專利名稱：修飾的melk肽及包含它們的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作為癌癥疫苗極為有用的新肽，以及用于治療和預(yù)防腫瘤(或者涉及MELK表達(dá)的疾病)的藥物。優(yōu)先權(quán)本申請要求2010年I月25日提交的美國臨時申請61/297，996的權(quán)益，通過述及將其全部內(nèi)容收入本文。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明，⑶8陽性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)可識別主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類分子上出現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。從TAA的第一個例子——黑素瘤抗原(MAGE)家族被發(fā)現(xiàn)起，人們主要通過免疫學(xué)手段(NPL1，2)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA。這些TAA中的ー些目前正在作為免疫治療靶標(biāo)接受臨床開發(fā)。有利的TAA對于癌細(xì)胞的擴增和存活而言是不可或缺的。使用這樣的TAA作為免疫治療的靶標(biāo)，可以最大程度的減小人們熟知的癌細(xì)胞免疫逃逸的風(fēng)險。癌細(xì)胞免疫逃逸可歸因于治療驅(qū)動的免疫選擇(therapeutically driven immune selection)而導(dǎo)致的TAA刪除、突變或下調(diào)。因此，能夠誘導(dǎo)強力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定保證了進(jìn)一步開發(fā)針對各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的臨床考察(NPL 3-10)。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)項使用這些TAA衍生的肽進(jìn)行臨床試驗的報告(NPL 11-13)。雖然已經(jīng)觀察到一些成功，但仍然需要鑒定能作為免疫治療靶的新TAA。MELK,即母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternal embryonic leucine zipperkinase)，先前被鑒定為涉及哺乳動物胚胎發(fā)育的snfl/AMPK絲氨酸-蘇氨酸激酶家族的新成員(NPL14)。已經(jīng)顯示這種基因在干細(xì)胞更新(NPL15)、細(xì)胞周期行進(jìn)(NPL16U7)和前mRNA剪接(NPL18)中發(fā)揮重要作用。為此目的，本發(fā)明人通過使用含有23，040種基因的全基因組cDNA微陣列的基因表達(dá)譜分析鑒定了 MELK，其在乳腺癌中上調(diào)(NPL19)。MELK在數(shù)種癌細(xì)胞中上調(diào)，例如肺癌、膀胱癌、淋巴瘤和宮頸癌細(xì)胞。對多種人體組織和癌細(xì)胞系進(jìn)行的Northern印跡分析顯示，在絕大部分乳腺癌和細(xì)胞系中顯著高水平表達(dá)，而在正常生命器官(如心臟、肝、肺和腎)中則不表達(dá)。此外，已經(jīng)顯著顯示用SiRNA抑制MELK表達(dá)可導(dǎo)致人乳腺癌細(xì)胞的生長。已經(jīng)有多項關(guān)于對與MHC或T細(xì)胞受體的相互作用必不可少的肽的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，以增強這些肽的免疫原性的研究的報道(NPL20、21)。弓丨用表專利文獻(xiàn)[PTL l]W02005/073374[非專利文獻(xiàn)][NPL I]Boon T, Int J Cancer 1993 May 8,54(2):177-80
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地基于可作為免疫療法的合適靶標(biāo)的新肽的發(fā)現(xiàn)。由于TAA —般被免疫系統(tǒng)察覺為“自身”并因此常常沒有免疫原性，適宜靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是極其重要的。意識到MELK(例如如上文SEQ ID NO: 47所描述的，又如GenBank登錄號NM_014791 (SEQ IDNO:46)所示)已經(jīng)被鑒定為在子宮內(nèi)膜異位以及癌癥(包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、慢性髓性白血病(CML)、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌(SCLC)中上調(diào)(W02010/013485)，本發(fā)明聚焦于MELK作為候選的免疫療法靶標(biāo)。為此目的，本發(fā)明至少部分地致カ于MELK的具有誘導(dǎo)針對MELK的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力的特異性修飾的表位肽的鑒定。如下文詳細(xì)討論的，使用源自修飾的MELK表位肽的肽，即野生型MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO: 6)的A*2402結(jié)合候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。然后建立了可特異性識別經(jīng)每種候選肽沖激的HLA-A24陽性靶細(xì)胞的CTL。綜合起來，這些結(jié)果證明這些肽是鑒定了能誘導(dǎo)針對MELK的強而特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A24限制型表位肽。這些結(jié)果進(jìn)ー步證明了 MELK具有強免疫原性，而且它的表位是腫瘤免疫療法的有效靶標(biāo)。因此，本發(fā)明的ー個目的是提供源自MELK (SEQ ID NO: 47)的修飾表位肽，尤其是源自野生型MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO:6)的修飾表位肽的分離的肽，或它們的結(jié)合HLA抗原的免疫學(xué)活性片段。這些肽具有CTL誘導(dǎo)能力。因此，它們可以用來離體誘導(dǎo)CTL或者用來施用給受試者以誘導(dǎo)針對子宮內(nèi)膜異位和癌癥的免疫應(yīng)答，癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。優(yōu)選的肽是九肽，并且典型地，由選自SEQ ID NO: 35-45的氨基酸序列組成。在這些之中，具有選自SEQID N0:35、41和44的氨基酸序列的肽顯示特別強的CTL誘導(dǎo)能力，因此在本發(fā)明中特別有用。本發(fā)明還考慮修飾的肽，它們具有SEQ ID NO:35_45的氨基酸序列，其中替代、缺失或添加了ー個、兩個或更多個氨基酸，只要所述的修飾的肽保留所需的原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。進(jìn)ー步，本發(fā)明還提供編碼任何本發(fā)明的肽的分離的多核苷酸。這些多核苷酸可以和本發(fā)明的肽ー樣用來誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，或者可以施用給受試者以誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答。 當(dāng)施用給受試者時，本發(fā)明的肽被呈遞在APC的表面上，以誘導(dǎo)靶向相應(yīng)肽的CTL0因此，本發(fā)明的ー個目的是提供誘導(dǎo)CTL的物質(zhì)，此類物質(zhì)包括一種或多種本發(fā)明的肽或者編碼此類肽的多核苷酸。本發(fā)明還考慮包含一種或多種本發(fā)明的肽或編碼此類肽的多核苷酸的藥用物質(zhì)，這樣的組合物可以用來治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位和癌癥，此類癌癥包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC，和/或防范其手術(shù)后復(fù)發(fā)，但不限于此。因此，本發(fā)明的另ー個目的是提供配制為用于治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位或癌癥，和/或防范其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物或藥用物質(zhì)，其包含任何本發(fā)明的肽或多核苷酸。作為本發(fā)明的肽或多核苷酸的替代或者補充，本發(fā)明物質(zhì)的物質(zhì)或藥物可任選地包括呈遞任何本發(fā)明的肽的APC或外來體作為有效成分。本發(fā)明的肽或多核苷酸可以用來誘導(dǎo)在表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物的APC，例如通過使源自受試者的APC與本發(fā)明的肽接觸，或者通過將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入到APC中。這樣的APC具有針對靶肽的高的CTL誘導(dǎo)能力，因而能夠用于癌癥免疫療法。因此，本發(fā)明的另ー個目標(biāo)是提供用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法和通過該方法獲得的APC。本發(fā)明的另ー個目的是提供用于誘導(dǎo)CTL的方法，所述方法包括將CD8-陽性細(xì)胞與在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體接觸的步驟，或者導(dǎo)入包括編碼結(jié)合本發(fā)明的肽的T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多核苷酸的基因的步驟。通過本方法能夠獲得的CTL也能夠用于治療和/或預(yù)防其中過表達(dá)MELK的疾病，如子宮內(nèi)膜異位、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC，但不限于此。因此，本發(fā)明的另ー個目的是提供通過本發(fā)明的方法獲得的CTL。此外，本發(fā)明的還有ー個目的是提供在有需要的受試者體內(nèi)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述受試者施用含有修飾的MELK或其免疫學(xué)活性片段、編碼修飾的MELK或其片段的多核苷酸、以及呈遞修飾的MELK或其片段的APC或外來體的物質(zhì)或組合物的步驟。
本發(fā)明的應(yīng)用可延及多種與MELK過表達(dá)相關(guān)，或者源于MELK過表達(dá)的疾病中的任何ー種，包括子宮內(nèi)膜異位和癌癥，癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巣癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。更具體地，本發(fā)明提供下述[I], 一種結(jié)合HLA抗原并具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中所述肽由SEQ ID N0:6的氨基酸序列組成，或者由在SEQ ID NO:6的氨基酸序列中包含一個或多個氨基酸替代的氨基酸序列組成。[2]. [I]的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24。[3]· [I]的分離的肽，其中所述肽在SEQ ID NO: 6的氨基酸序列中的選自下組
(a)-(d)中的位置上包含ー個或多個氨基酸替代 (a) N末端氨基酸，(b)自N末端起的第三個氨基酸(c)自C末端起的第三個氨基酸，和(d) C末端氨基酸。[4], [3]的分離的肽，其中所述多肽包含選自下組(i)-(iv)中的一個或多個氨基酸替代(i) SEQ ID NO: 6的氨基酸序列中N末端氨基酸從E到K或R的氨基酸替代；(ii)SEQ ID NO:6的氨基酸序列中自N末端起的第三個氨基酸從C到E、I、L、M、N或P的氨基酸替代；(iii)SEQ ID NO:6的氨基酸序列中自C末端起的第三個氨基酸從E到N或Q的氨基酸替代；和(iv) SEQ ID NO: 6的氨基酸序列中C末端氨基酸從F到L的氨基酸替代。[5], [4]的分離的肽，其中所述肽包含單ー氨基酸替代。[6], [4]的分離的肽，其中所述肽包含兩個氨基酸替代。[7], [4]的分離的肽，其中所述肽包含三個氨基酸替代。[8], [4]的分離的肽，其中所述肽包含四個氨基酸替代。[9], [4]-[5]的分離的肽，其包含選自SEQ ID NO:35-45的氨基酸序列。[10]. —種結(jié)合HLA抗原并具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中所述肽由選自SEQ ID N0:35-45的氨基酸序列組成，其中插入、替代、缺失或添加了 I個、2個或數(shù)個氨基酸。[11]· [10]的肽，其具有下述特征之一或者二者(a)自N末端起的第二個氨基酸選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和(b) C末端氨基酸選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸。[12]. —種分離的多核苷酸，其編碼[1]_[11]中任ー項的肽。[13]. —種用于誘導(dǎo)CTL的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)包含ー種或多種[1]-[11]中任一項的肽，或者ー種或多種[12]的多核苷酸。[14]. 一種用于治療和/或預(yù)防癌癥或子宮內(nèi)膜異位，和/或防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物，其中所述組合物包含ー種或多種[1]-[11]中任一項的肽，或者ー種或多種[12]的多核苷酸。[15]. [14]的藥物組合物，其中所述組合物配制為對HLA抗原為HLA-A24的受試者施用。[16]. [14]或[15]的藥物組合物，其中所述組合物配制為用于治療癌癥或子宮內(nèi)膜異位。[17]. —種用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法，其中所述方法包括下述步驟之一(a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC與[1]-[11]中任一項的肽接觸；和(b)將編碼[1]_[9]中任一項的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC。
[18].通過任何包含至少ー個下述的步驟的方法來誘導(dǎo)CTL的方法(a)將⑶8-陽性T細(xì)胞與APC共培養(yǎng)，所述APC在其表面上呈遞HLA抗原與[1]-[9]中任一項的肽的復(fù)合物；(b)將CD8-陽性T細(xì)胞與外來體共培養(yǎng)，所述外來體在其表面上呈遞HLA抗原與[1]-[11]中任一項的肽的復(fù)合物；和(c)向T細(xì)胞中導(dǎo)入包含編碼結(jié)合[1]_[11]中任一項的肽的T細(xì)胞受體(TCR)亞単位多肽的多核苷酸的基因。[19]. 一種分離的APC，該APC在其表面上呈遞HLA抗原與[1]-[11]中任ー項的肽的復(fù)合物。[20]· [19]的APC，其中所述APC是通過[17]的方法誘導(dǎo)的。[21]. —種分離的CTL，其靶向[1]-[11]中任ー項的肽。[22]· [21]的CTL，其是通過[18]的方法誘導(dǎo)的。[23]. —種誘導(dǎo)受試者中針對癌癥或子宮內(nèi)膜異位的免疫應(yīng)答的方法，包括對受試者施用包含[1]-[11]中任一項的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或所述片段的多核苷酸的組合物。除了上述之外，在聯(lián)系附圖
和實施例閱讀下面的詳細(xì)說明時，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，前面的發(fā)明概要和后面的詳細(xì)說明都僅僅提出了示例性的實施方案，并不對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替代實施方案構(gòu)成限制。尤其是，雖然在本文中就若干具體的實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了說明，應(yīng)當(dāng)理解這些描述對本發(fā)明而言是示例說明性的，不解釋成對本發(fā)明的限制。在不背離如隨附的權(quán)利要求所描述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地想到本發(fā)明的多種修改和應(yīng)用。類似地，本發(fā)明的其它目的、特征、好處和優(yōu)勢是從此處的概要和下文描述的特定實施方案可以容易地想到的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以顯見的。根據(jù)上文的內(nèi)容并結(jié)合隨附的實施例、數(shù)據(jù)、附圖以及從中能夠合理推斷的內(nèi)容，或者進(jìn)ー步考慮本文中引用的參考文獻(xiàn)，這樣的目的、特征、好處和優(yōu)勢是容易想到的。附圖簡述本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明后將清楚地得知本發(fā)明的各個方面的應(yīng)用。[圖I]圖I描繪顯示對用源自MELK的肽誘導(dǎo)的供體A的CTL進(jìn)行的 IFN-Y ELISP0T 測定的結(jié)果的照片。用 MELK-A24-9-87 (SEQ ID NO:6) (a)MELK-A24-10-637 (SEQ ID NO :23) (b) MELK-A24-9-199 (SEQ ID NO:I) (d)和MELK-A24-9-78 (SEQ ID N0:21) (e)刺激的 CTL 顯示了強的(potential) IFN-y 生成能力。對比地，作為典型的陰性數(shù)據(jù)實例，用MELK-A24-9-96(SEQ ID NO: 2) (c)刺激的CTL未檢出特異性的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)關(guān)聯(lián)肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。[圖2]圖2描繪顯示CTL的建立的結(jié)果的線圖。通過IFN-Y ELI SPOT測定從用 MELK-A24-9-87(SEQ ID NO:6)(a)，MELK-A24-10-637(SEQ ID NO:23)(b)和MELK-A24-9-199 (SEQ ID NO: I) (c)刺激的CTL系檢測到強的IFN-Y生成。在圖中，“黑色菱形”指示針對經(jīng)關(guān)聯(lián)肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y生成，而"白色方塊"指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。[圖3]圖3描繪顯示CTL克隆的建立的結(jié)果的線圖。通過IFN-YELISP0T測定從用 MELK-A24-9-87 (SEQ ID NO: 6) (a)和MELK-A24-9-199 (SEQ ID NO: I) (b)刺激的 CTL克隆檢測到強的IFN-Y生成。在圖中，“黑色菱形”指示針對經(jīng)MELK-A24-9-87(SEQ ID NO: 6)沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y生成，而〃白色方塊〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y·生成。[圖4]圖4是描繪針對外源表達(dá)MELK和HLA_A*2402的靶細(xì)胞的特異性CTL活性的線圖。制備用HLA-A*2402或用全長MELK基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對照。用MELK-A24-9-87 (SEQ ID NO:6)建立的 CTL 克隆顯示針對用 MELK 和 HLA_A*2402 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性(黒色菱形)。另ー方面，沒有檢測到顯著的針對表達(dá)HLA-A*2402 (白色三角形)或MELK (白色圓形)任一的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。[圖5A]圖5A描繪顯示對用來自MELK-A24-9-87_WT(SEQID NO:6)的修飾肽誘導(dǎo)的供體B的CTL進(jìn)行的IFN- Y ELISP0T測定的結(jié)果的照片。用MELK-A24_9_87_1K(SEQID NO:35)(a),MELK-A24-9-87_3M(SEQ ID N0:41) (b)和 MELK_A24-9_87_7N(SEQ IDN0:44) (c)刺激的CTL顯示了強的IFN-γ生成能力，如方塊中表示的。另ー方面，用MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO:6) (d)刺激的CTL未檢出肽特異性的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)關(guān)聯(lián)肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y生成，而〃_〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。[圖5Β]圖5Β描繪顯示對用來自MELK-A24-9-87_WT(SEQID NO:6)的修飾肽誘導(dǎo)的供體C的CTL進(jìn)行的IFN- Y ELISP0T測定的結(jié)果的照片。用MELK-A24-9-87 7N(SEQID NO:44) (a)刺激的CTL顯示了強的IFN-Y生成能力，如方塊中表示的。另ー方面，用MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO:6) (b)刺激的CTL未檢出肽特異性的IFN-Y生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)關(guān)聯(lián)肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y生成，而〃_〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。將用MELK-A24-9-87_7N(SEQ ID NO:44)刺激的14號孔中的細(xì)胞擴增以建立CTL系。對于顯示較少IFN-Y生成的用MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO:6)刺激的4號孔中的細(xì)胞也進(jìn)行了擴增。[圖6]圖6a_c描繪了顯示從供體B的PBMC誘導(dǎo)的CTL系的建立的結(jié)果的線圖。通過 IFN-YELISP0I^|Jt|_MELK-A24-9-87_lK(SEQ ID NO: 35) (a), MELK-A24-9-87_3M(SEQID N0:41) (b)和MELK-A24-9-87_7N(SEQ ID NO:44) (c)刺激的CTL系檢測到了強的 IFN-γ生成。在圖中，“黑色菱形”表示針對用MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID N0:6)沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而“白色方塊”表示針對用無關(guān)的HIV肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ生成。圖6d-e描繪了顯示從供體C的PBMC誘導(dǎo)的CTL系的建立的結(jié)果的線圖。通過IFN- y ELI SPOT測定從用MELK-A24-9-87_7N(SEQ ID NO:44) (d)刺激的CTL系檢測到了強的IFN-Y生成。從用MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO:6) (e)刺激的PBMC未建立起CTL系。在圖中，“黑色菱形”表示針對用MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO: 6)沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而“白色方塊”表示針對用無關(guān)的HIV肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。[圖7]圖7a_c描繪了顯示從供體B的PBMC誘導(dǎo)的CTL克隆的建立的結(jié)果的線圖。通過 IFN-Y ELISP0T 測定從用 MELK-A24-9_87_1K(SEQ ID NO: 35)
(a),MELK-A24-9-87_3M(SEQ ID N0:41) (b)和 MELK_A24-9_87_7N(SEQ ID NO:44) (c)刺激的CTL克隆檢測到了強的IFN-Y生成。在圖中，“黑色菱形”表示針對用MELK-A24-9-87_WT (SEQ ID NO:6)沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而“白色方塊”表示針對用無關(guān)的HIV肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- Y生成。圖7d描繪了顯示從供體C的PBMC誘導(dǎo)的CTL克隆的建立的 結(jié)果的線圖。通過 IFN-YELISP0I^lJtA_MELK-A24-9-87_7N(SEQ ID NO:44)刺激的 CTL克隆檢測到了強的IFN-Y生成。在圖中，“黑色菱形”表示針對用MELK-A24-9-87_WT(SEQID NO: 6)沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而“白色方塊”表示針對用無關(guān)的HIV肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。[圖8]圖8描繪針對外源表達(dá)MELK和HLA_A*2402的靶細(xì)胞的特異性CTL活性的線圖。(a)用MELK-A24-9-87 7N(SEQ ID N0:44)建立的CTL系針對表達(dá)MELK和HLA_A*2402二者的腫瘤細(xì)胞系顯示了特異性CTL活性(黑色菱形；KLM-1，黑色三角形；MDA-MB-435S)，與其他表達(dá)MELK而不表達(dá)HLA-A*2402的細(xì)胞系相比(白色圓形；T47D，白色方塊；KP_1N)。
(b)顯示了用抗HLAI類單抗處理對CTL應(yīng)答的抑制。用MELK-A24-9-87_7N (SEQ IDNO :44)建立的CTL克隆針對KLM-I (黑色菱形)顯示了特異性CTL活性，與KP-IN相比(白色方塊)。針對KLM-I (黒色菱形)的INF- Y生成被抗HLA I類單抗處理(白色菱形)所抑制，與作為對照的正常小鼠IgG處理相比(短線)。[圖9]圖9描繪了顯示MELK-A24-9-199(SEQID NO: I)特異性CTL克隆的反應(yīng)性的結(jié)果的線圖。在圖9(a)中，“黑色菱形”表示針對用MELK-A24-9-199(SEQ ID N0:1)沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而“白色方塊”表示針對未用任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。在圖9(b)中，針對表達(dá)MELK和HLA-A*2402 二者的腫瘤細(xì)胞系的IFN-Y生成(黒色菱形；KLM-1)和針對表達(dá)MELK但不表達(dá)HLA-A*2402的腫瘤細(xì)胞系的IFN-Y生成(白色方塊；KP-1N)實施方案的描述現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，不過在實施或檢驗本發(fā)明的實施方案時可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解本發(fā)明不限于特定大小、性狀、尺度、材料、方法學(xué)、方案等，因為它們可因循例行實驗和優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康模且鈭D限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。通過提述明確地將本說明書中提到的每ー篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本完整收入本文。然而，本文中無ー處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開文本。
除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知曉的意義。如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實例僅為舉例說明而不構(gòu)成限制。I.定義如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非
另有明確說明。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在型殘基(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。本說明書中有時使用的術(shù)語“寡肽”用于指長度為20個殘基或更少，典型地為15個殘基或更少的本發(fā)明的肽，通常由約8個-約11個殘基，經(jīng)常為9個或10個殘基組成。如本文中使用的，術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有與天然存在的氨基酸相似的功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。氨基酸可以是L-氨基酸或者是D-氨基酸。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和O-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在型氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團(tuán)結(jié)合)但具有經(jīng)過修飾的R基團(tuán)或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以通過它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號來指稱。術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中除非另有明確說明可互換使用，而且與氨基酸類似地通過它們普遍接受的單字母代碼來指稱。術(shù)語“組合物”、“物質(zhì)”、或“(作用)劑”和在本文中可以互換使用，指包含規(guī)定量的規(guī)定成分的產(chǎn)品，以及通過所述規(guī)定量的規(guī)定成分的組合直接或間接地得到的任何產(chǎn)品。這些術(shù)語當(dāng)與“藥劑”關(guān)聯(lián)使用時，意在涵蓋包括活性成分以及任何組成擔(dān)載體的惰性成分的產(chǎn)品，以及通過所述任何兩種或更多種成分的組合、復(fù)合或聚集，或通過一種或多種組分的解離，或通過一種或多種成分的其他類型的反應(yīng)或相互作用而直接或間接地得到的任何產(chǎn)品。相應(yīng)地，在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“藥物組合物”指任何通過混合本發(fā)明的化合物與藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體而制成的產(chǎn)品。本文中所用的短語“藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體”或“生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體”意思是藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的材料、組合物、物質(zhì)或媒介，包括但不限于擔(dān)載或運輸主題的支架多聚藥效團(tuán)從一個器官或身體部分到另一個器官或身體部分所涉及的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包埋材料。術(shù)語“活性成分”在本文中意指作用劑或組合物中具有生物學(xué)活性或生理學(xué)活性的物質(zhì)。尤其是，在藥劑或藥物組合物中，“活性成分”是指顯示客觀的藥理學(xué)效果的物質(zhì)。例如，在用于治療或預(yù)防癌癥的藥劑或藥物組合物的場合，作用劑或組合物中的活性成分可直接或間接地導(dǎo)致對于癌細(xì)胞和/或組織的至少一種生物學(xué)或生理學(xué)作用。優(yōu)選地，這樣的作用可包括減少或抑制癌細(xì)胞生長、破壞或殺死癌細(xì)胞和/或癌組織，等等。典型地，活性成分的間接效果包括誘導(dǎo)可識別或殺死癌細(xì)胞的CTL。在配制之前，“活性成分”又稱“原料藥”(bulk)、“藥物物質(zhì)” (drug substance)或“技術(shù)產(chǎn)品” (technical product)。本發(fā)明的藥劑或藥物組合物特別可以用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(又稱“免疫原性組合物)是指在接種到動物體內(nèi)后具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫功能的物質(zhì)。除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達(dá)MELK基因的癌癥，其實例包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。除非另有定義，術(shù)語“子宮內(nèi)膜異位”是指過表達(dá)MELK基因的子宮內(nèi)膜異位，其實例包括但不限于根據(jù)修改的美國生育學(xué)會分類法(American Fertility Societyclassification)分類的子宮內(nèi)膜異位I期(極小)、II期(輕微)、III期(中度)或IV期(嚴(yán)重)?；蛘撸訉m內(nèi)膜的實例包括但不限于根據(jù)Beecham分類法分類的子宮內(nèi)膜異位I期、II期、III期或IV期。 除非另有定義，術(shù)語“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”、“細(xì)胞毒性T細(xì)胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞)并誘導(dǎo)此類細(xì)胞死亡的T淋巴細(xì)胞亞群。除非另有定義，本文中使用的術(shù)語“HLA-A24 ”指包含亞型如HLA_A*2402等的HLA-A24 型。除非另有定義，如本文中所用的術(shù)語“試劑盒”是指試劑及其他材料的組合?？紤]術(shù)語“試劑盒”可包括微陣列、芯片、標(biāo)記物、等等。術(shù)語“試劑盒”不意圖限于某種特定的試劑和/或材料組合。如本文中使用的，在受試者或者患者的語境中，短語“HLA-A24陽性”是指受試者或患者純合地或者雜合地?fù)碛蠬LA-A24抗原基因，且HLA-A24抗原在受試者或患者的細(xì)胞中作為HLA抗原表達(dá)。以本發(fā)明的材料和方法在“治療”癌癥或子宮內(nèi)膜異位的語境中有用為限，如果治療導(dǎo)致臨床上的收益，例如受試者體內(nèi)MELK基因表達(dá)的減少、或者癌癥或子宮內(nèi)膜異位的尺寸、普遍性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力的降低，則認(rèn)為治療是“有效的”。當(dāng)預(yù)防性地進(jìn)行治療時，“有效的”意思是其阻礙或阻止癌癥或子宮內(nèi)膜異位的形成，或者阻止或減輕癌癥或其他疾病的臨床癥狀?！坝行浴苯Y(jié)合用于診斷或治療疾病或特定腫瘤類型的任何已知方法來確定。以本發(fā)明的材料和方法可用于疾病如癌癥或子宮內(nèi)膜異位的“預(yù)防”和“防范”的語境為限，此類術(shù)語在本文中可互換使用，指降低緣于疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進(jìn)展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動?；蛘?，預(yù)防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等)的多種多樣的預(yù)防性療法。在本發(fā)明的語境中，治療和/或預(yù)防癌癥或子宮內(nèi)膜異位和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)可包括下述一個或多個步驟，手術(shù)去除癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和阻抑癌癥發(fā)生、腫瘤衰退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個體死亡率及改善其預(yù)后，降低其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防，包括10%、20%、30%或更多降低，或?qū)崿F(xiàn)病情穩(wěn)定。在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“抗體”指可以與指定的蛋白或其肽具有特異性反應(yīng)性的免疫球蛋白及其片段?？贵w可以包括人抗體、靈長源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標(biāo)記物融合的抗體、和抗體片段。另外，在本文中，抗體以最廣義使用，具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性?！翱贵w”指示所有類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。II. At為了證明源自MELK的修飾肽發(fā)揮被CTL所識別的抗原的功能，對源自MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO:6)的修飾肽進(jìn)行了分析以確定它們是否為HLA-A24限制 性的抗原表位，HLA-A24是經(jīng)常遇到的HLA等位基因(Date Y et al·，Tissue Antigens47:93-101, 1996;Kondo A et al. , J Tmmunol 155:4307-12，1995;Kubo RT et al. , JTmmunol 152:3913-24，1994)?；谒鼈儗LA-A24的結(jié)合親和力，鑒定了源自MELK具有比野生型MELK-A24-9-87 (MELK-A24-9-87_WT) (SEQ ID NO: 6)更高效的誘導(dǎo)特異性 CTL 的潛在能力的HLA-A24結(jié)合性修飾肽的候選者。也就是說，根據(jù)本發(fā)明，提供了修飾的肽，其包含在SEQID NO:6的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸替代的氨基酸序列。在本發(fā)明中，修飾的MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO: 6)中的氨基酸替代的數(shù)目是至少一個。在一些實施方案中，替代的數(shù)目是在SEQ ID N0:6的氨基酸序列的下述位置(a)-(d)上有一個、兩個、三個、或四個替代(a) N末端氨基酸，(b)自N末端起第3個氨基酸(c)自C末端起第3個氨基酸，和(d) C末端氨基酸。在通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列中的保守殘基的位置是已知的(JTmmunol 1994,152:3913;Immunogenetics 1995,41:178;J Tmmunol 1994,155:4307)。根據(jù)保守的殘基，可以在自N末端起的第2個氨基酸和C末端引入替代來保留或增加HLA-A24與該肽的結(jié)合。但是，如(a)-(d)所示的位置與保守殘基的位置不同。換言之，本發(fā)明提供了具有改善的CTL誘導(dǎo)能力的修飾肽，其具有不同于已知的保守殘基的替代。在本發(fā)明的一個實施方案中，這些位置上的替代可選自下組(i)至(iv)(i) SEQ ID NO: 6的氨基酸序列中N末端氨基酸從E到K或R的氨基酸替代；(ii)SEQ ID N0:6的氨基酸序列中自N末端起的第三個氨基酸從C到E、I、L、M、N或P的替代；(iii)SEQ ID NO: 6的氨基酸序列中C末端氨基酸從E到N或Q的氨基酸替代；和(iv) SEQ ID NO: 6的氨基酸序列中自C末端起的第三個氨基酸從F到L的替代。肽中一個、兩個或更多個氨基酸的替代不會影響肽的功能，如下面詳細(xì)描述的。鑒定了下述肽是具有與MELK-A24-9-87_WT(SEQ ID NO:6)相比更高的結(jié)合能力的候選肽
MELK-A24-9-87_lK(SEQ ID NO :35),MELK-A24-9-87_lR(SEQ ID NO:36),MELK-A24-9-87_9L(SEQ ID NO :37),MELK-A24-9-87_3E(SEQ ID NO :38),MELK-A24-9-87_3I(SEQ ID NO :39),MELK-A24-9-87_3L(SEQ ID NO :40),MELK-A24-9-87_3M(SEQ ID NO :41),MELK-A24-9-87_3N(SEQ ID NO :42), MELK-A24-9-87_3P(SEQ ID NO :43),MELK-A24-9-87_7N(SEQ ID NO :44),和MELK-A24-9-87_7Q(SEQ ID N0:45),.用加載了這些肽的樹突細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞后，使用下述肽成功地建立了CTL MELK-A24-9-87_lK(SEQ ID NO:35)，MELK-A24-9-87_3M(SEQ ID NO:41)，和MELK-A24-9-87_7N(SEQ ID NO:44)。這些建立的CTL針對用相應(yīng)的肽沖激的靶細(xì)胞顯示強的CTL活性。這里的結(jié)果表明這些肽是MELK的受HLA-A24限制的修飾的表位肽。由于MELK基因在子宮內(nèi)膜異位和癌細(xì)胞和癌組織(包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC的細(xì)胞和組織)中過表達(dá)，而在大多數(shù)正常器官中不表達(dá)，它是良好的免疫治療靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供對應(yīng)于MELK的被CTL識別的表位的九肽(由九個氨基酸殘基組成的肽)。本發(fā)明的九肽的優(yōu)選的例子包括那些具有選自SEQ ID NO :35-45的氨基酸序列的肽。一般而言，目前可以通過互聯(lián)網(wǎng)訪問的軟件程序,如Parker KC et al. , J Immunol1994 Jan 1，152 (I) : 163-75等中描述的那些，可以用來在計算機上計算不同肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。與HLA抗原的結(jié)合親和力可以按照例如下述文獻(xiàn)中描述的那樣進(jìn)行測定 Parker KC et al. , J Tmmunol 1994Jan 1，152 (I) : 163-75 和 Kuzushima Ket al. , Blood 2001, 98 (6):1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct31;8:424, Buus S et al. Tissue Antigens.，62:378-84，2003，Nielsen M et al. , ProteinSci 2003;12:1007-17,和 Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796，這些在例如 LafuenteEM et al. , Current Pharmaceutical Design, 2009，15，3209-3220 中有總結(jié)。用于測定結(jié)合親和力的方法在例如 Journal of Immunological Methods, 1995，185:181-190.;和Protein Science, 2000，9:1838-1846中有描述。因而可以利用這樣的軟件程序來選擇具有高度的HLA抗原結(jié)合親和力的源自MELK的免疫學(xué)活性片段。因此，本發(fā)明涵蓋由通過這些已知程序被確定為可與HLA抗原結(jié)合的選自修飾的MELK的免疫學(xué)活性片段構(gòu)成的肽。此外，本發(fā)明肽在其側(cè)翼可以具有額外的氨基酸殘基，只要所述肽保持其CTL誘導(dǎo)能力即可。本發(fā)明肽的側(cè)翼的氨基酸殘基可以由任何種類的氨基酸構(gòu)成，只要其不損害原來的肽的CTL誘導(dǎo)能力。因此，本發(fā)明涵蓋這樣的肽，其包含源自MELK的修飾肽且具有對HLA抗原的結(jié)合親和力。這樣的肽典型地少于約40個氨基酸，經(jīng)常少于約20個氨基酸，通常少于約15個氨基酸。一般而言，蛋白質(zhì)中一個、兩個、或更多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能，或者在有些情況下甚至?xí)鰪娫鞍踪|(zhì)的期望功能。事實上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中修飾(即替代、缺失、添加和/或插入)一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基而成的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(Mark et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1984,81:5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982，10:6487-500;Dalbadie-McFarland et al. , Proc NatlAcad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的肽可既具有CTL誘導(dǎo)能力，又具有選自SEQ ID NO:35-45的氨基酸序列中添力口、插入、和/或替代一個、兩個或甚至更多個氨基酸而得到的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可，改變氨基酸序列中的單個氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的個別添加或替代往往會導(dǎo)致原始氨基酸序列的特性得以保留。因此，它們常規(guī)上稱作“保守取代”或“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變導(dǎo)致具有與原始蛋白質(zhì)類似的性質(zhì)和功能的修飾蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。期望保留的 氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R, D, N, C，E, Q, G，H, K, S，T)、和具有下面的共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A, V,L, I, P);含羥基側(cè)鏈(S, T, Y);含硫原子側(cè)鏈(C, M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D, N, E, Q);含堿側(cè)鏈(R，K，H);和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組各自含有本領(lǐng)域公認(rèn)互為保守取代的氨基酸I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守修飾，只要該肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應(yīng)排除MELK的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導(dǎo)CTL的肽?？梢詫Ρ景l(fā)明的肽插入、替代或添加氨基酸殘基，或者，可以從本發(fā)明的肽缺失氨基酸殘基，以實現(xiàn)更高的結(jié)合親和力。為了保持所需的CTL誘導(dǎo)能力，可以修飾(添加、缺失或替代)少數(shù)(例如，I個、2個或數(shù)個)或小百分比的氨基酸。這里，術(shù)語“數(shù)個”意指5個以下的氨基酸，如4個或3個以下。要被修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選為20%以下，更優(yōu)選15%以下，進(jìn)一步更優(yōu)選10%以下，或1-5%。此外，可以對本發(fā)明的肽插入、替代或添加氨基酸殘基，或者可以刪除氨基酸殘基，以實現(xiàn)更高的結(jié)合活性。當(dāng)在免疫療法的語境中使用時，本發(fā)明的肽應(yīng)呈遞在細(xì)胞或外來體的表面上，優(yōu)選作為與HLA抗原的復(fù)合物。除了天然被展示的肽之外，由于已經(jīng)知道通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics1995，41:178; J Immunol 1994, 155:4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原
性肽。例如，可能優(yōu)選的是將自N末端起的第二個氨基酸替代為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸，和/或?qū)末端氨基酸替代為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸，以增加HLA-A24結(jié)合。因此，具有SEQ ID NO: 35-45的氨基酸序列，其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的自N末端起的第二個氨基酸被替代為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸，和/或其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的C末端被替代為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替代，而且可以在肽的潛在TCR識別位置處引入替代。數(shù)項研究已證明了肽中的氨基酸替代可等同于或好于原來，例如CAPl、p53(264_272)、Her-2/neu(369-377)或 gplOO(209_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T.K. Hoffmann et al.J Tmmunol. (2002)Febl;168(3):1338-47. , S. O. Dionne et al. CancerTmmunol immunother. (2003) 52:199-206 及 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Tmmunotherapy(2004)53, 307-314)?！?br> 本發(fā)明還考慮向所描述的肽的N和/或C末端添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸。此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的修飾肽也包含在本發(fā)明之內(nèi)。需要注意的是，雖然如上所述已經(jīng)報道了對肽的自N末端起的第二個氨基酸以及N和/或C末端進(jìn)行替代以實現(xiàn)更高的結(jié)合親和力，對自N末端起第7個氨基酸進(jìn)行替代的效果還沒有被闡明。然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時，可能誘導(dǎo)副作用，諸如自身免疫性病癥和/或針對特定物質(zhì)的變應(yīng)性癥狀。因此，優(yōu)選的是，首先利用可用的數(shù)據(jù)庫實施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索清楚了即使與目標(biāo)肽相比僅相差I(lǐng)個或2個氨基酸的肽亦不存在時，可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導(dǎo)能力，而沒有任何發(fā)生此類副作用的危險。雖然如上所述的對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽預(yù)期是高度有效的，但還是對根據(jù)高結(jié)合親和力的存在為指標(biāo)選出的候選肽檢查了 CTL誘導(dǎo)能力的存在。這里，短語“CTL誘導(dǎo)能力”指肽被呈遞到抗原呈遞細(xì)胞上時誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的能力。另外，“CTL誘導(dǎo)能力”包括肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進(jìn)CTL溶解靶細(xì)胞、和提高CTL IFN- Y生成的能力。CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)如下來實現(xiàn)，誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的APC(例如B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和樹突細(xì)胞(DC))，或者更具體地說，源自人外周血單核白細(xì)胞的DC，并且在用肽刺激后，與CD8-陽性細(xì)胞混合，然后測量由CTL針對靶細(xì)胞生成和釋放的IFN-Y。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達(dá)人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如BenMohamed L，Krishnan R，Longmate Jj Auge C，Low L，Primus J，Diamond DJ，Hum Immunol 2000Aug，61 (8):764_79Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by aminimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLAclass II restricted T(H)response中描述的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標(biāo)記革巴細(xì)胞，并且可以自靶細(xì)胞釋放的放射性計算細(xì)胞毒性活性。或者，CTL誘導(dǎo)能力可以如下評估測量在攜帶固定化肽的APC存在下由CTL生成和釋放的IFN- Y，并使用抗IFN- Y單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。作為如上所述檢查肽的CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)選自具有SEQ ID N0:35_45所示的氨基酸序列的肽的九肽不但具有對HLA抗原的高親和力，還具有特別高的CTL誘導(dǎo)能力。因此，例舉這些肽為本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。另外，同源性分析的結(jié)果顯示了那些肽與自任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽沒有顯著的同源性。這降低了用于免疫療法時發(fā)生未知的或不想要的免疫應(yīng)答的可能性。因此，也是根據(jù)這個方面，這些肽可用于在癌癥或子宮內(nèi)膜異位患者中引發(fā)針對MELK的免疫力。因此，本發(fā)明的肽，優(yōu)選由SEQ ID NOs:35-45的氨基酸序列的肽組成。除上文所述修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它肽，只要所得的連接肽保留所需的原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。合適的“其他肽”的例子包括從其他TAA衍生的能誘導(dǎo)CTL的肽。合適的肽間接頭是本領(lǐng)域公知的，例如AAY(P. M. Daftarian et al. , J TransMed 2007,5:26), AAA, NKRK(R. P. M. SutmulIer et al. , J Immunol. 2000，165:57308-7315) 或 K(S.0ta et a I. , Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et a I. , JTmmunol. 2002, 168:5709-5715)。例如，非MELK腫瘤相關(guān)抗原肽也可以基本上同時地用來增加藉由HLAI類和/或HLA II類的免疫應(yīng)答。公認(rèn)癌細(xì)胞能表達(dá)多于一種腫瘤相關(guān)基因。因此，確定特定的受試者是否表達(dá)其他腫瘤相關(guān)基因，并進(jìn)一步將源自這樣的基因的表達(dá)產(chǎn)物的HLA I類和/或HLA II類結(jié)合肽包含在根據(jù)本發(fā)明的MELK組合物或疫苗中，是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)實驗的范圍之內(nèi)的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉I類HLAI和II類HLA結(jié)合肽的例子(例如參見Coulie, Stem Cells 13:393-403，1995)，而且可以以與本文公開類似的方式用于本發(fā)明。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能容易地利用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來制備包括一種或多種MELK肽和一種或多種非MELK肽的多肽，或編碼此類多肽的核酸。上述連接的肽在本文中被稱為“多表位”(polytope) ”，即兩個或更多個潛在免疫原性或免疫應(yīng)答刺激性肽構(gòu)成的組，這些肽可以以各種排列方式(例如串聯(lián)、交疊)連接在一起。該多表位(或編碼該多表位的核酸)可以以標(biāo)準(zhǔn)免疫方案來施用，例如施用于動物，以測試該多表位刺激、增強和/或引起免疫應(yīng)答的有效性。肽可直接地或經(jīng)使用側(cè)翼序列連接在一起以形成多表位，而且多表位作為疫苗的用途是本領(lǐng)域公知的(參見例如Thomson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA92(13):5845-5849, 1995;Gilbert et al. , Nature Biotechnol. 15 (12):1280-1284, 1997;Thomson et al. , J Immunol. 157 (2) :822-826，1996;Tarn et al. ,J Exp.Med. 171(1) :299-306, 1990)?？芍苽浜胁煌瑪?shù)目和組合的表位的多表位并測試它們被CTL識別的情況及提高免疫應(yīng)答的功效。除了上面討論的本發(fā)明的肽的修飾之外，還可將上述的肽進(jìn)一步連接至其它物質(zhì)，只要它們保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。合適的物質(zhì)包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；⑻烊坏暮秃铣傻木酆衔锏?。肽還可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、和/或磷酸化；前提是該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性。這些修飾可賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)和/或使肽穩(wěn)定。例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽?？梢砸远喾N方式測定多肽的穩(wěn)定性。例如，可使用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef etal. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。此外，如上文所述，在上述替代、缺失或添加了一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基的修飾肽中，可以篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高者。因此，本發(fā)明還提供由于篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高的修飾肽的方法。一種示例性的方法可包括下述步驟a:對本發(fā)明的肽替代、刪除或添加至少一個氨基酸殘基，b:測定肽的活性，和c :選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。這里，要測定的活性可包括MHC結(jié)合活性，APC或CTL誘導(dǎo)能力，和細(xì)胞毒活性 。本文中，本發(fā)明的肽也可以稱為“MELK肽”或“MELK多肽”。HL修飾的MELK狀的制各本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或合成為由兩個或更多個肽構(gòu)成的較長多肽。然后可以分離，即純化或分離所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性。其他示例性的修飾包括摻入D-氨基酸或其他可用的氨基酸模擬物，以便例如增加肽的血清半壽期。本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，只要該修飾不破壞如本文所述的肽的生物學(xué)活性。其他修飾包括摻入D-氨基酸或其他可用的氨基酸模擬物，以便例如增加肽的血清半壽期?？梢愿鶕?jù)選定的氨基酸序列，借助化學(xué)合成來獲得本發(fā)明的肽?？蛇m用于合成的常規(guī)肽合成法的例子包括但不限于(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976 ；(iii) Peptide Synthesis (日文)，Maruzen Co. , 1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文),MaruzenCo.,1985 ；(v) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol. 14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67288 ;和(vii)Barany G. & Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2，"Solid Phase PeptideSynthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118?；蛘撸蓱?yīng)用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如Morrison J, J Bacteriology1977, 132:349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods inEnzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101:347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達(dá)形式(例如處于相當(dāng)于啟動子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。IV.多核苷酸本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括源自天然存在型MELK基因(GenBank Accession No. 014791 (SEQ ID NO:46))的修飾的多核苷酸以及具有它們的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，對于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應(yīng)所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也描述該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到，核酸中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)都可以被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一種所公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。
本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構(gòu)成。DNA由堿基諸如天然存在的A、T、C、和G合適地構(gòu)成，而T在RNA中被U替代。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到非天然存在的堿基也包括在多核苷酸中。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，其中它們之間有或無居間氨基酸序列存在。例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(例如酶識別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達(dá)肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達(dá)載體(質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來制備，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達(dá)的適宜載體來生成多核苷酸。或者，可借助PCR技術(shù)或通過在合適宿主中的表達(dá)來擴增多核苷酸(參見例如Sambrook et al. , Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)?；蛘撸墒褂霉滔嗉夹g(shù)來合成多核苷酸，如Beaucage SL &Iyer RP,Tetrahedron 1992，48:2223-311 ;Mattheset al. , EMBO J 1984，3:801-5 中記載的。V.夕卜來體(exosomes)本發(fā)明進(jìn)一步提供了稱作外來體的細(xì)胞內(nèi)囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報平11-510507和W099/03499中詳細(xì)描述的方法來制備，并可以用從作為治療和/或預(yù)防對象的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外來體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進(jìn)行接種。復(fù)合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的類型匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24(尤其是A*2402)是主要的，因而適合用于日本人患者的治療。使用在日本人和白種人中高度表達(dá)的A24型對于獲得有效的結(jié)果是有利的。典型地，在臨床上，預(yù)先考察需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠合適地選擇對這種抗原具有高水平的結(jié)合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的CTL誘導(dǎo)能力的肽。此外，為了獲得具有高結(jié)合親和力和CTL誘導(dǎo)能力二者的肽，可以在修飾的MELK部分肽，即來自MELK-A24-9-87WT(SEQ ID NO:6)的修飾肽的氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行I個、2個或數(shù)個氨基酸的替代和/或添加。當(dāng)本發(fā)明的外來體使用A24型HLA抗原時，具有SEQ ID NO: 35_45中任一序列的肽是有用的。VI.杭原旱遞細(xì)朐(APC)本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的分離的APC。所述APC可源自作為治療和/或預(yù)防對象的患者，而且可作為疫苗單獨地或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體、或CTL)組合來施用。APC不限于特定種類的細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞(DC)、Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知這些細(xì)胞可在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，以供淋巴細(xì)胞識別。由于DC是APC中具有最強CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC，DC可以用作本發(fā)明的 APC。例如，可通過自外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸(刺激)它們來獲得APC。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者的身體中誘導(dǎo)出呈遞本發(fā)明肽的APC。短語“誘導(dǎo)APC”包括用本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明肽的核苷酸接觸(刺激)細(xì)胞，以在細(xì)胞的表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物。短語“誘導(dǎo)APC”包括用本發(fā)明的肽，或者編碼本發(fā)明的肽的核苷酸接觸(刺激)細(xì)胞，以在細(xì)胞表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物。因此，可以通過對受試者使用本發(fā)明的肽，然后從受試者收集APC本發(fā)明的APC，來獲得本發(fā)明的APC?；蛘撸梢酝ㄟ^使從受試者收集的APC與本發(fā)明的肽接觸來獲得本發(fā)明的APC。本發(fā)明的APC可以單獨或者與其他藥物，包括本發(fā)明的肽、外來體或CTL組合施用給受試者，以在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答。例如，離體施用可包括下述步驟a :自第一受試者收集APC ；b :使肽接觸步驟a的APC ;并c :對第二受試者步驟b的APC。第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。或者，根據(jù)本發(fā)明，提供了本發(fā)明的肽用于治療誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物的用途。此外，本發(fā)明還提供用于制備誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物的方法或工藝。此外，本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的本發(fā)明的肽。步驟b獲得的APC可以作為疫苗施用來治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位或癌癥，癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。本發(fā)明還提供用于制備誘導(dǎo)APC的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括將本發(fā)明的肽與藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體混合或配制的步驟。依照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的APC具有高水平的CTL誘導(dǎo)能力。在術(shù)語“高水平的CTL誘導(dǎo)能力”中，高水平是相對于未與肽接觸或與不能誘導(dǎo)CTL的肽接觸的APC的該水平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導(dǎo)能力的APC除了用上文描述的方法外，還可以通過包括在體外將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)移至APC的步驟的方法來制備。所導(dǎo)入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于進(jìn)行導(dǎo)入的方法的例子包括但不具體限于本領(lǐng)域中常規(guī)實施的各種方法，諸如可使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如CancerRes 1996，56:5672-7; J Immunol 1998，161:5607-13; J Exp Medl996, 184:465-72;國際公開文本No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細(xì)胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的肽。VII.細(xì)朐毒件T細(xì)朐(CTL)誘導(dǎo)出的針對任何本發(fā)明肽的CTL可在體內(nèi)加強靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并且因此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明還提供由任何本發(fā)明肽特異性誘導(dǎo)或活化的、分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。此類CTL可通過下述步驟來獲得(I)對受試者施用本發(fā)明的肽，并從該受試者收集CTL;或(2)在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)源自受試者的APC，以及CD8-陽性細(xì)胞或外周血單核白細(xì)胞，然后分離CTL ;或(3)在體外使CD8-陽性細(xì)胞或外周血單核白細(xì)胞接·觸在其表面上呈遞HLA抗原與肽之間形成的復(fù)合物的APC或外來體，然后分離CTL ;或(4)向CTL導(dǎo)入包括編碼能結(jié)合本發(fā)明的肽的T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多核苷酸的基因。上述APC或外來體可通過上文記載的方法來制備，而且(4)之方法的詳情記載于下文“VIII.T細(xì)胞受體(TCR) ”部分。本發(fā)明的CTL可以從要進(jìn)行治療和/或預(yù)防的患者獲取，而且可以將它們單獨施用，或者與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體)組合施用以產(chǎn)生調(diào)節(jié)效果。所得到的CTL特異性針對呈遞本發(fā)明的肽(例如與用于誘導(dǎo)的肽相同的肽)的靶細(xì)胞起作用。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)MELK的細(xì)胞，例如癌細(xì)胞或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞，或者或被MELK基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；而且因本發(fā)明肽的刺激而在細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細(xì)胞也可充當(dāng)活化CTL攻擊的靶標(biāo)。VITLT 細(xì)胞受體(TCR)本發(fā)明還提供包含編碼能夠形成T細(xì)胞受體(TCR)的亞單位的多肽的核酸的組合物，及使用該組合物的方法。這些TCR亞基能夠形成TCR，后者賦予T細(xì)胞以針對表達(dá)MELK的腫瘤細(xì)胞的特異性。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可鑒定出在用本發(fā)明的一種或多種肽誘導(dǎo)的CTL中表達(dá)的TCRa和β鏈的核酸序列(W02007/032255及Morganet al. , J Immunol, 171, 3288 (2003)) 0例如，優(yōu)選用PCR方法分析TCR。用于分析的PCR引物可以是，例如，作為5’側(cè)引物的5’ -R引物(5’ -gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:49)，以及作為3’側(cè)引物的對TCRa鏈C區(qū)特異的3_TRa_C引物(5，-tcagctggaccacagccgcagcgt-3，)(SEQ ID N0:50),對 TCRP 鏈 Cl 區(qū)特異的 3_TRb_Cl引物(5 ' -tcagaaatcctttctcttgac-3’)(SEQ ID NO: 51),或?qū)?TCRβ 鏈 C2 區(qū)特異的3_TRbeta_C2 引物(5，-ctagcctctggaatcctttctctt-3，)(SEQ ID NO:52),但不限于此。衍生的TCR能夠以高親合力結(jié)合展示修飾的MELK肽的靶細(xì)胞，并任選地在體內(nèi)和體外介導(dǎo)針對呈遞修飾的MELK肽的靶細(xì)胞的高效殺傷?？梢詫⒕幋aTCR亞單位的核酸摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。這些載體是本領(lǐng)域公知的?？梢詫⑺龊怂峄蛘甙鼈兊妮d體有用地轉(zhuǎn)入T細(xì)胞，例如來自患者的T細(xì)胞中。有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型組合物，其容許快速修飾患者自己的T細(xì)胞(或其他哺乳動物的T細(xì)胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細(xì)胞殺傷特性的修飾型T細(xì)胞。特異性的TCR是這樣的受體，它能夠特異性地識別本發(fā)明的肽與HLA分子的復(fù)合物，當(dāng)TCR處于T細(xì)胞的表面上時給予T細(xì)胞針對靶細(xì)胞的特異性。上述復(fù)合物的特異性識別可以通過任何已知方法來確認(rèn)，優(yōu)選的方法包括，例如，利用HLA分子和本發(fā)明的肽的四聚體分析、以及ELISP0T測定。通過實施ELISP0T測定，可以確認(rèn)在細(xì)胞表面上表達(dá)TCR的T細(xì)胞借助TCR識別細(xì)胞，且信號在細(xì)胞內(nèi)被傳遞。也可以通過已知方法來確認(rèn)上述復(fù)合物當(dāng)存在于T細(xì)胞表面時能夠給予T細(xì)胞以細(xì)胞毒活性。優(yōu)選的方法包括，例如，測定針對HLA陽性靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，例如鉻釋放測定。此外，本發(fā)明提供通過用編碼在HLA-A24的背景下結(jié)合修飾的MELK肽(例如SEQID NO:35-45)的TCR亞單位多肽的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)而制備的CTL。經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL在體內(nèi)能夠歸巢(homing)到癌細(xì)胞,并且可以利用公知的培養(yǎng)方法體外擴增(例如Kawakami et al. , JImmunol.，142，3452-3461 (1989))。可以利用本發(fā)明的T細(xì)胞來形成免疫原性組合物，所述 組合物可以用來在需要治療或保護(hù)的患者中治療或預(yù)防癌癥(W02006/031221)。預(yù)防和防范包括降低緣于疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進(jìn)展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動?；蛘?，預(yù)防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤或子宮內(nèi)膜異位的增殖和轉(zhuǎn)移，降低血管新生)的多種多樣的預(yù)防性療法。治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)可包括下述一個或多個步驟，手術(shù)去除癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和阻抑癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個體死亡率及改善其預(yù)后，降低其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防，包括10%、20%、30%或更多降低，或病情穩(wěn)定。IX.藥物物質(zhì)或藥物組合物由于MELK表達(dá)在子宮內(nèi)膜異位和癌癥(包括乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC)中與正常組織相比上調(diào)，本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可用于治療和/或預(yù)防子宮內(nèi)膜異位和癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物物質(zhì)或藥物組合物，其包括一種或多種本發(fā)明肽或編碼所述肽的多核苷酸作為活性成分?；蛘?，可以在任何上述外來體或細(xì)胞諸如APC的表面上表達(dá)本發(fā)明的肽，以用作藥物物質(zhì)或藥物組合物。另外，上述靶向任何本發(fā)明的肽的CTL也可用作本發(fā)明藥物物質(zhì)或藥物組合物的活性成分。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物也可用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩，特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預(yù)防癌癥或子宮內(nèi)膜異位，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供活性成分在制備用于治療癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位的藥物組合物或藥物物質(zhì)中的用途，所述活性成分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于治療或預(yù)防癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位的活性 成分，所述活性成分選自(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備用于治療癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位的藥物組合物或藥物物質(zhì)的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體與選自下組的活性成分的步驟(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位的藥物組合物或藥物物質(zhì)的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性成分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟，其中所述活性成分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC或外來體，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞?；蛘撸景l(fā)明還提供一種用于誘導(dǎo)CTL的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)由一種或多種本發(fā)明的肽或者一種或多種本發(fā)明的多核苷酸組成?；蛘?，本發(fā)明的藥物組合物或藥物物質(zhì)可用于防范癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可用作疫苗。如上所述，在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩，特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預(yù)防癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。
依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID N0:35_45中的任一氨基酸序列的肽是能誘導(dǎo)強且特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A24限制性表位肽或候選者。因此，包括任何這些具有SEQID NOs:35-45的氨基酸序列的肽的本發(fā)明藥物物質(zhì)或藥物組合物特別適合于對其HLA抗原為HLA-A24的受試者施用。對于包含編碼這些肽中的任一個的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)的藥物物質(zhì)和藥物組合物也是如此。要用本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物治療的癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位不受限制，包括其中涉及MELK的所有種類的疾病，包括但不限于子宮內(nèi)膜異位、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物除上述活性成分之外還可含有其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細(xì)胞，等等。在本文中，其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原
(例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。如果需要，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性成分，只要該物質(zhì)不抑制活性成分(例如任何本發(fā)明肽)的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗炎物質(zhì)或組合物、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了在藥物自身中包括其它治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學(xué)物質(zhì)順序或同時施用。藥物和藥理學(xué)物質(zhì)的量取決于例如所使用的藥理學(xué)物質(zhì)的類型、所治療的疾病、及施用的時序安排和路徑。應(yīng)當(dāng)理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可包括與所討論的配制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它物質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可包括在制品和試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥或子宮內(nèi)膜異位)的病理狀況的材料。制品可包括任何本發(fā)明藥物物質(zhì)或藥物組合物的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)指明該藥物物質(zhì)用于治療或預(yù)防疾病的一種或多種狀況。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥物物質(zhì)或藥物組合物的試劑盒還可任選進(jìn)一步包括第二容器，其中裝有可藥用的稀釋劑。它可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。如果期望的話，藥物物質(zhì)或藥物組合物可在藥包或分配器裝置中提供，該藥包或分配器裝置可裝有一個或多個含有活性成分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。(I)含有肽作為活性成分的藥物物質(zhì)或藥物組合物本發(fā)明的肽可以作為藥物物質(zhì)或藥物組合物直接施用，或者如果必要，通過常規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，除本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物的擔(dān)載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類擔(dān)載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液、等等。另外，藥物物質(zhì)或藥物組合物可在必要時含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可用于抗癌目的。本發(fā)明的肽可制備成由兩種或更多種本發(fā)明肽構(gòu)成的組合以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。肽組合可采取雞尾酒的形式，或者可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將各個肽化學(xué)連接或表達(dá)成為單一融合多肽序列。組合中的各個肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后誘導(dǎo)出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的CTL?；蛘?，從受試者分離APC (例如DC)，然后用本發(fā)明的肽刺激它們，來獲得在其細(xì)胞表面上展示任何本發(fā)明的肽的APC。將這些APC重新施用給受試者而在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出CTL，結(jié)果，可提高針對腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的攻擊性。包括本發(fā)明的肽作為活性成分、用于治療和/或預(yù)防癌癥、腫瘤或子宮內(nèi)膜異位的藥物物質(zhì)或藥物組合物還可包括已知可有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的佐劑?；蛘撸鏊幬镂镔|(zhì)或藥物組合物可以與其它活性成分一起施用，或者通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時增強針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。本文中涵蓋的佐劑包括文獻(xiàn)中記載的那些(Clin Microbiol Rev 1994，7:277-89)。合適佐劑的例子包括但不限于磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等等，但不限于此。另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制齊U、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。 在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的肽還可以作為可藥用鹽的形式施用。所述鹽的優(yōu)選實例包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機堿的鹽、與有機酸的鹽、和與無機酸的鹽。本文中所用的“可藥用鹽”是指保留所述化合物的生物學(xué)有效性和性質(zhì)，通過與無機酸或堿(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等)反應(yīng)所得到的鹽。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物可進(jìn)一步包括引發(fā)(prime)CTL的成分。已經(jīng)確認(rèn)脂質(zhì)是能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的物質(zhì)。例如，可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應(yīng)答的另一個例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS),當(dāng)與適宜的肽共價連接時,可用來引發(fā)CTL (參見例如Deres et al. , Nature1989，342:561-4)。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。本發(fā)明肽的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整，通常是O. OOlmg至IOOOmg,例如O. OOlmg至IOOOmg,例如O. Img至IOmg,而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。(2)含有多核苷酸作為活性成分的藥物物質(zhì)或藥物組合物本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物也可含有處于可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的核酸。在本文中，短語“處于可表達(dá)形式的”意味著多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞時會在體內(nèi)表達(dá)成誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細(xì)胞的基因組所需的配置(關(guān)于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR & Capecchi MR, Cell1987,51:503-12)。參見例如 Wolff et al. , Science 1990，247:1465-8;美國專利 No. 5，580，859; 5, 589，466; 5, 804，566; 5, 739，118;5, 736，524; 5, 679，647;及 W098/04720。基于DNA的投遞技術(shù)的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo)的)投遞、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的投遞(參見例如美國專利No. 5，922，687)。本發(fā)明的肽還可用病毒或細(xì)菌載體來表達(dá)。表達(dá)載體的例子包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如牛痘病毒作為載體來表達(dá)編碼肽的核苷酸序列。在導(dǎo)入宿主后，重組牛痘病毒表達(dá)表達(dá)免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應(yīng)答?？捎糜诿庖呓臃N方案的牛痘載體和方法記載于例如美國專利No. 4，722，848。另一種載體是卡介苗(BCG，Bacille Calmette Guerin) qBCG載體記載于Stover et al. , Nature 1991，351:456-60。有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是容易想到的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如 Shata et al. , Mol Med Today 2000，6:66-71; Shedlock et al. , J LeukocBiol 2000,68:793-806;Hipp et al. , In Vivo 2000,14:571-85。將多核苷酸投遞入受試者可以是直接的，其中使受試者直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入受試者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。 關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy1993, 12:488-505;Wu and ffu, Biotherapy 1991,3:87-95;Tolstoshev, Ann RevPharmacol Toxicol 1993，33:573-96;Mulligan, Science 1993,260:926-32;Morgan& Anderson,Ann Rev Biochem 1993，62: 191-217;Trends in Biotechnology1993，11(5):155-215。 在 eds.Ausubel et al. , Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons,NY,1993;及 Krieger, Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990中描述的重組DNA技術(shù)領(lǐng)域的公知方法也可用于本發(fā)明。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。合適的擔(dān)載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的多核苷酸的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整，通常是O. OOlmg至lOOOmg，例如O. Img至IOmg,而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法本發(fā)明的肽和編碼此類肽的多核苷酸可用于誘導(dǎo)APC和CTL。本發(fā)明的外來體和APC也可用于誘導(dǎo)CTL。以及用于誘導(dǎo)針對癌癥或腫瘤的免疫應(yīng)答。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該其他的化合物不抑制CTL誘導(dǎo)能力。因此，任何前文所述的本發(fā)明的藥物物質(zhì)或藥物組合物均可用于誘導(dǎo)CTL，而且除它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導(dǎo)APC，如下文討論解釋的。(I)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或多核苷酸來誘導(dǎo)具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法。本發(fā)明的方法包括在體外、離體或體內(nèi)使APC與本發(fā)明的肽接觸的步驟。例如，離體將APC與肽接觸的方法可包括下述步驟
a :從受試者收集APC ;和b 使步驟a的APC與肽接觸。APC不限于特定種類的細(xì)胞，而且包括DC、Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知它們在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細(xì)胞識另|J。優(yōu)選地，由于DC是APC中具有最強CTL誘導(dǎo)能力的，可使用DC。任何本發(fā)明的肽均可以單獨或與其它本發(fā)明的肽一起用作步驟b的肽?；蛘?，可以將本發(fā)明的肽施用給受試者以使肽在體內(nèi)接觸APC。結(jié)果，可以在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明也考慮將本發(fā)明的肽施用于受試者以在體內(nèi)誘導(dǎo)APC的方法。還可以將處于可表達(dá)形式的編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸施用于受試者，使得本發(fā)明的肽在體內(nèi)表達(dá)并與APC接觸，從而在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明還考慮將本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者以在體內(nèi) 誘導(dǎo)APC的方法。短語“可表達(dá)的形式”描述于上文“IX.藥物物質(zhì)(2)含有多核苷酸作為 活性組分的藥物物質(zhì)”部分。此外，本發(fā)明包括將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入APC以誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC。例如，該方法可包括下述步驟a 自受試者收集APC ；并b :導(dǎo)入編碼本發(fā)明肽的多核苷酸。步驟b可如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分中所述來實施?；蛘撸景l(fā)明提供了一種用于制備特異性誘導(dǎo)針對MELK的CTL活性的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法，其中所述方法可包括下述步驟之一(a)在體外、離體或體內(nèi)使APC與本發(fā)明的肽接觸；和(b)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC中。(2)誘導(dǎo)CTL的方法本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的肽、多核苷酸、或外來體或APC來誘導(dǎo)CTL的方法。本發(fā)明還提供了使用編碼能形成T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多肽的多核苷酸來誘導(dǎo)CTL的方法，所述TCR亞單位識別本發(fā)明的肽與HLA抗原的復(fù)合物。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)CTL的方法包括選自下組的至少一個步驟(a)使CD8-陽性T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體接觸，所述抗原呈遞細(xì)胞和外來體在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物；和(b)向⑶8-陽性T細(xì)胞中導(dǎo)入編碼能夠形成TCR亞單位的多肽的多核苷酸，所述TCR亞單位可識別HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物。當(dāng)本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體被施用給受試者后，受試者的身體中誘導(dǎo)出CTL，而且靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的強度增強。因此，本發(fā)明還設(shè)想這樣的方法，其包括將本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體施用于受試者以誘導(dǎo)APC的步驟?；蛘?，也可通過離體使用它們來誘導(dǎo)CTL。在此場合，在誘導(dǎo)CTL后，活化的CTL將被返還受試者。例如，本發(fā)明的誘導(dǎo)CTL的方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;b :用肽接觸步驟a)的APC ;并c :將步驟b的APC與⑶8-陽性細(xì)胞共培養(yǎng)。
上文步驟c中要與⑶8-陽性細(xì)胞共培養(yǎng)的APC也可通過將包括本發(fā)明多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移入APC來制備，如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分所述，但是不限于此，而且任何在其表面上有效呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的APC均可用于此方法。作為此類APC的替代，也可使用在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外來體。即，本發(fā)明還設(shè)想這樣的方法，其中將在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外來體與CD8-陽性細(xì)胞共培養(yǎng)。此類外來體可通過上文“V.外來體”部分中描述的方法來制備。另外，可通過將包括編碼能與本發(fā)明的肽結(jié)合的TCR亞單位的多核苷酸的基因?qū)擘?-陽性細(xì)胞來誘導(dǎo)CTL。此類轉(zhuǎn)導(dǎo)可如上文“VIII. T細(xì)胞受體(TCR) ”部分中所述來實施。另外，本發(fā)明提供了一種制造用于誘導(dǎo)CTL的藥用物質(zhì)或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟。(3)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法·此外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對涉及MELK的疾病的免疫應(yīng)答的方法。合適的疾病包括子宮內(nèi)膜異位和癌癥，其例子包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CMIVg性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。本發(fā)明的方法包括施用含有任何本發(fā)明肽或編碼它們的多核苷酸的物質(zhì)或組合物的步驟。本發(fā)明的方法還涵蓋施用呈遞任何本發(fā)明肽的外來體或APC。關(guān)于詳情參見“IX.藥用物質(zhì)或藥物組合物”項，特別是描述本發(fā)明的藥用物質(zhì)或藥物組合物作為疫苗的用途的部分。另外，可用于本發(fā)明誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法的外來體和APC詳細(xì)描述于上文“V.外來體”、“VI.抗原呈遞細(xì)胞(APC) ”、和“X.使用肽、外來體、APC和CTL”的⑴和(2)部分。本發(fā)明還提供了一種制造用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥用物質(zhì)或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟。所述方法包括施用本發(fā)明的疫苗，所述疫苗包含a: 一種或多種本發(fā)明的表位肽，或其免疫學(xué)活性片段；b: 一種或多種編碼(a)的表位肽或免疫學(xué)活性片段的多核苷酸；c: 一種或多種分離的本發(fā)明的CTL ;或d: 一種多種分離的本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞。在本發(fā)明的語境中，過表達(dá)MELK的疾病可用這些活性組分來治療。所述疾病的例子包括但不限于子宮內(nèi)膜異位、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。因而，在施用包括活性組分的疫苗或藥物組合物之前，優(yōu)選確認(rèn)要治療的癌或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞或組織中的MELK表達(dá)水平與同一器官的正常細(xì)胞相比是否增強了。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療(過)表達(dá)MELK的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的方法，該方法可包括下述步驟i)測定自具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中的MELK表達(dá)水平；
ii)將MELK表達(dá)水平與正常對照比較；并iii)對具有與正常對照相比過表達(dá)MELK的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的受試者施用至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分?；蛘?，本發(fā)明還提供包含至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或藥物組合物，其用于對具有過表達(dá)MELK的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的受試者施用。換言之，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于鑒定要用本發(fā)明MELK多肽來治療的受試者的方法，所述方法可包括測定源自受試者的癌或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞或組織中的MELK表達(dá)水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示該受試者具有可用本發(fā)明MELK多肽來治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位。本發(fā)明的治療癌癥或子宮內(nèi)膜異位的方法將在下面更加詳細(xì)的加以敘述。需用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。根據(jù)本發(fā)明，測定在自受試者獲得的癌或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞或組織中MELK的表 達(dá)水平。表達(dá)水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平確定，使用本領(lǐng)域已知方法。舉例而言，MELK的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量。檢測可在芯片或陣列上實施。對檢測MELK的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用MELK的序列信息制備上述探針。舉例而言，MELK的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物來標(biāo)記，例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達(dá)水平可以作為所雜交的標(biāo)記物的強度檢測。此外，MELK(例如SEQ ID NO:46)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還可通過基于擴增的檢測方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。此類引物可基于所述基因的可得序列信息制備。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下與MELK的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，而且在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5攝氏度。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm，平衡時50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件會是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約O. 01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7· 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30攝氏度，用于較長的探針或引物是至少大約60攝氏度。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定物質(zhì)，例如甲酰胺，來實現(xiàn)。探針或引物可具有特定的大小。大小的范圍可為至少10個核苷酸，至少12個核苷酸，至少15個核苷酸，至少20個核苷酸，至少25個核苷酸，至少30個核苷酸，且探針和引物的大小范圍可為5-10個核苷酸，10-15個核苷酸，15-20個核苷酸，20-25個核苷酸，和25-30個核苷酸?；蛘?，可以檢測翻譯產(chǎn)物以進(jìn)行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定MELK蛋白(SEQ IDNO:47)的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F (ab’)2、Fv等)均可用于檢測,只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對MELK蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于MELK的翻譯產(chǎn)物檢測MELK基因的表達(dá)水平的方法，可利用針對MELK蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析測量其染色的強度。意即，在這種測量中，強染色表明所述蛋白質(zhì)的存在/水平增加，且同時表明MELK基因的高表達(dá)水平。對于癌或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞中的靶基因(例如MELK基因)，如果其較之靶基因的對照水平(例如正常細(xì)胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過I. I倍，超過I. 5倍，超過2. O倍，超過5. O倍，超過10倍或者更多，則可以認(rèn)為其在癌或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞中的表達(dá)水平增加了。對照水平可以與癌或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞同時確定，使用先前從疾病狀態(tài)(患病或未患病)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的器官的非病區(qū)獲得的正常細(xì)胞可用作正常對照?；蛘?，對照水平可以借助統(tǒng)計方 法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的MELK基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)一步，對照水平可以是來自先前測試過的細(xì)胞的表達(dá)模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中MELK基因的表達(dá)水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的樣品的組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中MELK基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2 S.D.或平均值+/-3 S.D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的語境中，從已知非患病的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從患病生物樣品確定，則會稱作“患病對照水平”。當(dāng)MELK基因的表達(dá)水平相比正常表達(dá)水平有所提高，或與患病對照水平相似/等同，則受試者可診斷為具有要治療的疾病。更具體地說，本發(fā)明提供了一種(i)診斷受試者是否具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位，和/或(ii)選擇受試者進(jìn)行癌癥或子宮內(nèi)膜異位治療的方法，該方法包括下述步驟a ;測定MELK在自懷疑具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平；b ;將MELK的表達(dá)水平與正常對照水平比較；c ;gMELK的表達(dá)水平與正常對照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位；并d)若在步驟(C)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的話，選擇受試者進(jìn)行癌癥或子宮內(nèi)膜異位治療?；蛘?此類方法包括下述步驟a)測定MELK在自懷疑具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的受試者獲得的癌或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平；b)將MELK的表達(dá)水平與患病對照水平比較；c)若MELK的表達(dá)水平與患病對照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位；并
d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的話，選擇受試者進(jìn)行癌癥或子宮內(nèi)膜異位治療。本發(fā)明還提供了用于確定患有能用本發(fā)明的MELK多肽來治療的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的受試者的試劑盒，其亦可用于評價和/或監(jiān)測癌癥免疫療法的功效。優(yōu)選地，所述癌癥包括，但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。更特別地，所述試劑盒優(yōu)選包含至少一種在源自受試者的癌或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞中檢測MELK基因表達(dá)的試劑，所述試劑可選自下組(a)用于檢測MELK基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測MELK蛋白的試劑；和(c)用于檢測MELK蛋白的生物學(xué)活性的試劑。
適于檢測MELK基因mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或識別MELK mRNA的核酸，諸如具有與MELK mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對MELK mRNA特異性的引物與探針。這類寡核苷酸可基于本領(lǐng)域眾所周知的方法制備。如果需要，用于檢測MELK mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測MELK mRNA的試劑。另一方面，適于檢測MELK蛋白的試劑包括針對MELK蛋白的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進(jìn)一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要所述片段或經(jīng)修飾抗體保留與MELK蛋白的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備此類抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價物。進(jìn)一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種用于檢測MELK蛋白的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。舉例而言，從沒有癌癥或子宮內(nèi)膜異位或患有癌癥或子宮內(nèi)膜異位的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器和帶有使用說明書(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)的裝箱單。這些試劑之類的可標(biāo)上標(biāo)簽包含在容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可用多種材料制造，例如玻璃或塑料。在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)所述試劑是針對MELK mRNA的探針時，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位置?；蛘?，對照位置可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較大而在后面的位置上量較小。在加入測試樣品之后，顯示可檢測信號位置的數(shù)目提供了在樣品中存在的MELK mRNA量的定量指征。所述檢測位置可設(shè)置成具有任何合適可檢測的形狀，通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。本發(fā)明所述試劑盒可進(jìn)一步包括陽性對照樣品或MELK標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集MELK陽性樣品，隨后測定其MELK水平來制備。此外，可將純化的MELK蛋白或多核苷酸添加到不表達(dá)MELK的細(xì)胞中以形成所述陽性樣品或MELK標(biāo)準(zhǔn)品。在本發(fā)明中，純化的MELK可以是重組蛋白。例如，陽性對照樣品的MELK水平大于截留值。在一個實施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種診斷試劑盒，其包括能夠特異性識別本發(fā)明抗體的蛋白或其部分蛋白或其免疫原性片段。本發(fā)明的蛋白的部分肽的例子包括由本發(fā)明蛋白的氨基酸序列中的至少8個、優(yōu)選15個、和更優(yōu)選20個連續(xù)氨基酸構(gòu)成的多肽。癌癥或子宮內(nèi)膜異位可通過使用本發(fā)明的蛋白或肽(多肽)檢測樣品(例如血液、組織)中的抗體來診斷。上文描述了用于制備本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明用于診斷癌癥或子宮內(nèi)膜異位的方法可通過如上所述測定抗MELK抗體量和相應(yīng)對照樣品中的量之間的差異來進(jìn)行。若受試者的細(xì)胞或組織含有針對該基因的表達(dá)產(chǎn)物(MELK)的抗體和抗MELK抗體的數(shù)量測定為大于截留值(與正常對照中的水平相比)的 話，則該受試者懷疑患有癌癥或子宮內(nèi)膜異位。在另一個實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒可包括本發(fā)明的肽及與它結(jié)合的HLA分子。使用抗原性肽和HLA分子檢測抗原特異性CTL的合適方法早已確立(例如AltmanJD et al.，Science. 1996，274(5284) :94-6)。因此，本發(fā)明肽和HLA分子形成的復(fù)合物可用于檢測方法來檢測腫瘤抗原特異性CTL，由此能夠較早檢測癌癥的復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步，它可用于選擇適合包含本發(fā)明肽作為活性組分的藥物的受試者或評估該藥物的治療效果O特別地,依照已知方法(參見例如Altman JD et al. , Science. 1996, 274(5284):94-6)，可制備放射性標(biāo)記的HLA分子和本發(fā)明肽的寡聚物復(fù)合物，諸如四聚體?？墒褂迷搹?fù)合物來對源自懷疑患有癌癥的受試者的外周血淋巴細(xì)胞中的抗原-肽特異性CTL定量。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用如本文所述的肽表位來評估受試者的免疫學(xué)應(yīng)答的方法或診斷試劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，本文所述的HLA限制肽可作為試劑來評估或預(yù)測受試者的免疫應(yīng)答。要評估的免疫應(yīng)答可以是通過在體外或在體內(nèi)使免疫原接觸有免疫能力的細(xì)胞來誘導(dǎo)的。在優(yōu)選的實施方案中，用于評估免疫應(yīng)答的有免疫能力的細(xì)胞可以選自外周血、外周血淋巴細(xì)胞(PBL)、和外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。用于收集或分離此類有免疫能力的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。在一些實施方案中，任何可導(dǎo)致識別和結(jié)合肽表位的抗原特異性CTL的生成的物質(zhì)或組合物均可用作所述試劑。肽試劑無需用作免疫原。用于此類分析的測定系統(tǒng)包括相對較新的技術(shù)發(fā)展，諸如四聚體、胞內(nèi)淋巴因子染色和干擾素釋放測定法、或ELISP0T測定法。在一個優(yōu)選的實施方案中，要與肽試劑接觸的有免疫能力的細(xì)胞可以是抗原呈遞細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞。例如，本發(fā)明的肽可用于四聚體染色測定法，評估外周血單個核細(xì)胞在暴露于腫瘤細(xì)胞抗原或免疫原后抗原特異性CTL的存在。HLA四聚體復(fù)合物可用于直接顯現(xiàn)抗原特異性CTL(參見例如 Ogg et al. , Science 279:2103-2106，1998;和Altman et al, Science174:94-96, 1996)和測定抗原特異性CTL群體在外周血單個核細(xì)胞樣品中的頻率。使用本發(fā)明肽的四聚體試劑可如下所述來生成。與HLA分子結(jié)合的肽在相應(yīng)HLA重鏈和β 2_微球蛋白存在下重折疊以生成三分子復(fù)合物。在該復(fù)合物中，重鏈的羧基末端在先前工程化到蛋白質(zhì)中的位點處被生物素化。然后，將鏈霉親合素添加至復(fù)合物以形成由三分子復(fù)合物和鏈霉親合素組成的四聚體。借助熒光標(biāo)記的鏈霉親合素，四聚體能用于對抗原特異性細(xì)胞染色。然后可鑒定細(xì)胞，例如通過流式細(xì)胞術(shù)。此類分析可用于診斷或預(yù)后目的。通過該規(guī)程鑒定的細(xì)胞也可用于治療目的。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明肽的用于免疫回憶應(yīng)答的試劑(參見例如 Bertoni et al,J.Clin.Invest.100:503-513,1997 和 Penna et al.,J Exp.Med. 174:1565-1570, 1991)。例如，可使用特定肽對來自具有要治療的癌癥的個體的患者PBMC樣品分析抗原特異性CTL的存在。含有單個核細(xì)胞的血液樣品可如下評估培養(yǎng)PBMC，并用本發(fā)明的肽刺激該細(xì)胞。適宜培養(yǎng)時段后，可對擴增的細(xì)胞群體進(jìn)行分析，例如分析CTL活性。肽還可作為試劑用于評估疫苗的功效?？墒褂美缟衔乃龇椒▉矸治鲎砸呙缃臃N免疫原的患者獲得的PBMC。測定患者的HLA型，并選擇識別患者中存在的等位基因特異性分子的肽表位試劑進(jìn)行分析。疫苗的免疫原性可通過PBMC樣品中表位特異性CTL的存在來指示。本發(fā)明的肽還可用于制備抗體，使用本領(lǐng)域公知技術(shù)(參見例如 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene, NY ;和 Antibodies A LaboratoryManual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),其可作為試劑用于診斷、檢測或監(jiān)測癌癥或子宮內(nèi)膜異位。此類抗體可包括識別HLA分子背景中的肽的抗體，即結(jié)合肽-MHC復(fù)合物的抗體。本發(fā)明還提供了多種其他應(yīng)用，本文中描述了其中一些。例如，本發(fā)明提供了一種用于診斷或檢測以MELK免疫原性多肽表達(dá)為特征的病癥的方法。這些方法涉及測定MELKHLA結(jié)合肽、或MELK HLA結(jié)合肽與I類HLA分子形成的復(fù)合物在生物學(xué)樣品中的表達(dá)。肽或肽和I類HLA分子形成的復(fù)合物的表達(dá)可通過用針對肽或復(fù)合物的結(jié)合配偶測定來測定或檢測。在一個優(yōu)選的實施方案中，針對肽或復(fù)合物的結(jié)合配偶可以是識別和特異性結(jié)合肽的抗體。MELK在生物學(xué)樣品諸如腫瘤或子宮內(nèi)膜異位活檢中的表達(dá)也可使用MELK引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增方案來測試。本文中呈現(xiàn)了腫瘤表達(dá)的一個例子，而且用于MELK擴增的例示性條件和引物的進(jìn)一步公開內(nèi)容可見于W02003/27322。優(yōu)選地，診斷方法涉及使自受試者分離的生物學(xué)樣品接觸對MELK HLA結(jié)合肽特異性的作用劑以檢測MELK HLA結(jié)合肽在生物學(xué)樣品中的存在。如本文中使用的，“接觸”意味著在適宜條件(例如濃度、溫度、時間、離子強度)下放置生物學(xué)樣品使其足夠接近所述作用劑，以容許作用劑和生物學(xué)樣品中存在的MELK HLA結(jié)合肽之間的特異性相互作用。一般地，作用劑接觸生物學(xué)樣品的條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的可促進(jìn)生物學(xué)樣品中分子與其關(guān)聯(lián)物(例如蛋白質(zhì)與其受體關(guān)聯(lián)物、抗體與其蛋白質(zhì)抗原關(guān)聯(lián)物、核酸與其互補序列關(guān)聯(lián)物)之間的特異性相互作用的條件。用于促進(jìn)分子與其關(guān)聯(lián)物之間的特異性相互作用的例示性條件記載于授權(quán)給Low等人的美國專利No. 5，108，921。本發(fā)明的診斷方法可以在體內(nèi)和/或在體外實施。因而，生物學(xué)樣品在本發(fā)明中可位于體內(nèi)或體外。例如，生物學(xué)樣品可以是體內(nèi)組織，而且可使用對MELK免疫原性多肽特異性的作用劑來檢測此類分子在組織中的存在?；蛘?，可在體外收集或分離生物學(xué)樣品(例如血液樣品、腫瘤活檢、組織提取物)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，生物學(xué)樣品可以是含有細(xì)胞的樣品，更優(yōu)選自要診斷或治療的受試者收集的含有腫瘤或子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的樣品。
或者，診斷可使用容許通過對熒光素標(biāo)記的HLA多聚體復(fù)合物染色而直接定量抗原特異性 T 細(xì)胞的方法來進(jìn)行(例如 Altman, J. D. et al. , 1996, Science274:94; Altman, J.D. et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10330)。還提供了對胞內(nèi)淋巴因子的染色和干擾素-Y釋放測定法或ELISP0T測定法。多聚體染色、胞內(nèi)淋巴因子染色和ELISP0T測定法都表現(xiàn)出比更常規(guī)的測定法靈敏至少10倍(Murali-Krishna，K. etal. , 1998, Immunity 8:177; Lalvani, A. et al. , 1997, J. Exp. Med. 186:859; Dunbar, P. R. etal. , 1998, Curr. Biol. 8:413) 也可使用五聚體(例如 US 2004-209295A)、Dextramers (例如 WO 02/072631)、和 Streptamers (例如 Nature medicine 6. 631-637 (2002))。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于診斷或評價被施用了至少一種本發(fā)明的MELK肽的受試者的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟(a)在適合誘導(dǎo)對免疫原特異性的CTL的條件下使免疫原與具有免疫能力的細(xì)胞接觸；(b)檢測或測定步驟(a)中誘導(dǎo)的CTL的誘導(dǎo)水平；和(c)將所述受試者的免疫應(yīng)答與所述CTL誘導(dǎo)水平相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明中，免疫原是下述中至少一種(a)選自SEQ ID NO:6,35-45中的氨基酸序列的MELK肽，具有所述氨基酸序列的肽，和具有所述氨基酸序列中已經(jīng)過I個、2個或更多個氨基酸替代而修飾的氨基酸序列的肽。同時，適合誘導(dǎo)免疫原特異性CTL的條件是本領(lǐng)域公知的。例如，可以在體外在免疫原存在下培養(yǎng)具有免疫能力的細(xì)胞來誘導(dǎo)免疫原特異性CTL。為了誘導(dǎo)免疫原特異性CTL，可以將任何刺激因子添加至細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，IL-2是用于CTL誘導(dǎo)的優(yōu)選的刺激因子。在一些實施方案中，對要用肽癌癥療法治療的受試者的免疫應(yīng)答的監(jiān)測或評價步驟可以在治療之前、之中和/或之后進(jìn)行。一般而言，在癌癥治療規(guī)程中，反復(fù)地對要治療的受試者施用免疫原性肽。例如，可以每周施用免疫原性肽3-10周。相應(yīng)地，可以在整個癌癥治療程序中評價或監(jiān)測受試者的免疫應(yīng)答?；蛘撸u價或監(jiān)測免疫應(yīng)答的步驟可以在治療程序完成時進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，免疫原特異性CTL的誘導(dǎo)相對于對照增強，表明要評價或診斷的受試者對已施用的免疫原免疫應(yīng)答。用于評價免疫應(yīng)答的合適的對照可包括，例如，具有免疫能力的細(xì)胞未接觸肽時的CTL誘導(dǎo)水平，或者與具有MELK肽之外的氨基酸序列(例如隨機氨基酸序列)的對照肽接觸時的CTL誘導(dǎo)水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，以序列特異性的方式評價受試者的免疫應(yīng)答，方法是在施用給受試者的各種免疫原之間比較免疫應(yīng)答。具體地，即使當(dāng)數(shù)種MELK肽的混合物被施用給受試者時，免疫應(yīng)答也會依賴于肽而改變。在這種情況下，通過比較每種肽的免疫應(yīng)答，可以鑒定出受試者對其顯示更高應(yīng)答的肽。XI 抗體本發(fā)明進(jìn)一步提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。優(yōu)選的抗體特異性結(jié)合本發(fā)明的肽且不會結(jié)合(或會微弱結(jié)合)非本發(fā)明的肽?；蛘撸贵w能結(jié)合本發(fā)明的肽及其同源物。針對本發(fā)明肽的抗體可用于癌癥或子宮內(nèi)膜異位診斷和預(yù)后測定法、及成像方法學(xué)。類似地，此類抗體可用于其它癌癥或子宮內(nèi)膜異位的治療、診斷、和/或預(yù)后，只要癌癥或子宮內(nèi)膜異位患者中也表達(dá)或過表達(dá)MELK。此外,胞內(nèi)表達(dá)的抗體(例如單鏈抗體)在治療上可用于治療涉及MELK表達(dá)的癌癥或子宮內(nèi)膜異位，這樣的癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。本發(fā)明還提供了多種免疫學(xué)測定法，用于檢測和/或定量MELK蛋白(SEQ IDNO:47)或其片段，包括具有選自SEQ ID NO:35、41、44的氨基酸序列的多肽。此類測定法可根據(jù)需要包括一種或多種能夠識別和結(jié)合MELK蛋白或其片段的抗MELK抗體。在本發(fā)明的語境中，能與MELK多肽結(jié)合的抗MELK抗體優(yōu)選識別具有選自SEQ ID NO: 35、41、44的氨基酸序列的多肽?？贵w的結(jié)合特異性可用抑制測試來確認(rèn)。即，當(dāng)要分析的抗體與全長MELK多肽之間的結(jié)合在任何具有選自SEQ ID N0:35、41、44的氨基酸序列的片段多肽存在下受到抑制時，證明此抗體特異性結(jié)合該片段。在本發(fā)明的語境中，此類免疫學(xué)測定法以本領(lǐng)域公知的各種免疫學(xué)測定形式實施，包括但不限于各種類型的放射免疫測定法、免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定法(ELIFA)、等等。
本發(fā)明的相關(guān)免疫學(xué)的但非抗體的測定法還可包括T細(xì)胞免疫原性測定法(抑制性的或刺激性的)以及MHC結(jié)合測定法。另外，本發(fā)明還提供能夠檢測表達(dá)MELK的癌癥或子宮內(nèi)膜異位的免疫學(xué)成像方法，包括但不限于使用經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明抗體的放射閃爍成像方法。此類測定法在臨床上可用于表達(dá)MELK的子宮內(nèi)膜異位或癌癥的檢測、監(jiān)測、和預(yù)后，此類癌癥的例子包括但不限于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、慢性髓性白血病、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和SCLC。 本發(fā)明還提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以以任何形式使用，例如單克隆或多克隆抗體，而且包括通過用本發(fā)明的肽免疫動物(諸如家兔)而獲得的抗血清、所有種類的多克隆和單克隆抗體、及通過遺傳重組生成的人抗體和人源化抗體。本發(fā)明的作為抗原用于獲得抗體的肽可來源于任何動物物種，但優(yōu)選來源于哺乳動物，諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選來源于人。來源于人的肽可以由本文所公開的核苷酸或氨基酸序列獲得。根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的肽可以是完整的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分肽。部分肽可以包含例如本發(fā)明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。在本文中，抗體定義為能與MELK肽的全長或片段起反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體識別具有選自SEQ ID N0:35、41、44的氨基酸序列的MELK的片段肽。用于合成寡肽的方法是本領(lǐng)域公知的。合成后，可任選在作為免疫原使用之前純化肽。在本發(fā)明的語境中，寡肽(例如9或10聚物)可與擔(dān)載體綴合或連接以增強免疫原性。匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)作為擔(dān)載體是公知的。用于綴合KLH和肽的方法也是本領(lǐng)域公知的。或者，可以將編碼本發(fā)明肽或其片段的基因插入已知的表達(dá)載體，然后用該載體轉(zhuǎn)化本文所述宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞外部或內(nèi)部回收所需肽或其片段，然后可將其用作抗原。或者，表達(dá)肽的完整細(xì)胞或其溶胞物或者化學(xué)合成的肽也可用作抗原?？梢杂每乖庖呷魏尾溉閯游铮珒?yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性。通常，可使用卩齒齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)的動物。嚙齒科動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形科動物包括例如家兔。靈長科動物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域已知的。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體的說，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸浮液與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑諸如弗氏(Freund)完全佐劑混合，制成乳狀液，然后施用于哺乳動物。優(yōu)選的是，其后每4-21天施用數(shù)次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。還可使用適宜的擔(dān)載體進(jìn)行免疫。如上所述進(jìn)行免疫后，可通過標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗血清中所需抗體的量的增加?？梢匀缦轮苽溽槍Ρ景l(fā)明肽的多克隆抗體從經(jīng)過免疫的哺乳動物(該哺乳動物經(jīng)檢驗其血清中所需抗體增加)收集血液,并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清。多克隆抗體可包括含有多克隆抗體的血清,并且可以從所述血清中分離的、含有該多克隆抗體的級分?？梢允褂美缗悸?lián)有本發(fā)明肽的親和柱從僅識別本發(fā)明肽的級分中制備免疫球蛋白G或M，并進(jìn)一步使用蛋白A或蛋白G柱純化該級分?！榱酥苽鋯慰寺】贵w，從經(jīng)過抗原免疫并如上所述檢查出血清中所需抗體水平升高的哺乳動物收集免疫細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞可優(yōu)選獲自脾。其它要與上述免疫細(xì)胞融合的優(yōu)選親本細(xì)胞包括例如哺乳動物的骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選具有為了用藥物選擇融合細(xì)胞而獲得的特性的骨髓瘤細(xì)胞。可根據(jù)已知的方法，例如Milstein 等(Galfre 和 Milstein, MethodsEnzymo173:3-46 (1981))的方法，將上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。對于由細(xì)胞融合得到的雜交瘤，可在標(biāo)準(zhǔn)選擇培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)它們以進(jìn)行選擇。通常，細(xì)胞培養(yǎng)在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進(jìn)行數(shù)天至數(shù)周，培養(yǎng)的時間足以使除了所需雜交瘤之外的所有其它細(xì)胞(非融合的細(xì)胞)死亡。然后，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋(standard limiting dilution)來篩選和克隆生成所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。除了上述用抗原免疫非人動物來制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用肽、表達(dá)肽的細(xì)胞或其溶胞物免疫人淋巴細(xì)胞，諸如那些感染了 EB病毒的人淋巴細(xì)胞。然后，使經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細(xì)胞諸如U266融合，以產(chǎn)生期望的生成能夠與所述肽結(jié)合的人抗體的雜交瘤(已公開但未審查的日本專利申請No. Sho63-17688)。隨后將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的單克隆抗體可通過例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱進(jìn)行純化。本發(fā)明的抗體不僅可用于純化和檢測本發(fā)明的肽，還可以用作本發(fā)明肽的激動劑和拮抗劑的候選物?；蛘撸梢酝ㄟ^癌基因使生成抗體的免疫細(xì)胞(諸如經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)胞)永生化，并用于制備單克隆抗體。如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術(shù)來重組制備(參見例如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies,由 MacMillanPublishers LTD在英國出版(1990))。例如，可以從生成抗體的免疫細(xì)胞諸如雜交瘤或經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供如上所述制備的重組抗體。此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)過修飾的抗體，只要它結(jié)合一種或多種本發(fā)明的肽。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或?qū)碜訦鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv) (Huston et al. , Proc Natl Acad SciUSA 85:5879-83(1988))。更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段。或者，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達(dá)載體，并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見例如Co et al. , J Immunol 152:2968-76 (1994) ;Betterand Horwitz, Methods Enzymol 178:476-96 (1989);Pluckthun and Skerra,MethodsEnzymol 178:497-515(1989);Lamoyi, Methods Enzymol 121:652-63(1986);Rousseauxet al. , Methods Enzymol 121:663-9(1986) ;Bird and Walker, Trends Biotechnol9:132-7(1991))?？贵w可以通過與多種分子諸如聚乙二醇(PEG)綴合來修飾。本發(fā)明提供了經(jīng)過這 樣修飾的抗體?？赏ㄟ^化學(xué)修飾抗體來獲得經(jīng)過修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的?；蛘撸梢砸栽醋苑侨丝贵w的可變區(qū)與源自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體或者包含源自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、源自人抗體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體的形式來獲得本發(fā)明的抗體。此類抗體可依照已知技術(shù)來制備。人源化可通過用嚙齒類的⑶R或⑶R序列替代人抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行(參見例如Verhoeyen et al. , Science239:1534-1536(1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中人可變域的一小部分已被來自非人物種的相應(yīng)序列所替代。也可以使用完全的人抗體，這樣的抗體除了人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)。此類抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來制備。例如，體外方法包括使用展示在噬菌體上的人抗體片段的重組文庫(例如Hoogenboom &ffinter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991))。類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠，來生成人抗體。該方法記載于例如美國專利Nos. 6，150，584 ;5，545，807 ；5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016?？梢詫⑷缟汐@得的抗體純化至同質(zhì)。例如，可依照用于一般蛋白質(zhì)的分離和純化方法進(jìn)行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當(dāng)選擇和組合使用柱層析諸如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦來分出和分離抗體(Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring HarborLaboratory (1988)),但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白 A 柱包括例如 Hyper D、POROS 和 Sepharose F. F. (Pharmacia)。除親和層析外的例示性層析包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析、等等(Strategies for Protein Purification 和 Characterization:ALaboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring HarborLaboratory Press (1996))?？梢酝ㄟ^液相層析來進(jìn)行層析規(guī)程,諸如HPLC和FPLC。例如，可使用吸光度測量、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)和/或免疫熒光來測量本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定化在板上，將本發(fā)明的肽施加到該板上，再施加含有所需抗體的樣品，諸如生成抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后施加用酶(諸如堿性磷酸酶)標(biāo)記的、識別第一抗體的第二抗體，并將板溫育。接著，在洗滌后，向板中加入酶底物，諸如磷酸對硝基苯酯，并測量吸光度以評估樣品的抗原結(jié)合活性。可以使用肽的片段，諸如C-末端或N-末端片段作為抗原來評估抗體的結(jié)合活性。可以使用BIAcore (Pharmacia)來評估本發(fā)明抗體的活性。上述方法允許通過將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明肽的樣品，并檢測或測量由抗體與肽形成的免疫復(fù)合物，來檢測或測量本發(fā)明的肽。因為依照本發(fā)明的肽檢測或測量方法可特異性的檢測或測量肽，所以該方法可用于使用肽的各種實驗。XII.載體和宿豐細(xì)朐
本發(fā)明還提供了導(dǎo)入有編碼本發(fā)明肽的核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體可用于在宿主細(xì)胞中維持本發(fā)明的核苷酸、尤其是DNA，用于表達(dá)本發(fā)明的肽，或者用于施用本發(fā)明的核苷酸以用于基因療法。當(dāng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌且在大腸桿菌(例如JM109、DH5 a、HBlOl或XLlBlue)中大量擴增和生成載體時，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中擴增的“(復(fù)制)起點”和用于選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)志基因(例如通過藥物諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等進(jìn)行選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用Μ13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR_Script等。另外，與上述載體一樣，pGEM_T、pDIRECT和pT7也可以用于亞克隆和提取cDNA。當(dāng)使用載體來生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，表達(dá)載體是有用的。例如，要在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體應(yīng)具備上述在大腸桿菌中擴增的特征。當(dāng)使用大腸桿菌諸如JM109、DH5a、HBlOl或XLlBlue作為宿主細(xì)胞時，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中高效表達(dá)所需基因的啟動子，例如IacZ啟動子(Ward et al. , Nature341:544-6(1989);FASEB J 6:2422-7 (1992))、araB 啟動子(Better et al. , Science240:1041-3(1988))、T7 啟動子等。在這方面，可以使用例如 pGEX_5X_I (Pharmacia)、“QIAexpress系統(tǒng)” (Qiagen)、pEGFP和pET(在這種情況中，宿主優(yōu)選為表達(dá)T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體還可以包含用于肽分泌的信號序列。指導(dǎo)肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號序列有pelB信號序列(Lei et al.，J Bacteriol169:4379(1987))。用于將載體導(dǎo)入靶宿主細(xì)胞的手段包括例如氯化鈣法和電穿孔法。除了大腸桿菌夕卜，還可以使用例如源自哺乳動物的表達(dá)載體(例如pcDNA3 (Invitrogen)和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18 (17):5322 (1990))、pEF、PCDM8)、源自昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體(例如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、源自植物的表達(dá)載體(例如pMHl、pMH2)、源自動物病毒的表達(dá)載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(例如pZIpneo)、源自酵母的表達(dá)載體(例如“畢赤酵母表達(dá)試劑盒”(Invitrogen)、pNVll、SP-QOI)及源自枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體(例如pPL608、pKTH50)來生成本發(fā)明的多肽。為了在動物細(xì)胞諸如CHO、COS或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)載體，載體應(yīng)具有在所述細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan et al. , Nature277:108 (1979))、MMLV-LTR 啟動子、EFla 啟動子(Mizushima et al. , Nucleic Acids Res18:5322 (1990))、CMV啟動子、等等，及優(yōu)選用于選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)志基因(例如通過藥物(例如新霉素、G418)進(jìn)行選擇的藥物抗性基因)。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 pOP13。提供下面的實施例來例示本發(fā)明及幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來制備和使用本發(fā)明。實施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例材料和方法細(xì)朐系人白細(xì)胞抗原(HLA)-A*2402陽性B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系TISI購自IHWG Celland Gene Bank (Seattle WA)。0S7, MDA-MB-435S 和 T47D 購自 ATCC。KLM-1 和 KP-1N 分別 購自RIKEN細(xì)胞庫和JCRB細(xì)胞庫。源自MELK的肽的候選者選擇使用結(jié)合預(yù)測軟件〃BIMAS〃 (www-bimas· cit. nih. gov/molbio/hla bind)預(yù)測了源自MELK的結(jié)合HLA-A*2402分子的9聚體和10聚體肽，該算法由Parker et al. (JImmunol 1994, 152(1):163-75)和 Kuzushima et al. (Blood 2001,98(6):1872-81)描述。受HLA-A*2402限制的HIV肽(RYLRQQLLGI (SEQ ID NO :48))用作對照。這些肽由Biosynthesis (Lewisville, TX)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成，并通過反相高效液相色譜(HPLC)純化。分別通過分析型HPLC和質(zhì)譜分析來確定肽的純度(>90%)和身份。將肽以20mg/ml溶解在二甲基亞砜(DMSO)中并保存于_80°C。體外CTL誘導(dǎo)使用單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)來誘導(dǎo)針對呈現(xiàn)在HLA上的肽的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。如他處所述(Nakahara Set al. , Cancer Res 2003Jul 15，63 (14) :4112-8)體外制備 DC。具體地說，對于用Ficoll-Plaque (Pharmacia)溶液從三名健康供體(稱為供體A、B、C) (HLA_A*2402陽性)分離的外周血單個核細(xì)胞(PBMC),通過粘附塑料組織培養(yǎng)盤(Becton Dickinson)加以分離，以將它們作為單核細(xì)胞級分加以富集。將富集了單核細(xì)胞的群體在含2%熱滅活的自體血清(AS)的AM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)中，在l，000U/ml的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D System)和 1，000U/ml 白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DC在AIM-V培養(yǎng)基中在3 μ g/ml β 2-微球蛋白存在下用20 μ g/ml每一種合成肽于37° C沖激3小時。所生成的細(xì)胞表觀上在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)DC相關(guān)分子，諸如⑶80、⑶83、⑶86和HLA II類(數(shù)據(jù)未顯示)。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC用X輻照(20Gy)滅活，并以1:20比例與用⑶8陽性分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的自體⑶8+T細(xì)胞混合。在48孔板(Corning)中設(shè)立這些培養(yǎng)物；每個孔在0.5ml AM_V/2%AS培養(yǎng)基中含有I. 5xl04個經(jīng)肽沖激的DC、3xl05個CD8+T細(xì)胞和10ng/mlIL_7 (R&D System)。3天后，給這些培養(yǎng)物補充IL-2 (CHIRON)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將T細(xì)胞用經(jīng)肽沖激的自體DC進(jìn)一步刺激。每次通過與上文所述相同的方式來制備DC。在第21天在第三輪肽刺激后針對經(jīng)肽沖激的A24LCL細(xì)胞測試CTL (Tanaka H et al. , Br J Cancer 2001Jan 5, 84(I):94-9;Umano Y et al. , Br J Cancer 2001 Apr 20，84(8):1052-7;UchidaN et al. , Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci2006May,97 (5):411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506)。CTL擴增規(guī)稈使用與Riddell 等人(Walter EA et al. , N Engl J Med 1995 Oct19,333(16):1038-44;Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb, 2(2):216-23)記載的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴增CTL。將總共5x IO4個CTL在40ng/ml抗CD3單克隆抗體(Pharmingen)存在下懸浮于25ml AIM-V/5% AS培養(yǎng)基中，其中有經(jīng)MMC滅活的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系。啟動培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天給培養(yǎng)物補加新鮮的含有30IU/ml IL-2的AIM_V/5%AS培養(yǎng)基(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5, 84 (I):94-9;Umano Y et al. , Br JCancer 2001 Apr 20，84(8):1052-7;Uchida N et al. , Clin Cancer Res 2004 Dec15,10(24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9;Watanabe T etal., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8):498-506) CTL克降的律立在96圓底微量滴定板(Nalge Nunc International)中進(jìn)行稀釋以獲得O. 3、I和3個CTL/孔。在總共150 μ I/孔的含5%AS的AIM-V培養(yǎng)基中，將CTL與IxlO4個細(xì)胞/孔的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系、30ng/ml的抗CD3抗體，和125U/ml的IL-2 —起培養(yǎng)。10天后向培養(yǎng)基中加入50 μ I//孔的IL-2以達(dá)到終濃度125U/ml的IL-2。在第14天測試CTL活性，并使用如上所述的相同方法擴增CTL克隆(Uchida N et al. , Clin Cancer Res 2004Dec 15, 10(24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci 2006 May, 97(5):411-9;Watanabe Tet al. , Cancer Sci 2005Aug, 96 (8):498-506)。特異件CTL活件為了檢查特異性CTL活性，實施了干擾素(IFN)I酶聯(lián)免疫斑點(ELISP0T)測定法和IFN-Y酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。具體而言，制備經(jīng)肽沖激的A24LCL (IxlO4/孔)和腫瘤細(xì)胞系(5xl04/孔)作為刺激細(xì)胞。使用48孔中培養(yǎng)的細(xì)胞、CTL系和克隆作為應(yīng)答細(xì)胞。依照制造商的規(guī)程實施IFN- Y ELISP0T測定法和IFN- y ELISA測定法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染通過PCR來擴增編碼靶基因可讀框或HLA_A*2402的cDNA。將PCR擴增產(chǎn)物克隆入pCAGGS載體。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī)程將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C0S7(靶基因和HLA-A24陰性的細(xì)胞系)。自轉(zhuǎn)染起2天后，用Versene (Invitrogen)收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作CTL活性測定法的刺激細(xì)胞(5X104個細(xì)胞/孔)。抑制測丨定為了確認(rèn)HLA I類限制性CTL活性，將刺激細(xì)胞與10 μ g/ml抗HLA I類單克隆抗體 W6/32 (Biolegend)或正常小鼠 IgG (Santa Cruz Biotechnology)在 4°C 一起溫育 30 分鐘。經(jīng)過處理的細(xì)胞用作刺激物來檢查CTL活性。結(jié)果源自MELK的HLA-A24結(jié)合肽的預(yù)測表IA和IB以高結(jié)合親和力的順序顯示了源自MELK的HLA-A24結(jié)合性9聚體和10聚體肽。選擇并考察了總共34個具有潛在HLA-A24結(jié)合能力的肽以確定表位肽。
[表ΙΑ]源自MELK的HLA-A24結(jié)合性9聚體肽
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合HLA抗原并具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中所述肽由SEQ ID N0:6的氨基酸序列組成，或者由在SEQ ID N0:6的氨基酸序列中包含ー個或多個氨基酸替代的氨基酸序列組成。
2.權(quán)利要求I的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24。
3.權(quán)利要求I的分離的肽，其中所述多肽在SEQID N0:6的氨基酸序列中的選自下組(a)-(d)中的位置上包含ー個或多個氨基酸替代 (a)N末端氨基酸， (b)自N末端起的第三個氨基酸 (c)自C末端起的第三個氨基酸，和 (d)C末端氨基酸。
4.權(quán)利要求3的分離的肽，其中所述多肽包含選自下組(i)-(iv)中的一個或多個氨基酸替代 (i)SEQ ID NO: 6的氨基酸序列中N末端氨基酸從E到K或R的氨基酸替代； (ii)SEQID N0:6的氨基酸序列中自N末端起的第三個氨基酸從C到E、I、L、M、N或P的氨基酸替代； (iii)SEQID N0:6的氨基酸序列中自C末端起的第三個氨基酸從E到N或Q的氨基酸替代；和 (iv)SEQ ID NO: 6的氨基酸序列中C末端氨基酸從F到L的氨基酸替代。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，其中所述肽包含單ー氨基酸替代。
6.權(quán)利要求4的分離的肽，其中所述肽包含兩個氨基酸替代。
7.權(quán)利要求4的分離的肽，其中所述肽包含三個氨基酸替代。
8.權(quán)利要求4的分離的肽，其中所述肽包含四個氨基酸替代。
9.權(quán)利要求4-5的分離的肽，其包含選自SEQID NO:35-45的氨基酸序列。
10.一種結(jié)合HLA抗原并具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中所述肽由選自SEQ ID NO:35-45的氨基酸序列組成，其中插入、替代、缺失或添加了 I個、2個或數(shù)個氨基酸。
11.權(quán)利要求10的肽，其具有下述特征之一或者二者 (a)自N末端起的第二個氨基酸選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和 (b)C末端氨基酸選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
12.—種分離的多核苷酸,其編碼權(quán)利要求1-11中任ー項的肽。
13.ー種用于誘導(dǎo)CTL的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)包含一種或多種權(quán)利要求1-11中任ー項的肽，或者一種或多種權(quán)利要求12的多核苷酸。
14.ー種用于治療和/或預(yù)防癌癥或子宮內(nèi)膜異位，和/或防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物，其中所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-11中任一項的肽，或者一種或多種權(quán)利要求12的多核苷酸。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述組合物配制為對其HLA抗原為HLA-A24的受試者施用。
16.權(quán)利要求14或15的藥物組合物，其中所述組合物配制為用于治療癌癥或子宮內(nèi)膜異位。
17.ー種用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法，其中所述方法包括下述步驟之一 (a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC與權(quán)利要求1-11中任一項的肽接觸；和 (b)將編碼權(quán)利要求1-9中任一項的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC。
18.通過任何包括至少ー個下述的步驟的方法來誘導(dǎo)CTL的方法 (a)將CD8-陽性T細(xì)胞與APC共培養(yǎng)，所述APC在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-11中任一項的肽的復(fù)合物； (b)將CD8-陽性T細(xì)胞與外來體共培養(yǎng)，所述外來體在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-11中任一項的肽的復(fù)合物；和 (c)向T細(xì)胞中導(dǎo)入包含編碼結(jié)合權(quán)利要求1-9中任一項的肽的T細(xì)胞受體(TCR)亞単位多肽的多核苷酸的基因。
19.一種分離的APC，該APC在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1_11中任一項的肽的復(fù)合物。
20.權(quán)利要求19的APC，其中所述APC是通過權(quán)利要求17的方法誘導(dǎo)的。
21.—種分離的CTL,其祀向權(quán)利要求1-11中任ー項的肽。
22.權(quán)利要求21的CTL，其是通過權(quán)利要求18的方法誘導(dǎo)的。
23.一種誘導(dǎo)受試者中針對癌癥或子宮內(nèi)膜異位的免疫應(yīng)答的方法，包括對受試者施用包含權(quán)利要求1-11中任一項的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或所述片段的多核苷酸的組合物。
全文摘要
本申請中描述了由修飾的MELK表位肽或其免疫學(xué)活性片段的氨基酸序列組成的分離的肽，它們結(jié)合HLA抗原并且具有比野生型MELK肽表位肽更高的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力，因此可用于癌癥免疫治療或子宮內(nèi)膜異位免疫治療，更具體地說是癌癥疫苗或子宮內(nèi)膜異位疫苗的語境。本發(fā)明還提供包含對上述肽或片段的一個、兩個或者數(shù)個氨基酸插入、替代或添加，但仍保留所需的細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽。進(jìn)一步提供了編碼上述任何肽的核酸，以及包含任何上述肽或核酸的藥用物質(zhì)或者組合物。本發(fā)明的肽、核酸、藥用物質(zhì)和組合物在癌癥、腫瘤和子宮內(nèi)膜異位的治療中特別有用。
文檔編號A61K38/00GK102822193SQ20118001596
公開日2012年12月12日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者中村佑輔, 角田卓也, 大澤龍司, 吉村祥子, 渡邊朝久 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司