專利名稱：消毒組合物及其在牙齒治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適合用于牙齒治療的消毒或抗菌組合物。更特別地，本發(fā)明涉及組合物，其用于治療或預(yù)防根尖、側(cè)部(lateral)或邊緣牙周炎、齒銀炎(牙銀炎)、種植體周圍炎(種植牙周炎)或其他形式的口腔感染，尤其是在牙髓和/或牙周治療或植入(implant)手術(shù)期間，尤其是在根管治療期間。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的組合物的這些方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根管系統(tǒng)中的微生物和它們的副產(chǎn)物引起牙髓和根尖周(periapical)發(fā)炎(Kakehashi et al, 1965)。因此,認(rèn)為根管系統(tǒng)的不完全消毒是持續(xù)性根尖周炎的主要原因(Seltzer & Bender 1967，Lin et al. 1992)。微生物感染的消除是根管治療的主要目標(biāo)之一。盡管極為努力，然而組織和培養(yǎng)研究證實了在根管治療后微生物的持續(xù)存在(Nairet al.2005)。我們不能使根管系統(tǒng)完全消毒的原因之一是其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性(Vertucci·1984, Wu et al. 2000)。另一個原因是，諸如細(xì)菌的微生物生存于生物膜結(jié)構(gòu)中(Costertonetal. 1995, Watnick & Kolter 2000)。這使得它們對牙髓治療過程更有耐性。由于其復(fù)雜的形態(tài)，根管系統(tǒng)的徹底機(jī)械清洗是不可能的。進(jìn)行機(jī)械填充以使得能夠用抗菌劑沖洗。目前的根管沖洗劑具有表面工作范圍。由于其反應(yīng)性質(zhì)，最有效的消毒劑次氯酸鈉不從主管(main canal)滲入側(cè)部。一旦次氯酸鈉遇到有機(jī)物質(zhì)就失活(Moorer & Wesselink 1982)。洗必太(雙氯苯雙胍己燒)不滲入生物膜(Zaura-Arite et al.2001)。諸如IKI (IPI)、乙醇或洗必太的沖洗劑在清除根管系統(tǒng)中是不太有效的，因為它們?nèi)狈M織溶解性質(zhì)。在化學(xué)-機(jī)械清創(chuàng)之后平均每顆牙齒上持續(xù)存在4百萬CFU。經(jīng)由副管可以接近根尖周組織的殘余細(xì)菌和其他微生物，保持慢性的炎性過程。取決于牙齒類型，多達(dá)百分之五十牙齒發(fā)生根尖分支。慢性感染和炎癥是牙髓治療失敗的原因。由于檢測失敗的增加，隨著CBCT (錐形束計算機(jī)斷層成像)的引入失敗率將增加(Estrela et al. 2008)。根管治療以兩種方式進(jìn)行i)在牙科醫(yī)生的椅子上的一次會見(就診，session)，用NaOCl作為消毒沖洗劑或ii)包括用NaOCl沖洗的兩次或多次會見(就診)，同時在會見(就診)之間將氫氧化鈣(Ca (OH) 2)封入根管中以便進(jìn)一步消毒。目前Ca(OH)2用作兩次治療會見(就診，session)之間的管內(nèi)涂敷(intracanaldressing)。其pH為12，Ca(OH)2是弱殺菌性的。這在一些關(guān)于細(xì)菌懸浮液(浮游細(xì)菌)的研究中有報道。對經(jīng)診斷患有根尖周炎的受試者給予Ca (OH)2,以便達(dá)到額外的消毒并預(yù)防在兩次治療會見之間的管內(nèi)菌群再生長。用于牙髓的抗菌劑具有一定劣勢。例如，只有當(dāng)氫氧化鈣與微生物直接接觸時是有效的(Siqueira & Lopes 1999)。而且，Ca(OH)2僅對一些菌種是殺菌性的，其刺激微生物菌群向更有耐性的菌種轉(zhuǎn)化(Nakajo et al. 2006)。Ca(OH)2不能根除與牙髓治療失敗相關(guān)的幾腸球菌(E. faecalis) (Siren et al. 1997, Sundqvist et al. 1998)。Ca(OH)2 的長期應(yīng)用削弱了牙質(zhì)，并且Ca(OH)^MU的殘余物難以去除。在我們的研究中觀察到有趣的發(fā)現(xiàn)。使雙菌種生物膜暴露至Ca(0H)2。在最初細(xì)菌百倍減少之后，在一周之后(實驗結(jié)束)細(xì)菌數(shù)量恢復(fù)到十倍減少。這引起了對Ca(OH)2在生物膜上的抗菌效能的懷疑。而且，氫氧化鈣組(類，group)顯示存活菌落存在的生物膜的鈣化(在死/活染色后用共焦激光掃描顯微鏡觀測)。通過用棉球擦拭或用硬塑料設(shè)備刮削不能將鈣化的斑塊從模型中去除。這是本研究有趣的發(fā)現(xiàn)，因為Ca(OH)2是世界上唯一公認(rèn)的管內(nèi)藥物。如果鈣化也發(fā)生在根管中，那么這將更多地妨礙消毒。本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的消毒或抗菌組合物，其能有助于克服目前可用的治療的劣勢
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，典型地感染牙齒組織并引起其炎癥的微生物易受滲透脅迫(osmotic stress)的影響,影響程度為對經(jīng)感染的組織或處于受感染的風(fēng)險中的組織應(yīng)用高滲組合物將治愈或預(yù)防感染和/或由其引起的炎癥。在不希望受到任何特定理論限制的情況下，假設(shè)是由于滲透脅迫，諸如細(xì)菌的引起炎癥的微生物代謝耗盡，而導(dǎo)致其死亡。此外，發(fā)現(xiàn)了牙齒組織感染中涉及的微生物也易受酸性脅迫的影響。在不希望受到任何特定理論限制的情況下，假設(shè)酸性脅迫也有助于諸如細(xì)菌的引起炎癥的微生物代謝耗盡。進(jìn)一步假設(shè)，滲透脅迫和酸性脅迫的組合將比單獨地應(yīng)用這些脅迫因素中的一個更快速地導(dǎo)致微生物的死亡。因此本發(fā)明提供組合物，當(dāng)局部應(yīng)用時，在導(dǎo)致牙齒組織感染的微生物中引起滲透脅迫。本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中提供了組合物，當(dāng)局部應(yīng)用時，在導(dǎo)致牙齒組織感染的微生物中弓I起滲透脅迫以及酸性脅迫。此外，本發(fā)明提供了以上組合物在牙齒治療中的應(yīng)用，尤其是用于治療或預(yù)防根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎、齒齦炎、種植體周圍炎或其他形式的口腔感染，例如在牙髓和/或牙周治療期間，如根管治療。而且，本發(fā)明提供了牙齒治療的方法，尤其是治療或預(yù)防根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎、齒齦炎、種植體周圍炎或其他形式的口腔感染的方法，例如在牙髓和/或牙周治療期間或在植入手術(shù)期間，如根管治療，包括引起滲透和可選地酸性脅迫的組合物的應(yīng)用。而且，本發(fā)明提供了張度劑(tonicity agent)在制備用于牙齒治療的藥物中的應(yīng)用，尤其是在治療或預(yù)防根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎、齒齦炎、種植體周圍炎或其他形式的口腔感染中，例如在牙髓和/或牙周治療期間或在植入手術(shù)期間，如根管治療期間。


圖I :NaCl和Ca(OH)2對糞腸球菌和綠膿桿菌(P. aeruginosa)的減少的影響。圖表顯示了在暴露(小時)至NaCl和Ca(OH)2之后，以log CFU/生物膜(計)的細(xì)菌菌種CFU數(shù)量的減少。陰性對照包括平均2. OxlO8 CFU的糞腸球菌和3. 5xl08 CFU的綠膿桿菌，其數(shù)量隨時間增長。圖2 :用山梨酸鉀 0. 05Μ、0. 5Μ、1Μ、1· 5Μ、2Μ (ρΗ7)、乙酸鈉 O. 5Μ、1Μ、1· 5Μ、2Μ (ρΗ6或7)治療2小時,生物膜的刃天青試驗(Resazurinassay)的突光讀數(shù)。NaOCl充當(dāng)陽性對照，PBS和不治療是陰性對照。最后的柱代表無菌對照。3小時后采集讀數(shù)。
具體實施例方式因此，在第一個方面中，提供了一種組合物，其包括賦予該組合物高滲性的量的張度劑(tonicity agent),該組合物適宜用作牙齒治療中的消毒或抗菌制劑。在本文檔和其權(quán)利要求中，以非限制性意義使用動詞“包括”和其變形，以意指包括該詞后面的項目，而不排除沒有特別提到的項目。此外，通過不定冠詞“一個”或“一種”指代的要素不排除以下可能性，即存在多于一個該要素，除非上下文明確要求有一個且僅有一個該要素。因此不定冠詞“一個”或“一種”通常意味著“至少一個”。本發(fā)明的“組合物”典型地包括兩種或更多種不同物質(zhì)的組合，并且典型地將是以固體、半固體或液體形式，其中半固體指的是流變學(xué)典型的假塑性或塑性流體。適宜的實例包括粉劑、分散劑、乳液、懸浮液和溶液。如上指出的，本發(fā)明的組合物適宜用于牙齒治療， 其意味著該組合物適宜應(yīng)用在人類口腔中。因此，該組合物典型地是“生理可接受的”，即它不包括任何以下量的成分，當(dāng)應(yīng)用在人類受試者的口腔中時，將對所述受試者引起超過任何有益效果的程度的傷害。如在本文中使用的，術(shù)語“張度劑”包括可以溶解在水中以便在張力(滲透壓，tonicity)或水勢中產(chǎn)生差異的任何物質(zhì)。通常，張度劑可以是無機(jī)鹽或有機(jī)鹽、低分子量分子或(水溶性)聚合物。原則上，張力是依數(shù)特性的，即它取決于溶質(zhì)的濃度但不取決于其特性(identity )。因此，在本發(fā)明的背景下，用作張度劑的給定試劑的適用性將取決于其溶解度，高度水溶性試劑典型地優(yōu)選于水難溶性試劑(sparingly water-solubleagent),并且取決于其(被動地或主動地)穿過細(xì)胞膜的能力，由于如果可以形成濃度差異，溶質(zhì)可以僅影響張力。選擇最適當(dāng)?shù)膹埗葎┑拇我紤]可以典型地包括生理可容忍性(physiological tolerability),進(jìn)一步的生物和/或化學(xué)(反應(yīng))活性、處理的容易性和(其他)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境因素。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，提供了任意上文定義的組合物，其中滲透劑(osmotic agent)選自由以下構(gòu)成的組無機(jī)鈉鹽、有機(jī)鈉鹽、無機(jī)鉀鹽、有機(jī)鉀鹽、無機(jī)鎂鹽、有機(jī)鎂鹽、糖醇和其混合物，優(yōu)選由以下構(gòu)成的組無機(jī)鈉鹽、有機(jī)鈉鹽、無機(jī)鎂鹽、有機(jī)鎂鹽、糖醇和其混合物。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常已知的，根據(jù)本發(fā)明，糖醇，也常稱為多元醇，具有通式H(HCHO)n+1H(具有化學(xué)式H(HCHO)nHCO的糖)，并且也可以充當(dāng)張度劑。然而，一些糖醇可以也充當(dāng)牙齒組織中微生物的代謝底物(代謝基質(zhì)，metabolic substrate)或能源，而這些糖醇是為本發(fā)明目的較不優(yōu)選的。優(yōu)選的糖醇是甘露醇。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，提供了任意上文定義的組合物，其中滲透劑選自由以下構(gòu)成的組氯化鈉、碘化鈉、氯化鎂、乙酸鈉、山梨酸鈉、乳酸鈉、甲酸鈉、乙酸鉀、山梨酸鉀、乳酸鉀和甲酸鉀、甘露醇和其混合物，更優(yōu)選由以下構(gòu)成的組氯化鈉、碘化鈉、氯化鎂、乙酸鈉、山梨酸鈉、乳酸鈉、甲酸鈉、甘露醇和其混合物。如上文指出的，本組合物是高滲性組合物?！案邼B性(hypertonic)”通常表示給定的組合物包括比另一種溶液更高濃度的非滲透溶質(zhì)(impermeable solute),以便當(dāng)所述溶液置于半透膜的反面(對側(cè))時產(chǎn)生水勢(water potential)。在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，當(dāng)描述浸沒在外部溶液中的細(xì)胞的應(yīng)答時，典型地采用張力(tonicity)。因此，在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“高滲性”表示組合物中溶質(zhì)的濃度高于與該組合物接觸的細(xì)胞，以便水將從所述細(xì)胞中擴(kuò)散出去。為了本發(fā)明的目的，典型地采用術(shù)語“高滲性”以意指包含以下量的溶質(zhì)的組合物，該量足以產(chǎn)生高于人血液、活細(xì)胞或最優(yōu)選地諸如那些典型地感染牙齒組織引起其發(fā)炎的微生物的細(xì)胞液(細(xì)胞溶質(zhì)、胞液，cytosol)的水勢。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的，在身體治療的部位產(chǎn)生引起滲透脅迫的環(huán)境，不僅可以通過向其應(yīng)用張度劑(多種張度劑)的水溶液，還可以通過以其他形式或制劑應(yīng)用所述試劑(多種試劑)實現(xiàn)，例如包含非溶解形式的張度劑，其可以溶解在應(yīng)用部位存在的生理流體中。本發(fā)明不特別地限制在這個方面中。然而，本發(fā)明的優(yōu)選實施方式提供了任意上文定義的組合物，其中該組合物包括張度劑的高滲性水溶液。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“溶液”用于表示包含水相的組合物，其中張度劑已溶解；不意圖將本發(fā)明的范圍限制于排他地由水溶液相構(gòu)成的組合物。更特別地，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了任意上文定義的組合物，包含水相，其包含以下量的張度劑，該量賦予所述水相高滲性，以及一種或多種其他成分，其實例 將在下文給出，其中的每一種可以溶解在所述水相中或者可以包含在特定相中。優(yōu)選，雖然不必要，本組合物包含水相作為連續(xù)相，該水相中包含溶解的張度劑。因此，在本發(fā)明實施方式中，組合物可以采取包含連續(xù)水相的乳液、懸浮液、分散液或溶液的形式，張度劑以向其提供高滲性的量溶解在其中。如上面指出的，高滲環(huán)境迫使水離開包含在所述環(huán)境中的細(xì)胞。在真核細(xì)胞中，這將導(dǎo)致細(xì)胞形狀變形和裙皺，稱為鋸齒(皺縮，crenation)的狀態(tài)。在包括細(xì)胞壁的細(xì)胞中，效應(yīng)甚至更劇烈?？勺冃蔚募?xì)胞膜從剛性細(xì)胞壁脫離，但是仍然在稱為胞間連絲(plasmodesmata)的點與細(xì)胞壁連接。細(xì)胞呈現(xiàn)針墊狀外形，并且胞間連絲幾乎停止作用，因為它們變得狹窄(constricted)，稱為質(zhì)壁分離的情況。在環(huán)境中的溶質(zhì)為高濃度的情況下，除了水通過滲透從細(xì)胞中滲出之外，還阻止基質(zhì)(substrate)和輔助因子運輸至細(xì)胞中，從而引起細(xì)胞中(高滲性)“脅迫”或“沖擊”。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的，本組合物應(yīng)用于用本發(fā)明治療的部位，以產(chǎn)生高滲環(huán)境以便在所述部位的細(xì)菌和/或其他微生物中引起(高)滲脅迫或沖擊。細(xì)菌和/或其他微生物可以具有以下機(jī)制，其可以使得它們在某種程度上對滲透性沖擊做出應(yīng)答。由于上述考慮，本組合物特別優(yōu)選具有高于血液、細(xì)胞或微生物的細(xì)胞液的同滲容摩(osmolarity)，其大約為0. 3滲摩/L。因此，本組合物的水相包括以下量的張度劑，該量滿足組合物的同滲容摩為至少高于0. 5、1、2、5或10滲摩/L。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的，這意味著如果張度劑是分離成兩種離子的試劑，如本發(fā)明大多數(shù)優(yōu)選的張度劑的情況，這相當(dāng)于該組合物的優(yōu)選摩爾濃度，例如至少0. 25、至少0. 5、至少I、至少2. 5、至少3. 5或至少5。而且，特別優(yōu)選本組合物的水相包含足以產(chǎn)生以下滲透值的量的張度劑，至少0. 125父10^1、至少0. 25父10乍&、至少0· 5X107Pa、至少 I. 25 X 107Pa、至少 2. 5 X IO7Pa 或至少3X107Pa。滲透值,其與滲透壓同義,可以簡單地通過范特霍夫法則(van ‘t Hoff law)計算，該法則通過等式H=RTC描述，其中π是滲透壓(atm. )，R是理想氣體常數(shù)，T是熱力學(xué)(絕對)溫度(開爾文)，C是總?cè)苜|(zhì)濃度，表示為溶質(zhì)的滲透壓摩爾每升溶液，如本領(lǐng)域通常已知的。正如之前在本文中指出的，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本文中稱為有機(jī)酸脅迫的機(jī)制可以適當(dāng)抑制牙齒組織上細(xì)菌的增長。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了任意上文定義的組合物，其包括有效量的有機(jī)酸和/或有機(jī)酸陰離子，尤其是有機(jī)酸和/或有機(jī)酸鹽。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的，水溶性有機(jī)鹽將增加該組合物的張力。因此，在本發(fā)明的實施方式中，張度劑選自有機(jī)酸鹽的組，優(yōu)選有機(jī)酸鈉鹽，如選自由乙酸鈉、山梨酸鈉、乳酸鈉、甲酸鈉和其混合物構(gòu)成的組中的那些和/或選自由乙酸鉀、山梨酸鉀、乳酸鉀、甲酸鉀構(gòu)成的組中的那些，并且該組合物包含向制劑提供高滲性的量的所述有機(jī)酸鹽。在本發(fā)明另一個實施方式中，提供了根據(jù)任何上文的組合物，其包括張度劑的組合，其中，存在的第一試劑選自無機(jī)鹽和糖醇的組，優(yōu)選無機(jī)鈉鹽(如氯化鈉、碘化鈉)、無機(jī)鉀鹽(如氯化鉀和碘化鉀)、無機(jī)鎂鹽(如氯化鎂)、和其混合物，并且存在的進(jìn)一步試劑選自有機(jī)酸和/或其鹽的組，優(yōu)選有機(jī)酸鈉鹽，如乙酸鈉、山梨酸鈉、乳酸鈉、甲酸鈉、乙酸鉀、山梨酸鉀、乳酸鉀和甲酸鉀和其混合物，其中所述試劑的總量向組合物提供高滲性。在另一個實施方式中，存在張度劑的組合，第一試劑選自無機(jī)鹽和糖醇的組，優(yōu)選無機(jī)鈉鹽(如氯化鈉和碘化鈉)、無機(jī) 鎂鹽(如氯化鎂)、和其混合物，以及進(jìn)一步的試劑，選自有機(jī)酸和/或其鹽的組，優(yōu)選有機(jī)酸鈉鹽，如乙酸鈉、山梨酸鈉、乳酸鈉、甲酸鈉和其混合物，其中所述試劑的總量向組合物提供高滲性。在不希望受到任何特定理論限制的情況下，認(rèn)為有機(jī)酸在較低pH值下是最有效的。在溶液中，弱有機(jī)酸在解離態(tài)(dissociated state)和未解離態(tài)(undissociatedstate)之間存在平衡。酸的兩種形式的分布由其pKa值和環(huán)境的pH決定。因此,在酸性更強(qiáng)的環(huán)境中，平衡向未解離形式移動。帶電荷的分子，如質(zhì)子和陰離子，不能穿過脂質(zhì)膜。然而，中性未解離的酸是相對膜可滲透的并且能夠在膜上擴(kuò)散。在細(xì)胞內(nèi)，在解離態(tài)和未解離態(tài)之間形成新的平衡。由于大多數(shù)微生物顯示細(xì)胞內(nèi)的PH接近中性，因此平衡向酸的解離態(tài)移動。因此，質(zhì)子釋放到細(xì)胞液中，降低質(zhì)子梯度。部分用來建立質(zhì)子梯度的能量(例如ATP合成)從而立即喪失。取決于細(xì)胞的緩沖能力，質(zhì)子的進(jìn)入可以使細(xì)胞液酸化。細(xì)胞內(nèi)PH的改變將實質(zhì)上影響所有生物化學(xué)過程，包括氧化還原狀態(tài)、DNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和折疊、酶活性、和在膜上的運輸。由于未解離的酸進(jìn)入到細(xì)胞中是通過擴(kuò)散驅(qū)動的，這個過程持續(xù)直至內(nèi)膜和外膜的片層(層，leaflet)上的未解離酸的濃度相等。環(huán)境(較低的pH)和細(xì)胞的內(nèi)部(較高的pH)之間的初始pH差異越大，細(xì)胞內(nèi)的陰離子濃度可以達(dá)到越高。而且，當(dāng)與有機(jī)酸比較時，生長抑制效應(yīng)似乎與它們的膜溶解性有關(guān)，正如通過辛醇-水分配系數(shù)(log Kow)反映的。為了獲得類似的微生物生長率的降低，通常與較高親水性弱有機(jī)酸相比，需要較低濃度的較高疏水性弱有機(jī)酸。觀察到這種關(guān)系將可能是較高疏水性弱有機(jī)酸較快/較容易進(jìn)入到細(xì)胞中的結(jié)果?？傊?，似乎沒有單一的機(jī)制解釋有機(jī)酸的抗菌活性。認(rèn)為它們的作用模式主要涉及質(zhì)子梯度的消散(解偶聯(lián)Uncoupling))和細(xì)胞液的酸化作用，但是諸如膜破裂的其他因素和通過使特定的酶失活的代謝紊亂也可以是相關(guān)的。與提出的解偶聯(lián)和細(xì)胞液酸化作用的機(jī)制一致，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如果將組合物緩沖至酸性PH值，可以獲得特別好的結(jié)果。因此在發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供了在前文中定義的組合物，其包括緩沖系統(tǒng)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，緩沖系統(tǒng)典型地包括弱酸和其共軛堿(conjugate base)的組合。適宜的和通常已知的生理上可接受的緩沖系統(tǒng)的實例包括以下組合檸檬酸鹽/HCl ;檸檬酸/檸檬酸鹽；蘋果酸/馬來酸鹽、琥珀酸/琥珀酸鹽、乙酸/乙酸鹽、山梨酸/山梨酸鹽、乳酸/乳酸鹽和1 2即04/]\^2 04 (其中M是單價陽離子)。優(yōu)選緩沖系統(tǒng)選自由朽1檬酸鹽/HCl ;梓檬酸/朽1檬酸鹽；蘋果酸/馬來酸鹽、琥拍酸/琥珀酸鹽、乙酸/乙酸鹽、和m2hpo4/mh2po4構(gòu)成的組。因此，本發(fā)明的實施方式中提供了前文中定義的組合物，其包括引起滲透和酸性脅迫的量的以下組合i) 一種或多種有機(jī)酸和/或其鹽，優(yōu)選其鈉鹽或鉀鹽，最優(yōu)選其鈉鹽，優(yōu)選有機(jī)酸選自乙酸、甲酸，山梨酸和乳酸的組；ii) 一種或多種緩沖劑，優(yōu)選由以下構(gòu)成的組檸檬酸鹽緩沖液(緩沖劑，buffer)、琥珀酸鹽緩沖液、馬來酸鹽緩沖液、山梨酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液，更優(yōu)選由檸檬酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、馬來酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液構(gòu)成的組，可選地，iii) 一種或多種另外的張度劑，優(yōu)先選自無機(jī)鈉鹽、無機(jī)鉀鹽、無機(jī)鎂鹽和糖醇，更優(yōu)先選自無機(jī)鈉鹽、無機(jī)鎂鹽和糖醇，最優(yōu)先選自氯化·鈉、氯化鎂、碘化鈉和甘露醇，其中所述試劑的總量向組合物提供高滲性。在優(yōu)選實施方式中，組合物包含列舉的組分i)_iii)的水溶液。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，在水相中組合列舉的組分典型地獲得動力學(xué)平衡的系統(tǒng)，其包括溶解的、未解離的和/或部分解離的有機(jī)酸分子、有機(jī)酸陰離子、無機(jī)陽離子和，可選地，無機(jī)陰離子。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，提供了任意上文定義的組合物，其中該組合物緩沖至低于7的pH。遠(yuǎn)低于5. 5的值在引起酸性脅迫中將仍然是有效的，但是還可以引起牙釉質(zhì)脫鈣，因此不是優(yōu)選的。典型地，該組合物緩沖至5. 5-6. 7范圍內(nèi)的pH，優(yōu)選在5. 7-6. 5范圍內(nèi)，最優(yōu)選在6-6. 25范圍內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，該組合物的最佳pH將尤其取決于選擇的用作引起酸性脅迫試劑的有機(jī)酸。本組合物可以包括一種或多種額外的“活性組分”。在優(yōu)選實施方式中，該組合物包括一種或多種額外的試劑(另外的試劑，additional agent),這些試劑充當(dāng)抗菌劑、防腐齊U、殺微生物劑(microbiocide)、殺細(xì)菌劑(bacteriocide)、殺病菌劑(germicide)、抗生素、細(xì)菌素和/或生物膜抑制劑。這樣的額外活性組分的優(yōu)選實例包括抗菌劑，優(yōu)選選自由以下構(gòu)成的組的那些次氯酸鈉、EDTA、IPI (碘-碘化鉀(iodine potassium iodide), I2KI或“魯戈氏碘液(Lugol’ s iodine)”)、乙醇、洗必太(葡糖酸鹽)、弗氏菌絲素(Framycetin)(硫酸鹽)、β -內(nèi)酰胺、氨基糖苷(aminoglycoside)、三氯生(二氯苯氧氯酹,triclosan)、甲硝唑、四環(huán)素、喹諾酮、植物精油(plant essential oil)、樟腦、麝香草酚、香芹酚、薄荷醇、桉樹腦、和水楊酸甲酯，最優(yōu)選選自由次氯酸鈉、IPI (碘-碘化鉀，I2KI或“魯戈氏碘液”)、乙醇和洗必太構(gòu)成的組中的那些。正如在本文檔的背景技術(shù)部分中表明的，本領(lǐng)域已知大多數(shù)這些試劑在牙齒治療中的應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，盡管存在以下事實與用本組合物治療相比，單獨用這些試劑中的任意一種治療典型地獲得較差的結(jié)果，但它們在本組合物中的合并可以進(jìn)一步增強(qiáng)(可能協(xié)同地)其抗菌作用。確定要并入在本組合物中的適當(dāng)量的這樣的額外成分在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的通常能力內(nèi)。此外，本組合物將典型地包括一種或多種額外成分，如著色劑、增味劑、醫(yī)藥化合物、表面活性劑、去垢劑、穩(wěn)定劑、粘度調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、流量控制添加劑、聚合增稠劑(polymeric thickener)、防腐劑、顯像劑、造影劑和/或?qū)Ρ仍鰪?qiáng)劑等。正如前文指出的，特別優(yōu)選該組合物至少包括水，以便獲得張度劑已經(jīng)溶解在其中的水相以及，可選地，一種或多種含有或不含有緩沖劑的酸性脅迫引發(fā)劑。優(yōu)選本組合物存在于常規(guī)牙科學(xué)中使用的產(chǎn)物形式中。特別地，組合物可以是以選自填料、沖洗液或清洗液的組中的產(chǎn)物形式。在發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，提供了任意上文定義的組合物，其具有凝膠、糊劑、軟膏或黏性或假塑性液體的形式，該組合物包括如在前文中定義的水相，其可以是連續(xù)相或分散相。這樣的組合物特別適合在根管治療期間作為“(臨時)填料”。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，提供了任意前文定義的組合物，其具有液體形式，優(yōu)選溶液、乳液或懸浮液，包括一種或多種上文定義的額外成分分散在所述水相中。這樣的液體組合物特別適合用于牙齒治療，其作為沖洗液、清洗液或作為鉆孔(drilling)或填充流體。同樣，在本文中涉及的不同制劑對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的或者將明了的(參見，例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. MackPublishing Co. (1990))。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明白如何在本說明書的基礎(chǔ)上，在本發(fā)明的范圍內(nèi)設(shè)計和制備適宜的組合物。 如在上文中表明的，本發(fā)明的組合物適合并意圖用于牙齒治療，典型地作為消毒或抗菌制劑。以其最廣義的術(shù)語“牙齒治療”指的是旨在預(yù)防和/或治愈人體的頜部(下頜)、口腔、上頜面區(qū)域以及相鄰和相關(guān)結(jié)構(gòu)的軟組織和硬組織的疾病、紊亂以及病癥的任何治療方法。如在本文中使用的，當(dāng)意指殺死或者抑制諸如細(xì)菌、酵母和霉菌(真菌)、或原生動物、以及破壞性病毒的微生物的生長時，認(rèn)為術(shù)語“消毒劑”和“抗菌劑”是同義的，并且可以互換使用。認(rèn)為殺細(xì)菌劑、抗生素、殺病菌劑和防腐劑都構(gòu)成“抗菌劑”的具體子類。因此，本發(fā)明的具體實施方式
提供如在前文中定義的組合物，其適合或意圖用作防腐劑、抗生素、殺細(xì)菌劑、殺病菌劑或殺真菌劑的制劑。根據(jù)本發(fā)明，組合物優(yōu)選適合并意圖用于治療和/或預(yù)防根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎、齒齦炎、種植體周圍炎或其他形式的口腔感染的方法中，優(yōu)選用于治療根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎、齒齦炎或其他形式的口腔感染的方法中，最優(yōu)選用于治療根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎的方法中。而且，優(yōu)選組合物適合并意圖用于牙髓和牙周治療，尤其是根管治療。因此，在一個實施方式中，提供了如在任何上文中定義的組合物，其包括能夠引發(fā)酸性脅迫的一種或多種試劑，優(yōu)選有機(jī)酸的鈉鹽，在牙齒治療中用作消毒或抗菌制劑，優(yōu)選在牙髓或牙周治療中，尤其是在根管治療中。在另一個實施方式中，提供了這樣的組合物，其用于治療和/或預(yù)防根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎、齒齦炎、種植體周圍炎或其他形式的口腔感染的方法中，更優(yōu)選用于治療和/或預(yù)防根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎、齒齦炎或其他形式的口腔感染的方法中。在另一個實施方式中，提供了如在任何上文中定義的組合物，其包括向組合物提供高滲性的量的張度劑，在牙髓或牙周治療或植入手術(shù)中用作消毒或抗菌制劑，優(yōu)選在牙髓或牙周治療中，尤其是在根管治療中。在另一個實施方式中，提供了這樣的組合物，其用于治療根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎的方法中。本發(fā)明的第二個方面涉及在受試者中的牙齒治療的方法，優(yōu)選牙髓治療或牙周治療，所述方法包括如在之前本文中定義的組合物的使用或應(yīng)用。如可由上文推斷的，優(yōu)選本方法涉及治療和/或預(yù)防根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎；治療和/或預(yù)防齒齦炎；治療和/或預(yù)防種植體周圍炎；治療和/或預(yù)防口腔感染。本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式涉及根管治療的方法。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的，本發(fā)明的治療方法中進(jìn)行的特定步驟將部分地取決于該方法的具體(exact)目標(biāo)和性質(zhì)(nature)。在第一個優(yōu)選的實施方式中，提供了一種用于治療和/或預(yù)防口腔感染的方法，口腔感染包括齒齦炎、種植體周圍炎和牙周炎，其中該方法包括以一定量的沖洗液清洗受感染的牙齒組織或處于受感染的風(fēng)險中的牙齒組織，優(yōu)選整個口腔，該清洗液包括在任何上文中定義的組合物。典型地，本方法包括在治療期間重復(fù)沖洗，優(yōu)選至少兩次，更優(yōu)選至少三次，最優(yōu)選至少4次。在特別優(yōu)選的實施方式中，提供了預(yù)防性治療，其中該方法包括沖洗處于受感染的風(fēng)險中的牙齒組織，優(yōu)選整個口腔，至少每月一次，更優(yōu)選至少每兩周一次，更優(yōu)選至少每周一次，更優(yōu)選至少兩次，更優(yōu)選至少每周四次，例如每日一次或兩次。在本發(fā)明范圍內(nèi)確定最佳治療方案在訓(xùn)練有素的醫(yī)療專業(yè)人員的技能范圍內(nèi)。在第二個優(yōu)選的實施方式中，提供了根管治療的方法，例如治療根尖或側(cè)部牙周炎，其中該方法包括以下步驟i)機(jī)械打開并擴(kuò)大根管的空間，從所述根管空間中去除受感 染的牙髓(pulp);ii)通過用沖洗液沖洗根管空間，對根管空間消毒；iii)用臨時性或永久性填料填充根管空間，以及iv)臨時或永久地密封開口 ；其中如在本文中之前描述的組合物用作所述沖洗液和/或用作所述臨時性根管填充劑(root canal filler)。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用沖洗液和臨時性根管填充劑。而且，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，在機(jī)械打開和擴(kuò)大根管空間的步驟期間，有時可以使用流體，其在本文中指的是“鉆孔流體(鉆孔液體，drilling fluid)”或“填充流體”。根據(jù)本發(fā)明，組合物也可以用于這種特定的目的。在鉆孔/填充期間使用本發(fā)明的高滲流體，將減少生存的微生物在這樣的手術(shù)期間沿著根管移動(drag )。在本方法特別優(yōu)選的實施方式中，使用如上文描述的高滲液體或高滲流體之后，使用蒸餾水(低滲性)。高滲性和低滲性液體和/或流體的使用可以交替若干次。在不希望受任何特定理論的限制的情況下，應(yīng)認(rèn)為這樣的交替使用將更進(jìn)一步增強(qiáng)消毒的過程，因為細(xì)菌將適應(yīng)高滲性和低滲性環(huán)境。適應(yīng)(adaptation)花費時間和能量并且由于代謝耗盡最后將失敗。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知用于治療牙髓管(pulp canal)的技術(shù)，并且本發(fā)明特別地限制在這一點上。常規(guī)的技術(shù)包括使用由扭轉(zhuǎn)的(twisted)或搖動的(grinded)正方形或三角形絲線制作的手動桿(手持桿)，以各種量規(guī)的鉸刀(reamer)或銼刀(file)和/或發(fā)動機(jī)驅(qū)動的旋轉(zhuǎn)挫刀或鉸刀的形式。用于將沖洗液(irrigation liquid)和/或填料引入至根管空間中的各種技術(shù)也是可用的。雖然使用手動沖洗設(shè)備可以沖洗儀器化(instrumented)的牙齒開口，但是用于將治療液弓I入至牙髓腔和髓管中的機(jī)械自動化系統(tǒng)也是可用的。在此之前涉及的治療，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的或者將明了的。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明了如何在前文的基礎(chǔ)上實施本發(fā)明。本發(fā)明的第三個方面涉及試劑盒，優(yōu)選牙髓或牙周試劑盒，其包括第一容器、安瓿或注射器，容納本發(fā)明的消毒劑或抗菌組合物，連同一個或多個選自由以下構(gòu)成的組中的物品(項目，items):牙髓或牙周毛刷(bristle)、鉸刀(reamer)和挫刀；牙髓或牙周沖洗針或頭；牙髓或牙周沖洗器；容納牙髓或牙周治療組合物的另外的容器、安瓿和注射器，該組合物選自根管填充劑、根管封閉劑和牙齒粘固劑(cement);以及螺旋分配器(分配螺旋器，distributing spirals),例如螺旋輸送器(lentulo spirals)。在本文中涉及的各種項目，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知或?qū)⒚髁说?。本發(fā)明的第四個方面涉及張度劑在藥物制備中的應(yīng)用，所述藥物在牙齒治療中用作消毒或抗菌制劑，其中所述消毒或抗菌制劑包括向藥物提供高滲性的量的所述張度劑，根據(jù)已經(jīng)在任何上文中定義的。下列實施例進(jìn)一步示出了本發(fā)明的某些實施方式，而不以任何方式限制其范圍。實施例實駘I進(jìn)行這個實驗以確立本發(fā)明的組合物(實驗藥物或“ E M，，)的效能(有效性)，在根管治療中使用6. 2M的NaCl溶液，并與氫氧化鈣(CH)比較其效能，如在本文檔的背景技術(shù)中已經(jīng)解釋的，目前氫氧化鈣是對治療的選擇。因此，實驗設(shè)置是在糞腸球菌和綠膿桿菌的 生物膜上將EM的殺菌效果與CH進(jìn)行比較。材料和方法最近Deng et al，2009描述了在此處使用的生物膜模型。簡而言之，使附著在訂制的不銹鋼邊緣上的圓形蓋玻片，懸浮在接種細(xì)菌的培養(yǎng)基中。在這個模型中，生物膜生長是對抗重力的活性過程。使用雙菌種生物膜，因為其對抗菌劑增加的耐性(Ozok et al. 2007，Kara etal. 2007, Adriao et al. 2008)。將糞腸球菌選定為測試的生物體，因為報道了與持續(xù)性根尖周病(periapical pathosis)有關(guān)(Sundqvist et al. 1998, Siqueira & Rocas 2004,Stuart et al. 2006)。促進(jìn)其以持續(xù)性損害存在于經(jīng)填充的牙根管中的因子包括以下能力侵入牙質(zhì)管中(Haapasalo&0rstavik 1987，Weiger et al. 2002)、耐受 Ca(OH)2 的堿性pH (Evans etal. 2002, Nakajo et al. 2006)、經(jīng)受長期饑餓(starvation)隨后在血清存在下恢復(fù)(Figdor et al. 2003)、沒有額外的營養(yǎng)素的情況下在根管中長期存活(Sedgleyet al.2005)、以及在實驗室設(shè)置下容易生長。而且，已知糞腸球菌有效地從培養(yǎng)基中積累相容性溶質(zhì)以中和(抵消)增加的滲透壓(Pichereau et al. 1999)。綠膿桿菌是需氧的革蘭氏陰性能動桿菌(motileiOd)，以其優(yōu)良的產(chǎn)生海藻酸鹽的性質(zhì)而聞名。無論表面多么平滑，綠膿桿菌在30秒內(nèi)附著(Vanhaecke et al. 1990)。雖然歸類為需氧的，綠膿桿菌在厭氧條件下存活(Yoon et al.2002)。其存在于牙根管中與失敗的牙髓治療有關(guān)(Ranta etal.1998,Siren et al. 1997)。微生物學(xué)使糞腸球菌V583和綠膿桿菌的細(xì)胞(均為臨床分離物)生長，并在血瓊脂平板上保持為純培養(yǎng)物。在厭氧條件(80%的N2,10%的H2和10%的CO2)下使糞腸球菌生長，同時在空氣中使綠膿桿菌生長，兩者均在37° C下。因為它們的形狀、革蘭氏染色和氣氛偏愛性，用CLSM和CFU區(qū)分兩個菌種是十分簡單的。在生物膜生長期間，培養(yǎng)物和生物膜的過夜生長培養(yǎng)基是腦心浸出物肉湯(8!11，(^0丨(1，8&8丨118如1 5，皿)和BHI-肉湯，其包括0. 5的BHI、50mM的管(pipes)、5%的鹿糖、ImM的Ca2+。在實驗階段，向BHI-肉湯中加入氯化鈉(NaCl)(Merck,達(dá)姆施塔特，德國)以提高滲透值。使用的其他藥物是BHI-肉湯中的飽和Ca(OH)2(淤漿)、2%的次氯酸鈉(NaOCl) (Merck,達(dá)姆施塔特，德國)、在蛋白胨水(水中的1%蛋白胨(Oxoid))中的2%硫代硫酸鈉(STS )，用于中和NaOCl。磷酸鹽緩沖鹽(PBS，Oxoid)用于洗滌陰性對照，對于NaCl、Ca(OH)2作為中和試劑，并且用于連續(xù)稀釋。
生物膜生長通過使一環(huán)(Ioopful)細(xì)菌懸浮在5mL的BHI中并在空氣中在37° C下培養(yǎng)過夜獲得每一種微生物的新鮮培養(yǎng)物。通過600nm的光學(xué)密度測量估算CFU的數(shù)量，并且使讀數(shù)與之前進(jìn)行的細(xì)菌數(shù)量相關(guān)。在包含I. 5mL的BHI-肉湯的24-孔多孔板(GreinerBio-one, Frickenhausen,德國)的孔中接種含有大約2xl09個糞腸球菌的100 μ L和含有大約2χ107個綠膿桿菌的100 μ L0使安裝在訂制的不銹鋼邊緣中的直徑為15mm的圓形蓋玻片(MMG，蓋玻片)懸浮在BHI-肉湯中。生物膜在蓋玻片上生長，能夠用共焦激光掃描顯微鏡(CLSM ；Leica SP2-0BS)監(jiān)測生物膜的生長。使生物膜穩(wěn)固地附著在玻璃片上，在不破壞生物膜的情況下允許處理蓋玻片。在暴露在藥物中之前，使生物膜在蓋玻片上生長96h。在96-h生長之后，生物膜中的生物量增加，同時或多或少地建立了活細(xì)胞的量(Wilsonet al. 1996)。每日更新肉湯。在37° C下于空氣中接種細(xì)菌，并使生物膜生長。在48h之后，借助于CLSM證實生物膜的生長。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，在用Syto 9和碘化丙啶(PI)(LIVE/DEAD BacLight )·染色之后，用CLSM觀測帶有附著的生物膜的三個蓋玻片。完整的活細(xì)胞染成熒光綠，而帶有破損的質(zhì)膜的死亡細(xì)胞染成熒光紅。之后臨床證實了生物膜的生長。實驗在96h之后，將帶有附著的生物膜的蓋玻片浸沒在NaCl-肉湯或Ca(OH)2-肉湯中持續(xù)4h、24h、48h、72h和168h。陰性對照保存在BHI-肉湯中。當(dāng)適用的情況下，每日更新孵育流體。在2%的NaOCl中浸沒10分鐘充當(dāng)陽性對照。在實驗之后，從邊緣上去除蓋玻片，并將蓋玻片浸沒在大量中和試劑中對于NaCl組、Ca(OH)2組和陰性對照在PBS中10分鐘，對于陽性對照在STS中30分鐘。使用無菌棉簽收獲細(xì)菌細(xì)胞，并通過在I. 5mL的試管(Eppendorf, Standard Micro Test Tube 3810)中激烈地上下移動棉簽50次使其再次懸浮于ImL的PBS中。連續(xù)稀釋懸浮液，并將其放置在血瓊脂平板上，用于總的活性數(shù)量測定(CFU)。當(dāng)在空氣中生長時，糞腸球菌和綠膿桿菌的CFU形態(tài)類似于彼此，但是當(dāng)在缺氧下孵育時，與糞腸球菌相比，綠膿桿菌的CFU具有明顯不同的形態(tài)。菌落非常小。因此，在37° C下厭氧地孵育板48h。測定了糞腸球菌(大的白色菌落)和綠膿桿菌(小的黑色菌落)兩者的CFU。然后在空氣中孵育板另外24h，以證明綠膿桿菌(大的黃綠色菌落)的存在或不存在。每一組由三個樣品組成，并且每一次實驗進(jìn)行三次。共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)分析為了成像，使用Leica DM-IRB倒置顯微鏡/SP2-A0BS共焦系統(tǒng)。用40x/NA I. 25HCX PLAPO油鏡(oil objective)獲得圖像(512 X 512像素)。最終像素尺寸是O. 776 μ m。將針孔尺寸設(shè)置為lAiry，導(dǎo)致大約O. 5 μ m的Z分辨率。獲得具有O. 3 μ m步長的圖像棧(image stack)。用488nm激發(fā)，并分別對SYT0-9用500_550nm檢測以及對PI用600-690nm檢測，同時進(jìn)行Syto_9和碘化丙啶(PI)的激發(fā)/檢測。使用圖片倍增管的增益和補償(offset)，將圖像調(diào)節(jié)至系統(tǒng)的全(8位元)動態(tài)范圍。用Leica軟件產(chǎn)生2張圖像(綠色和紅色)的疊加。統(tǒng)計分析用對數(shù)轉(zhuǎn)換CFU數(shù)量。通過單向方差分析(ANOVA)分析數(shù)據(jù)，以將實驗組與陰性對照進(jìn)行比較。顯著性水平設(shè)置為a=0. 05。用統(tǒng)計包SPSS版本12 (SPSS Inc.芝加哥，IL，USA)進(jìn)行分析。結(jié)果微生物學(xué)與對照相比，以log CFU減少每生物膜給出結(jié)果(圖I)。對照包括8. l±0.61og(CFU)微生物每生物膜,其隨時間逐漸增加。對于糞腸球菌和綠膿桿菌兩者在72h之后和在168h之后在NaCl組中的CFU的平均log減少分別為6和8，并且與對照相比，是統(tǒng)計上顯著的。在168h，對照生物膜包含平均I. 5x109CFU的綠膿桿菌，在168h之后不能檢測到NaCl。糞腸球菌減少至平均40CFU。減少對于兩個菌種是非常顯著的(P〈0. 001)，并且顯示隨時間的顯著線性趨勢。Ca(OH)2顯著減少綠膿桿菌，(P=O. 02)，然而，隨著增加的應(yīng)用時間，減少沒有增 力口。Ca(OH)Jf糞腸球菌的減少是不顯著的(P=O. 09)。在72h之后對于兩個菌種檢測到log2減少，但是在168h之后，細(xì)菌恢復(fù)增長直至平均log I減少。在10分鐘暴露之后NaOCl組顯示100%死亡。在實驗階段之后，用視覺觀察暴露至NaCl的蓋玻片，顯示沒有生物膜蝕斑(biofilm plaque)的跡象。在Ca(OH)2組中，出乎意料地觀測到蝕斑的f丐化。在24h之后，所有樣品顯示生物膜鈣化。在實驗期間蝕斑的厚度增加。鈣化的蝕斑穩(wěn)固地附著在蓋玻片上并且通過用棉簽擦拭不能完全去除。共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)對照生物膜顯示活細(xì)胞和死細(xì)胞的質(zhì)量嵌入非晶質(zhì)量(amorphousmass)中。NaCl影響存活的細(xì)菌細(xì)胞的生長模式。用視覺觀測以及在CLSM圖像上，沒有非晶生物質(zhì)是可見的。因為NaCl組的蓋玻片幾乎不包含細(xì)菌，我們以更高的放大率檢測蓋玻片以尋找留下的細(xì)胞。Ca(OH)2影響生物膜的生長模式。細(xì)菌細(xì)胞形成集落(cluster)。在相同的樣品的剖視圖中這是清楚可見的。討論在該生物膜模型中NaCl對細(xì)菌載量的減少顯著高于Ca(OH)2 (圖I)。通過吸收或合成不干擾其代謝的小離子和分子恢復(fù)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度，微生物中和由于胞外的高滲值導(dǎo)致的水活度(water activity)的降低(Csonkal989, Guttierez et al. 1995, Record etal. 1998)。具有低水活度的環(huán)境是否是致命的，也部分地取決于微生物適應(yīng)這些改變的能力，并且取決于它們可達(dá)(范圍)之內(nèi)相容性溶質(zhì)的可用性。低的高滲濃度的NaCl足以在低相容性的溶質(zhì)的培養(yǎng)基中殺死細(xì)菌(Lee et al. 1972, Faklam et al. 1973, Pichereau etal. 1999, Bautista et al. 2008)。很有可能牙根管系統(tǒng)的未清除區(qū)域堆積營養(yǎng)素,給予微生物抵消環(huán)境變化的機(jī)會。在本研究中，通過在加入NaCl或Ca(OH)2的BHI-肉湯中使生物膜生長模擬未清除的根管。提供營養(yǎng)素也會防止饑餓導(dǎo)致的細(xì)菌死亡。儲存以及合成相容性溶質(zhì)是需能過程。一旦相容性溶質(zhì)的儲備或能源耗盡，細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后細(xì)菌最終死亡(Csonka & Hanson 1991 )。滲透現(xiàn)象僅依賴于溶質(zhì)的濃度。溶質(zhì)對溶劑的吸引持續(xù)直至已經(jīng)達(dá)到特定的平衡。因此，可以預(yù)期主根管的側(cè)部的一些效果O值得注意的是，在暴露至NaCl之后，蓋玻片上的粘液的增長(生物膜)已經(jīng)消失，因此，用視覺觀察，蓋玻片比陰性對照和氫氧化鈣組“更潔凈”。用CLSM圖像證實了非晶質(zhì)的去除。顯然，NaCl對生物膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一些影響。此外對于生物膜增長必要的胞外聚合糖類的形成可能已經(jīng)被NaCl的存在所干擾。眾所周知，生理鹽的攝入有助于清除鼻塞或鼻竇。檢索了文獻(xiàn)，探尋解釋。預(yù)先使用反滲透膜，回收廢水用于產(chǎn)生潔凈的水。該產(chǎn)業(yè)的主要挑戰(zhàn)是膜的清潔，廢水中的大量有機(jī)碎屑堵塞(污垢，foule) 了膜。使用單獨的沖洗劑不能去除膜上堵塞物質(zhì)。膜的清潔涉及物理和化學(xué)清潔；大塊堵塞物的物理去除之后化學(xué)消毒(Ang et al.2006)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，將堵塞的膜暴露至NaCl溶液中致使堵塞層的破壞和去除(Lee &Elimelech 2007)。在本研究中，沒有提到術(shù)語生物膜，而是著力于堵塞的污染層。作者在其實驗中使用海藻酸鹽模擬堵塞物。本研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果不能推斷至根管系統(tǒng)中的情形，但是本研究可以對NaCl的清潔效果給予啟示。Ca(OH)2是世界范圍內(nèi)最常用的管內(nèi)藥物。Bystrijm和同事(1985)首先測試了在根管中Ca(OH)2的抗菌性能。細(xì)菌數(shù)量減少。在1991年Sjdgren和合作者證實了這 些發(fā)現(xiàn)。在受感染的根管中應(yīng)用Ca(OH)2+周之后，沒有重新獲得或培養(yǎng)出細(xì)菌，暗示了Ca(OH)2使根管無可培養(yǎng)的細(xì)菌。然而,應(yīng)謹(jǐn)記根管的臨床采樣是由紙尖技術(shù)(paper pointtechnique)完成的?，F(xiàn)今普遍承認(rèn)這個技術(shù)是有許多缺點的，主要是因為紙尖不可能到達(dá)整個根管壁、側(cè)管以及在化學(xué)機(jī)械清除過程存活的微生物可以占據(jù)的位置。該紙尖采樣技術(shù)給出以下良好的指示可以從根管去除的那些不是仍然殘存的那些(Sathorn etal.2007a)。而且，不可能培養(yǎng)或檢測饑餓階段的微生物?；谀壳白詈玫目捎玫淖C據(jù)，當(dāng)通過培養(yǎng)技術(shù)評估時，氫氧化鈣從人類根管中消除細(xì)菌方面具有有限的效能(Peters etal. 2002, Waltimo et al. 2005, Sathorn et al. 2007b)。氫氧化鈣對浮游細(xì)菌具有抗菌效能(Stuart et al. 1991, Georgopoulou et al. 1993, Ferreira et al. 2007),然而，微生物位于生物膜結(jié)構(gòu)中的根管系統(tǒng)中(Chavez de Paz 2007a)。關(guān)于Ca (OH) 2對生物膜的影響的研究顯示，在生物膜中糞腸球菌對Ca(OH)2是有耐性的(Abdullah et al. 2005, Chavez etal. 2007b)。Ca(OH)Jt微生物的作用的精確模式還沒有充分闡明(Siqueira&Lopes 1999)。臨床成果研究比較了用Ca(OH)2的藥物的一次性治療(single-visit treatment)與多次性治療(multi-visits treatment),顯示在組間的治愈中沒有顯著差異(Weigeret al. 2000,Peters et al. 2002, Sathorn et al. 2005, Molander et al.2007)。除了可疑的抗菌效果之外，使用Ca(OH)2有更多缺點。生物膜的鈣化是Ca (OH)2的不希望的副作用并且嚴(yán)重妨礙徹底消毒。CLSM圖像顯示活性細(xì)菌聚集體嵌入至鈣化的基質(zhì)中。已顯示糞腸球菌的生物膜在牙質(zhì)上的I丐化(Kishen et al.2006)。氫氧化鈣是弱殺菌性的(Nakajo et al. 2006)，可能引起牙髓菌群向更有耐性的菌種轉(zhuǎn)化。當(dāng)Ca2+可用時，一些細(xì)菌菌種產(chǎn)生更多胞外多糖(Lattner et al. 2003,Sarkisova et al. 2005)。在本研究的實驗期間，當(dāng)ImM的Ca2+加入到肉湯中，同時在肉湯中沒有鈣時，CLSM圖像顯示在蓋玻片上形成活性糞腸球菌聚集體，糞腸球菌沒有附著。這些研究結(jié)果可以使得使用Ca(OH)2作為無害的內(nèi)部-訪問空間修復(fù)物(inter-visitspace-maintainer)可疑，但是這需要進(jìn)一步研究。結(jié)論在這個模型中，糞腸球菌和綠膿桿菌產(chǎn)生了可再現(xiàn)的和穩(wěn)定的雙菌種生物膜。高滲鹽溶液能夠在生物膜中殺死受感染的根管的菌群的典型微生物，因此適宜于用作根管消毒劑。在這個模型中氫氧化鈣是無效的。實駘 2弱酸具有低于5的pKa。只有當(dāng)酸的質(zhì)子化、不帶電的形式擴(kuò)散至細(xì)胞中時，可以引發(fā)弱酸脅迫。因此，藥物的pH值必須低于細(xì)胞的pH值。相比于在較高的pH值下，在低于5. 5的低pH值下需要具有較低的酸濃度，為了相同的效能，必須提高濃度。但是在pH5. 7下，牙質(zhì)和釉質(zhì)發(fā)生脫鹽(脫礦質(zhì))。證明肉湯溶液中6. 2M的NaCl在雙菌種生物膜上是殺菌性的。在暴露一周之后達(dá)到IO8減少和IO7減少，導(dǎo)致一個菌種的根除(實驗I)。應(yīng)認(rèn)為，較高濃度的吸濕性鹽將是更強(qiáng)殺菌性的，導(dǎo)致所有菌種(包括糞腸球菌)更快和更可靠的根除。通過對細(xì)菌施加另一種附加的脅迫因子，將增加效能。這致使EM以較高的摩爾濃度發(fā)展，并且EM的發(fā)展刺激微生物內(nèi)額外的弱酸脅迫，或兩者。在初步研究中使用的相同的生物膜模型中，將根據(jù)效能篩選在各種優(yōu)選的實施方 式中提到的已經(jīng)確定的化合物。材料和方法在懸浮于細(xì)菌接種液中的蓋玻片上培養(yǎng)糞腸球菌和綠膿桿菌的雙菌種生物膜。培養(yǎng)生物膜24h。在4h、24h、48h期間將附著有生物膜的蓋玻片浸沒在實驗化合物中。2%的次氯酸鈉和BHI-肉湯充當(dāng)陽性和陰性對照。在用生理鹽水(PBS)沖洗之后，從蓋玻片上收獲細(xì)菌細(xì)胞并將其再次懸浮于PBS中，連續(xù)稀釋，置于血瓊脂平板上，并在37° C下厭氧地孵育48h和在空氣中24h。通過測定菌落形成單位(CFU)評估殺菌效率。測試了碘化鈉、氯化鎂和甘露醇(高滲透值)和乳酸鈉、乙酸鈉、山梨酸鈉和甲酸鈉(滲透和弱酸脅迫的結(jié)合)。實驗 3本研究的目的是研究牙質(zhì)對EM的作用模式是否有抑制性影響。似乎沖洗溶液和局部消毒劑在牙髓中的抗菌效能在體內(nèi)比在體外更差。對于在體內(nèi)性能較低的原因有幾個，但是顯然牙質(zhì)和存在于壞死的根管中的其他物質(zhì)使消毒劑失活是一個因素，其對從根管系統(tǒng)中完全根除微生物的公認(rèn)困難做出貢獻(xiàn)。當(dāng)向試管中加入微生物和抗菌劑時，在體內(nèi)研究中牙質(zhì)碎屑具有緩沖能力。在該體外研究中糞腸球菌的過夜培養(yǎng)暴露在含有和不含附加的牙質(zhì)碎屑的藥物中。在孵育24h之后，進(jìn)行連續(xù)十倍稀釋并在血瓊脂平板上培養(yǎng)。對菌落計數(shù)。這致使證實了 EM的不同實施方式的活性以及EM的不同實施方式的最佳緩沖。實驗4:在糞腸球菌生物膜上篩選將用作根管消毒劑的化合物的刃天青代謝試驗。在非外科根管治療之后，在如峽部(isthmuses)的遠(yuǎn)解剖部位仍然可以檢測到在生物膜上成群的微生物。生物膜是一個寬泛的定義，其為通常在固液界面積累并裝入在高度水合的胞外聚合物質(zhì)(EPS)的基質(zhì)中的微生物聚集體。微生物細(xì)胞存在于并包圍在EPS的自產(chǎn)生基質(zhì)(self-producedmatrix)中，因此,其不易受如,例如抗生素的抗菌作用的影響。本研究的目的是選擇具有其最有效的濃度和pH的最有效的化合物，其抑制糞腸球菌的單菌種生物膜的代謝。選擇了幾種化合物，其飽和溶液比氯化鈉具有更高的摩爾濃度或其結(jié)合高溶解度和弱酸脅迫作用。為了證實抗生物膜的作用，在生物膜模型中篩選了這些化合物。在生物膜研究活力測試中，通常應(yīng)用菌落形成單位(CFU)計數(shù)。這種方法是費力的、消耗時間的，并且不適合高通量篩選。此外，生物膜在平板接種之前必須有效地從表面去除和分散，而該過程的效率通常是值得懷疑的。之前已經(jīng)建議了更簡單的方法(例如，熒光活/死細(xì)胞染色和代謝活性指示劑)，因為它們可以是高通量的并且避免生物膜脫離/分散的步驟。刃天青是常用的代謝活性指示劑中的一種。其為無毒的、水溶性染料(藍(lán)色和非熒光性的)，其可以由代謝活性細(xì)菌還原成水溶性試鹵靈(resorufin)(粉紅色和高度熒光性的)。其已經(jīng)用于評估浮游細(xì)菌的活力，對脅迫和細(xì)菌污染的適應(yīng)性。最近，還開發(fā)了其在微量滴定板中生物膜定量的潛能，并且從測試的六次試驗，建議其作為CFU計數(shù)的最佳替換。其也成功用于在幾種臨床相關(guān)(不經(jīng)口的)病菌的單菌種生物膜上評估消毒效能。
材料和方法在本研究中使用了臨床糞腸球菌株E2 (由Dr CM. Sedgley饋贈)(22)。在37° C下，在血瓊脂上厭氧地常規(guī)培養(yǎng)菌株。如之前描述的(17)，生物膜在改良的半組合生物膜培養(yǎng)基(BM) (modified semidefined biofilmmedium)中生長。培養(yǎng)基的 pH 為 7. O。生物膜在活性附著卡爾加里(Calgary)生物膜模型中生長。該模型由標(biāo)準(zhǔn)96-孔微量滴定板和適合該孔(NuncTM, Roskilde, Denmark)的帶有相同數(shù)量的聚苯乙烯柱(栓、釘，peg)的蓋(23，24)構(gòu)成。選擇在平底96-孔微量滴定板中避免潛在的細(xì)菌沉降，而對消毒治療試驗保持96-孔的高通量優(yōu)勢。將糞腸球菌的過夜培養(yǎng)物稀釋至加有O. 2%蔗糖的BM培養(yǎng)基中的大約I. 2xl08個細(xì)胞/mL。將200 μ L的細(xì)胞懸浮液分配至無菌的96-孔板中。然后用包含96個柱的無菌蓋覆蓋板。在孵育8小時后，將柱置于新鮮BM (含有O. 2%蔗糖)中。在孵育另外16小時后，將帶有附著的生物膜的柱轉(zhuǎn)移至含有待測化合物的96-孔板中。處理生物膜15min、l或2小時，在這之后，通過將生物膜柱浸沒在中和劑(用1%硫代硫酸鈉緩沖的蛋白胨水)中持續(xù)5分鐘停止處理(18)。使治療對照組也經(jīng)受中和劑孵育，在這之后，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌生物膜三次。隨后，將柱浸沒在含有O. 2%蔗糖的BM培養(yǎng)基中的O. 016mg/mL刃天青中并在37° C孵育。使用485nm激發(fā)和580nm發(fā)射波長的突光設(shè)置,在室溫下,在突光計(SpectramaxM2;Molecular Device, Sunnyvale, CA)中記錄每一個孔的突光強(qiáng)度(FI)。在10分鐘和3小時采集讀數(shù)。對于一次實驗，需要I個和半個96-孔板以測試具有pH 6或7的各種濃度的化合物。對照組為保存在BMS中的生物膜、保存在PBS中的生物膜，陰性對照，而用2%次氯酸鈉處理的生物膜作為陽性對照組?？椎钠溆嗖糠钟糜跓o菌對照?；谒鼈兊母呷芙舛取o毒性和弱酸性質(zhì)，選擇測試的化合物。在本試驗中，測試了甲酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉和山梨酸鉀。也包括氯化鈉從而僅基于滲透脅迫使其效能與具有滲透和弱酸脅迫的化合物相比較。在一系列級聯(lián)實驗中，順序地刪除證明為不令人滿意的化合物或濃度。關(guān)于治療效能的評估
刃天青代謝試驗。如最近已經(jīng)由Jiang et al. 2011建立的,刃天青可以用作糞腸球菌的代謝活性指示劑。當(dāng)在治療之后評估生物膜的代謝時，在37° C下在加入刃天青儲備溶液的BMS中孵育生物膜，以獲得最終濃度為O. 0016%。在10分鐘(基線)或3小時(恰好在峰讀數(shù)之前)之后，采集FI讀數(shù)。進(jìn)行四次該實驗并重復(fù)兩次。對于所有FI讀數(shù)，包括O. 0016%的刃天青與無菌BMS混合的背景對照組以記錄背景FI變化，隨后從每一個孔的FI中減去(扣除)。在治療之后，將治療效能計算為FI值相對于對照組中的值的百分?jǐn)?shù)減少。在圖2中示出了結(jié)果。參考文獻(xiàn) Abdullah M,Ng YL,Gulabivala K,Moles DR,Spratt DA(2005)Susceptibiltiesof twoEnterococcus faecalis phenotypes to root canal medications. Journal of·Endodontics 31,30-6.· AdriaoA, Vieira MiFernandes IiBarbosa M，Sol MiTenreiro RP,Chambel I，Barata B，Zilhao I，Shama G，Perni S, Jordan SJ, Andrew PW,Falciro ML (2008)Markedintra-strain variation in response of Listeria monocytogenes dairy isolates toacid or salt strcssand the effect of acid or salt adaptation on adherence toabiotic surfaces. InternationalJournal of Food Microbiology 31，142—50.· Ang WS, Lee S，Elimelech M(2006)Chemieal and physical aspects ofcleaning oforganic-fouled reverse osmosis membranes. 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權(quán)利要求
1.組合物，包括賦予所述組合物高滲性的量的一種或多種張度劑，在牙齒治療中用作消毒或抗菌制劑，所述組合物包括選自有機(jī)酸和/或其鹽的組中的張度劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中，所述張度劑選自由有機(jī)酸鹽構(gòu)成的組，優(yōu)先選自由有機(jī)酸的鈉鹽、鉀鹽和鎂鹽構(gòu)成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的組合物，包括賦予所述制劑高滲性的量的所述有機(jī)酸和/或有機(jī)酸鹽。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中，所述鈉鹽選自由以下構(gòu)成的組乙酸鈉、山梨酸鈉、乳酸鈉、甲酸鈉、乙酸鉀、山梨酸鉀、乳酸鉀和甲酸鉀。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，包括來自由無機(jī)鹽和糖醇構(gòu)成的組中的另外的張度劑。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，用于治療和/或預(yù)防根尖、側(cè)部或邊緣牙周炎、齒齦炎、種植體周圍炎或其他形式的口腔感染的方法中。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中，所述組合物被緩沖至低于7的pH。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求I中任一項所述的組合物，在牙髓、修復(fù)或牙周治療，尤其是根管治療中用作消毒或抗菌制劑。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中，所述制劑包括所述張度劑的高滲水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述高滲水溶液具有至少I.25· IO7Pa的滲透值和至少2. 5M的摩爾濃度。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，進(jìn)一步包括選自由以下構(gòu)成的組中的一種或多種試劑著色劑、增味劑、醫(yī)藥化合物、表面活性劑、去垢劑、穩(wěn)定劑、粘度調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、流量控制添加劑、聚合增稠劑、防腐劑、顯像劑、以及造影劑和/或?qū)Ρ仍鰪?qiáng)劑。
12.在受試者中進(jìn)行牙齒、牙髓或牙周治療或植入手術(shù)的方法，所述方法包括應(yīng)用消毒或抗菌制劑，所述消毒或抗菌制劑以賦予組合物高滲性的量包含一種或多種張度劑，所述制劑包括選自有機(jī)酸和其鹽的組中的第一張度劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述制劑包括有機(jī)酸的鈉鹽、鉀鹽或鎂鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中，所述第一張度劑選自由以下構(gòu)成的組乙酸鈉、山梨酸鈉、乳酸鈉、甲酸鈉、乙酸鉀、山梨酸鉀、乳酸鉀和甲酸鉀。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項所述的方法，其中，所述制劑包括選自由無機(jī)鹽和糖醇構(gòu)成的組中的另外的張度劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中任一項所述的方法，其是用于治療和/或預(yù)防根尖、側(cè)部和/或邊緣牙周炎、齒齦炎、種植體周圍炎和/或其他形式的口腔感染的方法。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-16中任一項所述的方法，其中所述消毒或抗菌制劑被緩沖至低于7的pH。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一項所述的方法，其中所述方法包括根管治療。
19.牙髓或牙周試劑盒，包括容納消毒或抗菌制劑的第一容器、安瓿或注射器，所述消毒或抗菌制劑包括賦予組合物高滲性的量的張度劑，所述張度劑包括一定量的有機(jī)酸和/或有機(jī)酸鹽，連同一種或多種選自由以下構(gòu)成的組中的物品牙髓和牙周沖洗針和頭；牙髓或牙周沖洗器；容納根管填充劑、根管封閉劑或粘固劑的另外的容器、安瓿或注射器；以及螺 旋分配器。
全文摘要
本發(fā)明涉及消毒或抗菌組合物，其用于牙齒治療，如治療和/或預(yù)防牙周炎、齒齦炎或其他形式的口腔感染。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)感染牙齒組織并引發(fā)其炎癥的微生物，易受滲透脅迫影響的程度為在治療或預(yù)防感染和/或炎癥中應(yīng)用高滲組合物是有效的。此外，發(fā)現(xiàn)了這些微生物還易受酸性脅迫的影響。因此，本發(fā)明提供了組合物，當(dāng)局部應(yīng)用時，其在引發(fā)牙齒組織感染的微生物中誘導(dǎo)滲透脅迫，優(yōu)選滲透以及酸性脅迫。本發(fā)明還考慮到涉及本發(fā)明組合物的方法和應(yīng)用。
文檔編號A61K47/26GK102985051SQ201180019585
公開日2013年3月20日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者敘澤特·韋羅尼卡·范德爾瓦爾, 斯坦利·布魯爾, 約翰內(nèi)斯·雅各布·德澤特, 盧卡斯·威廉默斯·瑪麗亞·范德爾斯勒伊斯 申請人:尼京克制藥有限公司