取物的方法，包括a)使包括過敏原的一種源材料與一種液體提取劑接觸，以產(chǎn)生一種混合物,該混合物含有溶解在液相中的多種脂質(zhì)和由包括多種過敏原和蛋白的源材料殘余物組成的一種固相。b)使該混合物經(jīng)歷一個第一分離步驟，以分離該源材料殘余物，c)使該源材料殘余物與一種過敏原提取劑接觸，以產(chǎn)生溶解在液相中的多種過敏原與由非過敏原性殘余物組成的一種固相的一種混合物。d)使該混合物經(jīng)歷一個第二分離步驟，以分離溶解在液相中的這些過敏原，從而產(chǎn)生一種粗過敏原提取物，e)使該粗過敏原提取物經(jīng)歷一個去除低分子量部分的步驟，以去除具有小于
3.5kDa的分子大小的多種分子，并且f)進行步驟e)，直至該過敏原提取物在3°C _5°C下的導(dǎo)電率低于1000 S/cm為止，從而獲得一種純化的天然過敏原提取物。一個進一步處理步驟可以包括g)酸化該天然過敏原提取物，去除具有小于3. 5kDa的分子大小的多種分子，并且中和PH值，從而產(chǎn)生一種脫色的過敏原提取物。該方法可以進一步包括一個聚合步驟，該聚合步驟包括h)使一種天然過敏原提取物或一種脫色的過敏原提取物與一種醛接觸，并且i)去除具有小于IOOkDa的分子大小的多種分子。根據(jù)本發(fā)明的一個第二方面，提供了一種過敏原提取物，該過敏原提取物根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法是可獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一個第三方面，提供了一種純化的過敏原提取物，該過敏原提取物在治療過敏中用作一種活性治療性物質(zhì)。“過敏原”可以被定義為一種能夠誘導(dǎo)IgE反應(yīng)和/或I型過敏反應(yīng)的分子。在此提及的術(shù)語“脫色的”可以被定義為一種半純化的過敏原提取物，該過敏原提取物是從一種天然提取物中通過去除它可能包含的多種無關(guān)物質(zhì)(包括吸附的多種色素)而獲得的。
具體實施例方式本發(fā)明的過敏原提取物可以來源于包括已知在個體中引起一種IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的多種天然過敏原的任何源材料。這些過敏原可以包括食物過敏原(例如花生)、通過空氣傳播的過敏原(例如來自草、樹木、草本植物以及野草的花粉，塵螨，真菌以及霉菌)、昆蟲過敏原(例如蟑螂、蚤、蜜蜂以及胡蜂毒液)以及上皮過敏原(動物毛發(fā)、動物皮屑，例如貓和狗的皮屑)。來自樹木、草以及野草的花粉過敏原源自于以下分類學(xué)目類組殼斗目(Fagales)(例如棺木屬(Alnus)和樺木屬(Betula))、唇形目(Lamiales)(例如木犀欖屬(Olea)和車前草屬(Plantago))、禾本目(Poales)(例如梯牧草(Phleum pratense))、菊目(Asterales)(例如豚草屬(Ambrosia)和蒿屬(Artemisia))、石竹目(Cayophyllales)(例如藜屬(Chenopodium)和豬毛菜屬(Salsola))、薔薇目(Rosales)(例如墻草屬(Parietaria))、睡蓮目(Proteales)(例如懸鈴木屬(Platanus))等。塵螨屬于無氣門亞目(Astigmata)組(例如表皮螨屬(Dermatophagoides)和嗜霉螨屬(Euroglyphus))。通過空氣傳播的過敏原源自于屬于格孢腔目(Pleosporales)(例如交鏈孢霉屬(Alternaria))、煤食目(Capnodiales)(例如分支孢子菌屬(Cladosporium))等的霉菌和真菌。根據(jù)本發(fā)明的源材料可以是任何過敏原，包括食物過敏原、花生、完整花生、通過空氣傳播的過敏原(例如花粉(樹木的花粉、野草的花粉、草的花粉、谷類植物的花粉)、塵 螨、真菌、霉菌)、螨、草、樹木以及野草過敏原、上皮過敏原(動物毛發(fā)、動物皮屑，例如貓的毛發(fā)和皮屑以及狗的毛發(fā)和皮屑)以及昆蟲過敏原(例如蟑螂、蚤、蜜蜂以及胡蜂毒液)。一種優(yōu)選的食物過敏原是花生。更優(yōu)選的是，該花生過敏原是落花生。通過空氣傳播的過敏原可以選自以下各項/或選自以下各項的組樹木的花粉(歐洲棺木(Alnus glutinosa)、白樣(Betula alba)、歐洲棒(Corylus avellana)、綠干柏(Cupressus arizonica)、齊墩果(Olea europea)、懸鈴木屬(Platanus sp))、草的花粉(狗牙根(Cynodon dactylon)、鴨茅(Dactylis glomerata)、草地羊茅(Festuca elatior)、絨毛草(Holcus Ianatus)、多年生黑麥草(Lolium perenne)、梯牧草(Phleum pratense)、普通蘆華(Phragmites communis)、草地早熟禾(Poa pratensis))、野草的花粉(美洲艾(Ambrosia elatior)、北艾(Artemisia vulgaris)、藜(Chenopodium album)、歐蓍草(Parietaria judaica)、長葉車前(Plantago lanceolata)、鉀豬毛菜(Salsola kali))以及谷類植物的花粉(燕麥(Avena sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、黑麥(Secalecereal)、普通小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays))、塵螨(粗腳粉螨(Acarussiro)、熱帶無爪螨(Blomia tropicalis)、粉塵螨(Dermatophagoides farinae)、微角塵螨(Dermatophagoides microceras)、屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)、害鱗嗜螨(lepidoglyphus destructor)、腐食酪螨(Tyrophagasputrescentiae))、真菌以及霉菌(交鏈格抱菌(Alternaria alternate)、臘葉芽枝霉(Cladosporium herbarum)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus))。上皮過敏原可以選自任何動物，包括貓的毛發(fā)和皮屑、狗的毛發(fā)和皮屑、馬的毛發(fā)和皮屑、人的毛發(fā)和皮屑、兔的毛發(fā)和皮屑、以及羽毛。昆蟲過敏原可以選自螞蟻、蚤、螨(粗腳粉螨、熱帶無爪螨、粉塵螨、微角塵螨、屋塵螨、梅氏嗜霉螨、害鱗嗜螨、腐食酪螨)、蟑螂、胡蜂毒液以及蜜蜂毒液。優(yōu)選地，該源材料是選自食物過敏原(落花生)、花粉(歐洲榿木、白樺、歐洲榛、綠干柏、齊墩果、懸鈴木屬、狗牙根、鴨茅、草地羊茅、絨毛草、多年生黑麥草、梯牧草、普通蘆華、草地早熟禾、美洲艾、北艾、藜、歐蓍草、長葉車前、鉀豬毛菜、燕麥、大麥、黑麥、普通小麥、玉米)、塵螨(粗腳粉螨、熱帶無爪螨、粉塵螨、微角塵螨、屋塵螨、梅氏嗜霉螨、害鱗嗜螨、腐食酪螨)、真菌和霉菌(交鏈格孢菌、蠟葉芽枝霉、煙曲霉)、上皮過敏原(貓的毛發(fā)和皮屑、狗的毛發(fā)和皮屑、馬的毛發(fā)和皮屑、人的毛發(fā)和皮屑、兔的毛發(fā)和皮屑、以及羽毛)、昆蟲過敏原(螞蟻、蚤、螨、蟑螂、胡蜂毒液以及蜜蜂毒液)。更優(yōu)選的是，該源材料是選自花生(落花生)、花粉(齊墩果、歐蓍草、普通蘆葦以及梯牧草)、螨(屋塵螨)以及上皮(貓的皮屑)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，該源材料是選自落花生、齊墩果、歐蓍草、梯牧草、屋塵螨、普通蘆葦、歐蓍草以及貓的皮屑。在本發(fā)明的一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該源材料是選自落花生、梯牧草、普通蘆葦、歐蓍草以及貓的皮屑。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實施方案中，該過敏原是落花生。當(dāng)該源材料是花生時，優(yōu)選地去除它的外皮，或者可以碾碎該材料或使它變成粉末。這些花生可以是被烘烤、烘焙、油炸過的或者是生的?？梢詫υ撛床牧线M行處理以造成一個與液體提取劑進行接觸的最大的表面積?？梢詫υ撛床牧线M行均質(zhì)化、摻混、碾碎或者使它變成粉末以產(chǎn)生一種用于液體提取的均質(zhì)漿料。該液體提取步驟是一個脫脂”步驟，以去除來自源材料的親脂性化合物，例如脂質(zhì)和脂肪酸。該液體提取劑可以是丙酮，它可以是冷的。該液體提取步驟可能以I : 1(源材料的重量/液體提取劑的重量)的比率，或在該液體提取劑重量超過該源材料重量的情況下的任何比率(例如I : 2、1 3、1 5、1 10)來進行。該液體提取步驟優(yōu)選地以Ikg源材料對應(yīng)2L液體提取劑的比率進行。優(yōu)選地，進行該液體提取步驟持續(xù)足夠的時間，以使該源材料中的脂質(zhì)溶解于該液體提取劑中，該步驟可以持續(xù)超過I分鐘，優(yōu)選地超過5min，更優(yōu)選地超過30分鐘，以及最優(yōu)選地持續(xù)I小時或更長。該液體提取步驟可以在20°C -25°C下進行，但優(yōu)選地在2V _6°C的冷的情況下進行，并且最優(yōu)選地在3°C _5°C之間進行。在該液體提取步驟期間，優(yōu)選地將該源材料與該液體提取劑一起攪拌或攪動。該第一分離步驟可以是過濾。在第一分離步驟之后，可以用該液體提取劑洗滌源材料殘余物。任選地，可以用該液體提取劑進一步提取該源材料殘余物，然后分離。優(yōu)選地，另外進行一次、兩次或更多次液體提取步驟。優(yōu)選地，對源材料殘余物持續(xù)進行液體提取，直到至該液體提取劑在與該源材料殘余物接觸后仍保持透明。在液體提取之后，可以干燥源材料殘余物?？梢栽?°C _25°C下干燥源材料殘余物，并且優(yōu)選地在室溫下進行干燥。優(yōu)選地，持續(xù)進行該干燥步驟，持續(xù)足夠的時間以允許從源材料殘余物中去除液體提取劑，該步驟可以持續(xù)1-24小時、6-18小時、10-14小時并且優(yōu)選地持續(xù)約12小時。通過使用一種過敏原提取劑進行提取，以產(chǎn)生一種粗過敏原提取物，過敏原可以得自“脫脂的”源材料殘余物，，該粗過敏原提取物包括溶解在液相中的過敏原和由“不要的”非過敏原性殘余物組成的固相。該過敏原提取劑可以是水溶液，并且優(yōu)選地包括一種緩沖劑。該過敏原提取劑可以包括PBS和/或NaCl，例如0. OlM PBS/0. 15M NaCl的溶液?？梢园慈魏伪嚷剩谠撨^敏原提取劑中提取源材料殘余物，其中該過敏原提取劑重量超過該源材料殘余物重量，例如I : 2、1 3、1 5、1 IOU 20,1 50。優(yōu)選地，以I : 10源材料殘余物過敏原提取劑(Wt/wt)的比率，在該過敏原提取劑中提取源材料殘余物。雖然在該提取步驟中，源材料殘余物與過敏原提取劑的比率可以變化，但應(yīng)使得源材料殘余物中的過敏原能夠溶解在過敏原提取劑中。優(yōu)選地，用過敏原提取劑對源材料殘余物進行提取，持續(xù)足夠的時間，以使得源材料殘余物中的過敏原溶解在過敏原提取劑中，該步驟可以持續(xù)30分鐘至12小時，優(yōu)選地持續(xù)1-6小時，更優(yōu)選地持續(xù)2-5小時，并且最優(yōu)選地持續(xù)約4小時。該過敏原提取步驟可以在20°C -25°C下進行，但優(yōu)選地在2°C _6°C的冷的情況下進行，并且最優(yōu)選地在3°C _5°C下進行。在該過敏原提取步驟期間，優(yōu)選地將該源材料殘余物與該過敏原提取劑一起攪拌或攪動。在該過敏原提取步驟之后，可以將溶解在液相中的過敏原與非過敏原性殘余物分離，以產(chǎn)生一種粗過敏原提取物。該分離步驟優(yōu)選地是離心，雖然用于從液體分離固體的很多技術(shù)是可適用的，這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。優(yōu)選地，在2°C _6°C下，并且優(yōu)選地，在:TC _5°C下對溶解在液相中的過敏原進行離心，持續(xù)足夠的時間，以使非過敏原性殘余物沉降為團塊，例如持續(xù)I分鐘至I小時，或超過I小時?？梢詫⒋诌^敏原提取物(即包含溶解了的過敏原的上清液)儲存在2°C-6°C下?？梢杂迷撨^敏原提取劑，使用與第一過 敏原提取步驟相同的條件，進一步提取非過敏原性殘余物團塊，并且優(yōu)選地持續(xù)更長的提取時段，例如4-8小時、8-12小時、或超過12小時。在該第二過敏原提取步驟之后，可以從非過敏原性殘余物分離溶解在液相中的過敏原，以產(chǎn)生一種粗過敏原提取物。優(yōu)選地，合并來自第一和第二過敏原提取步驟的粗過敏原提取物用于進一步處理?？梢赃^濾該粗過敏原提取物，例如使用0. 45 y m孔徑?？梢允乖摯诌^敏原提取物經(jīng)歷一個低分子量部分去除步驟，從而去除具有低分子大小的分子，例如鹽和其他非過敏原性化合物。本申請人已經(jīng)以實驗方式測定出花生提取物的蛋白和過敏原組合物是SkDa與150kDa之間，并且這些過敏原需要在分子部分去除步驟期間被保留下來。例如，花生脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(LTP)——一種重要的過敏原，是SkDa并且它需要在去除低分子量部分的步驟期間被保留下來。在步驟e)中，具有小于8kDa、或7kDa、或6kDa、或5kDa、4kDa或3. 5kDa的分子大小的分子可以被去除。優(yōu)選地，持續(xù)進行該低分子量部分去除步驟，直至過敏原提取物在3°C _5°C下的導(dǎo)電率小于900 u S/cm,或小于800 u S/cm,或小于700 u S/cm,或小于600y S/cm，或更優(yōu)選地小于500 y S/cm。優(yōu)選地，持續(xù)進行該低分子量部分去除步驟，直至過敏原提取物在3 V -5 °C下的導(dǎo)電率在200至1000 ii S/cm至，或在300至900 u S/cm之間，并且最優(yōu)選地在400至800 u S/cm之間?？梢赃^濾生成的純化的天然過敏原提取物，例如使用0. 45 ii m和/或0. 22 ii m孔徑。該天然過敏原提取物可以被用于制備一種用于標(biāo)準化、診斷、合成以及疫苗接種目標(biāo)的藥物組合物或疫苗。該方法可以另外包括進一步處理步驟，其中使用破壞負責(zé)粘附非過敏原性化合物到蛋白的靜電力、疏水力或其他物理力的手段，來去除粘附到過敏原蛋白的非過敏原性化合物。用于破壞靜電力、疏水力或其他物理力的手段可以選自化學(xué)手段的下組，該組由以下各項組成酸性和堿性材料(包括陰離子和陽離子交換材料)、鹽類以及電流?？梢允褂盟嵝院蛪A性化學(xué)手段，用量會使得超過這些蛋白的等電點。生成自該進一步處理步驟的過敏原提取物在下文中被稱為脫色的過敏原提取物。
該進一步處理步驟可以包括g)酸化該天然過敏原提取物，去除具有小于3. 5kDa的分子大小的分子，并且中和PH值，從而產(chǎn)生一種脫色的過敏原提取物。該進一步處理步驟優(yōu)選地包括溫和酸處理。在該溫和酸處理中，可以降低這些過敏原蛋白的pH值至小于pH 3，例如2.0至2. 5之間的pH值。這些過敏原蛋白的pH值可以在2. 0至6. 0之間。本申請人已經(jīng)以實驗方式鑒別出，用于使粘附到過敏原蛋白的非過敏原性化合物脫粘附的最佳PH值是在pH 2. 0至2. I之間。pH值低于2. 0會導(dǎo)致脫色的過敏原提取物的蛋白曲線(protein profile)不完全,而不夠低的pH值,例如高于3. 0,導(dǎo)致在生成的脫色的過敏原提取物中的非過敏原性化合物的不完全消除?？梢允褂煤线m的酸，例如HCl，來降低該天然過敏原提取物的pH值。酸化的提取物 可以被維持在低PH值下1-60分鐘，優(yōu)選地5-30分鐘，更優(yōu)選地10-20分鐘，并且最優(yōu)選地持續(xù)約15分鐘。具有小于3. 5kDa的分子大小的分子可以在低分子量部分去除步驟中被去除。在該進一步處理步驟之后，可以收集生成的脫色的提取物，并且可以使用合適的堿，例如NaOH，來中和過敏原提取物的pH值?？梢詫H值調(diào)節(jié)到能夠避免蛋白沉淀的值，例如高于PH 7. 0，優(yōu)選地在pH 7. 0至8. 0之間，更優(yōu)選地在pH 7. 0至7. 5之間，并且最優(yōu)選地在pH 7. 3至7. 4之間。該進一步處理步驟可以包括g)酸化該天然過敏原提取物至pH 2-2. 1，并且將該酸化的提取物維持5-30分鐘，接著使該提取物經(jīng)歷一個低分子量部分去除步驟，以去除具有小于3. 5kDa的分子大小的分子，并且調(diào)節(jié)PH值至7. 3-7. 4，從而產(chǎn)生一種脫色的過敏原提取物。該進一步處理步驟可以包括酸化該天然過敏原提取物到pH 2. 0至4. O。用于破壞靜電力的手段可以包括電泳形式的電流。非過敏原性化合物可能具有小于8，000Da、5，OOODa并且優(yōu)選地小于3，500的分子量，并且可以包括類黃酮和/或其糖苷。該低分子量部分去除步驟可以是一個透析步驟，其中針對一種透析液(如純水或一種緩沖液)，透析該提取物。該低分子量部分去除步驟可以在20°C _25°C下進行，但優(yōu)選地在2°C -6°C的冷的情況下進行，并且最優(yōu)選地在3°C _5°C下進行。該低分子量部分去除步驟可以進行12-24小時，其中定期更換溶劑，或在透析的情況下，定期更換透析液，從而維持反應(yīng)?？梢赃^濾生成的脫色的過敏原提取物，例如使用0. 45 ii m和/或0. 22 ii m孔徑，并且可以冷凍或冷凍干燥用于儲存?？梢詫κ褂帽景l(fā)明方法所產(chǎn)生的任一種提取物進行進一步處理。該方法可以另外包括一個聚合步驟，包括h)使一種天然過敏原提取物或一種脫色的過敏原提取物與一種醛接觸，并且i)去除具有小于IOOkDa的分子大小的分子。該醛可以是任何合適的醛，例如戊二醛或甲醛。該聚合步驟可以包括h)使一種天然過敏原提取物或一種脫色的過敏原提取物與戊二醛或甲醛接觸，i)使該提取物經(jīng)歷一個分子部分去除步驟，以去除具有小于IOOkDa的分子大小的分子，并且j)進行步驟i)，直至該過敏原提取物具有3°C _5°C下低于210 u S/cm的導(dǎo)電率和/或不具有戊二醛，以獲得一種聚合過敏原提取物或一種脫色的聚合過敏原提取物。在冷凍干燥用于聚合的提取物的情況下，可以使它在緩沖液(例如0. 01MPBS/0. 15M NaCl)中復(fù)原至 0. l_500mg/ml，優(yōu)選地 l-100mg/ml,并且最優(yōu)選地10-50mg/ml的最終濃度。優(yōu)選地進行該聚合反應(yīng)至完成，以使得在聚合提取物中，< IOOkDa(例如14-25kDa)的蛋白條帶不是通過非還原性SDS-PAGE可檢測的。本申請人已經(jīng)以實驗方式測定出(參見表2)，兩種參數(shù)影響用于聚合的最佳條件。首先，戊二醛的最終濃度是重要的，由此增加戊二醛的濃度降低聚合物產(chǎn)率并且增加在透析之前通過離心獲得的殘余物產(chǎn)率。與采用約5mg/ml的戊二醛濃度(即每ml 過敏原提取物0. 009ml戊二醛)的先前已知的聚合條件對比，通過實驗方式被測定最佳戊二醛濃度為已知量的約兩倍，即10mg/ml (每ml過敏原提取物0. 02ml戊二醛)。可以添加l-20mg/ml范圍內(nèi)的醛。同時采用先前已知量的最終濃度的戊二醛會導(dǎo)致過敏原的某種程度的聚合，優(yōu)選的是，添加該醛至10mg/ml的最終濃度，或以每ml提取物0. 02ml戊二醛的比率添加該醛，從而實現(xiàn)最佳聚合。其次，本申請人已測定出降低戊二醛的添加速率降低聚合物產(chǎn)率并且增加殘余物產(chǎn)率?？梢园春愣ㄋ俣?，例如每分鐘0. 001-0. 5ml (1-500 u 1/min,60-3000 yl/小時)，添加該醛至提取物。聚合反應(yīng)可以在室溫下維持l_12h，優(yōu)選地7小時?？梢园?0mg每ml聚合的提取物溶液的比例使用甘氨酸，以停止該聚合反應(yīng)。停止的反應(yīng)可以在:TC -5°C下，優(yōu)選地在攪拌下維持過夜?？梢詮牟蝗苄詺堄辔锓蛛x液相中的聚合過敏原,從而產(chǎn)生一種聚合過敏原提取物或一種經(jīng)過脫色的聚合過敏原提取物。該分離步驟優(yōu)選地是離心，雖然很多分離技術(shù)是可適用的，這些為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。優(yōu)選地在2V _6°C之間，并且優(yōu)選地在3°C _5°C之間，離心提取物持續(xù)足夠的時間，以沉降不溶性殘余物為團塊，例如持續(xù)I分鐘至I小時，或超過I小時?？梢允占锨逡?包含可溶性過敏原)，并且使其經(jīng)歷分子部分去除步驟(i)。在步驟i)中，可以去除具有小于150kDa的分子大小的分子。已發(fā)現(xiàn)具有高于3MDa的分子量的分子沉淀，而這些分子也可以在聚合步驟期間被去除。優(yōu)選地，該分子部分去除步驟是一個透析步驟，其中在:TC _5°C下，針對一種透析液(例如純水或一種緩沖液)透析提取物?？梢猿掷m(xù)進行該分子部分去除步驟，直至在3°C _5°C下所測量到的導(dǎo)電率小于200ii S/cm，更優(yōu)選地小于175 y S/cm，更優(yōu)選地小于150 u S/cm,更優(yōu)選地小于125 u S/cm,更優(yōu)選地小于100 u S/cm,更優(yōu)選地在50至200 u S/cm之間，并且最優(yōu)選地在100至150iiS/cm之間?？梢赃^濾生成的過敏原提取物，例如使用0. 45 ii m和/或0. 22 U m孔徑，并且可以冷凍或冷凍干燥以進行儲存。任何低分子量部分去除步驟C)、e)、或g)可以包括超濾步驟、透濾步驟、透析步驟、或過濾。在本發(fā)明方法的最簡單的形式中，可以包括制備一種天然可溶性過敏原提取物，任選地例如經(jīng)由溫和酸處理來進一步處理該提取物，以去除具有低分子大小的非過敏原性化合物，并且使用一種醛聚合該提取物。該天然可溶性過敏原提取物可能是花生、花粉、草、上皮、霉菌、真菌、昆蟲或螨過敏原。本發(fā)明的方法會產(chǎn)生一種展現(xiàn)出已降低了的IgE結(jié)合能力，但保留了免疫原性能力的過敏原提取物。本發(fā)明進一步包括一種過敏癥的治療和一種過敏癥的診斷性藥物，這兩者均包括通過本發(fā)明方法所產(chǎn)生的過敏原提取物作為活性成分。過敏癥可能與暴露于在此討論的會引發(fā)IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的不同過敏原有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種過敏原提取物，該過敏原提取物是根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法可獲得的。提供了一種用作活性治療性物質(zhì)的純化的過敏原提取物。提供了一種天然過敏原提取物、一種聚合天然過敏原提取物、一種脫色的過敏原提取物、一種脫色的并且聚合過敏原提取物，以上各項根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法都是可獲得的。優(yōu)選地，該提取物是一種聚合天然過敏原提取物，并且更優(yōu)選地，是一種脫色的聚合過敏原 提取物。
該過敏原提取物可以選自花生(落花生)、花粉(齊墩果、歐蓍草、普通蘆葦、歐蓍草以及梯牧草)、螨(屋塵螨)、以及上皮(貓的皮屑)。該過敏原提取物可以用于治療過敏癥。在一個優(yōu)選的實施方案中，過敏原提取物落花生可以用于治療花生過敏癥。該脫色的聚合過敏原提取物可以特征在于以下物理化學(xué)和生物學(xué)特性i.可溶于水中，ii.不存在分子量低于IOOkDa的未聚合過敏原/蛋白(通過在非還原性條件下的SDS-PAGE鑒別為條帶)iii.不存在分子量低于IOOkDa的IgE識別條帶(通過非還原性條件下的免疫印跡法鑒別)iv.不存在分子量低于IOOkDa的聚合分子(通過尺寸排阻色譜法與HPLC —起測定)。V.相對于天然提取物，游離氨基減少了 75% (通過熒光胺法測定)。vi.相對于天然過敏原提取物，生物學(xué)效能降低(95% )(通過使用來自敏個體的特定血清池進行IgE ELISA抑制實驗測定)，以及vii.在小鼠中不存在異常毒性。本發(fā)明的過敏原提取物可以用作一種用于治療過敏性個體的藥物中的一種活性組分，目的在于誘導(dǎo)對某些過敏原的耐受性。提供了根據(jù)本發(fā)明的過敏原提取物在對免疫失調(diào)的診斷中的用途，優(yōu)選地用于檢測過敏性疾病。提供了根據(jù)本發(fā)明的過敏原提取物的用途，用于治療過敏癥或用于制造一種用于治療過敏癥的藥物。該用途可以是用于免疫療法。該用途可以是用于標(biāo)準化、診斷、合成以及疫苗接種的目的。該用途可以在患者的治療性治療中，優(yōu)選地在免疫療法中。該用途可以在免疫療法期間監(jiān)控患者。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種藥物組合物，包含根據(jù)本發(fā)明的過敏原提取物。提供了一種用于治療過敏癥的藥物組合物，它包括作為活性成分的一種藥學(xué)有效量的根據(jù)本發(fā)明的過敏原提取物，和至少一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。提供了一種用于過敏癥的診斷性組合物，它包括作為活性成分的一種診斷有效量的根據(jù)本發(fā)明的過敏原提取物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種疫苗，該疫苗包括根據(jù)本發(fā)明的過敏原提取物。該藥物組合物和疫苗可以進一步包括一種或多種佐劑、稀釋劑、防腐劑或其混合物。該藥物組合物或疫苗可以包括一種生理學(xué)上可接受的載體。如在此使用，短語“藥學(xué)上可接受的”優(yōu)選地是由政府管理機構(gòu)批準，或列于歐洲或美國藥典或另一種用于人類的公認藥典中。這類藥學(xué)上可接受的載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油，動物、植物或合成源性油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油以及類似物中的那些。還可以使用生理鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液作為液體載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括甘露醇、人血清白蛋白(HSA)、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、碳酸鎂、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇以及類似物。 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種用于生產(chǎn)過敏原疫苗的方法，包括配制根據(jù)本發(fā)明的過敏原提取物與一種或多種佐劑、稀釋劑、防腐劑或其混合物。提供了一種根據(jù)本發(fā)明的另一個方面的方法可獲得的疫苗。該疫苗可以用于皮下或舌下使用。提供了根據(jù)本發(fā)明的疫苗在治療過敏癥中，或在制造一種用于治療過敏癥的藥物中的用途或用于。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種預(yù)防過敏原致敏的方法，包括以下步驟使個體暴露于有效量的本發(fā)明的過敏原提取物、藥物組合物或疫苗。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種治療敏化個體的過敏癥的方法，包括給予該個體有效量的本發(fā)明的過敏原提取物、藥物組合物或疫苗。該過敏原提取物、該藥物組合物或該疫苗可以皮下或舌下給予，并且可以按遞增或恒定的劑量給予。該個體可以是人或動物，優(yōu)選地是人。


圖I :概述了用于生產(chǎn)過敏原提取物的方法。圖2 :天然花生過敏原提取物的HPLC分析=BioRad低范圍標(biāo)準品(泳道I)、天然提取物(泳道2)、沉淀物(泳道3)、部分部分20 (泳道4)、部分部分21 (泳道5)、部分部分40 (泳道6)、部分部分78 (泳道7)、部分部分96 (泳道8)、部分111 (泳道 9);圖3 :脫色的聚合花生過敏原提取物的HPLC分析；圖4 :脫色的聚合花生過敏原提取物殘余物的HPLC分析=BioRad低范圍標(biāo)準品(泳道I)、脫色的聚合提取物殘余物(泳道2)、沉淀物(泳道3)、部分21 (泳道4)、部分51 (泳道5)、部分74 (泳道6)、部分75 (泳道7)、部分120 (泳道8)；圖5 :40 ii g花生過敏原提取物的SDS PAGE分析STD (Bio-Rad低范圍標(biāo)準品)、泳道1-4 (在還原性條件下)、泳道5-8 (在非還原性條件下)、花生230209/LN天然提取物(泳道I)、花生230209/LD脫色的提取物(泳道2)、花生030309/LP脫色/聚合的提取物(泳道3)、花生030309/LP脫色/聚合了的殘余物(泳道4)、花生230209/LN天然提取物(泳道5)、花生230209/LD脫色的提取物(泳道6)、花生030309/LP脫色/聚合了的提取物(泳道7)、以及花生030309/LP脫色/聚合的殘余物(泳道8)；圖6 :40 ii g花生過敏原提取物的IEF分析；標(biāo)準Bio-Rad IEF標(biāo)記(pi
4.45-9. 6 (泳道I和2))、花生230209/LN天然提取物(泳道3)、花生230209/LD脫色的提取物(泳道4)、花生030309/LP脫色/聚合的提取物(泳道5)、花生030309/LP脫色/聚合了的殘余物(泳道6)；圖7 :在還原性條件(圖7a)和非還原性條件(圖7b)下使用花生過敏性供體的血清池(1/20稀釋)和a -IgE-PO (120705,1/500稀釋)對40 y g花生過敏原提取物進行的免疫印跡分析，其中在各圖中花生230209/LN天然提取物(泳道I)、花生230209/LD脫色的提取物(泳道2)、花生030309/LP脫色/聚合的提取物(泳道3)、花生030309/LP脫色/聚合的殘余物(泳道4)；
圖8 :在還原性條件下使用花生過敏性供體的血清池(1/20稀釋)和a -IgE-PO(120705,1/500稀釋)對花生過敏原提取物進行的免疫印跡抑制分析，其中泳道I是對照(僅血清)，并且泳道2-4使用成池的血清與800 y g脫色/聚合的花生過敏原提取物、400 u g提取物(泳道3)以及200 ii g提取物(泳道4) 一起；圖9 :花生過敏原提取物的基于ELISA的IgE抑制作用分析；本發(fā)明通過以下實例來說明，這些實例詳述了包括過敏原的提取物的制備、純化、進一步處理以及聚合的方法。方法A-D詳述了用于制造過敏原提取物的方法，而實例1-8描述了脫色的聚合過敏原提取物或脫色的過敏原提取物的實驗性表征。方法A.原始過敏原材料的脫脂方法通過不同方法獲得了脫脂提取物，取決于原料的性質(zhì)。各實例中定義了用于各過敏原的方法?？傮w而言，在:TC -5°c下在丙酮中將已均質(zhì)化的材料脫脂，并且過濾。重復(fù)這一步驟直至丙酮是透明的?；厥彰撝牟牧喜⑶以谑覝叵赂稍镏敝烈讶コ斜?。B.天然過敏原提取物的制備稱重干燥的脫脂材料，并且在3°C _5°C下，在磁性攪拌下，在0. 01MPBS/0. 15MNaCl中按I : 10比例提取4小時。然后，在4°C下以10. OOOr. p. m.離心溶液30分鐘。收集生成的上清液并且儲存在3°C_5°C下，并且在0.01M/NaC10. 15M(1 10)中復(fù)原團塊，并且在3°C -5°C下，在磁性攪拌下提取過夜。在3°C _5°C下，以10. OOOr. p. m離心溶液30分鐘，并且收集上清液，并且與先前獲得的部分混合。使用0. 45 y m孔徑過濾結(jié)合的提取物，并且在3kDa截留透析膜中充分透析直至導(dǎo)電率低于1000 u S/cm。然后使用0. 22 y m孔徑無菌過濾提取物。C.脫色的過敏原提取物的制備使用以下程序?qū)μ幱谒芤褐胁⑶揖S持在3°C _5°C下的天然提取物進行進一步處理。在磁性攪拌下，通過添加0. IM HCl將該溶液的pH值調(diào)節(jié)到2-2. 1，并且在這些條件下維持15分鐘。然后，在:TC _5°C下，在3. 5kDa截留透析膜中，用純水(相對于10體積純水)透析提取物17小時。在這一期間將純水更換4次。在溫和酸處理后，收集提取物并且使用0. IM NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 3-7. 4。最后，無菌過濾提取物直至0. 22 u m,冷凍并且冷凍干燥。D.聚合的脫色的過敏原提取物的制備在磁性攪拌下，將冷凍干燥的脫色的提取物在0. OlM PBS/0. 15M NaCl中復(fù)原至15mg/ml的最終濃度，直至完全稀釋。聚合方法由以下步驟組成使用0. 02ml戊二醛每毫升脫色的提取物來添加戊二醛。使用自動注射器以恒定速度(36毫升/小時)添加戊二醛至脫色的提取物中。在室溫下維持聚合反應(yīng)7小時。以40mg甘氨酸每ml溶液的比例添加甘氨酸來停止反應(yīng)。在:TC -5°C下，在連續(xù)磁性攪拌下維持反應(yīng)過夜。然后，在:TC -5°C下，以10. OOOr. p. m離心溶液30分鐘。去除團塊，并且收集上清液并且在冷卻條件下，在IOOkDa截留透析膜中用純水(16. 67ml水每毫升提取物)充分透析。當(dāng)導(dǎo)電率低于210 y S/cm并且通過UV/可見光掃描確認不存在戊二醛時，認為該方法完成。最后，使用0. 22 y m孔徑無菌過濾提取物，冷凍并且冷凍干燥。最終產(chǎn)物由冷凍干燥了的脫色的聚合提取物組成，將該最終產(chǎn)物在冷凍干燥條件下儲存在4°C下。免瘡學(xué)表征蛋白含暈遵循制造商的說明書，通過Lowry Biuret法(Lowry Biuret method)來測量天然提取物、脫色的提取物、脫色/聚合的提取物以及脫色/聚合的殘余物的蛋白含量。表I中示出了實例I的一批實驗的結(jié)果。尺寸排阻色譜法(HPLC)將凍干了的提取物樣品在高純水中再懸浮，達到lmg/ml的最終濃度，并且攪拌10-15分鐘。以13000r. p. m.將離心樣品10分鐘，并且轉(zhuǎn)移上清液到用于自動注入的小瓶中。用于HPLC分析的色譜柱是先前用水平衡了的PL-水凝膠-OH 608 Um(PolymerLabs)，其中分級分離是基于大小的差異。以lml/min的流速運行樣品(遵循制造商的建議)。檢測254nm和280nm下的UV信號以獲得色譜圖。圖2-4示出了 HPLC分析的結(jié)果。十二烷基硫酸鈉聚丙烯釀胺凝膠電泳使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析來測定提取物的蛋白/抗原曲線。使樣品在具有2. 67% CU5% T丙烯酰胺的SDS-PAGE凝膠中，在天然或變性(緩沖溶液包含￠-巰基乙醇并且在95°C下加熱10分鐘)的條件下跑膠。將各提取物的四十微克凍干了的材料加載在凝膠上。使具有已知分子量的參照標(biāo)記(美國加利福尼亞州赫告斯市的伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA))在同一塊凝膠上跑膠。用考馬斯亮藍R_250(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司)對凝膠進行染色。使用掃描儀(Sharp JX-330 ;新澤西州莫瓦市的夏普電子公司(Sharp Electronics Corp, Mahwah,NJ))研究抗原曲線，并且使用Image Master I-D Elite v 4. 00 (瑞典烏普薩拉市的法瑪西亞生物技術(shù)公司(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden))進行分析。圖5不出了考馬斯藍染色的凝膠，其中脫色/聚合的過敏原提取物在非還原性條件下(泳道7)示出不存在分子量低于IOOkDa的未聚合的過敏原/蛋白。等電聚焦
使用等電聚焦(IEF)分析來根據(jù)蛋白的等電點測定提取物的蛋白/抗原曲線。使樣品在聚丙烯酰胺電泳凝膠中，在天然條件下跑膠。將各提取物的四十微克凍干了的材料加載到凝膠上。使具有已知等電點的參照標(biāo)記(美國加利福尼亞州赫告斯市的伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司)，在同一塊凝膠上跑膠。用考馬斯亮藍R_250(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司)對凝膠進行染色，并且使用掃描儀(Sharp JX-330 ;新澤西州莫瓦市的夏普電子公司)研究抗原曲線并且使用Image Master I-D Elite v 4. 00 (瑞典烏普薩拉市的法瑪西亞生物技術(shù)公司)進行分析。圖6的泳道3-6示出了天然提取物(泳道3)、脫色的提取物(泳道4)、脫色/聚合的提取物(泳道5)以及脫色/聚合的殘余物(泳道6)的結(jié)果。免瘡印跡法轉(zhuǎn)移電泳分離的蛋白到P-Immobilon膜(馬薩諸塞州貝德福德市的密理博公司(Millipore，Bedford，MA))上。在轉(zhuǎn)移后，在室溫下干燥這些膜4小時。將這些膜與在
0.OlM磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液(2%吐溫(Tween))中稀釋的血清池一起孵育過夜。使用結(jié)合了過氧化物酶的單克隆抗-人IgE(馬德里的雅雷薩公司(Ingenasa,Madrid))檢測特 異性IgE結(jié)合，持續(xù)2小時。使用Sharp JX-330研究過敏原曲線并且使用Image Master
I-D Elite v 4. 00進行分析。圖7b的泳道1_4示出了在非還原性條件下天然提取物(泳道I)、脫色的提取物(泳道2)、脫色/聚合的提取物(泳道3)以及脫色/聚合的殘余物(泳道4)的結(jié)果。脫色/聚合的過敏原提取物在IOOkDa處沒有展現(xiàn)出IgE識別條帶。在圖8中，使用聚合的花生過敏原提取物的稀釋液與成池的花生過敏性供體的血清相比較來觀察IgE抑制作用。IrE抑制作用借助ELISA抑制法，建立50%抑制點，使用天然提取物作為參照物，來測試多種提取物(天然、脫色以及聚合的提取物)的體外過敏原性活性。用天然提取物(10 yg蛋白/毫升)涂覆塑料微量滴定板(Immulon IV ;弗吉尼亞州尚蒂利市的達耐斯技術(shù)公司(DynexTechnologies,Chantilly,VA))過夜。由天然、脫色以及聚合的提取物制成若干稀釋液。在室溫下，將各稀釋液與血清池一起孵育2小時。然后，轉(zhuǎn)移這些提取物的稀釋液到天然提取物涂覆的板中并且孵育2小時。在洗滌后，添加100 ill的抗人IgE過氧化物酶，并且在室溫下靜置30分鐘。在洗滌后，將這些板顯影30分鐘并且用硫酸(IN)來停止。使用脫色/聚合的過敏原提取物觀察到IgE結(jié)合的最大抑制作用(圖9)。IgG抑制作用借助于ELISA抑制法，建立50%抑制點，使用天然提取物作為參照物來測試多種提取物(天然、脫色以及聚合的提取物)的體外過敏原性活性。用天然提取物(10 yg蛋白/毫升)涂覆塑料微量滴定板(Immulon II ;弗吉尼亞州尚蒂利市的達耐斯技術(shù)公司)過夜。由天然、脫色以及聚合的提取物制成若干稀釋液。在室溫下將各稀釋液與血清池一起孵育2小時。然后，轉(zhuǎn)移這些提取物的稀釋液到天然提取物涂覆的板中并且孵育2小時。在洗滌后，添加100 抗人IgG過氧化物酶并且在室溫下靜置30分鐘。在洗滌后，將這些板顯影30分鐘并且使用硫酸(IN)來停止。熒光胺法在天然提取物、脫色的提取物以及脫色的聚合提取物中檢測游離氨基的測定值。聚合減少游離氨基的數(shù)目，因為過敏原之間的交聯(lián)是由這一反應(yīng)性基團介導(dǎo)的。制備25ii g/ml的天然提取物和脫色的提取物以及IOOOii g/ml的脫色的聚合提取物。使用
2-10mg/ml的6-氨基己酸作為標(biāo)準。添加Evans溶液(Evans solution)到所有樣品中。在這種緩沖液中稀釋氨基。然后，添加硼酸鈉緩沖液(0.2M)到所有樣品中并且均質(zhì)化。最后，添加先前在丙酮中稀釋的熒光胺到混合物中并且在熒光計中用在390nm和480nm發(fā)射來激發(fā)，對溶液進行測量。UV/可見光掃描分光光度測定法在0. OlM PBS中稀釋天然過敏原性提取物、脫色的過敏原性提取物以及經(jīng)過脫色的聚合過敏原性提取物到lmg/ml。在稀釋后,在200nm至600nm之間的\下分析樣品。通討HEP測定的牛物學(xué)效能通過REINA競爭法來測量多種提取物(天然提取物以及脫色的提取物)的生物活性。用抗IgE涂覆塑料微量滴定板。將來自過敏性個體的血清池添加到這些微量培養(yǎng)板中 且孵育30分鐘。先前已稀釋樣品和內(nèi)部參照物(IHR)，并且與過氧化物酶標(biāo)記的IHR —起孵育。然后，洗滌微量培養(yǎng)板，并且添加孵育的樣品到這些微量培養(yǎng)板中，并且孵育30分鐘。最后，充分地洗漆微量培養(yǎng)板，并且與色原體(cromogen) —起孵育。在450nm下讀取這些板。在小鼠體內(nèi)的異常毒性遵循歐洲藥典的建議，用Iml脫色的聚合花生提取物以0. lmg/ml和lmg/ml的濃度注射雌性小鼠(品系NMRI)。使用腹膜內(nèi)注射進行給藥。觀測時段是7天，在7天后，在動物中未觀察到體重或行為方面的顯著變化。SM實例I-花牛過敏原提取物步驟A.原始花生材料的脫脂方法將去皮的花生在摻混機中均質(zhì)化以獲得一種經(jīng)過均質(zhì)化的漿料。在3°C_5°C下，在連續(xù)磁性攪拌下，用冷丙酮以Ikg漿料2L丙酮的比例將均質(zhì)化的材料脫脂，持續(xù)I小時，以提取出脂質(zhì)、脂肪酸以及游離類黃酮。在布氏漏斗(Buchner funnel)中過濾生成的溶液。去除丙酮并且在過濾器中收集提取物，并且用新鮮的丙酮洗滌兩次。再重復(fù)整個過程兩次，直至所收集到的丙酮是透明的。在完成該方法后，收集脫脂的花生提取物并且在室溫下，在層流凈化罩下干燥12小時，直至該材料完全干燥并且所有丙酮均已被去除。根據(jù)方法步驟B-D獲得脫色的聚合花生過敏原提取物?；ㄉ^敏原提取物的表征這一脫色的聚合花生過敏原提取物產(chǎn)物必須滿足以下規(guī)范a.在水中可溶的產(chǎn)物b.不存在分子量低于IOOkDa的未聚合過敏原/蛋白(通過在非還原性條件下進行SDS-PAGE而鑒別為條帶)c.不存在分子量低于IOOkDa的IgE識別條帶(通過免疫印跡法在非還原性條件下鑒別)d.不存在分子量低于IOOkDa的聚合分子(通過尺寸排阻色譜法與HPLC —起測定)e.相對于天然提取物，游離氨基的減少(75% )(通過熒光胺法測定)
f.相對于天然提取物，生物學(xué)效能降低(95% )(通過使用來自敏化個體的特定血清池進行IgE ELISA抑制實驗測定)g.在小鼠中不存在異常毒性。在對天然提取物、脫色的提取物以及脫色/聚合的提取物進行表征時，使用包括脫色/聚合的殘余物的團塊作為對照(參看表I和2)。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)過敏原提取物的方法，包括 a)使包括的一種源材料與一種液體提取劑接觸以產(chǎn)生一種混合物，該混合物含有溶解在液相中的多種脂質(zhì)和由包括多種過敏原和蛋白的源材料殘余物組成的一種固相， b)使該混合物經(jīng)歷一個第一分離步驟以分離該源材料殘余物， c)使該源材料殘余物與一種過敏原提取劑接觸以產(chǎn)生溶解在液相中的多種過敏原與由非過敏原性殘余物組成的一種固相的一種混合物， d)使該混合物經(jīng)歷一個第二分離步驟以分離溶解在液相中的這些過敏原，從而產(chǎn)生一種粗過敏原提取物， e)使該粗過敏原提取物經(jīng)歷一個低分子量部分去除步驟，以去除具有小于3.5kDa的分子大小的多種分子，并且 f)進行步驟e)，直至該過敏原提取物在3°C_5°C下的導(dǎo)電率低于ΙΟΟΟμ S/cm，從而獲得一種純化的天然過敏原提取物。
2.如權(quán)利要求I所述的一種方法，其中持續(xù)進行該低分子量部分去除步驟直至該導(dǎo)電率在 3°C _5°C下低于 500 μ S/cm。
3.如以上任何一項權(quán)利要求所述的一種方法，另外包括一個進一步處理步驟，包括 g)酸化該天然過敏原提取物至PH2到3. 0，并且維持該酸化了的提取物530分鐘，接著使該提取物經(jīng)歷一個低分子量部分去除步驟，以去除具有小于3. 5kDa的分子大小的多種分子，并且調(diào)節(jié)該PH值至7. 0-8. O,從而產(chǎn)生一種脫色的過敏原提取物。
4.如權(quán)利要求3所述的一種方法，其中酸化該天然過敏原提取物至pH2到2.I。
5.如權(quán)利要求3所述的一種方法，其中酸化該天然過敏原提取物至pH2.O到4. O。
6.如以上任何一項權(quán)利要求所述的一種方法，另外包括一個聚合步驟，包括 h)使一種天然過敏原提取物或一種脫色的過敏原提取物與戊二醛或甲醛接觸， i)使該提取物經(jīng)歷一個分子部分去除步驟，以去除具有小于IOOkDa的分子大小的多種分子，并且 j)進行步驟i)直至該過敏原提取物在TC-5°C下的導(dǎo)電率低于210yS/cm和/或如通過UV或可見光掃描法所測定，該過敏原提取物中不存在戊二醛，以獲得一種聚合過敏原提取物或一種脫色的聚合過敏原提取物。
7.一種天然過敏原提取物，根據(jù)如任何一項權(quán)利要求所述的方法是可獲得的。
8.一種脫色的過敏原提取物，根據(jù)如權(quán)利要求3或4中任一項所述的方法是可獲得的。
9.一種脫色的聚合過敏原提取物，根據(jù)如權(quán)利要求5所述的方法是可獲得的。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-8所述的一種過敏原提取物，其中該源材料選自包括食物過敏原、花生、完整花生、通過空氣傳播的過敏原(例如花粉(樹木的花粉、野草的花粉、草的花粉、谷類植物的花粉)、塵螨、真菌、霉菌)、螨、草、樹木以及野草過敏原、上皮過敏原(動物毛發(fā)、動物皮屑，例如貓的毛發(fā)和皮屑以及狗的毛發(fā)和皮屑)以及昆蟲過敏原(例如蟑螂、蚤、蜜蜂以及胡蜂毒液)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的過敏原提取物，其中該源材料選自食物過敏原(落花生(Arachis hypogeal))、花粉(歐洲棺木(Alnus glutinosa)、白樣(Betula alba)、歐洲棒(Corylus avellana)、綠干柏(Cupressus arizonica)、齊墩果(Olea europea)、懸鈴木屬(Platanus sp)、狗牙根(Cynodon dactylon)、鴨茅(Dactylis glomerata)、草地羊茅(Festuca elatior)、域毛草(HoIcus lanatus)、多年生黑麥草(Lolium perenne)、梯牧草(Phleum pratense)、普通蘆華(Phragmites communis)、草地早熟禾(Poa pratensis)、美洲艾(Ambrosia elatior)、北艾(Artemisia vulgaris)、藜(Chenopodium album)、歐蓍草(Parietaria judaica)、長葉車前(Plantago Ianceolata)、鉀豬毛菜(Salsolakali)、燕麥(Avena sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、黑麥(Secale cereal)、普通小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays))、塵螨(粗腳粉螨(Acarus siro)、熱帶無爪螨(Blomia tropicalis)、粉塵螨(Dermatophagoides farinae)、微角塵螨(Dermatophagoides microceras)、屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)、梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)、害鱗嗜螨(lepidoglyphus destructor)、腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae))、真菌和霉菌(交鏈格抱菌(Alternaria alternate)、錯葉芽枝霉(Cladosporium herbarum)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus))、上皮過敏原(貓的毛發(fā)和皮屑、狗的毛發(fā)和皮屑、馬的毛發(fā)和皮屑、人類的毛發(fā)和皮屑、兔的毛發(fā)和皮屑、以及羽毛)、昆蟲過敏原(螞蟻、蚤、螨、蟑螂、胡蜂毒液以及蜜蜂毒液)。
12.如權(quán)利要求9所述的過敏原提取物，其中該源材料選自花生(落花生)、花粉(齊墩果、歐蓍草、普通蘆葦以及梯牧草)、螨(屋塵螨)以及上皮(貓的皮屑)。
13.如權(quán)利要求12所述的過敏原提取物，其中該源材料是落花生。
14.根據(jù)權(quán)利要求6-13中任一項所述的一種過敏原提取物，用于治療過敏癥。
15.—種如權(quán)利要求13所述的過敏原提取物在治療花生過敏癥中的用途。
16.—種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求12-15中任一項所述的過敏原提取物。
17.—種疫苗，包括根據(jù)權(quán)利要求6-13中任一項所述的過敏原提取物。
全文摘要
本發(fā)明披露了用于生產(chǎn)天然的、脫色的以及聚合的過敏原提取物的多種方法。本發(fā)明進一步披露了經(jīng)由這些方法所生產(chǎn)的多種提取物，以及用于診斷和治療過敏癥的包括這些提取物的多種藥物和疫苗組合物。
文檔編號A61P37/08GK102821785SQ201180015844
公開日2012年12月12日 申請日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者J·卡奈斯·桑切斯 申請人:過敏癥研究實驗室有限公司