專利名稱：促卵泡激素的液體配制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新穎的人類促卵泡激素(FSH)的水性配制品，該配制品可以在環(huán)境溫度或體溫下長時間保持穩(wěn)定，以保證合理的保質(zhì)期。更確切地說，它涉及一種人類促卵泡激素的水性配制品，該配制品包括穩(wěn)定在一種緩沖劑中的治療有效量的人類FSH，該緩沖劑包含一種或多種穩(wěn)定劑、一種非離子型表面活性劑、一種抗氧化劑、無機鹽、和一種或多種防腐劑。
背景技術(shù)：
人類促卵泡激素(FSH)是一種激素，它在促黃體激素(LH)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)的協(xié)同下，在生殖功能中發(fā)揮重要作用。從結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)SH是一種異二聚體糖蛋白，由a和0亞基非共價締合形成。a亞基由92個氨基酸殘基構(gòu)成，而P亞基由111個氨基酸殘基構(gòu)成，每種亞基都保留兩個個天冬氨酸連接的糖基化位點。直到20世紀80年代，F(xiàn)SH的主要來源都是懷孕婦女的尿液。一種進一步純化形式的、尿液衍生的FSH在20世紀90年代被引入，并且之后從1998年開始，一種重組FSH被開發(fā)并廣泛使用。隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，變得有可能在用編碼a和P鏈的核酸序列進行了轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)人類FSH。編碼a和0鏈的DNA序列，和生產(chǎn)重組FSH的方法披露于W088/10270、W086/04589和W00735139中。FSH刺激女性卵巢濾泡的生長和成熟。因此，F(xiàn)SH是一種負責雌性排卵的關(guān)鍵激素，并且被用于治療無排卵性不孕婦女的不孕癥。當前，在市場上，有四種商業(yè)化的重組人類FSH產(chǎn)品；Merck Serono的Gonal - F 和Gonal-F RFF ，及 Organon (Schering Plough)的Puregorft5P Follistim AQ ，都是通過重組DNA技術(shù)在中國倉鼠卵巢(CHO)中生產(chǎn)的?？傮w而言，蛋白質(zhì)具有非常短的半衰期，并且因暴露在不同因素下如不適宜溫度、氣液界面、高壓、物理/機械壓力、有機溶劑和微生物污染中，會經(jīng)歷變性(如聚合、解離和容器表面吸附)。結(jié)果，變性蛋白不再具有本身的物理化學特性和生理活性。蛋白質(zhì)的變性通常是不可逆的，并且因此，蛋白質(zhì)一旦發(fā)生變性，可能不會再將它們的天然特性恢復(fù)到初始狀態(tài)。具體地講，具有由兩個不同的亞基構(gòu)成的異二聚體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)如FSH，具有在水溶液中解離以及吸附在容器內(nèi)表面上的趨勢。解離的蛋白質(zhì)不再具有它們自身的生理活性，并且解離后的單體容易對解離和聚集敏感。另外，吸附在容器內(nèi)表面刪的蛋白質(zhì)易通過變性過程聚集。當聚合的蛋白質(zhì)被給予到人體內(nèi)后，它們可能會是引起多種抗體形成的原因，這些抗體所針對的是一種注入蛋白以及在人體內(nèi)自然產(chǎn)生的蛋白。因此，所關(guān)注的蛋白應(yīng)該在一個足夠穩(wěn)定的狀態(tài)下給予。為此，對于發(fā)展一種防止蛋白質(zhì)在溶液中變性的方法進行了大量的研究。為克服蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性問題，一些基于蛋白質(zhì)的藥物產(chǎn)品通過凍干(冷凍-干燥)變得更穩(wěn)定。作為一個實例，US5270057披露了一種凍干配制品，包括用它的多元羧酸或鹽穩(wěn)定的促性腺激素，優(yōu)選為朽1檬酸和一種非還原二糖，鹿糖。US5650390披露了一種凍干配制品，包括通過蔗糖和甘氨酸的組合穩(wěn)定的FSH、LH或hCG。然而，凍干產(chǎn)品的不方便之處在于在使用它們之前必須將它們?nèi)芙庥谧⑸溆盟?WFI)中進行復(fù)水。另外，凍干產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝包括一個可能導(dǎo)致凍干的蛋白質(zhì)被凍傷的凍干步驟。US5929028披露了一種促性腺激素的穩(wěn)定液體配制品，通過溶解促性腺激素[例如，LH、TSH(促甲狀腺激素)、FSH和hCG]來制備，使用的是由一個穩(wěn)定量的多元羧酸或其鹽、一個穩(wěn)定量的硫醚化合物、一種非還原二糖(如蔗糖)和一種非離子型表面活性劑組成的一種稀釋劑。根據(jù)此工藝，檸檬酸鈉被描述為多元羧酸或其鹽的最優(yōu)選的形式，并且該配制品包含I. 47%的檸檬酸鈉。這種組合物在被配藥前應(yīng)該在2V _8°C下冷藏貯存。在配藥后，該產(chǎn)品可以由患者在2°C_8°C下貯存至有效期，或在25°C (77° F)及更低的溫度下貯 存三個月，以最先發(fā)生者為準。EP1610822的申請描述了 FSH、LH、以及FSH與LH的混合物的藥物配制品，以及生產(chǎn)此類配制品的方法。該發(fā)明描述了 FSH或LH或FSH和LH的一種液體或凍干配制品，包括一種選自Pluronic‘;yF77^PIuronic"' F87>p{uronic'5F88>^PpiUionic '<;F68 的表面活性劑。此專利申請中描述的組合物在被配藥前需要在2°C -8°C下冷藏。在用稀釋劑進行復(fù)水后，包含藥物產(chǎn)品的Pen裝置可能由患者在2V _8°C下貯存至有效期，或者在室溫20°C -25°C下貯存長達三個月或者到有效期，以先發(fā)生者為準。W02007/037607披露了一種FSH的水性配制品，該配制品被穩(wěn)定以長時間地保持FSH的活性。該專利申請要求了一種水性配制品，該配制品包括一個治療有效量的FSH，被穩(wěn)定在一種包含甘氨酸、甲硫氨酸和一種非離子型表面活性劑(優(yōu)選為聚山梨醇20)的磷酸鹽緩沖劑中，能夠?qū)SH的活性維持一個延長的時間段。該組合物包含甘氨酸、甲硫氨酸、作為穩(wěn)定劑的聚山梨醇20以及在室溫下長達六個月保持穩(wěn)定并且經(jīng)歷較少氧化的、純度為90%的FSH。W02009/098318的申請披露了一種液體藥用組合物，包括一種FSH多肽，以及氯化芐烷銨和苯甲醇作為防腐劑。該組合物進一步包括，可任選地一種或多種另外的藥學上可接受的賦形劑。在一個實施方案中，該組合物包含甲硫氨酸作為抗氧化劑。該組合物在2°C至8°C下貯存時表現(xiàn)出良好的貯存穩(wěn)定性。此FSH水性配制品包括聚山梨醇20作為表面活性劑、甘露醇作為緊張調(diào)節(jié)劑、磷酸鹽作為緩沖劑、甲硫氨酸作為穩(wěn)定劑、以及苯甲醇和氯化芐烷銨作為防腐劑，它防止蛋白質(zhì)損耗以及蛋白質(zhì)解離成構(gòu)成單體，由此將FSH穩(wěn)定一個延長的時間段。從以上工藝中可以看出，在將該FSH組合物配藥之前必須將其冷藏貯存在2°C_8°C下。在配藥后，該產(chǎn)品可以由患者在2°C _8°C下貯存至有效期，或在25°C (77° F)及以下溫度，貯存3個月，以先發(fā)生者為準。因此，對于發(fā)展一種新穎的、熱穩(wěn)定的FSH水性配制品存在需要，該配制品被穩(wěn)定以便維持其活性，即使是處于升高的溫度(如體溫)下，因為FSH是自給藥的，并且因此，在旅行中或貯存過程中會便于攜帶，從而避免將產(chǎn)品維持在冷藏(2°C -8°C )條件下的需要。本發(fā)明是鑒于最終用戶所面臨的問題而產(chǎn)生的，最終用戶可能需要在室溫、環(huán)境溫度或體溫下以一種液體形式攜帶該產(chǎn)品而無需冷藏延長的時間段以保證合理的保質(zhì)期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新穎的人類促卵泡激素(FSH)的水性配制品，該配制品可以在環(huán)境溫度或體溫下長時間保持穩(wěn)定，以此維持合理的保質(zhì)期。在一個方面，本發(fā)明提供了一種人類FSH的水性配制品，該配制品包括穩(wěn)定在一種緩沖系統(tǒng)中的一個治療有效量的人類FSH，該緩沖系統(tǒng)包括一種或多種穩(wěn)定劑、一種非離子型表面活性劑、一種抗氧化劑、無機鹽、以及一種或多種防腐劑。在另一方面，本發(fā)明提供了一種人類FSH或其變體的配制品，以及一種選自下組的無機鹽，該組由以下各項組成氯化鈉、氯化鈣和作為耐熱劑的氯化鉀。 在又另一方面，該配制品包含一種多元醇，該多元醇是蔗糖、海藻糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糖醇、或木糖醇，單獨或以它們的組合的形式。人類FSH配制品還由以下各項組成一種基于聚山梨醇酯的非離子型表面活性劑或一種基于泊洛沙姆的非離子型表面活性劑、或它們的組合。在一個方面，該新穎的人類FSH水性配制品還包括選自下組的抗氧化劑，該組由以下各項組成L-甲硫氨酸、亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、丁羥甲苯(BHT)和丁羥苯甲醚(BAH)。本發(fā)明還提供了在人類FSH配制品中加入一種或多種選自下組的防腐劑，該組由以下各項組成苯酚、間甲苯酚、對苯甲酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、烷基防腐劑、芐索氯銨、脫氫醋酸鈉和硫柳汞，或它們的組合。該新穎的人類FSH水性配制品在一個緩沖系統(tǒng)中被維持在pH約6. 5到7. 2，該緩沖系統(tǒng)選自下組，該組由以下各項組成磷酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、精氨酸、TRIS和組氨酸，或它們的組合。本發(fā)明提供了一種人類FSH的配制品，該配制品包括氯化鈉、海藻糖、甘露醇、聚山梨醇20、L-甲硫氨酸、苯酚、磷酸二氫鈉一水合物和磷酸氫二鈉二水合物，并且維持在pH約 6. 5 到 7. 2。本發(fā)明還提供了一種人類FSH的配制品，包括蔗糖、L-甲硫氨酸、聚山梨醇20、苯酚、磷酸二氫鈉一水合物和磷酸氫二鈉脫水物并且維持在PH大約6. 5到7. 2之間。


圖I示出了重組人類促卵泡激素組合物的a和0亞基在40°C下保持7天后的解離比較。條帶I :預(yù)染標準參照物條帶2 :緩沖劑樣品條帶3 :表I給出的組合物(負載4. g的蛋白質(zhì))條帶4 :參比醫(yī)藥產(chǎn)品(Gonal F RFF-Pen)(負載4. 4 U g的蛋白質(zhì))條帶5 :0. 22 Ug解離(通過煮沸)的FSH(4.4 Ug的5.0%)
條帶6 0. 111^完整卩511(4.41^的2.5% )條帶7 :緩沖劑樣品圖2示出了重組人類促卵泡激素組合物的a和0亞基在2V _8°C下放置3個月的解離比較。條帶I :預(yù)染標準參照物條帶2 :表I給出的組合物(負載2. 2ug的蛋白質(zhì))條帶3 :0. 44 Ug 解離(通過煮沸)的 FSH(4. 4 y g 的 10. 0% )條帶4 :0. 22 Ug解離(通過煮沸)的FSH(4. 4 y g的5. 0% )
條帶5 :0. 11 ii g 解離(通過煮沸)的 FSH(4. 4 y g 的 2. 5% )條帶6 :0. 04 Ug解離(通過煮沸)的FSH(4. 4 y g的I. 0% )條帶7 :0. 02 iig 無損傷 FSH (4.4 iig 的 0.5% )條帶8 :0. 04 U g 無損傷 FSH (4. 4 ii g 的 I. 0% )條帶9 :表I給出的組合物(負載4. g的蛋白質(zhì))條帶10 :表I給出的組合物(負載4. g的蛋白質(zhì))條帶11 :表I給出的組合物(負載4. g的蛋白質(zhì))圖3示出了重組人類促卵泡激素組合物的a和0亞基在25°C下放置3個月的解離比較。條帶I :預(yù)染標準參照物條帶2 :表I給出的組合物(負載2. 2 ii g的蛋白質(zhì))條帶3 :0. 44 Ug 解離(通過煮沸)的 FSH(4. 4 y g 的 10. 0% )條帶4 :0. 22 Ug解離(通過煮沸)的FSH(4. 4 y g的5. 0% )條帶5 :0. Iliig 解離(通過煮沸)的 FSH(4.4 Ug 的 2. 5%)條帶6 :0. 04 Ug解離(通過煮沸)的FSH(4. 4 y g的I. 0% )條帶7 :0. 04 V- g 無損傷 FSH (4. g 的 I. 0% )條帶8 :0. 02 u g 無損傷 FSH(4. 4 ii g 的 0. 5% )條帶9 :表I給出的組合物(負載4. g的蛋白質(zhì))條帶10 :表I給出的組合物(負載4. g的蛋白質(zhì))條帶11 :表I給出的組合物(負載4. g的蛋白質(zhì))圖4示出了表I中給出的組合物與參比醫(yī)藥產(chǎn)品相比的RP-HPLC特征曲線。圖5示出了表I中給出的組合物(紅線)與參比醫(yī)藥產(chǎn)品(藍線)相比的SE-HPLC特征曲線。
具體實施例方式本發(fā)明涉及一種新穎的FSH水性配制品，該配制品被穩(wěn)定以便在升高的溫度下維持其活性，其中在55°C下兩小時后的解離量小于5%。在一個實施方案中，本發(fā)明的水性配制品包括重組人類促卵泡激素，連同合適的緩沖劑、抗氧化劑、非離子型表面活性劑、一種或多種穩(wěn)定劑、無機鹽、以及可任選的一種或多種防腐劑。人類促卵泡激素(FSH)由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。FSH作為一種復(fù)雜的異二聚體蛋白，已選擇了一種真核細胞系進行表達工作(中國倉鼠卵巢細胞)。重組人類FSH(rFSH)的藥物制品在批量蛋白質(zhì)來源、純度、比活性、批次間一致性和促黃體激素活性的完全缺失方面與人類絕經(jīng)期促性腺素(hMG)以及第一代泌尿FSH(uFSH)不同。緩沖劑被用于維持該配制品的pH。在另一個實施方案中，在本配制品中使用的緩沖系統(tǒng)包括磷酸鹽緩沖劑、琥珀酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑、精氨酸、TRIS緩沖劑、組氨酸，單獨或者以給出所希望的PH范圍(從6. 5到8)的合適組合的形式。優(yōu)選地，所使用的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑，單獨或者以組合形式。如在此使用的，抗氧化劑是指一種在包含F(xiàn)SH的溶液中減少被氧化的FSH雜質(zhì)/種類的化學品。本發(fā)明中使用的抗氧化劑選自下組，該組由以下各項組成L-甲硫氨酸、亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、丁羥甲苯(BHT)和丁羥苯甲醚(BAH)。更優(yōu)選地，該抗氧化劑是L-甲硫氨酸。在本發(fā)明中使用非離子型表面活性劑是為了阻止FSH或FSH變異體在小瓶、安瓿、卡普耳(carpoule)、藥筒(cartridge)或注射器表面的吸附作用。非離子型表面活性劑使 蛋白質(zhì)溶液的表面張力降低，由此阻止蛋白質(zhì)對疏水表面的吸附或聚集作用。本發(fā)明中使用的非離子型表面活性劑的優(yōu)選實例可以包括一種基于聚山梨醇酯的非離子型表面活性劑和一種基于泊洛沙姆的非離子型表面活性劑，單獨或以組合形式。本發(fā)明使用的穩(wěn)定劑選自下組，該組由以下各項組成氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸，單獨或以組合形式；單糖，如葡萄糖、果糖、木糖和甘露糖，單獨或以組合形式；多元醇，如蔗糖、海藻糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糖醇和木糖醇，單獨或以組合形式。在相對高的溫度下貯存時，多元醇的存在保護了分子。防腐劑是指添加到配制品中的賦形劑或物質(zhì)，當作為多劑量被填充時，其作用為抑菌劑。包含本發(fā)明的配制品的一種防腐的FSH或FSH變體優(yōu)選滿足法定的或規(guī)定的防腐有效性指導(dǎo)原則，以成為一種商業(yè)可行的多劑量產(chǎn)品，優(yōu)選用于人類。本發(fā)明中使用的防腐劑是選自下組，該組由以下各項組成苯酚、間甲苯酚、對苯甲酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、烷基防腐劑(甲基、乙基、丙基、丁基等)、芐索氯銨、脫氫醋酸鈉和硫柳萊，單獨或以組合形式。本發(fā)明的無機鹽包括但不限于氯化鈉、氯化鈣和氯化鉀。這些鹽通過升高產(chǎn)品的熔融溫度并且同時降低分子的非特異性交互作用而充當耐熱劑，由此提高產(chǎn)品在較高溫度下的穩(wěn)定性。它們還防止完整的FSH解離成a和P亞基。以下實例展示了本發(fā)明描述的藥用組合物以及實施本發(fā)明以獲得人類FSH的熱穩(wěn)定的藥物配制品的手段。然而，這些實例不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。實例I 通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)重組人類FSH重組人類FSH是通過標準方法在轉(zhuǎn)染的CHO宿主細胞中生產(chǎn)的。實例2使用海藻糖和甘露醇制備hFSH水性配制品使用包括磷酸二氫鈉一水合物與磷酸氫二鈉脫水物的配制品緩沖劑制備pH 7.0的磷酸鹽緩沖劑。甘露醇、海藻糖和氯化鈉作為緊張調(diào)節(jié)劑及穩(wěn)定劑被添加到該磷酸鹽緩沖劑中。L-甲硫氨酸作為抗氧化劑并且聚山梨醇20作為穩(wěn)定劑被添加到溶液中，以形成一種配制品緩沖劑，用磷酸溶液或氫氧化鈉溶液來調(diào)節(jié)PH以獲得7. 0±0. 2的pH。用WFI使容量達到100%并且將溶液攪拌均勻。將所要求量的配制品緩沖劑與苯酚混合，以形成均勻的混合物。加入計算出的量的rHu FSH原料藥，同時持續(xù)攪拌直到均勻的混合物完全形成。表l:hFSH的配制品
權(quán)利要求
1.一種配制品，該配制品包括人類促卵泡激素(FSH)或其變體以及選自下組的一種無機鹽，該組由氯化鈉、氯化鈣和氯化鉀組成。
2.一種人類FSH或其變體的配制品,包括一種熱穩(wěn)定劑、一種或多種多兀醇、一種非離子型表面活性劑、一種抗氧化劑、一種或多種防腐劑、以及一種緩沖系統(tǒng)，從而將該配制品的pH維持在大約6. 5到7. 2。
3.如權(quán)利要求2所述的配制品，其中所述多元醇選自下組，該組由以下各項組成蔗糖、海藻糖、麥芽糖、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇和山梨醇或它們的組合。
4.如權(quán)利要求2所述的配制品，其中該非離子型表面活性劑是選自下組，該組由以下各項組成一種基于聚山梨醇酯的非離子型表面活性劑、一種基于泊洛沙姆的非離子型表面活性劑或它們的組合。
5.如權(quán)利要求4所述的配制品，其中該非離子型表面活性劑是聚山梨醇20。
6.如權(quán)利要求2所述的配制品，其中該抗氧化劑選自下組，該組由以下各項組成L-甲硫氨酸、亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、丁羥甲苯(BHT)和丁羥苯甲醚(BAH)。
7.如權(quán)利要求2所述的配制品，其中該防腐劑選自下組，該組由以下各項組成苯酚、間甲苯酚、對苯甲酚、鄰甲苯酚、氯甲酚、烷基苯甲酸酯(alkylparaben)、芐索氯銨、脫氫醋酸鈉以及硫柳汞，或它們的組合。
8.如權(quán)利要求2所述的配制品，其中該緩沖劑選自下組，該組由以下各項組成磷酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、精氨酸、TRIS以及組氨酸，或它們的組合。
9.如權(quán)利要求2所述的配制品，其中該pH被維持在約6.5到8. O之間，優(yōu)選在6. 5到7.2之間。
10.如權(quán)利要求I或2所述的配制品，其中該人類FSH是一種天然發(fā)生的FSH或一種重組 FSH。
11.一種人類FSH的配制品，包括氯化鈉、海藻糖、甘露醇、聚山梨醇20、L-甲硫氨酸、苯酚、磷酸鹽緩沖劑并且維持在PH大約6. 5到7. 2之間。
12.—種配制品，包括人類FSH、蔗糖、L-甲硫氨酸、聚山梨醇20、苯酚、磷酸鹽緩沖劑并且維持在PH大約6. 5到7. 2之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促卵泡激素(hFSH)的水性配制品，該配制品被穩(wěn)定從而將hFSH的活性維持延長的時間段。
文檔編號A61K38/24GK102821782SQ201180016736
公開日2012年12月12日 申請日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者蘇迪普·庫馬爾·瑪杰姆德, 馬尼施·庫馬爾·夏爾馬, 塔倫·庫馬爾·古浦塔 申請人:印塔斯生物制藥有限公司