專利名稱：低白蛋白血癥改善用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低白蛋白血癥改善用組合物，詳細(xì)地說，涉及適合使用于輸液制劑、口服制劑、飲食品等形態(tài)的低白蛋白血癥改善用組合物。
背景技術(shù)：
為了改善起因于肝臟疾病等的低白蛋白血癥，以往廣泛使用含有支鏈氨基酸的氨基酸制劑。對于這樣的含有支鏈氨基酸的低白蛋白血癥改善用的氨基酸制劑，要求作為有效性的指標(biāo)的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生的效果、以及作為安全性的指標(biāo)的副作用的降低。作為該支鏈氨基酸，可舉出纈氨酸、亮氨酸以及異亮氨酸3種，作為含有上述纈氨酸、亮氨酸以及異亮氨酸全部作為有效成分的氨基酸制劑的一個(gè)例子，廣泛使用例如Livact (注冊商標(biāo))。含有上述全部3種支鏈氨基酸的以往的氨基酸制劑，對于肝臟疾病患者的低白蛋 白血癥改善作用，無法達(dá)到臨床上的要求，從上述的有效性的觀點(diǎn)考慮，目前期望進(jìn)一步改善低白蛋白血癥的新的醫(yī)藥品或食品。另外，含有上述全部3種支鏈氨基酸的以往的氨基酸制劑，有可能導(dǎo)致惡心、腹脹、腹瀉、便秘、腹部不適、腹痛、嘔吐、食欲不振、胃灼熱等副作用。由于這些副作用起因于生物體內(nèi)蛋白質(zhì)量的負(fù)荷過大，因而蛋白質(zhì)量多的以往的氨基酸制劑有可能降低依從性。即，從上述安全性的觀點(diǎn)考慮，期望副作用少、依從性良好的低白蛋白血癥改善用的醫(yī)藥品或食品。因此，從上述的有效性和安全性的觀點(diǎn)考慮，提出了考量上述氨基酸制劑中的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等的有效成分之間的疊加、協(xié)同作用或拮抗作用的技術(shù)。例如，日本專利第3712539號(hào)公報(bào)中，公開了僅含有L-纈氨酸作為有效成分，用于改善或治療伴隨肝功能降低的低白蛋白血癥的組合物。該組合物的特征在于完全不含有L-纈氨酸以外的氨基酸作為有效成分，被認(rèn)為副作用少、可改善肝臟疾病等。然而，上述以往的氨基酸制劑或日本專利第3712539號(hào)公報(bào)中公開的組合物不能充分發(fā)揮對氨基酸制劑所期待的有效性、特別是促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果。即，目前尚未能提供可發(fā)揮高的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果，且使副作用降低的安全性高的氨基酸制劑等。專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I日本專利第3712539號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于這些不良情況，目的在于提供可發(fā)揮高的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果、同時(shí)副作用降低的安全性高的低白蛋白血癥改善用組合物。本發(fā)明人推測，作為支鏈氨基酸的纈氨酸、亮氨酸以及異亮氨酸中的纈氨酸，在人肝細(xì)胞中，具有對亮氨酸和異亮氨酸的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用的拮抗作用(阻礙作用)，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將纈氨酸排除在外，以亮氨酸和/或異亮氨酸作為有效成分的組合物在人肝細(xì)胞水平具有非常高的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果。
其結(jié)果，用于解決上述課題的發(fā)明為一種含有支鏈氨基酸作為有效成分的低白蛋白血癥改善用組合物，其特征在于，作為有效成分，含有亮氨酸和/或異亮氨酸，不含有纈氨酸。由于該低白蛋白血癥改善用組合物實(shí)質(zhì)上不含有纈氨酸，因而可排除對于其它的作為有效成分的亮氨酸和/或異亮氨酸的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用的、因纈氨酸而導(dǎo)致的拮抗作用，其結(jié)果，纈氨酸以外的有效成分可在生物體內(nèi)有效地發(fā)揮高的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用。另外，該低白蛋白血癥改善用組合物，由于實(shí)質(zhì)上不含有纈氨酸作為有效成分，因而可減少纈氨酸的部分對應(yīng)的蛋白質(zhì)量的負(fù)荷，其結(jié)果，可降低副作用，提高安全性。特別是，不含有有效成分量的纈氨酸的該低白蛋白血癥改善用組合物，對于葡萄糖耐受異常狀態(tài)的肝臟疾病患者，可大大減輕實(shí)質(zhì)上的糖分負(fù)荷，在血糖管理上也是有用的。該低白蛋白血癥改善用組合物，作為支鏈氨基酸，可以含有亮氨酸和異亮氨酸。這樣，該低白蛋白血癥改善用組合物通過含有亮氨酸和異亮氨酸兩者作為支鏈氨基酸，可疊 加性地發(fā)揮亮氨酸和異亮氨酸各自具有的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用。這樣，含有亮氨酸和異亮氨酸作為支鏈氨基酸的情況下，亮氨酸相對于異亮氨酸的質(zhì)量比優(yōu)選為O. I以上10以下。這樣，通過使亮氨酸相對于異亮氨酸的質(zhì)量比為上述范圍，可有效地發(fā)揮上述的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用的疊加性的提高作用。另外，該低白蛋白血癥改善用組合物，作為支鏈氨基酸，可以僅含有亮氨酸或異亮氨酸。這樣，通過各自單獨(dú)含有僅亮氨酸或異亮氨酸，可進(jìn)一步減輕生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)量的負(fù)荷，可根據(jù)例如肝臟疾病的患者的病情，實(shí)現(xiàn)有效性和安全性的平衡。該低白蛋白血癥改善用組合物可以以輸液制劑的形態(tài)適合地使用。這樣，通過使該低白蛋白血癥改善用組合物為輸液制劑的形態(tài)，可經(jīng)由血管，迅速且有效地將該低白蛋白血癥改善用組合物進(jìn)行給藥。該低白蛋白血癥改善用組合物可以以口服制劑的形態(tài)適合地使用。這樣，通過使該低白蛋白血癥改善用組合物為口服制劑的形態(tài)，可以將該低白蛋白血癥改善用組合物在不伴隨對生物體造成傷害的情況下，容易且方便地進(jìn)行給藥。該低白蛋白血癥改善用組合物可以以飲食品的形態(tài)使用。這樣，通過使該低白蛋白血癥改善用組合物為飲食品的形態(tài)，與上述口服制劑的情況相比，能夠?qū)⒃摰桶椎鞍籽Y改善用組合物更容易地且簡便地進(jìn)行給藥，特別是可實(shí)現(xiàn)Q0L(Quality Of Life)的提聞。在此，“支鏈氨基酸”是指亮氨酸、異亮氨酸以及纈氨酸3種必需氨基酸，還包括它們的鹽、肽或衍生物的形態(tài)?！坝行С煞帧笔侵敢詥为?dú)使用即可發(fā)揮促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用的程度含有的成分。如以上說明的那樣，本發(fā)明的低白蛋白血癥改善用組合物，含有支鏈氨基酸作為有效成分，由于該支鏈氨基酸中實(shí)質(zhì)上不含有纈氨酸，作為制劑等時(shí)可發(fā)揮高的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果，同時(shí)可降低副作用且安全性高，特別是對于葡萄糖耐受異常狀態(tài)的肝臟疾病患者，由于可大大減輕實(shí)質(zhì)上的糖分負(fù)荷，因此可充分解決上述以往的課題。具體地，該低白蛋白血癥改善用組合物可預(yù)防或改善由消化不良或營養(yǎng)失調(diào)導(dǎo)致的從體外攝取營養(yǎng)素的降低、手術(shù)后的低營養(yǎng)狀態(tài)、肝炎或肝硬化等的肝臟疾病造成的蛋白質(zhì)合成降低；腎病綜合征、蛋白喪失胃腸綜合征、燙傷等中出現(xiàn)的生物體內(nèi)蛋白質(zhì)向體外的喪失；嚴(yán)重的感染癥、發(fā)熱、甲狀腺功能亢進(jìn)、惡性腫瘤等疾病中出現(xiàn)的生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解代謝過度；大量的胸膜腔積液或腹腔積液滯留時(shí)、全身浮腫、燙傷發(fā)病等的低白蛋白血癥。進(jìn)而，該低白蛋白血癥改善用組合物可預(yù)防或改善上述低白蛋白狀態(tài)導(dǎo)致的抽筋、肺水腫、腹腔積液、浮腫等癥狀發(fā)生。


圖I為表示實(shí)驗(yàn)I的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式。(低白蛋白血癥改善用組合物)該低白蛋白血癥改善用組合物含有支鏈氨基酸作為有效成分，作為有效成分，含 有亮氨酸和/或異亮氨酸，不含有纈氨酸。這樣，該低白蛋白血癥改善用組合物，由于實(shí)質(zhì)上不含有纈氨酸作為有效成分，雖然詳細(xì)的機(jī)理尚不明確，但認(rèn)為具有下述(A)及(B)的作用效果。(A)纈氨酸是亮氨酸等其它有效成分的重要阻礙因素，推測其具有在生物體內(nèi)對于亮氨酸等有效成分所發(fā)揮的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用的拮抗作用。因此，該低白蛋白血癥改善用組合物，通過實(shí)質(zhì)上不含有纈氨酸作為有效成分，能夠完全排除因纈氨酸對亮氨酸和/或異亮氨酸的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用的拮抗作用，其結(jié)果，纈氨酸以外的亮氨酸等有效成分可在生物體內(nèi)有效發(fā)揮高的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用。(B)該低白蛋白血癥改善用組合物通過實(shí)質(zhì)上不含有纈氨酸，特別是作為制劑使用的情況下，由于可減少纈氨酸的部分對應(yīng)的蛋白質(zhì)量的負(fù)荷，因而可減輕含有全部3種的支鏈氨基酸的以往的氨基酸制劑給予到生物體內(nèi)時(shí)的消化器官系統(tǒng)癥狀或腎臟系統(tǒng)癥狀等的副作用，提高安全性。特別是，纈氨酸為3種支鏈氨基酸中、由于服用而造成血糖值升高的唯一的糖原性氨基酸。肝臟疾病患者服用配合有該作為糖原性氨基酸的纈氨酸的以往的氨基酸制劑時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致肝臟疾病患者進(jìn)食后的血糖值進(jìn)一步上升的副作用。另一方面，該低白蛋白血癥改善用組合物通過實(shí)質(zhì)上不含有纈氨酸作為有效成分，對于葡萄糖耐受異常狀態(tài)的肝臟疾病患者，可大大減輕實(shí)質(zhì)上的糖分負(fù)荷，在血糖管理上也是有用的。作為上述支鏈氨基酸的異構(gòu)體，沒有特別的限定，可舉出例如L型、D型、DL型等。其中，優(yōu)選使用在生物體內(nèi)對白蛋白的合成顯示出親和性的L體的支鏈氨基酸異構(gòu)體。作為上述支鏈氨基酸的形態(tài)，沒有特別的限定，可舉出例如游離形態(tài)的純粹結(jié)晶狀氨基酸、其鹽、肽或衍生物的形態(tài)。作為該支鏈氨基酸的鹽的形態(tài)，可舉出例如鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽、醋酸鹽等藥理學(xué)上可接受的鹽的形態(tài)。另外，作為支鏈氨基酸的肽的形態(tài)，可舉出使支鏈氨基酸形成二肽、三肽等進(jìn)行肽化而得到的肽化物。這樣，通過將上述支鏈氨基酸肽化，這些肽在生物體內(nèi)通過肽酶的作用水解成游離氨基酸而可被有效地利用。進(jìn)而，作為支鏈氨基酸的衍生物，可舉出N-乙?；?DL-亮氨酸、DL-正亮氨酸、N-乙?；?DL-異亮氨酸、4-羥基-L-異亮氨酸、β -甲基正亮氨酸等。這些衍生物在生物體內(nèi)通過?；D(zhuǎn)移酶等的作用形成為游離氨基酸而可被有效地利用。該低白蛋白血癥改善用組合物，作為支鏈氨基酸，可以同時(shí)含有亮氨酸和異亮氨酸。這樣，通過含有亮氨酸和異亮氨酸兩者作為支鏈氨基酸，該低白蛋白血癥改善用組合物，特別是作為制劑使用時(shí)，亮氨酸和異亮氨酸不會(huì)對彼此的白蛋白產(chǎn)生作用起到拮抗作用，在生物體內(nèi)可疊加性地且有效地提高促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果。該低白蛋白血癥改善用組合物，作為支鏈氨基酸，可以僅單獨(dú)含有亮氨酸或異亮氨酸。這樣，通過單獨(dú)含有亮氨酸或異亮氨酸，該低白蛋白血癥改善用組合物，特別是作為制劑使用時(shí)，可進(jìn)一步減輕生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)量的負(fù)荷，有效地降低副作用。因此，該低白蛋白血癥改善用組合物，例如在對肝臟疾病患者的給藥中重視有效性時(shí)，謀求上述的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果的疊加性效果的提高，可以同時(shí)含有亮氨酸和異亮氨酸。另一方面，在對肝臟疾病患者的給藥中重視安全性時(shí)，該低白蛋白血癥改善用組合物，謀求通過減輕上述的蛋白質(zhì)量的負(fù)荷而有效地降低副作用，可僅含有亮氨酸或異亮氨酸。即，該低白蛋白血癥改善用組合物可根據(jù)肝臟疾病的患者的病情實(shí)現(xiàn)有效性和安全性的平衡。
上述亮氨酸相對于異亮氨酸的質(zhì)量比優(yōu)選為O. I以上10以下，更優(yōu)選為O. 5以上3.0以下。這樣，通過使亮氨酸相對于異亮氨酸的質(zhì)量比為上述范圍，該低白蛋白血癥改善用組合物可切實(shí)地發(fā)揮上述的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生作用的疊加性的提高效果。(任意成分等)該低白蛋白血癥改善用組合物，在不損害本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)，可以根據(jù)需要含有上述支鏈氨基酸以外的添加劑。作為該添加劑，可舉出藥學(xué)上或食品衛(wèi)生學(xué)上允許的氨基酸、穩(wěn)定化劑、防腐劑、增溶劑、PH調(diào)整劑、增粘劑、抗氧化劑、著色劑、香料、人工甜味劑等。這些添加劑的配合量可根據(jù)上述支鏈氨基酸的配合量適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。(制劑的形態(tài))該低白蛋白血癥改善用組合物，適合以制劑的形態(tài)使用。作為該制劑的形態(tài)，沒有特別的限定，可舉出例如輸液制劑、口服制劑、經(jīng)皮吸收型制劑、栓劑、貼劑、軟膏劑、巴布齊U、洗劑等的形態(tài)。特別地，該低白蛋白血癥改善用組合物適合以輸液制劑的形態(tài)使用。這樣，通過將該低白蛋白血癥改善用組合物形成輸液制劑的形態(tài)，可通過血管迅速且有效地將該低白蛋白血癥改善用組合物進(jìn)行給藥，可使生物體內(nèi)的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果發(fā)揮至最高。作為上述輸液制劑的種類，可舉出例如注射劑、滴劑等。這樣，將該低白蛋白血癥改善用組合物以注射劑或滴劑的狀態(tài)使用時(shí)，可對該制劑進(jìn)行殺菌且使其與血液等張。另夕卜，將該低白蛋白血癥改善用組合物配制為注射劑或滴劑時(shí)，作為稀釋劑可使用例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、乙氧基化異硬脂醇、聚氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯類，進(jìn)而，可使其含有對于調(diào)整為與體液為等張溶液是充分量的食鹽、葡萄糖或甘油。并且，上述輸液制劑可冷凍保存，還可通過冷凍干燥等除去水分后保存。這樣的通過冷凍干燥保存的上述輸液制劑，在使用時(shí)可加入注射用蒸留水、滅菌水等，再次溶解后使用。該低白蛋白血癥改善用組合物適合以口服制劑的形態(tài)使用。這樣，通過將該低白蛋白血癥改善用組合物形成為口服制劑的形態(tài)，可將該低白蛋白血癥改善用組合物在對生物體不造成的傷害的情況下，容易且簡便地進(jìn)行給藥，可充分發(fā)揮在生物體內(nèi)促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果。作為上述口服制劑的種類，沒有特別的限定，可舉出例如片齊IJ、散齊IJ、顆粒劑、細(xì)粒劑(subtle granules)、丸劑、膠囊劑、含片、咀嚼片、糖楽；劑等。作為上述片劑使用時(shí),可使用低白蛋白血癥改善領(lǐng)域中公知的各種載體。作為該載體，可舉出例如乳糖、白糖、氯化鈉、葡萄糖、脲、淀粉、碳酸鉀、高嶺土、結(jié)晶纖維素、硅酸等賦形劑；水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖液、淀粉液、明膠溶液、羧甲基纖維素、蟲膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等粘合劑；干燥淀粉、海藻酸鈉、瓊脂粉末、昆布糖粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯類、月桂基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、淀粉、乳糖等崩解劑；白糖、硬脂、可可脂、氫化油等崩解抑制劑；季銨鹽、月桂醇硫酸鈉等促吸收劑；甘油、淀粉等保濕劑；淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠狀硅酸等吸附劑；精制滑石、硬脂酸鹽、硼酸粉末、聚乙二醇等潤滑劑等。另夕卜，該片劑可以為根據(jù)需要實(shí)施通常的包衣的片劑，可形成例如糖衣片、明膠包衣片、腸溶包衣片、薄膜包衣片、雙層片、多層片。另外，作為丸劑使用時(shí)，可使用低白蛋白血癥改善領(lǐng)域中公知的各種載體。作為該載體，可舉出例如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、高嶺土、滑石等賦形劑；阿拉伯膠粉末、西黃蓍膠粉末、明膠、乙醇等粘合劑；昆布糖、瓊脂等。 上述口服制劑可以進(jìn)一步含有添加劑。作為該添加劑，可舉出例如表面活性劑、促吸收齊 、填充劑、增量劑、增濕劑、防腐齊 、穩(wěn)定齊 、乳化劑、增溶齊 、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽等，可根據(jù)口服制劑的給藥單位形態(tài)適當(dāng)?shù)剡x擇使用。(飲食品的形態(tài))該低白蛋白血癥改善用組合物適合作為飲食品的形態(tài)使用。這樣，通過將該低白蛋白血癥改善用組合物作為飲食品的形態(tài)使用，與上述口服制劑的情況相比，能夠更容易地且簡便地進(jìn)行給藥，可充分發(fā)揮在生物體內(nèi)的促進(jìn)白蛋白產(chǎn)生效果。進(jìn)而，通過將該低白蛋白血癥改善用組合物形成為飲食品的形態(tài)，可在日常生活中特別容易且簡便地?cái)z取，可實(shí)現(xiàn) QOL(Quality Of Life)的提高。作為上述飲食品，沒有特別的限定，可舉出例如營養(yǎng)補(bǔ)充品、營養(yǎng)功能性食品、特定保健用食品、患者用食品等。另外，作為上述飲食品的形態(tài)，可舉出例如粉末、顆粒、口服液等飲料、膠囊、包括咀嚼片等的片劑、可食性薄膜等。并且，作為這些飲食品的制造方法，只要不損害本發(fā)明的效果就沒有特別的限定，可使用各用途領(lǐng)域的技術(shù)人員所使用的方法。上述飲食品中顆粒狀食品的情況下，作為涉及的粒度,優(yōu)選為20 μ m以上2000 μ m以下，更優(yōu)選為100 μ m以上1500 μ m以下左右，特別優(yōu)選為500 μ m以上1000 μ m以下左右。
涉及的顆粒狀食品可以以顆粒狀態(tài)與水、茶、果汁等飲料共同攝取，還可以溶于飲料后再攝取。另外，本發(fā)明的低白蛋白血癥改善用組合物并不限于上述實(shí)施方式。例如本發(fā)明的低白蛋白血癥改善用組合物的形態(tài)為口服制劑或飲食品的情況下，可以根據(jù)需要添加粘稠劑(增粘劑、凝膠化劑)，配制成凝膠狀或膠凍狀。這樣，通過將本發(fā)明的低白蛋白血癥改善用組合物調(diào)整為凝膠狀或膠凍狀，使得口服給藥變得容易，在胃腸內(nèi)的吸收也變得良好。作為該粘稠劑的種類沒有特別的限定，可舉出例如瓊脂、明膠、角叉菜膠、阿拉伯膠、瓜爾膠、豆角膠、塔拉膠、吉蘭糖膠、凝膠多糖、黃原膠、支鏈淀粉、果膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、其它作為粘稠劑通?？墒褂玫亩嗵穷惖龋鲜鑫镔|(zhì)可以單獨(dú)使用I種或并用2種以上。另外，該粘稠劑的配合比例，相對于100質(zhì)量份的配制成凝膠狀或膠凍狀的低白蛋白血癥改善用組合物，優(yōu)選為5質(zhì)量份以下的比例。以下，基于實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但不能基于該實(shí)施例的記載對本發(fā)明進(jìn)行限定性解釋。<對人培養(yǎng)肝細(xì)胞的白蛋白mRNA表達(dá)及白蛋白分泌量的影響>該試驗(yàn)中，對于人初代培養(yǎng)肝細(xì)胞系，研究由于在各試液中進(jìn)行培養(yǎng)而引起的白蛋白mRNA的表達(dá)能力的變化與分泌的白蛋白量的變化，按照以下方式進(jìn)行實(shí)施。<測定項(xiàng)目>(I)白蛋白mRNA以及次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶I (hypoxanthine phosphor ibosy I transferase,以下簡稱為 “ HPRTI ”)mRNA 測定白蛋白mRNA以及HPRTlmRNA。白蛋白與HPRTl的堿基序列如下所述登陸在GenBank中，它們的堿基序列是按照登陸的堿基序列的堿基序列。白蛋白GenBank 登錄號(hào) XM031322HPRTl =GenBank 登錄號(hào) NM000194需要說明的是，對于HPRT1，作為作為對照的管家基因在同一試驗(yàn)中進(jìn)行測定。白蛋白的測定中使用的各引物和探針的序列被Nishimura, M. , Yoshitsugu, H. , Yokoi, T.,Tateno, C.，Kataoka, M.，Horie, T.，Y oshizato，K. and Naito，S. !Evaluation of mRNAexpression of human drug -metabolizing enzymes and transporters in chimericmouse with humanized liver. Xenobiotica, 35 :877-890(2005)公開。另外，HPRTl 的測定中使用的各引物和探針的序列被Nishimura，M. ,Naito, S. and Yokoi, T. :Tissue_specificmRNA expression profilesof human nuclear receptor subfamilies. Drug Metab.Pharmacokinet.，19 :135-149 (2004)公開。(2)培養(yǎng)基中的白蛋白濃度培養(yǎng)基中的白蛋白濃度通過Human Albumin EIA Kit (TAKARA-BI0株式會(huì)社制)進(jìn)行測定。<供試物質(zhì)>利用以下的物質(zhì)。異亮氨酸(lie):MW131. 17亮氨酸(Leu)MW131. 17纈氨酸(Val)MW117. 15<供試肝細(xì)胞>作為肝細(xì)胞，利用人正常肝細(xì)胞(HumanNormal Hepatocytes, Lot. 100, LMP, ONQ以及 VUA, In Vitro Technologies, Inc.公司制)。< 試劑 >利用以下的試劑和儀器。正常肝細(xì)胞專用培養(yǎng)基試劑盒=Cambrex公司(TAKARA-BI0株式會(huì)社)改良的漢克氏平衡鹽溶液(Hank，sBalanced Salt solution Modified) SIGMA公司，500mL
赫佩斯緩沖液(HEPESBuffer) (IM) : IOOmL丙酮酸鈉溶液(SodiumPyrvate Solution) (IOOmM) : IOOmLAcrodisc 注射器式濾器(Acrodisc Syringe Filters) PallCorpration,產(chǎn)品編號(hào) 4187, 50 個(gè)裝Rneasy Mini Kit (50) :QIAGEN 株式會(huì)社QIAshredder (50) :QIAGEN 株式會(huì)社酵母(Yeast)tRNA GIBC0 BRLTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit Applied Biosystems Fast 96-孔反應(yīng)板(Fast 96-ffell Reaction Plate)(0. ImL) AppliedBiosystems孔板高透光度蓋(OpticalAdhesive Covers) Applied Biosystems24孔平底板(膠原類型I涂布)旭TECHNO GLASS株式會(huì)社15mL 圓維管Falcon維蟲藍(lán)FlowLaboratories LTD. ,O. 4%溶于 O. 85%生理鹽水溶液(saline)β -巰基乙醇SIGMA公司Human Albumin EIA Kit TAKARA-BIO 株式會(huì)社另外，mRNA的定量，使用下述表I所示的各序列的引物對及探針(起始密碼子的位置按照登陸的各堿基序列)，通過RT-PCR(實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)，Real-timequantitative reverse transcription-polymerase reaction)實(shí)施。各弓丨物及探針使用自動(dòng)DNA合成儀制作。[表 I]
___堿基序列從起始密碼子開始的位置
Albumin 正向引物序列號(hào)I1281 - 1302
反向引物序列號(hào)21383 - 1363
___序列號(hào).· 3__1305 - 1334_
HPRT I 正向引物序列號(hào)4 139 - 159反向引物序列號(hào)5 238 - 218_探針序列號(hào)6 _174- 199_〈溶液的配制〉(I) 50 μ g/mL的酵母tRNA液的配制將酵母tRNA用不含有RNase的水稀釋為50 μ g/mL。(2)含有各種受試物質(zhì)的受試液的配制(2-1)緩沖液 A作為緩沖液A，將改良的漢克氏平衡鹽溶液HEPES緩沖液(IM)丙酮酸鈉溶液(IOOmM)以100 : I : 2的比例混合。(2-2)緩沖液 B
作為緩沖液B，將緩沖液A :培養(yǎng)基以9 I的比例混合。(2-3) Livact組成的受試液作為Livact組成的受試液，以Ile、Leu、Val混合后的濃度分別為13. 8mM、27. 7mM、18. 5mM(Livact組成的受試液濃度為60mM)進(jìn)行溶解。另外，溶解的步驟為溶解到緩沖液A后，添加緩沖液A的1/10量的培養(yǎng)基。(2-4) lie、Leu 或 Val 溶液作為lie、Leu或Val溶液，以lie、Leu或Val的濃度為60mM進(jìn)行溶解。另外，溶解的步驟為溶解到緩沖液A后，添加緩沖液A的1/10量的培養(yǎng)基。(2-5)調(diào)整
將(2-3)中配制的Livact組成的受試液及(2_4)中配制的Ile、Leu或Val溶液，使用緩沖液B稀釋3倍，形成20mM的溶液。〈人正常肝細(xì)胞的初代培養(yǎng)〉按照Nishimura 等的方法(Nishimura, M. , Yoshitsugu, H. , Naito, S. andHiraoka， I. !Evaluation of gene induction of drug-metabolizingenzymes andtransporters in primary culture of human hepatocytes using high-sensitivityreal-time reverse transcription PCR. Yakugaku Zasshi，122 :339-361 (2002))，在24孔板中分別注入I X IO5細(xì)胞/400 μ L/孔，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3小時(shí)后更換培養(yǎng)基。21小時(shí)后(自接種開始時(shí)刻24小時(shí)后)更換培養(yǎng)基。之后，每隔24小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基更換。另夕卜，更換的培養(yǎng)基的液量為400 μ L/孔。另外，各受試液的更換在48小時(shí)后更換培養(yǎng)基的時(shí)刻進(jìn)行。〈實(shí)驗(yàn)1>接種人肝細(xì)胞(I X IO5活細(xì)胞/0. 4mL/孔)后，自接種開始時(shí)刻3小時(shí)后以及24小時(shí)后更換培養(yǎng)基。另外，在該接種時(shí)的存活率為90.4% (Lot 100)。接著，自接種開始48小時(shí)后添加供試物質(zhì)，自開始添加該試驗(yàn)物質(zhì)24小時(shí)后，進(jìn)行總RNA提取(使用RneasyMini KU)，再用實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行白蛋白以及HPRTl的mRNA的定量。另外，HPRTl為管家基因，用作內(nèi)標(biāo)?！磳?shí)驗(yàn)2>接種人肝細(xì)胞(I X IO5活細(xì)胞/0. 4mL/孔)后，自接種開始時(shí)刻3小時(shí)后以及24小時(shí)后更換培養(yǎng)基。另外，在該接種時(shí)的存活率為93. 6% (Lot 100),84.2% (Lot LMP)、90.0% (Lot QNQ),84. 3% (Lot VUA)。接著，自接種開始48小時(shí)后添加供試物質(zhì)，自開始添加該供試物質(zhì)24小時(shí)后，提取培養(yǎng)基，定量分泌的白蛋白量?！纯俁NA的配制〉吸除培養(yǎng)基后，使用QIA shredder以及Rneasy Mini Kit提取總RNA。以下描述使用了該Kit的配制方法。在培養(yǎng)開始后3、24、48及72小時(shí)的時(shí)刻，從24孔板的各孔吸除培養(yǎng)基。但是，在培養(yǎng)開始O小時(shí)的時(shí)刻，向15mL的錐管中分取2 X IO5細(xì)胞/管的肝細(xì)胞，離心后，吸除培養(yǎng)基。接著，逐個(gè)添加含有巰基乙醇的RLT溶液(RLT溶液β-巰基乙醇=I : 100)400μ ,吸取(pipetting)后，全部添加至 QIA shredder column,以 15000rpm離心2分鐘。分取溶出液350 μ L，添加等量的70%乙醇溶液。進(jìn)行10秒攪拌3次后，全部添加到Rneasy Mini spin column,以12000rpm離心30秒,再去除收集管內(nèi)的溶出液。添加700 μ L的RWl溶液，以12000rpm離心30秒后，更換收集管。添加500 μ L的RPE溶液，以12000rpm離心30秒后，抽吸去除收集管內(nèi)的溶出液。添加500 μ L的RPE溶液，以15000rpm離心2分鐘后,更換為I. 5mL收集管,添加50 μ L的不含Rnase的水，以IOOOOrpm離心I分鐘，使總RNA溶出。將溶出液使用50 μ g/mL的酵母tRNA溶液稀釋5倍，作為測定用總RNA溶液。另外，提取操作全部在室溫下進(jìn)行。另外，50 μ g/mL的酵母tRNA溶液為將酵母tRNA用不含RNase的蒸懼水稀釋來配制?！磎RNA 的測定〉利用Applied Biosystems 7500 快速序列檢測系統(tǒng)(Fast Sequence DetectionSystem) (Applied Biosystems),按照以下方式對管家基因(HPRTl)及白蛋白的mRNA進(jìn)行定量。RT-PCR使用含有300nM正向引物、900nM反向引物及200nMTaqMan探針的TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit 以 20 μ L/管的系統(tǒng)進(jìn)行。使用 3 μ L 總 RNA溶液。作為RT-PCR的條件，進(jìn)行48°C下30分鐘、隨后95°C下10分鐘的保溫，然后再進(jìn)行95°C下15秒、60°C下I分鐘的循環(huán)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，以此為條件。每個(gè)循環(huán)測定熒光強(qiáng)度。另外，反應(yīng)容器使用Fast 96-孔反應(yīng)板(O. ImL)，蓋子使用孔板高透光度蓋?！窗椎鞍追置诹康亩俊蹬囵B(yǎng)基中的白蛋白濃度通過Human Albumin EIA Kit (TAKARA-BI0株式會(huì)社)進(jìn)行測定。<結(jié)果的計(jì)算方法及統(tǒng)計(jì)處理>(I)mRNA 的定量以HPRTl 的 mRNA 作為內(nèi)標(biāo)。各 mRNA 的定量值通過 ACt 法(Nishimura,M. ,Yaguri,
H.，Yoshitsugu, H.，Naito, S. &Satoh, T.， (2003) YakugakuZasshi, 123,369-375)計(jì)算，試驗(yàn)進(jìn)行三次(triplicate)。白蛋白mRNA的表達(dá)量用以HPRTlmRNA的表達(dá)量為I時(shí)的比表示，其平均值(mean) 土標(biāo)準(zhǔn)差(SD)如表2和圖I所示?！窗椎鞍追置诹康亩俊到Y(jié)果以分Lot的值及平均值(mean) 土標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示?！唇Y(jié)果及考察〉得到的結(jié)果如表2、表3及圖I所示。[表2]
權(quán)利要求
1.一種低白蛋白血癥改善用組合物，該組合物為含有支鏈氨基酸作為有效成分的低白蛋白血癥改善用組合物，其特征在于，作為有效成分，含有亮氨酸和/或異亮氨酸，不含有纈氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的低白蛋白血癥改善用組合物，其中，作為所述支鏈氨基酸，含有亮氨酸和異亮氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低白蛋白血癥改善用組合物，其中，亮氨酸相對于所述異亮氨酸的質(zhì)量比為O. I以上10以下。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的低白蛋白血癥改善用組合物，其中，作為所述支鏈氨基酸，僅含有亮氨酸或異亮氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的低白蛋白血癥改善用組合物，其中，所述低白蛋白血癥改善用組合物為輸液制劑的形態(tài)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的低白蛋白血癥改善用組合物，其中，所述低白蛋白血癥改善用組合物為口服制劑的形態(tài)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的低白蛋白血癥改善用組合物，其中，所述低白蛋白血癥改善用組合物為飲食品的形態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有支鏈氨基酸作為有效成分的低白蛋白血癥改善用組合物，其特征在于，作為有效成分，含有亮氨酸和/或異亮氨酸，不含有纈氨酸。作為上述支鏈氨基酸，只要含有亮氨酸和異亮氨酸即可。亮氨酸相對于上述異亮氨酸的質(zhì)量比優(yōu)選為0.1以上10以下。作為上述支鏈氨基酸，可以僅含有亮氨酸或異亮氨酸。適合使用于輸液制劑、口服制劑或飲食品的形態(tài)。
文檔編號(hào)A61P43/00GK102858334SQ20118001659
公開日2013年1月2日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者土居雅子, 西村益浩, 田村望 申請人:株式會(huì)社大塚制藥工場