專(zhuān)利名稱(chēng)：模板化成雙鏈卷曲螺旋的呼吸病毒表位及其在免疫中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及產(chǎn)生有效刺激對(duì)各種病毒疾病免疫應(yīng)答的綴合物的技術(shù)。
背景技術(shù)：
傳染病比如流感每年感染數(shù)億人。世界上，流感可影響上達(dá)5-15%的人口，估計(jì)三百萬(wàn)至五百萬(wàn)的病例為嚴(yán)重疾病，并且估計(jì)每年250，000至500，000的死亡。(見(jiàn)URLwww. who, int/mediacentre/factsheets/2003/fs21 l/en/)。其{也病毒病原體，I匕如嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒、副流感病毒和呼吸道合胞體病毒，每年造成額外的發(fā)病率和死亡率。由于病原體中的突變，比如流感病毒恒定的抗原性漂移和周期性的抗原性轉(zhuǎn)變，使得控制這些疾病復(fù)雜化。隨著突變?cè)斐芍把h(huán)的流感病毒株的抗原性改變的積累，從而突變體病毒遇到不具有對(duì)抗該突變體病毒株的保護(hù)抗體的個(gè)體，疾病的傳播增加。由于免疫壓力造成的突變體流感病毒的快速選擇需要每年開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)新的流感疫苗。數(shù)位研究人員已經(jīng)記載了有效疫苗策略的需要。Nabel和Fauci在NatureMedicine, 16 (12) : 1389 (2010)中對(duì)需要廣泛保護(hù)性“通用的流感疫苗”進(jìn)行評(píng)論。在“Template-based coiled-coil antigens elicit neutralizing antibodies tothe SARS-coronavirus” Journal of Structural Biology, 155:176-194 (2006)中，和在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2005/077103中，Tripet等描述了肽疫苗的一種方法。在“Broadly cross-reactive antibodies dominatethe human B cell response against2009pandemic HlNl influenza virus infection,，，J. Experimental Medicine, 2011 年 I月10日，打印前電子公開(kāi)，PMID:21220454中，Wrammer等描述了與多重流感株交叉反應(yīng)的中和抗體。本發(fā)明解決了對(duì)抗病原體比如呼吸道病毒的有效疫苗的需要。本發(fā)明也解決了通過(guò)單個(gè)疫苗保護(hù)免遭快速突變病原體、多抗原性不同毒株的單個(gè)病原體、或多病原體的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括兩個(gè)肽的模板化綴合物。如下產(chǎn)生綴合物將天然存在的α螺旋表位的第一氨基酸序列改變成七殘基重復(fù)序列以形成第一模板化表位；將天然存在的α螺旋表位的第二序列改變成七殘基重復(fù)序列以形成第二模板化表位；形成兩個(gè)模板化表位的復(fù)合體以產(chǎn)生卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；并連接卷曲螺旋結(jié)構(gòu)至載體，比如載體蛋白，以形成綴合物。在一種實(shí)施方式中，兩個(gè)模板化表位具有不同的序列。本發(fā)明也包括通過(guò)施用綴合物至受試者，比如需要其的受試者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法。綴合物以足夠的量施用至受試者以在受試者中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。在一種實(shí)施方式中，至少一個(gè)表位不衍生自流感病毒蛋白。在一種實(shí)施方式中，綴合物包含兩條多肽，即，第一多肽和第二多肽，其中每個(gè)多肽包含至少一個(gè)七殘基重復(fù)序列，并且其中所述兩條多肽具有小于或不大于約90%的序列同一'I"生；兩條多肽之間的共價(jià)連接(covalent linkage);和載體，比如載體蛋白，其與多肽之一共價(jià)連接。在另一種實(shí)施方式中，綴合物包含兩條多肽，即，第一多肽和第二多肽，其中每個(gè)多肽包含至少一個(gè)七殘基重復(fù)序列，并且其中所述兩條 多肽具有約100%的序列同一性；兩條多肽之間的共價(jià)連接；和載體，比如載體蛋白，其與多肽之一共價(jià)連接。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少兩個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少三個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少四個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少五個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少六個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少七個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少八個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少九個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少十個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少i^一個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少十二個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少十三個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少十四個(gè)七殘基重復(fù)序列。在任何一種實(shí)施方式中，綴合物包含至少十五個(gè)七殘基重復(fù)序列。在另外的實(shí)施方式中，單個(gè)另外的異亮氨酸殘基緊接在最后的七殘基重復(fù)序列之后存在。在任何一種實(shí)施方式中，至少一個(gè)表位不衍生自流感病毒蛋白。在一種實(shí)施方式中，綴合物的第一多肽可包含下列形式[ I _bj J-C jj-L-ejj-f J^gliJn,其中[I-bfCfL-eff^-gd是在第一多肽的序列中重復(fù)η次的片段。在每個(gè)片段中的“I”為異亮氨酸和在每個(gè)片段中的“L”為亮氨酸。數(shù)字η為至少3的整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，η為從3至15的整數(shù)，并包括3和15 ;即，η為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15。數(shù)字i為從I至η的整數(shù)，其中i的值由其出現(xiàn)在片段中的位置確定。在序列中首先出現(xiàn)的N末端片段賦予i=l的值。對(duì)于每一個(gè)另外的片段數(shù)字i增加1，直到C末端片段賦予i=n的值。可獨(dú)立于在第一多肽的所有其他片段中每個(gè)b、c、e、f和g氨基酸和第二多肽的所有片段，選擇在η個(gè)片段的每個(gè)中的每個(gè)b、c、e、f和g。在一種實(shí)施方式中，b、c、e、f和g氨基酸選自免疫應(yīng)答期望對(duì)抗的病原體的I類(lèi)病毒融合蛋白的α螺旋區(qū)域。在另外的實(shí)施方式中，單個(gè)另外的異亮氨酸殘基緊接在最后的片段之后(即，在最后片段的C末端)存在。在一種實(shí)施方式中，綴合物的第二多肽可包含下列形式[I_b2i_c2i_L_e2i_f2i_g2i] η，其中[I-b2i-c2i-L-e2i-g2i_g2i]是在第二多肽的序列中重復(fù)η次的片段。在每個(gè)片段中的“I”為異亮氨酸和在每個(gè)片段中的“L”為亮氨酸。數(shù)字N為至少3的整數(shù)并且與第一多肽的η相同。在一些實(shí)施方式中，η為從3至15的整數(shù)，并包括3和15 ;S卩，η為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，并且與第一多肽的η相同。數(shù)字i為從I至η的整數(shù)，
其中i的值由其出現(xiàn)在片段中的位置確定，從而在序列中首先出現(xiàn)的N末端片段賦予i=l的值，對(duì)于每一個(gè)另外的片段i增加1，并且C末端片段賦予i=n的值。可獨(dú)立于在第二多肽的所有其他片段中每個(gè)b、c、e、f和g氨基酸和第一多肽的所有片段，選擇在η個(gè)片段的每個(gè)中的每個(gè)b、c、e、f和g。b、c、e、f和g氨基酸選自免疫應(yīng)答期望對(duì)抗的病原體的I類(lèi)病毒融合蛋白的α螺旋區(qū)域。在一種實(shí)施方式中，綴合物的第二多肽具有與綴合物的第一多肽相同的序列。在另一種實(shí)施方式中，綴合物的第二多肽具有與綴合物的第一多肽不同的序列，并且b、c、e、f和g氨基酸選自與第一多肽所選自的蛋白不同的I類(lèi)病毒融合蛋白，或選自相同I類(lèi)病毒融合蛋白的與第一多肽所選自的區(qū)域不同的部分。在另外的實(shí)施方式中，單個(gè)另外的異亮氨酸殘基緊接在最后的片段之后(即，在最后片段的C末端)存在。在一種實(shí)施方式中，第一多肽和第二多肽長(zhǎng)度相等。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包含下列形式的綴合物
[載體部分]-[連接體A]-[連接體B]-[模板化表位I]-[表位I修飾體][模板化表位2]-[表位2修飾體]其中連接體A、連接體B、表位I修飾體(modifier)和表位2修飾體任選存在。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，綴合物可任選地包括模板化表位I和模板化表位2之間的另外的共價(jià)連接體C ;任選地包括表位I修飾體和表位2修飾體之間的另外的共價(jià)連接體D或任選地包含模板化表位I和模板化表位2之間的另外的共價(jià)連接體C以及表位I修飾體和表位2修飾體之間的另外的共價(jià)連接體D。在綴合物的一種實(shí)施方式中，表位I修飾體和表位2修飾體都存在，并選自親水的、極性和帶電的氨基酸。表位I修飾體和表位2修飾體每個(gè)可包含一個(gè)半胱氨酸殘基，用于在模板化表位I和模板化表位2之間形成二硫鍵(這樣二硫鍵將接著包括表位I修飾體和表位2修飾體之間的連接體D)。表位I修飾體和表位2修飾體可相同或不同，并可選自-Arg、- (Arg) 2> - (Arg) 3、- (Arg) 4、-Lys>- (Lys) 2、- (Lys) 3、- (Lys) 4、-Arg-酰胺、-(Arg) 2_ 酰胺、-(Arg) 3-酰胺、-(Arg) 4_ 酰胺、-Lys-酰胺、-(Lys) 2_ 酰胺、-(Lys) 3_ 酰胺、-(Lys) 4_ 酰胺、-Cys-Arg、-CyS- (Arg) 2、-Cys- (Arg) 3、-Cys- (Arg) 4、-Cys-Lys > -Cys- (Lys) 2、-Cys- (Lys)3、-Cys- (Lys) 4、-Cys-Arg-酉先胺、-Cys- (Arg) 2_ 酉先胺、-Cys- (Arg) 3_ 酉先胺、-Cys- (Arg) 4_ 酉先胺、-Cys-Lys-酰胺、-Cys- (Lys) 2_ 酰胺、-Cys- (Lys) 3_ 酰胺和 _Cys_ (Lys) 4_ 酰胺。當(dāng)[連接體A]存在時(shí)，其可以是肽；非遺傳編碼的氨基酸，比如正亮氨酸、α -氨基-3-胍基丙酸或丙氨酸；或包括非遺傳編碼的氨基酸的肽。當(dāng)[連接體B]存在時(shí)，其可以是氨基酸或妝，比如-Gly-、-Gly-Gly-、- (Gly) 3_和-(Gly) 4_。在一種實(shí)施方式中，綴合物中使用的表位或用于綴合物的修飾的或模板化的表位衍生自來(lái)自一種或多種具有I類(lèi)病毒融合蛋白的病毒的I類(lèi)病毒融合蛋白的干區(qū)。在一種實(shí)施方式中，一種或多種病毒選自流感A病毒株、SARS病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒5、副流感病毒4或副流感病毒3。在一種實(shí)施方式中，一種或多種病毒選自SARS病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒5、副流感病毒4或副流感病毒3。在一種實(shí)施方式中，I類(lèi)病毒融合蛋白可選自流感PR8(流感A/PR/8/34 (HlNl)) HA2結(jié)構(gòu)域、SARS冠狀病毒S2、呼吸道合胞體病毒RSV A2F、副流感病毒3PIV 3F、副流感病毒5PIV 5F或副流感病毒4PIV 4A F。在另一種實(shí)施方式中，I類(lèi)病毒融合蛋白可選自SARS冠狀病毒S2、呼吸道合胞體病毒RSVA2F、副流感病毒3PIV 3F、副流感病毒5PIV 5F或副流感病毒4PIV 4A F。病毒蛋白的七殘基重復(fù)序列區(qū)域選為待被修飾和模板化用于綴合物的表位。在本發(fā)明中用作模板化表位I和模板化表位2的模板化表位可選自流感PR8HA23MP (381-409)模板化表位 3MP(IKSLQNAINGLTNKINTLIEKINILFTACRR-酰胺( SEQ ID NO:))；流感PR8HA25P (420-448)模板化表位 5P(IENLNKKIDDLFLDIWTLNAEILVLLENCRR-酰胺(SEQ ID NO:))；流感PR8HA26P (448-476)模板化表位 6P(IRTLDFHISNLKNLIEKLKSQIKNLAKECRR-酰胺(SEQ ID NO:)) ;SARS 冠狀病毒 S2 中HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位(ISGLNASIVNLQKEIDRLNEVIKNLNESCRR-酰胺(SEQ ID NO:));呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位(ILHLEGEINKLKSAILSLNKAIVSLSNGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))，呼吸道合胞體病毒RSV A2F (171-199)模板化表位QLSLNKAIVSLSNGISVUSKILDLKNYCRR-酰胺(SEQ ID NO:));呼吸道合胞體病毒RSV A2F (492-520)模板化表位(ISQLNEKINQLLAFIRKLDELIHNLNAGCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 3PIV3F (144-172)模板化表位(IEKLKEAIRDLNKAIQSLQSSIGNLIVACRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 3PIV3F (151-179)模板化表位(IRDLNKAIQSLQSSIGNLIVAIKSLQDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 3PIV3F (460-488)模板化表位(INKLKSDIEELKEWIRRLNQKIDSLGNWCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 5PIV5F (130-158)模板化表位(INELAAAILNLKNAIQKLNAAIADLVQACRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 5PIV5F (144-172)模板化表位(IQKLNAAIADLVQAIQSLGTAIQALQDHCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 5PIV5F (453-481)模板化表位(lAALNKSISDLLQHIAQLDTYISAUSACRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 4PIV 4AF (131-159)模板化表位(IQEUKLILTLKKAITELNEAIRDUNSCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 4PIV 4AF (145-173)模板化表位(ITELNEAIRDUNSIKIUKMISALQNQCRR-酰胺(SEQ ID NO:));和副流感病毒 4PIV4A F (447-475)模板化表位(ILDLSTDINQLNQLIKSLEDHIQRUDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))。在一種實(shí)施方式中，模板化表位I和模板化表位2不相同(當(dāng)不相同的模板化表位I和模板化表位2用在綴合物中時(shí)，綴合物則是雜雙鏈綴合物)。在另一種實(shí)施方式中，僅僅模板化表位I或模板化表位2之一選自流感病毒表位,并且另一個(gè)模板化表位選自不同的病毒。在另一種實(shí)施方式中，模板化表位I和模板化表位2相同(當(dāng)相同的模板化表位I和模板化表位2用在綴合物中時(shí)，綴合物則是同雙鏈綴合物)。在本發(fā)明中用作模板化表位I和模板化表位2的模板化表位可選自SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位QSGLNASIVNLQKEIDRLNEVIKNLNESCRR-酰胺(SEQ ID NO:));呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位QLHLEGEINKLKSAILSLNKAIVSLSNGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))，呼吸道合胞體病毒RSV A2F (171-199)模板化表位QLSLNKAIVSLSNGISVUSKILDLKNYCRR-酰胺(SEQ ID NO:));呼吸道合胞體病毒RSV A2F (492-520)模板化表位(ISQLNEKINQLLAFIRKLDELIHNLNAGCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 3PIV 3F (144-172)模板化表位(IEKLKEAIRDLNKAIQSLQSSIGNLIVACRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 3PIV3F (151-179)模板化表位(IRDLNKAIQSLQSSIGNLIVAIKSLQDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 3PIV3F (460-488)模板化表位(INKLKSDIEELKEWIRRLNQKIDSLGNWCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 5PIV5F (130-158)模板化表位(INELAAAILNLKNAIQKLNAAIADLVQACRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 5PIV5F (144-172)模板化表位(IQKLNAAIADLVQAIQSLGTAIQALQDHCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 5PIV5F (453-481)模板化表位(lAALNKSISDLLQHIAQLDTYISAUSACRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 4PIV 4AF (131-159)模板化表位(IQEUKLILTLKKAITELNEAIRDUNSCRR-酰胺(SEQ ID NO:));副流感病毒 4PIV 4AF (145-173)模板化表位(ITELNEAIRDUNSIKIUKMISALQNQCRR-酰胺(SEQ ID NO:));和副流感病毒 4PIV4A F (447-475)模板化表位(ILDLSTDINQLNQLIKSLEDHIQRUDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))。在一種實(shí)施方式中，模板化表位I和模板化表位2不相同。在另一種實(shí)施方式中,模板化表位I和模板化表位2相同。在另一種實(shí)施方式中，模板化表位I、模板化表位2或模板化表位I和模板化表位
2二者可選自流感PR8HA23MP (381-409)模板化表位 3MP，流感PR8HA25P (420-448)模板化表位 5P ；流感PR8HA26P (448-476)模板化表位 6P，SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位；呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位，呼吸道合胞體病毒RSV A2F (171-199)模板化表位；呼吸道合胞體病毒RSV A2F (492-520)模板化表位；
副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位；副流感病毒3PIV 3F (151-179)模板化表位；副流感病毒3PIV 3F (460-488)模板化表位；副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位；副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位；副流感病毒5PIV 5F (453-481)模板化表位；副流感病毒4PIV 4A F(131_159)模板化表位；副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位；和 副流感病毒4PIV 4A F (447-475)模板化表位其中所選擇的模板化表位具有游離的羧基端(即，序列缺少C末端酰胺)。在一種實(shí)施方式中，模板化表位I和模板化表位2不相同。在另一種實(shí)施方式中,僅僅模板化表位I或模板化表位2之一選自流感病毒表位,并且另一種模板化表位選自不同的病毒。在另一種實(shí)施方式中，模板化表位I和模板化表位2相同。在另一種實(shí)施方式中，模板化表位I、模板化表位2或模板化表位I和模板化表位
2二者可選自SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位；呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位，呼吸道合胞體病毒RSV A2F (171-199)模板化表位；呼吸道合胞體病毒RSV A2F (492-520)模板化表位；副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位；副流感病毒3PIV 3F (151-179)模板化表位；副流感病毒3PIV 3F (460-488)模板化表位；副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位；副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位；副流感病毒5PIV 5F (453-481)模板化表位；副流感病毒4PIV 4A F(131_159)模板化表位；副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位；和副流感病毒4PIV 4A F (447-475)模板化表位其中所選擇的模板化表位具有游離的羧基端(S卩，序列缺少C末端酰胺)。在一種實(shí)施方式中，模板化表位I和模板化表位2不相同。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是流感PR8HA23MP (381-409)模板化表位3MP和模板化表位2是流感 PR8HA25P (420-448)模板化表位 5P。在綴合物的另一種實(shí)施方式中， 模板化表位I是流感PR8HA23MP (381-409)模板化表位3MP和模板化表位2是流感 PR8HA26P (448-476)模板化表位 6P。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是流感PR8HA25P (420-448)模板化表位5P和模板化表位2是流感PR8HA26P (448-476)模板化表位 6P。
在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是流感PR8HA23MP (381-409)模板化表位3MP和模板化表位2是SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是流感PR8HA25P (420-448)模板化表位5P和模板化表位2是SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是流感PR8HA26P (448-476)模板化表位6P和模板化表位2是SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位?！?br> 在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(492-520)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (171-199)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(492-520)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒3PIV 3F(151-179)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒3PIV 3F(460-488)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (151-179)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒3PIV 3F(460-488)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (151-179)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (151-179)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。
在綴合物的另一種實(shí)施方式中， 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒5PIV 5F(144-172)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒5PIV 5F(453-481)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒5PIV 5F(453-481)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中， 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中， 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (131-159)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒4PIV 4A F(145-173)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (131-159)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒4PIV 4A F(447-475)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒4PIV 4A F(447-475)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F(131_159)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (131-159)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位。在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位。
在綴合物的另一種實(shí)施方式中，模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，綴合物的載體部分是蛋白。蛋白可以是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、霍亂亞單位B、來(lái)自流感嗜血桿菌(H. influenza)的蛋白D或白喉類(lèi)毒素。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，綴合物的載體部分是非蛋白部分。非蛋白部分可以是多糖，比如藻酸(藻酸鹽)。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，載體部分和連接體A (如果存在)、連接體B (如果連接體B存在且連接體A缺乏)、或模板化表位I (如果連接體A和連接體B缺乏)之間的連接是化學(xué)上限定的(definite)。在綴合物的一種實(shí)施方式中，使用的模板化表位不包括其中模板化表位I和模板化表位2 二者具有相同序列的模板化流感表位。 在綴合物的一種實(shí)施方式中，使用的模板化表位不包括模板化流感表位。在本文描述的肽、表位和模板化表位的任何一種實(shí)施方式中，在“a”或“d”位置的I個(gè)、2個(gè)或3個(gè)殘基可以從所指示的殘基變化。在一種實(shí)施方式中，I個(gè)“a”殘基選自不同于異亮氨酸的氨基酸。在一種實(shí)施方式中，2個(gè)“a”殘基獨(dú)立地選自不同于異亮氨酸的氨基酸。在一種實(shí)施方式中，3個(gè)“a”殘基獨(dú)立地選自不同于異亮氨酸的氨基酸。在一種實(shí)施方式中，I個(gè)“d”殘基選自不同于亮氨酸的氨基酸。在一種實(shí)施方式中，2個(gè)“d”殘基獨(dú)立地選自不同于亮氨酸的氨基酸。在一種實(shí)施方式中，3個(gè)“d”殘基獨(dú)立地選自不同于亮氨酸的氨基酸。在一種實(shí)施方式中，I個(gè)或2個(gè)“a”殘基獨(dú)立地選自不同于異亮氨酸的氨基酸和I個(gè)“d”殘基獨(dú)立地選自不同于亮氨酸的氨基酸。在一種實(shí)施方式中，I個(gè)“a”殘基獨(dú)立地選自不同于異亮氨酸的氨基酸和I個(gè)或2個(gè)“d”殘基獨(dú)立地選自不同于亮氨酸的氨基酸。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包含試劑盒，其包括組合物和在受試者中使用的說(shuō)明書(shū)，所述組合物包括本發(fā)明的綴合物。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包含在有需要的個(gè)體中誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的方法，該方法包括以足以在個(gè)體中誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的量施用本文公開(kāi)的任何一種綴合物至需要其的個(gè)體。在一種實(shí)施方式中，抗體應(yīng)答是產(chǎn)生中和抗體。附圖簡(jiǎn)述圖I是模板化綴合物的示意圖。(A)具有任選的連接體C ； (B)具有任選的連接體D0圖2顯示在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)中殘基的排列。圖3描繪用于產(chǎn)生衍生自流感病毒PR8的3個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖4描繪用于產(chǎn)生衍生自嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒的同雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列(A)。圖5描繪用于產(chǎn)生衍生自流感和SARS病毒組合的3個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖6描繪用于產(chǎn)生衍生自呼吸道合胞體病毒(RSV)的3個(gè)同雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。
圖7描繪用于產(chǎn)生衍生自呼吸道合胞體病毒(RSV)的3個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖8描繪用于產(chǎn)生衍生自副流感病毒3(PIV3)的3個(gè)同雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖9描繪用于產(chǎn)生衍生自副流感病毒3(PIV3)的3個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。

圖10描繪用于產(chǎn)生衍生自RSV和PIV3組合的4個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖11描繪用于產(chǎn)生衍生自副流感病毒5(PIV5)的3個(gè)同雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。
圖12描繪用于產(chǎn)生衍生自副流感病毒5(PIV5)的3個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖13描繪用于產(chǎn)生衍生自RSV和PIV5組合的4個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖14描繪用于產(chǎn)生衍生自副流感病毒4(PIV5)的3個(gè)同雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖15描繪用于產(chǎn)生衍生自副流感病毒4(PIV5)的3個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。圖16描繪用于產(chǎn)生衍生自RSV和PIV4組合的4個(gè)雜雙鏈模板化肽綴合物(B)的天然序列㈧。發(fā)明詳述在一種實(shí)施方式中,本發(fā)明包含模板化綴合物,用于在受試者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答?！笆茉囌摺币馑际羌棺祫?dòng)物，比如鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類(lèi)?！胺沁z傳編碼的”氨基酸是與遺傳密碼使用的20種氨基酸不同的氨基酸。這20種遺傳編碼的氨基酸是L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纟顏氨酸。本發(fā)明中使用的非遺傳編碼的氨基酸的例子為正亮氨酸、α-氨基-3-胍基丙酸和β-丙氨酸。如本文所使用，“疫苗”是用于誘導(dǎo)個(gè)體中的免疫應(yīng)答的免疫原性制劑。疫苗可具有多于一種為免疫原性的組分。疫苗可用于預(yù)防性和/或治療性目的。疫苗不必要必須預(yù)防病毒感染。不被理論所束縛，本發(fā)明的疫苗可以以這樣的方式影響個(gè)體的免疫應(yīng)答當(dāng)如本文所描述的施用疫苗時(shí)，病毒感染以較少的量發(fā)生(包括根本沒(méi)有發(fā)生)或改善病毒感染的生物或生理作用。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“表位”指包含能夠引起免疫應(yīng)答的區(qū)域和/或包含能夠特異性結(jié)合抗體的區(qū)域的分子(或分子締合)。表位可選自，例如之前未知與抗體特異性結(jié)合的蛋白的部分。“特異性結(jié)合”指解離常數(shù)為不大于約10_6Μ，優(yōu)選地不大于約10_7Μ，更優(yōu)選地不大于約10_8Μ，仍更優(yōu)選地不大于約10_9Μ，再更優(yōu)選地不大于約KTkiM,或可選地親和力為至少約106/Μ，優(yōu)選地至少約107/Μ，更優(yōu)選地至少約108/Μ，仍更優(yōu)選地至少約109/Μ，再更優(yōu)選地至少約101CI/M的結(jié)合。物質(zhì)的“有效量”或“足夠量”是足以引起期望生物作用比如有益結(jié)果——包括臨床結(jié)果的量，因此，“有效量”取決于其應(yīng)用的背景。在本發(fā)明的背景下，疫苗的有效量的例子是在個(gè)體中足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(例如，抗體產(chǎn)生)的量。有效量可以以一次或多次給藥施用。免疫應(yīng)答的“刺激”或“誘導(dǎo)”可包括體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。一方面，其指與根本沒(méi)有給予疫苗的免疫應(yīng)答相比應(yīng)答增加，這可源自引起應(yīng)答和/或應(yīng)答增強(qiáng)。如本文所使用的，并如本領(lǐng)域所熟知的，“治療”是用于獲得有益的或期望的結(jié)果——包括臨床結(jié)果——的方法。為了本發(fā)明的目的，有益的或期望的臨床結(jié)果包括但不限于一種或多種癥狀的緩解或改善、感染程度的減小、感染的穩(wěn)定狀態(tài)(即，不惡化)、感染狀態(tài)的改善或減輕和病毒效價(jià)的降低(無(wú)論可檢測(cè)的或檢測(cè)不到的)?！爸委煛笨梢仓概c如果不接受治療期望的存活相比延長(zhǎng)存活。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知病毒感染(比如流感感染)的癥狀，并可包括但不限于發(fā)燒、咳嗽、流鼻涕、充血、肌肉疼、喘鳴、惡心和疲勞。 “保護(hù)性免疫應(yīng)答”可包括提供有益的或期望的臨床結(jié)果的任何免疫應(yīng)答。在個(gè)體中提高存活率可認(rèn)為是保護(hù)性免疫應(yīng)答。在某些疫苗實(shí)施方式的情況下，“寬保護(hù)性”指誘導(dǎo)針對(duì)不同流感病毒例如，針對(duì)多種血清學(xué)不同的流感病毒株進(jìn)行保護(hù)的能力。本領(lǐng)域理解“中和抗體”并對(duì)于某些實(shí)例指來(lái)自宿主動(dòng)物的免疫球蛋白，其能夠防止或抑制病毒感染。對(duì)于某些實(shí)施方式，當(dāng)討論血凝素糖蛋白結(jié)構(gòu)時(shí)，“干區(qū)(stemregion) ”與流感HA蛋白的HA2結(jié)構(gòu)域相關(guān)。如本文所使用，烷基是單價(jià)飽和烴，其可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的或其組合。烷基具有指定的碳原子數(shù)目，例如，C1-C12烷基可具有I個(gè)和12個(gè)之間的碳原子，或如果未指定數(shù)目，具有約I至8個(gè)碳原子。烷基的例子為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)丁基、環(huán)丙基-甲基、甲基-環(huán)丙基、戊基、環(huán)戊基、己基、環(huán)己基、庚基、環(huán)庚基、辛基和環(huán)辛基。烷基可在烷基的任何位置處連接至分子的剩余部分，其中氫可從相應(yīng)的烷烴去除。如本文所使用，雜烷基是單價(jià)飽和烴，其可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的或其組合，其中基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)碳原子已經(jīng)用雜原子取代。雜原子包括氧(-0-)、氮(優(yōu)選地用C1-C8烷基，例如，-N(CH3)-取代)和硫(-S-)。雜烷基具有指定的碳原子數(shù)目，例如，C1-C12雜烷基可具有I個(gè)和12個(gè)之間的碳原子，或如果未指定數(shù)目，具有約I至約8個(gè)碳原子；不限制雜原子的數(shù)目，但優(yōu)選地從I個(gè)至3個(gè)雜原子。雜烷基的例子是-0-CH2CH2-0-CH2CH2-0-。如本文所使用，烴基是單價(jià)飽和或不飽和烴，其可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的或其組合，但不包括芳基和芳族體系。烴基具有指定的碳原子數(shù)目，例如,C1-C12烴基可具有I個(gè)和12個(gè)之間的碳原子，或如果未指定數(shù)目，具有約I至8個(gè)碳原子。烴基的例子為甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)丁基、
I,3- 丁間二烯基、環(huán)丙基-甲基、甲基-環(huán)丙基、戊基、環(huán)戊基、己基、環(huán)己基、庚基、環(huán)庚基、辛基和環(huán)辛基。烴基可在烴基上任何化學(xué)上可行的位置處連接至分子的剩余部分。如本文所使用的，除非另外指出，單數(shù)形式“一個(gè)(a，an)和“所述”包括復(fù)數(shù)參考。例如，“一個(gè)”表位包括一個(gè)或多個(gè)表位。通用方法除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、核酸化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中充分地闡釋?zhuān)热?，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook 等，1989)和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook 和 Russel, 2001)，(本文一起或單獨(dú)地稱(chēng)為 “Sambrook” )。OligonucleotideSynthesis (M. J. Gait, ed. , 1984) ；AnimaI Cell Culture (R. I. Freshney, ed. , 1987)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds. ) ；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等，eds. , 1987,包括至 2001年的補(bǔ)充)；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等，eds. , 1994) ；CurrentProtocols in Immunology(J. E. Coligan 等，eds. ,1991) ；The Immunoassay Handbook(D·.Wild, ed. ,Stockton Press NY,1994) ；Bioconjugate Techniques(Greg T. Hermanson,ed.,Academic Press, 1996) ；Methods of Immunological Analysis(R. Masseyeff,ff. H. Albert,和 N. A. Staines, eds. , Weinheim :VCH Verlags gesellschaft mbH,1993), Antibodies,A Laboratory Manual, (Harlow 和 Lane, Cold Spring Harbor Publications, New York,1988) ；Using Antibodies A Laboratory Manual (Harlow 和 Lane, Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1999),Current Protocols in Nucleic acidChemistry (Beaucage 等 eds. , John Wiley & Sons, Inc. , New York,2000) ；Protocolsfor Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties(Agrawal, ed. , HumanaPress Inc. , New Jersey,1993), Vaccines (Plotkin 和 Orenstein, eds. ,4th ed. 2004)；和 Vaccines(S. Plotkin,3rd ed. 1999)。模板化綴合物概述在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包含模板化綴合物，比如圖I顯示的那些。綴合物包含第一多肽(模板化表位I)、第二多肽(模板化表位2)、任選的連接體A和任選的連接體B、載體、任選的連接體C (圖1A)、任選的連接體D(圖1B)和任選的表位I修飾和任選的表位2修飾。下面更詳細(xì)討論這些要素的每一個(gè)。載體載體可與綴合物一起使用?？墒褂眠m合用于人類(lèi)或其他哺乳動(dòng)物的任何載體。一方面，用于綴合物的載體通常是蛋白比如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、霍亂亞單位B、來(lái)自流感嗜血桿菌的蛋白D或白喉類(lèi)毒素或非蛋白部分比如多糖藻酸(藻酸鹽)。載體蛋白可增強(qiáng)肽表位的免疫原性。一方面，使用的載體是食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的用于人類(lèi)的載體。任選的連接體A、任選的連接體B連接體A和連接體B是附著至表位指定的模板化表位I的任選組分。它們用于連接模板化表位I以及與模板化表位I相關(guān)聯(lián)的模板化表位2至載體蛋白。它們可提供另外的功能；例如，它們可起到間隔子的作用以確保表位復(fù)合體保持在距載體蛋白足夠距離處，從而期望的肽表位的卷曲螺旋構(gòu)象不被載體蛋白改變。包括非遺傳編碼的氨基酸比如正亮氨酸或α -氨基-3-胍基丙酸或從遺傳編碼的氨基酸可無(wú)干擾地容易檢測(cè)的另一部分提供了檢測(cè)給定制劑中綴合物濃度的簡(jiǎn)單方法。在一種實(shí)施方式中，任選的連接體A是_ CH2-C (=0)-和任選的連接體B是-正売氨酸-甘氨酸-甘氨酸-(-Nle-Gly-Gly-),其中連接體A的亞甲基共價(jià)連接至載體,連接體A的羰基共價(jià)連接至連接體B的正亮氨酸殘基的氨基，和連接體B的C末端甘氨酸共價(jià)連接至模板化表位I的N末端氨基。如果模板化表位I通過(guò)固相肽合成制備，則連接體B可通過(guò)延伸合成容易地并入到模板化表位I上以在模板化表位I的N末端包括Nle-Gly-Gly。當(dāng)連接體A是-CH2-C(=0)_時(shí)，其可通過(guò)使用碘代乙酸酐容易地并入，以將碘代乙酰基I-CH2-C(=0)_連接至連接體B——如果連接體B存在的話，或連接至模板化表位I的N末端——如果連接體B不存在的話。這產(chǎn)生I-CH2-C(=0)-Nle-Gly-Gly-[模板化表位I]，或者如果模板化表位2在并入連接體A之前已經(jīng)連接至模板化表位1，這產(chǎn)生I-CH2-C(=0)-Nle-Gly-Gly-[模板化表位1]-[模板化表位2]。碘代乙?；瘡?fù)合體可接著與包含親和部分比如具有游離硫醇基的半胱氨酸殘基的載體蛋白反應(yīng)，產(chǎn)生[載體蛋 白]-CH2-C(=0)-Nle-Gly-Gly-[模板化表位1]-[模板化表位2]。可使用的其他連接(linkage)包括_00C_(CH2)n_C00--其中η是從I至12的
整數(shù)——作為連接體Α，和-Nle-Gly-Gly-作為連接體B。化合物PGig-OOC-(OE)n-COOH,其中PG#是羧酸保護(hù)基比如叔丁基或芐基，可連接至-Nle-Gly-Gly-[模板化表位1]-[模板化表位2]，以形成PGgg-OOCXOEh-COO-Nle-Gly-Gly—t模板化表位1]-[模板化表位2]?？山又コＷo(hù)基，產(chǎn)生H00C-(CH2)n-C00-Nle-Gly-Gly—[模板化表位1]-[模板化表位2]，其可使用縮合劑比如I-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺(EDC)連接至載體蛋白上的氨基。η的示例性值為η=4(己二酸連接體)或η=3(戍二酸連接體)?？捎米鬟B接體A的另一種連接體是馬來(lái)酰亞胺-(CH2)n-羧酸，形式如下
權(quán)利要求
1.綴合物，包括 約相同長(zhǎng)度的兩條模板化α螺旋多肽，其中每條多肽包含至少一個(gè)七殘基重復(fù)序列； 所述兩條多肽之間的共價(jià)連接；和 與所述多肽之一共價(jià)連接的載體蛋白； 條件是至少一條多肽不衍生自流感病毒蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述兩條多肽具有小于約90%的序列同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中第一多肽包含下列形式 J-C1J^gliJn, 其中[Ι- 3π-(3π- -θπ- ·πιπ]是在所述第一多肽的序列中重復(fù)η次的片段， 其中在每個(gè)片段中的I為異亮氨酸， 在每個(gè)片段中的L為亮氨酸， η為至少3的整數(shù)； i為從I至η的整數(shù)，其中i的值由其出現(xiàn)在所述片段中的位置確定，從而在所述序列中首先出現(xiàn)的N末端片段賦予i=l的值，對(duì)于每個(gè)另外的片段i增加1，并且C末端片段賦予i=n的值； 其中獨(dú)立于在所述第一多肽的所有其他片段中的每個(gè)b、C、e、f和g氨基酸和第二多肽的所有片段，選擇在η個(gè)片段的每個(gè)中的每個(gè)b、C、e、f和g ; 所述b、C、e、f和g氨基酸選自表位； 所述第二多肽包含下列形式 tI-b2i-c2i-L-e2i-f2i-g2i]n, 其中[I-b2i-c2i-L-e2i-f2i-g2i]是在所述第二多肽的序列中重復(fù)η次的片段， 其中在每個(gè)片段中的I為異亮氨酸， 在每個(gè)片段中的L為亮氨酸， η為至少3的整數(shù)并且與所述第一多肽的η相同； i為從I至η的整數(shù)，其中i的值由其出現(xiàn)在所述片段中的位置確定，從而在所述序列中首先出現(xiàn)的N末端片段賦予i=l的值，對(duì)每個(gè)另外的片段i增加1，并且C末端片段賦予i=n的值； 其中獨(dú)立于在所述第二多肽的所有其他片段中的每個(gè)b、c、e、f和g氨基酸和所述第一多肽的所有片段，選擇在η個(gè)片段的每個(gè)中的每個(gè)b、c、e、f和g ; 所述b、C、e、f和g氨基酸選自與所述第一多肽的表位不同的表位。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的綴合物，其中η是3和15之間的整數(shù)，并包括3和15。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中每條多肽包含至少四個(gè)七殘基重復(fù)序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的綴合物，其中單個(gè)另外的異亮氨酸殘基緊接在最后的七殘基重復(fù)序列之后存在。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中所述綴合物具有下列形式 [載體部分]-[連接體Α]-[連接體B]-[模板化表位I]-[表位I修飾體] [模板化表位2]-[表位2修飾體] 其中連接體Α、連接體B、表位I修飾體和表位2修飾體任選地存在；和 任選地包括模板化表位I和模板化表位2之間的另外的共價(jià)連接體C ；任選地包括表位I修飾體和表位2修飾體之間的另外的共價(jià)連接體D，或任選地包括模板化表位I和模板化表位2之間的另外的共價(jià)連接體C和表位I修飾體和表位2修飾體之間的另外的共價(jià)連接體D。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物，其中存在所述表位I修飾體和所述表位2修飾體，并選自親水的、極性和帶電的氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物，其中存在所述[連接體A]部分，并且是非遺傳編碼的氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物，其中存在所述[連接體B]部分，并選自-Gly-、-Gly-Gly-、-(Gly)3-和 _ (Gly) 4_。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物，其中模板化表位I和模板化表位2獨(dú)立地選自 流感PR8HA23MP (381-409)模板化表位3MP (IKSLQNAINGLTNKINTLIEKINILFTACRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 流感PR8HA25P (420-448)模板化表位5P (IENLNKKiDDLFLDiWTLNAEiLVLLENCRR-酰胺(seq id no))； 流感PR8HA26P (448-476)模板化表位6P (IRTLDFHISNLKNLIEKLKSQIKNLAKECRR-酰胺(SEQ ID NO:))； SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位 (ISGLNASIVNLQKEIDRLNEVIKNLNESCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位 (ILHLEGEINKLKSAILSLNKAIVSLSNGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))， 呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位 (ILSLNKAIVSLSNGISVUSKILDLKNYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 呼吸道合胞體病毒RSV A2F (492-520)模板化表位 (ISQLNEKINQLLAFIRKiJ)ELIHNLNAGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位 (IEKLKEAlRDLNKAlQsLQssiGNiJVACRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒3PIV 3F(151-179)模板化表位 (IRDLNKAlQsLQssiGNiJVAIKsLQDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒3PIV 3F (460-488)模板化表位 (Inklksdieelkewirrlnqkidslgnwcrr-酰胺(seq id no))； 副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位 (INELAAAILNLKNAIQKLNAAIADiJQACRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位 (IQKLNAAIADiJQAIQSLGTAIQALQDHCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒5PIV 5F (453-481)模板化表位 (lAALNKSISDaQHIAQLDTYISAUSACRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒4PIV 4A F(131-159)模板化表位 (Iqelaklililkkaitelneairdlanscrr-酰胺(seq id no))； 副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位(ITELNEAIRDLANSIKILVKMISALQNQCRR-酰胺(SEQ ID NO:));和副流感病毒4PIV 4A F (447-475)模板化表位(ILDLSTDINQLNQLIKSLEDHIQRLTDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:)) 條件是模板化表位I和模板化表位2不相同。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物，其中模板化表位I和模板化表位2相同，并且兩者都選自下列序列之一 SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位 (ISGLNASIVNLQKEIDRLNEVIKNLNESCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位 (ILHLEGEINKLKSAILSLNKAIVSLSNGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))· 呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位 (ILSLNKAIVSLSNGISVLTSKILDLKNYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 呼吸道合胞體病毒RSV A2F (492-520)模板化表位 (ISQLNEKINQLLAFIRKLDELIHNLNAGCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位 (IEKLKEAIRDLNKAIQSLQSSIGNLIVACRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒3PIV 3F(151-179)模板化表位 (IRDLNKAIQSLQSSIGNLIVAIKSLQDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒3PIV 3F (460-488)模板化表位 (Inklksdieelkewirrlnqkidslgnwcrr-酰胺(seq id no))； 副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位 (INELAAAILNLKNAIQKLNAAIADiJQACRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位 (IQKLNAAIADiJQAIQSLGTAIQALQDHCRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒5PIV 5F (453-481)模板化表位 (lAALNKSISDaQHIAQLDTYISAUSACRR-酰胺(SEQ ID NO:))； 副流感病毒4PIV 4A F(131-159)模板化表位 (Iqelaklililkkaitelneairdlanscrr-酰胺(seq id no))； 副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位 (ITELNEAlRDLANsiKIiJKMisALQNQCRR-酰胺(SEQ ID NO:));或 副流感病毒4PIV 4A F (447-475)模板化表位 (ILDLsTDINQLNQLIKsLEDHIQRiJDYCRR-酰胺(SEQ ID NO:))。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中 模板化表位I是流感PR8HA23MP (381-409)模板化表位3MP和模板化表位2是SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位； 模板化表位I是流感PR8HA25P (420-448)模板化表位5P和模板化表位2是SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位；或 模板化表位I是流感PR8HA26P (448-476)模板化表位6P和模板化表位2是SARS冠狀病毒S2的HRC結(jié)構(gòu)域(1151-1179)模板化表位。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中 模板化表位I是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位； 模板化表位I是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (492-520)模板化表位；或 模板化表位I是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (171-199)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(492-520)模板化表位。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中 模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒3PIV 3F(151-179)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒3PIV 3F (460-488)模板化表位；或 模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (151-179)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒3PIV 3F(460-488)模板化表位。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中 模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (144-172)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (151-179)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位；或 模板化表位I是副流感病毒3PIV 3F (151-179)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒5PIV 5F (453-481)模板化表位；或 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒5PIV 5F(453-481)模板化表位。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (130-158)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位；或 模板化表位I是副流感病毒5PIV 5F (144-172)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中 模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (131-159)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (131-159)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒4PIV 4A F (447-475)模板化表位；或 模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位和模板化表位2是副流感病毒4PIV 4A F(447-475)模板化表位。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中 模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (131-159)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F (157-185)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (131-159)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位； 模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(171-199)模板化表位；或 模板化表位I是副流感病毒4PIV 4A F (145-173)模板化表位和模板化表位2是呼吸道合胞體病毒RSV A2F(157-185)模板化表位。
21.在有需要的受試者中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括以足夠的量施加根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物至受試者以產(chǎn)生所述保護(hù)性免疫應(yīng)答。
22.根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物，其中所述載體部分選自蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、霍亂亞單位B、來(lái)自流感嗜血桿菌的蛋白D、白喉類(lèi)毒素、非蛋白部分、多糖或藻酸(藻酸鹽)。
23.根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物，其中所述載體部分和連接體A(如果存在)、連接體B (在不存在連接體A的情況下如果存在)或模板化表位I (如果連接體A和連接體B都不存在)之間的連接是化學(xué)上限定的。
24.在有需要的個(gè)體中誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的方法，所述方法包括以足以在所述個(gè)體中誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的量施用根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物至有需要的個(gè)體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述抗體應(yīng)答是產(chǎn)生中和抗體。
26.在有需要的個(gè)體中誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的方法，所述方法包括以足以在所述個(gè)體中誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的量施用根據(jù)權(quán)利要求7所述的綴合物至有需要的個(gè)體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述抗體應(yīng)答是產(chǎn)生中和抗體。
全文摘要
公開(kāi)了從在病原體比如病毒中發(fā)現(xiàn)的天然存在的蛋白序列制造的模板化綴合物。該序列被“模板化”成共有卷曲螺旋序列，以便形成適合免疫受試者的雙鏈抗原。
文檔編號(hào)A61K39/385GK102946901SQ201180016269
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者R·S·霍奇斯, K·V·霍爾姆斯, Z·顏, W·J·哈特索克, Z·錢(qián), B·E·B·希爾什 申請(qǐng)人:科羅拉多大學(xué)董事會(huì)，法人