專(zhuān)利名稱(chēng)：通用病毒樣顆粒(vlp)流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在此描述了包含抗原性流感蛋白的病毒樣顆粒(VLP)，以及制造和使用這些VLP的方法。
背景技術(shù)：
流感病毒(甲型、こ型以及丙型)是人類(lèi)以及其他哺乳動(dòng)物以及鳥(niǎo)類(lèi)中的呼吸道感染的致病因子。病毒生命周期中的獨(dú)特的生物學(xué)以及流行病學(xué)特征驅(qū)使新病毒株的快速抗原進(jìn)化和不斷出現(xiàn)，特別是甲型病毒的新病毒株?？乖凅w的這種不斷出現(xiàn)導(dǎo)致了季節(jié)性流感流行以及以不規(guī)則間隔的全球大流行。毎年的流感流行僅在美國(guó)就造成大約36，000人死亡，并且每年全世界的死亡人數(shù)超過(guò)250，000，同時(shí)造成了巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。流感大流行對(duì)于人類(lèi)的健康造成了嚴(yán)重威脅，并且像1918年大流行這樣的全球事件造成了據(jù)估計(jì)5千萬(wàn)例的死亡以及破壞性的社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響。流感病毒具有單鏈、分段的RNA基因組，并且是正粘病毒科的成員。甲型流感病毒在病毒顆粒的表面上展示兩種主要糖蛋白，即血凝素(HA)以及神經(jīng)氨酸酶(NA)，并且基于這兩種分子的抗原特性，它們被分成16種HA亞型(H1-H16)和9種NA亞型(N1-N9)。流感病毒感染之后的主要免疫應(yīng)答靶向表面糖蛋白HA和NA。針對(duì)HA的抗體能夠阻斷病毒結(jié)合至細(xì)胞表面受體，并防止病毒進(jìn)入和感染。然而，隨著時(shí)間的過(guò)去，這種應(yīng)答變得無(wú)效，并且不能針對(duì)由于抗原性漂移(突變的積累)或者抗原性轉(zhuǎn)變(由于重配造成的交換片段)而引起出現(xiàn)抗原變體進(jìn)行保護(hù)。目前，用于控制季節(jié)性或大流行性流感疾病的一種最有效的干預(yù)是預(yù)防接種。這種實(shí)踐要求易感受試者每年接收一定劑量的用最近的人病毒分離物配制的疫苗。這樣的疫苗通常由単獨(dú)的病毒制備，每ー種病毒在雞胚中或者培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)，并且然后混合于最終疫苗制劑中以便提供較寬的覆蓋范圍。由于流感病毒的快速抗原變異，疫苗必須定期重新配制以便結(jié)合出現(xiàn)的抗原變體，從而維持疫苗保護(hù)效力。因此，疫苗的有效性取決于疫苗與人體內(nèi)循環(huán)的病毒株之間的抗原相似性程度。此外，一定比例的接種個(gè)體，包括老年人，在使用當(dāng)前疫苗的情況下不能產(chǎn)生保護(hù)性免疫。最近用噬菌體展示抗體文庫(kù)進(jìn)行的ー項(xiàng)研究已經(jīng)鑒定出廣泛中和性抗體，它們能夠阻斷廣譜的流感病毒亞型導(dǎo)致的感染(Jianhua Sui等人(2009)Nat. Structural&Mol.Biol. 16 :265-273)。這些抗體中和光譜的病毒的能力由以下作用產(chǎn)生與HA分子的干區(qū)中存在的亞優(yōu)勢(shì)并且高度保守的表位反應(yīng)，通過(guò)抑制膜融合而不是通過(guò)阻止由于病毒感染或接種誘導(dǎo)的主要中和機(jī)制的受體結(jié)合來(lái)阻斷感染。對(duì)展顯示了這些亞優(yōu)勢(shì)并且高度保守的表位的疫苗的設(shè)計(jì)將引出能夠針對(duì)廣譜的流感亞型進(jìn)行保護(hù)的廣泛中和性免疫應(yīng)答。為了產(chǎn)生用于配制目前疫苗所需要的病毒組分，所選擇的病毒通過(guò)感染雞胚或培養(yǎng)細(xì)胞而生長(zhǎng)。這個(gè)過(guò)程取決于病毒的經(jīng)由HA分子附著至細(xì)胞表面上的含有唾液酸的受體的能力、侵入、病毒復(fù)制以及病毒子代從雞胚或培養(yǎng)細(xì)胞的液體中的分離。將病毒HA截短、重新工程化或重塑將消除受體結(jié)合并且排除病毒復(fù)制并且產(chǎn)生這樣ー種疫苗。通過(guò)同時(shí)表達(dá)2種、3種或4種病毒基因(Ml、M2、HA以及NA)來(lái)產(chǎn)生流感VLP，其中Ml、M2或(類(lèi)似基質(zhì)蛋白)HA以及NA是該結(jié)構(gòu)的主要和基本組分。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)20080031895和20090022762。編碼這些基因的DNA序列同時(shí)或依次轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，在細(xì)胞中它們被轉(zhuǎn)錄并且翻譯成它們對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)自組裝成病毒樣顆粒。與 病毒相反，針對(duì)受體結(jié)合和病毒侵入的HA區(qū)域的修飾并不干擾VLP在細(xì)胞中的產(chǎn)生、組裝或釋放。也就是說(shuō)，VLP的產(chǎn)生允許帶有分子的免疫優(yōu)勢(shì)和遺傳可變區(qū)的HA的主要部分的缺失和重塑，而病毒復(fù)制方法并不允許這些修飾。也可以在NA分子上引入相似的修飾，該NA分子也展示在VLP疫苗的表面上。然而，對(duì)于流感疫苗組合物以及制造和使用這類(lèi)組合物的方法仍然存在著需要。

發(fā)明內(nèi)容
在此描述了包含至少ー個(gè)截短的和/或雜合流感抗原蛋白(例如HA或NA)的病毒樣顆粒(VLP)。還描述了包含這些VLP的組合物，以及制造和使用這些VLP的方法。在此描述的VLP沒(méi)有病毒遺傳物質(zhì)，并且因此不會(huì)復(fù)制或?qū)е赂腥?；然而在假定它們與野生型病毒粒子的形態(tài)、生物化學(xué)以及抗原相似性的情況下，VLP具有高度免疫原性，并且能夠引出強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫應(yīng)答。不同于基于病毒粒子滅活的疫苗，VLP不具有傳染性，由此消除了化學(xué)處理的需要，因而保留了天然構(gòu)象。此外，本發(fā)明通過(guò)提供針對(duì)當(dāng)前的以及演化的流感病毒的廣泛保護(hù)，克服了與每個(gè)季節(jié)重新配制流感疫苗相關(guān)的問(wèn)題。因此，在一方面，在此披露的是ー種病毒樣顆粒(VLP)，該病毒樣顆粒包括在此提供的包含至少一種基質(zhì)蛋白(例如流感基質(zhì)蛋白如Ml、托聞土(thogoto)基質(zhì)蛋白以及RSV基質(zhì)蛋白)；以及修飾的流感多肽(例如糖蛋白如HA或NA)的病毒樣顆粒(VLP)，其中該修飾包括流感(例如HA)多肽的跨膜以及胞質(zhì)尾區(qū)外部的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失。在某些實(shí)施方案中，缺失包括至少150個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的缺失。在其他實(shí)施方案中，缺失包括ー個(gè)以上的非連續(xù)缺失。仍然在其他實(shí)施方案中，流感多肽(例如HA)包含ー個(gè)或多個(gè)氨基酸突變(置換和/或添加)，例如其中至少ー個(gè)溶蛋白性裂解位點(diǎn)和/或至少ー個(gè)連接物被插入修飾的流感多肽(例如HA)中的實(shí)施方案。該連接子可以是已知的連接序列，或者可以從頭產(chǎn)生以用于在此描述的分子中。在此處披露的任何VLP中，VLP可以是多價(jià)的，即可以包含多種流感抗原蛋白，包括在此描述的野生型和/或修飾的流感多肽的任何組合。另外，在此處描述的任何VLP中，修飾的流感(例如HA或NA)多肽的跨膜和/或胞漿區(qū)被替換為來(lái)自與修飾的流感多肽不同的毒株或亞型的跨膜和/或胞漿區(qū)。此外，在此描述的任何VLP可以進(jìn)一歩包含另外的流感蛋白，例如ー種或多種另外的野生型基質(zhì)蛋白(Ml和/或M2)、ー種或多種另外的修飾的(突變和/或雜合)基質(zhì)蛋白(Ml和/或M2)、ー種或多種野生型抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一種或多種雜合抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一種或多種修飾的抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、一種或多種雜合并修飾的抗原性糖蛋白(HA和/或NA)、ー種或多種核蛋白(NPs)、ー種或多種PBl蛋白、ー種或多種PB2蛋白、ー種或多種PA蛋白以及它們的組合。在某些實(shí)施方案中，VLP的多價(jià)性在于ー種以上抗原性糖蛋白(修飾的糖蛋白或野生型糖蛋白的任何組合)表達(dá)在VLP的表面上(例如以便產(chǎn)生免疫應(yīng)答)。在此描述的任何VLP可以在允許VLP組裝和釋放的條件下表達(dá)在真核細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中。在另一方面，在此描述的是包含以上描述的任何VLP的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞允許在此描述的VLP在編碼VLP多肽的ー種或多種載體中的組裝以及從其釋放。在某些實(shí)施方案中，真核細(xì)胞選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在又一方面，在此提供產(chǎn)生在此描述的任何VLP的方法，該方法包括以下步驟將編碼至少ー種基質(zhì)蛋白以及至少ー種修飾的流感(例如HA)多肽的ー種或多種載體轉(zhuǎn)染至合適的宿主細(xì)胞中，并且在允許形成VLP的條件下表達(dá)蛋白的組合。在任何VLP中，基質(zhì)蛋 白可以是流感Ml蛋白、托聞土基質(zhì)蛋白以及RSV基質(zhì)蛋白。在其他實(shí)施方案中，另外或相同的載體可以編碼另外的蛋白質(zhì)，例如另外的流感蛋白(例如NA蛋白等)。在某些實(shí)施方案中，該至少一種載體進(jìn)ー步包含編碼流感M2蛋白的序列。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒載體、桿狀病毒載體或非病毒載體。載體可以編碼ー種、ー種以上或所有VLP蛋白。在此處描述的任何VLP產(chǎn)生方法中，一種或多種載體可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，至少ー種基質(zhì)蛋白和修飾的流感HA多肽在分開(kāi)的載體中被編碼，并且編碼至少ー種基質(zhì)蛋白的載體被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，之后使用編碼修飾的流感HA多肽蛋白的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由載體編碼的蛋白質(zhì)可以是全長(zhǎng)野生型、全長(zhǎng)突變體、截短野生型、截短突變體，和/或雜合蛋白，包括全長(zhǎng)和/或截短的野生型或突變體蛋白。細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，至少ー種M蛋白包括流感基質(zhì)蛋白。仍然在另外的方面，在此描述的是包含至少ー種在此描述的VLP的免疫原性組合物。在某些實(shí)施方案中，該免疫原性組合物進(jìn)ー步包含佐劑。在此描述的任何免疫原性組合物可以包括至少兩種VLP，這些VLP包含不同的修飾的流感(例如HA)多肽。在某些實(shí)施方案中，該組合物包括并且含有至少兩種VLP，每ー種VLP包含不同的修飾的HA蛋白，或者在其表面上展示兩種或者更多種重塑的HA或NA糖蛋白(例如多價(jià)VLP)単一的VLP。仍然在另外的實(shí)施方案中，該免疫原性組合物進(jìn)ー步包含佐劑。仍然在另外的方面，在此提供的是ー種對(duì)于受試者體內(nèi)的流感產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者(例如人)給予ー個(gè)有效量的在此描述的VLP和/或免疫原性組合物。在某些實(shí)施方案中，該組合物經(jīng)過(guò)粘膜、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或者ロ服給予。在某些實(shí)施方案中，這些方法針對(duì)流感的多種毒株或亞型產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而提供ー種“通用”疫苗，該疫苗針對(duì)不同的流感病毒和/或隨著時(shí)間的過(guò)去(ー個(gè)以上的流感季節(jié))保護(hù)受試者免于流感感染。任何方法可以涉及多次給藥(例如多劑方案)。在另一方面，提供了用于產(chǎn)生在此描述的流感VLP的包裝細(xì)胞系。該細(xì)胞系用編碼至少兩種M蛋白的一種或多種多核苷酸來(lái)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染，并且在不穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的編碼ー種或多種流感蛋白的序列的引入和表達(dá)之后，由該細(xì)胞產(chǎn)生VLP。在某些實(shí)施方案中，編碼Ml和/或M2的序列被穩(wěn)定地整合到包裝細(xì)胞系中，并且將編碼在VLP表面上表達(dá)的修飾的HA蛋白的序列引入細(xì)胞中，使得形成VLP。在其他實(shí)施方案中，將編碼修飾的HA蛋白中的ー種或多種的序列穩(wěn)定地整合到細(xì)胞中以形成包裝細(xì)胞系，并且在引入編碼至少兩種M蛋白的序列之后形成了 VLP。包裝細(xì)胞可以是昆蟲(chóng)、植物、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌或真菌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，包裝細(xì)胞是哺乳動(dòng)物(例如人)細(xì)胞系。


圖I描繪了重塑HA分子的結(jié)構(gòu)的示意圖，其中HAl序列的一部分被去除，ー個(gè)插入被引入在信號(hào)肽與HAl分子的剰余部分之間。如示意圖和序列中所規(guī)定，引入了突變以防止ニ硫鍵形成。分子的HA2部分被完全保留，包括跨膜和胞漿區(qū)。這種構(gòu)建體被標(biāo)識(shí)為“1TA” (SEQ ID NO 1 和 2)。圖2顯示了第二種重塑HA分子的示意圖，其中在去除信號(hào)肽之后的NH2末端序列包括形成保守表位的一部分的序列以及用于形成鏈間ニ硫鍵的C20殘基。這個(gè)分子在基因 上連接至HAl的截短部分(R241-L333)以及整個(gè)HA2片段。這種構(gòu)建體被標(biāo)識(shí)為“2TA”(SEQID NO 3 和 4)。圖3描繪了重塑HA的示意性結(jié)構(gòu)，其中在去除信號(hào)肽之后的NH2末端部分(D17-P65)通過(guò)所設(shè)計(jì)的12個(gè)氨基酸連接子(DIGPGKVGYGPG，SEQ IDNO 11)連接至HAl的截短區(qū)域(M281-R346);這整個(gè)片段連接至在其上已經(jīng)引入突變V412至D412以及L419至G419的完整HA2(G347-I568)以防止蛋白聚集。這種構(gòu)建體被標(biāo)識(shí)為“3TA”(SEQ ID NO 5和6)。圖4顯示了截短的HA分子的示意圖，該分子包含在去除信號(hào)肽之后的HA2片段(G347-I568)的整個(gè)氨基酸序列，該序列包括細(xì)胞外、跨膜以及胞漿區(qū)。這種構(gòu)建體被標(biāo)識(shí)為 “4TA” (SEQ ID NO 7 和 8)。圖5的圖A和B是經(jīng)過(guò)重新工程化的HA分子的示意圖，其中兩個(gè)溶蛋白性裂解位點(diǎn)(各自為10個(gè)氨基酸插入，PQRERRRKKR，SEQ ID NO :12)已經(jīng)f 被引入HAl的序列之內(nèi)，ー個(gè)位點(diǎn)在位置P65與L66之間，而另ー個(gè)位點(diǎn)在位置1280與M281之間。在將修飾的HA表達(dá)并且折疊成其天然構(gòu)象之后，展示最優(yōu)勢(shì)并且高度可變的抗原位點(diǎn)的該結(jié)構(gòu)的球形頭部可以通過(guò)蛋白酶處理來(lái)去除，從而暴露可引出廣泛保護(hù)性免疫應(yīng)答的亞優(yōu)勢(shì)并且高度保守的表位(參見(jiàn)圖5B)。該結(jié)構(gòu)通過(guò)C20與C483之間的鏈間ニ硫鍵來(lái)維持。這種構(gòu)建體被標(biāo)識(shí)為 “5TA” (SEQ ID NO 9 和 10)。圖6的圖I和II是示例性DNA載體的示意圖，這些載體在所確定的位置中并且在所指示的調(diào)控元件下攜帯流感基因，用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生VLP。圖7的圖A和B描繪了用于將載體轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中、使蛋白質(zhì)表達(dá)以及選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系以便連續(xù)產(chǎn)生VLP的策略的實(shí)例。圖8的圖A至C顯示了使用抗M2抗體作為ー級(jí)抗體并且使用熒光素FITC標(biāo)記的抗小鼠抗體作為ニ級(jí)抗體，對(duì)M1/M2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的結(jié)果。圖8A顯示了未染色的對(duì)照。圖SB顯示了同種型對(duì)照并且圖SC顯示了 M2表面表達(dá)的染色。圖9的圖A和B描繪了 M1/M2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡。圖9A顯示了 MDCK細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平(泳道I顯示了來(lái)自正常MDCK細(xì)胞的結(jié)果并且泳道2顯示了來(lái)自組成性表達(dá)M1/M2蛋白的MDCK細(xì)胞的結(jié)果。圖9B顯示了來(lái)自CHO細(xì)胞的結(jié)果泳道I顯示了陰性對(duì)照(CH0細(xì)胞溶解產(chǎn)物)；泳道2顯示了用流感病毒PR8感染的CHO細(xì)胞；泳道3顯示了組成性表達(dá)M1/M2的CHO細(xì)胞(克隆I);并且泳道4顯示了組成性表達(dá)M1/M2的CHO細(xì)胞(克隆2)。
圖10顯示了 M1/M2以及NA/HA (重塑的)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡。圖10顯示了在CHO細(xì)胞溶解產(chǎn)物以及濃縮/純化的培養(yǎng)上清液中的蛋白質(zhì)水平；泳道I是流感病毒對(duì)照(HA5/NA1重配的PR8)，泳道2是作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，泳道3和5是用M1/M2以及NA/HA重塑的5TA (泳道3)和NA/HA重塑的3TA (泳道5)轉(zhuǎn)染的CHO的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。泳道4和6顯示了用M1/M2以及分別以NA/重塑的HAs_5TA以及3TA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的濃縮/純化的培養(yǎng)上清液。圖11顯示了在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生并且從M1/M2-NA/HA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中純化的VLP的電子顯微圖像。
具體實(shí)施例方式除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及藥學(xué)的常規(guī)方法。這類(lèi)技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整闡述。參見(jiàn)例如明頓藥學(xué)科學(xué)，第 18 版(Remington 1 s Pharmaceutical Sciences, 18thEdition)(Easton,Pennsylvania Mack Publishing Company, 1990);酶學(xué)方法(Methods In Enzymology)(S. Colowick&N. Kaplan 編，Academic Press, Inc.);以及實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)' (Handbook ofExperimental Immunology),第 I 至 IV 卷(D. M. Weir&C. C. Blackwell 編，1986, BlackwellScientific Publications) ;Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)■ (Molecular Cloning A Laboratory Manual)(第2版，1989);精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第4版(ShortProtocols in MolecularBiology, 4th ed. ) (Ausubel 等人編著，1999, John ffiley&Sons)；分子生物學(xué)技術(shù)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室課程(Molecular Biology Techniques An IntensiveLaboratoryCourse), (Ream 等人編著，1998, Academic Press) ；PCR(生物技術(shù)系列簡(jiǎn)介),第 2 版(PCR(Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. )(Newton&Graham 編，1997, Springer Verlag);基礎(chǔ)病毒學(xué)，第二版(Fundamental Virology, Second Edition)(Fields&Knipe 編，1"1, Raven Press, New York)。在此引用的所有公開(kāi)物、專(zhuān)利以及專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)卮送ㄟ^(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容進(jìn)行結(jié)
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ロ o本說(shuō)明書(shū)以及所附權(quán)利要求書(shū)中使用的単數(shù)形式“ー個(gè)”、“ー種”以及“該”包括復(fù)數(shù)個(gè)指代物，除非上下文另外明確指示。因此，例如，提到“一種VLP”時(shí)，包括兩種或更多種這類(lèi)VLP的混合物。定義如在此使用的術(shù)語(yǔ)“亞病毒顆?！?、“病毒樣顆?！被颉癡LP”是指非復(fù)制性病毒外売。VLP通常由ー種或多種病毒蛋白或來(lái)自這些蛋白質(zhì)的顆粒形成性多肽所組成，這些蛋白質(zhì)例如但是不限于被稱(chēng)為衣殼蛋白、外殼蛋白、殼蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的那些蛋白質(zhì)。VLP可以在該蛋白質(zhì)在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)之后自發(fā)地形成。用于產(chǎn)生具體VLP的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且在以下更全面地論述。可以使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)檢測(cè)病毒蛋白重組表達(dá)之后的VLP的存在，例如通過(guò)電子顯微術(shù)、生物物理表征等等。參見(jiàn)例如 Baker 等人，Biophys. J. (1991)60 :1445-1456 ；Hagensee 等人，J. Virol.(1994)68 :4503-4505。例如，VLP可以通過(guò)密度梯度離心來(lái)分離和/或通過(guò)特征密度條帶(characteristic density banding)(例如實(shí)例)來(lái)鑒定。可替代地,可以對(duì)于所討論的VLP制備物的玻璃化含水樣品進(jìn)行冷凍電子顯微鏡木，并且在適當(dāng)?shù)钠毓鈼l件下記錄圖像。另外的VLP純化的方法包括但是不限于色譜技術(shù)，例如親和色譜法、離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法以及反相色譜程序。在此使用的術(shù)語(yǔ)“雜合”或“嵌合”是指含有來(lái)自至少兩種不同蛋白質(zhì)的各自部分的分子(例如蛋白質(zhì)或VLP)。例如，雜合流感HA蛋白是指包含以下各項(xiàng)的蛋白質(zhì)流感HA蛋白的至少一部分(例如含有ー種或多種抗原決定簇的部分)以及異源蛋白的部分(例如不同流感蛋白或不同病毒蛋白例如RSV或VSV蛋白的胞漿和/或跨膜區(qū))。應(yīng)當(dāng)清楚的是， 在此描述的雜合分子可包括與另外的異源多肽(全長(zhǎng)或其部分)融合的全長(zhǎng)蛋白以及與另外的異源多肽(全長(zhǎng)或其部分)融合的蛋白質(zhì)部分。還應(yīng)當(dāng)清楚的是，雜合可包括在任何ー個(gè)、ー些或所有異源區(qū)中的野生型序列或突變體序列。對(duì)于來(lái)自特定病毒蛋白的“顆粒形成性多肽”，表示具有在有利于形成VLP的條件下形成VLP的能力的全長(zhǎng)或接近全長(zhǎng)病毒蛋白以及其片段，或具有內(nèi)部缺失的病毒蛋白。因此，多肽可包含全長(zhǎng)序列、片段、截短的以及部分序列，以及參考分子的類(lèi)似物以及前體形式。因此，該術(shù)語(yǔ)涉及序列的缺失、添加以及置換，只要多肽保留形成VLP的能力即可。因此，該術(shù)語(yǔ)包括所規(guī)定多肽的天然變異，因?yàn)樵诓《痉蛛x物之間經(jīng)常發(fā)生外殼蛋白的變異。該術(shù)語(yǔ)還包括并不天然發(fā)生在參考蛋白中的缺失、添加以及置換，只要蛋白質(zhì)保留形成VLP的能力即可。優(yōu)選的置換是在性質(zhì)上保守的那些置換，即，在它們的側(cè)鏈中相關(guān)的氨基酸的家族內(nèi)發(fā)生的那些置換。確切地說(shuō)，氨基酸通常被劃分成四個(gè)家族(I)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性一賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不帶電荷的極性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸有時(shí)分類(lèi)為芳香族氨基酸?！翱乖笔侵负幸粋€(gè)或多個(gè)表位(線(xiàn)性表位、構(gòu)象表位或兩種表位)的分子，這個(gè)或這些表位將會(huì)刺激宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞抗原特異性應(yīng)答。該術(shù)語(yǔ)與術(shù)語(yǔ)“免疫原”可互換地使用。通常，B細(xì)胞表位將包括至少大約5個(gè)氨基酸，但是可少至3-4個(gè)氨基酸。T細(xì)胞表位，例如CTL表位，將包括至少大約7-9個(gè)氨基酸，并且輔助T細(xì)胞表位具有至少大約12-20個(gè)氨基酸。通常，ー個(gè)表位將包括大約7個(gè)與15個(gè)之間的氨基酸，例如9、10、12或15個(gè)氨基酸。該術(shù)語(yǔ)包括與天然序列相比包含修飾例如缺失、添加以及置換(通常在性質(zhì)上是保守的)的多肽，只要該蛋白質(zhì)保留引出在此定義的免疫應(yīng)答的能力即可。這些修飾可能是故意的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或可能是偶然的，例如通過(guò)產(chǎn)生抗原的宿主的突變。對(duì)于抗原或組合物的“免疫應(yīng)答”是針對(duì)感興趣的組合物中存在的抗原在受試者體內(nèi)產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。出于本披露的目的，“體液免疫應(yīng)答”是指由抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而“細(xì)胞免疫應(yīng)答”是由T淋巴細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫的ー個(gè)重要方面涉及溶細(xì)胞性T細(xì)胞(“CTL”)的抗原特異性應(yīng)答。CTL具有針對(duì)與以下蛋白質(zhì)結(jié)合而呈現(xiàn)的肽抗原的特異性，即這些蛋白質(zhì)由主要組織相容性復(fù)合體(MHC)編碼并且表達(dá)在細(xì)胞表面上。CTL有助于誘導(dǎo)并且促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微生物的破環(huán)，或感染了這類(lèi)微生物的細(xì)胞的溶解。細(xì)胞免疫的另一方面涉及輔助性T細(xì)胞的抗原特異性應(yīng)答。輔助性T細(xì)胞起作用以幫助刺激非特異性效應(yīng)細(xì)胞的功能并且將其活性集中以便針對(duì)以下細(xì)胞這些細(xì)胞展示與其表面上的MHC分子相結(jié)合的肽抗原?！凹?xì)胞免疫應(yīng)答”還指細(xì)胞因子、趨化因子以及由活化T細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞產(chǎn)生的其他這類(lèi)分子(包括來(lái)自CD4+和⑶8+T細(xì)胞的那些分子)的產(chǎn)生。因此，免疫應(yīng)答可包括以下效應(yīng)的ー種或多種由B細(xì)胞產(chǎn)生抗體；和/或活化特異性地針對(duì)在感興趣的組合物或疫苗中存在的ー種或多種抗原的抑制性T細(xì)胞和/或Y AT細(xì)胞。這些應(yīng)答可以用來(lái)中和傳染性，和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體、或抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)，以便對(duì)免疫宿主提供保護(hù)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定和中和測(cè)定來(lái)確定這類(lèi)應(yīng)答?！懊庖咴越M合物”是包含抗原分子的組合物，其中向受試者給予該組合物導(dǎo)致受 試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)感興趣的抗原分子的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。“基本上純化”通常是指分離ー種物質(zhì)(化合物、多核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、多肽組合物)的分離，使得該物質(zhì)構(gòu)成其所在樣品的大部分百分比。典型地在一個(gè)樣品中，ー種基本上純化的組分構(gòu)成該樣品的50%、優(yōu)選地80% -85%、更優(yōu)選90% -95%。用于純化感興趣的多核苷酸以及多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包括例如離子交換色譜法、親和色譜法以及根據(jù)密度進(jìn)行沉降?！熬幋a序列”或“編碼”選擇的多肽的序列是ー種核酸分子，當(dāng)該分子處于適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列(或“控制元件”)的控制之下時(shí)在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(在DNA的情況下)并且翻譯(在mRNA的情況下)成多肽。編碼序列的邊界由在5'(氨基)末端的起始密碼子以及在3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子來(lái)確定。編碼序列可以包括但是不限于來(lái)自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、來(lái)自病毒或原核DNA的基因組DNA序列，以及甚至合成DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于相對(duì)于編碼序列的3'端。典型的“控制元件”包括但不限于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、多聚腺苷酸序列(位于相對(duì)于翻譯終止密碼子的3'端)、用于優(yōu)化翻譯起始的序列(位于相對(duì)于編碼序列的5'端)、以及翻譯終止序列、和/或控制開(kāi)放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的序列元件，參見(jiàn)例如 McCaughan 等人(1995)PNAS USA92 :543ト5435 ；Kochetov 等人(1998)FEBSLetts. 440 :351_355?！昂怂帷狈肿涌梢园ǖ遣幌抻谠诵蛄小⒄婧薽RNA、來(lái)自真核mRNA的cDNA、來(lái)自真核(例如，哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列、以及甚至合成DNA序列。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋包括DNA和RNA的任何已知堿基類(lèi)似物的序列。“可操作地連接”是指其中所描述的組分被配置成執(zhí)行其通常功能的元件的安排。因此，可操作地連接至編碼序列的指定啟動(dòng)子在具有活性時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列的表達(dá)。啟動(dòng)子不必是與編碼序列鄰近的，只要它起作用指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)即可。因此，例如，所介入的尚未翻譯但是已經(jīng)轉(zhuǎn)錄的序列可以存在于啟動(dòng)子序列與編碼序列之間，并且啟動(dòng)子序列可以仍然被認(rèn)為“可操作地連接”至編碼序列。在此用于描述核酸分子的“重組”表示基因組、cDNA、半合成或合成來(lái)源的多核苷酸，就其來(lái)源或操作而言(I)與它在天然狀態(tài)下相關(guān)的多核苷酸的全部或一部分不相關(guān)；和/或(2)被連接至除了它在天然狀態(tài)下所連接的多核苷酸以外的多核苷酸。相對(duì)于ー種蛋白質(zhì)或多肽所使用的術(shù)語(yǔ)“重組”表示通過(guò)重組多核苷酸的表達(dá)所產(chǎn)生的多肽?！爸亟M宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”以及表示作為單細(xì)胞實(shí)體加以培養(yǎng)的原核微生物或真核細(xì)胞系的其他這類(lèi)術(shù)語(yǔ)可互換地使用，并且是指可以或已經(jīng)用作重組載體或其他轉(zhuǎn)移DNA的接受者的細(xì)胞，并且包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的子代。應(yīng)當(dāng)理解的是，由于偶然的或故意的突變，單ー親本細(xì)胞的子代可能不一定在形態(tài)上或在基因組或總DNA互補(bǔ)物上與原始親本完全相同。與親本足夠相似以便由相關(guān)特性(例如編碼所希望的肽的核苷酸序列的存在)來(lái)表征的親本細(xì)胞的子代包括于此定義所預(yù)期的子代之中，并且由以上術(shù)語(yǔ)涵蓋。 用于確定氨基酸序列“相似性”的技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的。一般而言，“相似性”表示兩個(gè)或更多個(gè)多肽在適當(dāng)位置處的精確的氨基酸對(duì)氨基酸的比較，其中氨基酸是相同的或具有相似的化學(xué)和/或物理性質(zhì)，例如電荷或疏水性。然后，可以在所比較的多肽序列之間確定所謂的“相似性百分比”。用于確定核酸以及氨基酸序列一致性的技術(shù)在本領(lǐng)域中也是熟知的，并且包括確定這種基因的mRNA的核苷酸序列(通常經(jīng)由cDNA中間體)以及確定由此編碼的氨基酸序列，并且將這與第二氨基酸序列相比較。一般而言，“一致性”是指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的精確的核苷酸對(duì)核苷酸或氨基酸對(duì)氨基酸的對(duì)應(yīng)。兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸序列可通過(guò)確定它們的“一致性百分比”進(jìn)行比較。兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列同樣地可以通過(guò)確定它們的“一致性百分比”來(lái)比較。兩個(gè)序列(不論核酸或肽序列)的一致性百分比通常被描述為兩個(gè)比對(duì)的序列之間的精確匹配的數(shù)目除以較短序列的長(zhǎng)度，然后乘以100。用于核酸序列的近似比對(duì)由Smith&Waterman應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Smith and Waterman, Advances inApplied Mathematics) 2 :482-489 (1981)的局部同源性算法提供。這種算法可以延伸至與使用由Dayhoff開(kāi)發(fā)的評(píng)分矩陣(蛋白序列以及結(jié)構(gòu)圖集(Atlas ofProtein Sequences and Structure),M. 0. Dayhoff 編，第 5 增刊 3 353-358, NationalBiomedical Research Foundation,華盛頓區(qū)，美國(guó))的妝序列一起使用并且通過(guò)Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6) :6745-6763 (1986)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化。用于計(jì)算序列之間的一致性或相似性百分比的適合的程序在本領(lǐng)域中通常是已知的?！拜d體”能夠?qū)⒒蛐蛄修D(zhuǎn)移至靶細(xì)胞(例如，細(xì)菌質(zhì)粒載體、病毒載體、非病毒載體、微粒載體以及脂質(zhì)體)。典型地，“載體構(gòu)建體”、“表達(dá)載體”以及“基因轉(zhuǎn)移載體”表示能夠指導(dǎo)感興趣的ー個(gè)或多個(gè)序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何核酸構(gòu)建體。因此，該術(shù)語(yǔ)包括克隆與表達(dá)載體，以及病毒載體。該術(shù)語(yǔ)與術(shù)語(yǔ)“核酸表達(dá)載體”和“表達(dá)盒”可互換地使用。對(duì)于“受試者”，表示脊索動(dòng)物亞門(mén)的任何成員，包括但不限于人類(lèi)以及其他靈長(zhǎng)類(lèi)，包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)例如黒猩猩以及其他類(lèi)人猿以及猴子種類(lèi)；農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物例如牛、綿羊、豬、山羊以及馬；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物例如犬和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物例如小鼠、大鼠以及豚鼠；鳥(niǎo)類(lèi)，包括家養(yǎng)、野生以及獵鳥(niǎo)，例如雞、火雞以及其他鶉雞類(lèi)鳥(niǎo)、鴨子、鵝，等等。該術(shù)語(yǔ)未指示具體年齡。因此，預(yù)期將涵蓋成年以及新生個(gè)體。如上所述的系統(tǒng)預(yù)期用于任何上述脊椎動(dòng)物種類(lèi)中，因?yàn)樗羞@些脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)以類(lèi)似的方式起作用。對(duì)于“藥學(xué)上可接受”或“藥理學(xué)上可接受”，表示在生物學(xué)上或其他方面并非不合需要的材料，即在制劑或組合物中的該材料可以給予個(gè)體而不會(huì)引起任何不可接受的生物效應(yīng)或以有害的方式與它被包含于其中的組合物的任何組分相互作用。如在此使用的“治療”，是指以下任何ー項(xiàng)(i)如在傳統(tǒng)疫苗中那樣預(yù)防感染或再感染、(ii)減少或消除癥狀，以及(iii)基本或完全消除所討論的病原體。治療可以預(yù)防性地(在感染之前)或治療性地(在感染之后)實(shí)現(xiàn)。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“佐剤”，是指在與制劑中的特定免疫原(例如VLP)組合使用時(shí)將會(huì)增進(jìn)或以別的方式改變或修改所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的ー種化合物。修改免疫應(yīng)答包括增強(qiáng)或擴(kuò)大抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答的兩者之一或兩者的特異性。修改免疫應(yīng)答還可以表示降低或抑制某些抗原特異性免疫應(yīng)答。如在此使用的“有效劑量”通常是指足以誘導(dǎo)免疫、預(yù)防和/或減輕感染或減少感 染的至少ー種癥狀和/或增強(qiáng)另ー個(gè)劑量的VLP的效カ的本發(fā)明VLP的量。有效劑量可以是指足以將感染發(fā)病延遲或降低至最低限度的VLP的量。有效劑量還可以是指在感染的治療或控制中提供治療益處的VLP的量。此外，有效劑量是在感染的治療或控制中提供治療益處的關(guān)于單獨(dú)的或與其他療法組合的本發(fā)明VLP的量。有效劑量還可以是足以增強(qiáng)受試者(例如人)的對(duì)于隨后暴露于傳染原的自身免疫應(yīng)答的量。免疫水平可以例如通過(guò)測(cè)量中和性分泌抗體和/或血清抗體的量來(lái)監(jiān)測(cè)(例如通過(guò)噬菌斑中和、補(bǔ)體固定、酶聯(lián)免疫吸附或微量中和測(cè)定)。在疫苗的情況下，“有效劑量”是預(yù)防疾病和/或降低癥狀的嚴(yán)重性的量。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指用于實(shí)現(xiàn)所希望的生物效應(yīng)所必需或足夠的VLP的量。組合物的有效量是實(shí)現(xiàn)選擇的結(jié)果的量，并且這種量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員作為例行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。例如，用于預(yù)防、治療和/或減輕感染的有效量可以是引起免疫系統(tǒng)活化、從而導(dǎo)致在暴露于本發(fā)明的VLP之后產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的必需的量。該術(shù)語(yǔ)也與“足量”同義。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“多價(jià)”是指具有針對(duì)多種類(lèi)型或毒株的傳染原的多種抗原蛋白的VLP。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“免疫刺激劑”是指通過(guò)身體的自身化學(xué)信使(細(xì)胞因子)來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物。這些分子包括具有免疫刺激、免疫增強(qiáng)和促炎癥活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子以及趨化因子，例如干擾素、白細(xì)胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13);生長(zhǎng)因子(例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)-集落刺激因子(CSF));以及其他免疫刺激分子，例如巨噬細(xì)胞炎癥因子、Flt3配體、B7. I ；B7. 2等。免疫刺激劑分子可以在與本發(fā)明的VLP相同的制劑中給予，或者可以獨(dú)立給予。可以給予蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“保護(hù)性免疫應(yīng)答”或“保護(hù)性應(yīng)答”是指由脊椎動(dòng)物(例如人)所展現(xiàn)的由抗體介導(dǎo)的針對(duì)傳染原的免疫應(yīng)答，該應(yīng)答預(yù)防或減輕感染或減少其至少ー種癥狀。本發(fā)明的VLP可以刺激抗體的產(chǎn)生，這些抗體例如中和傳染原、阻斷傳染原進(jìn)入細(xì)胞、阻斷所述傳染原的復(fù)制，和/或保護(hù)宿主細(xì)胞避免感染和破壞。該術(shù)語(yǔ)也可以指由脊椎動(dòng)物(例如人)所展現(xiàn)的由T淋巴細(xì)胞和/或其他白細(xì)胞所介導(dǎo)的針對(duì)傳染原的免疫應(yīng)答，該應(yīng)答預(yù)防或減輕流感感染或減少其至少ー種癥狀。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“抗原性制劑”或“抗原性組合物”是指當(dāng)給予脊椎動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)時(shí)將誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的一種制備物。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”是指含有本發(fā)明的VLP的制劑，該制劑呈能夠被給予脊椎動(dòng)物的形式，并且誘導(dǎo)ー種保護(hù)性免疫應(yīng)答，該應(yīng)答足以誘導(dǎo)免疫以預(yù)防和/或減輕感染和/或減少感染的至少ー種癥狀和/或增強(qiáng)另ー個(gè)劑量的VLP的效力。典型地，疫苗包含本發(fā)明的組合物被懸浮或溶解于其中的常規(guī)鹽水或緩沖水溶液介質(zhì)。在此形式中，本發(fā)明的組合物可以方便地用于預(yù)防、減輕或以別的方式治療感染。在引入宿主中后，疫苗能夠激發(fā)免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答包括但是不限于抗體和/或細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和/或其他細(xì)胞應(yīng)答的活化。
總體概述在此描述的是可以用來(lái)保護(hù)和/或治療人以免于流感感染的流感VLP。具體而言，在此描述的是ー種VLP流感疫苗，該疫苗通過(guò)氨基酸殘基和肽序列的缺失來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)各種不同的流感病毒的強(qiáng)的免疫保護(hù)應(yīng)答，這些氨基酸殘基和肽序列形成或構(gòu)成了病毒的免疫優(yōu)勢(shì)和/或高度可變區(qū)的一部分(例如抗原性部分)。這允許免疫隱蔽表位另外地變成顯性的以及高度免疫原性的。為了產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上修飾的HA分子，將編碼這種糖蛋白的DNA序列通過(guò)截短、插入、突變或它們的組合來(lái)重新安排，從而產(chǎn)生針對(duì)重塑HA分子的合成的開(kāi)放閱讀框(0RF)。如以上所提及的，與通過(guò)病毒感染或用不同的疫苗組合物或制劑(包括以前描述的VLP)進(jìn)行免疫所刺激的應(yīng)答相比，在此描述的VLP引出截然不同的免疫應(yīng)答。由這種VLP疫苗引起的廣泛中和性反應(yīng)將提供針對(duì)多種流感病毒株或亞型的異源亞型保護(hù)。病毒樣顆粒當(dāng)編碼流感蛋白的序列在真核生物中表達(dá)時(shí)，這些蛋白質(zhì)已經(jīng)顯示自我組裝成非傳染性病毒樣顆粒(VLP) o 參見(jiàn) Latham&Galarza(2001) J. Virol. 75(13) :6154-6165;Galarza 等人(2005) Viral. Immunol. 18(1) :244-51 ;以及美國(guó)專(zhuān)利公布 2008/0233150 ；2008/0031895 以及 2009/0022762。本披露涉及來(lái)自真核細(xì)胞的質(zhì)膜的流感VLP，這些VLP在其表面上攜帶修飾的抗原流感蛋白。単獨(dú)或與ー種或多種另外的VLP和/或佐劑組合的這種VLP刺激了針對(duì)流感感染進(jìn)行保護(hù)的免疫應(yīng)答。在此描述的VLP (又稱(chēng)為亞病毒結(jié)構(gòu)疫苗(SVSV))典型地由病毒蛋白組成，這些病毒蛋白由編碼基質(zhì)蛋白M(又稱(chēng)為Ml)以及任選地M2蛋白的基因的天然發(fā)生和/或突變的核酸序列而產(chǎn)生?；|(zhì)蛋白M是用于形成所有可能的多價(jià)亞病毒結(jié)構(gòu)疫苗組合的ー種通用組分。Ml和M2蛋白可以來(lái)自任何病毒。在某些實(shí)施方案中，VLP的Ml和/或M2來(lái)自流感基質(zhì)蛋白。在其他實(shí)施方案中，VLP的Ml和/或M2蛋白來(lái)自RSV或托高土病毒。Ml和/或M2蛋白可以被修飾(突變)，例如在此以及在美國(guó)專(zhuān)利公布2008/0031895以及2009/0022762 中所披露?？梢赃x擇來(lái)自相同或不同有包膜病毒家族的流感蛋白來(lái)用于結(jié)合到疫苗的表面上。流感蛋結(jié)合到相同疫苗顆粒中可以通過(guò)以下步驟來(lái)促進(jìn)，通過(guò)在編碼這些蛋白質(zhì)的核酸中的變化，將胞質(zhì)尾區(qū)以及跨膜氨基酸序列替換為來(lái)自常見(jiàn)糖蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)以及跨膜氨基酸序列。這種方法允許設(shè)計(jì)大量可能的多價(jià)亞病毒疫苗組合。I.修飾的流感抗原性多肽如以上提及的，在此描述的VLP包含修飾的(例如截短、缺失、雜合等)流感抗原多肽。在某些實(shí)施方案中，修飾的流感抗原是血凝素(HA)多肽。血凝素(HA)分子的主要功能是受體結(jié)合以及膜融合活性，這些功能是病毒感染起始中的關(guān)鍵步驟。另外，HA是中和抗體的產(chǎn)生所針對(duì)的病毒的主要表面抗原。前體分子(HAO)被裂解成兩個(gè)多肽(HAl)以及(HA2)，并且通過(guò)單一二硫鍵共價(jià)連接。HAO的裂解使HA2亞單位的NH2末端上的融合肽活化，并且使HA的融合潛カ活化，這是病毒感染性所需要的必要過(guò)程。HA結(jié)構(gòu)上的最重要以及最具有免疫優(yōu)勢(shì)的抗原位點(diǎn)居于分子的頭部上，主要由HAl亞單位形成。這些抗原性區(qū)域中通過(guò)突變(抗原漂移)或HA交換(抗原移位)所發(fā)生的變化使得病毒能夠避開(kāi)宿主中和性抗體，并且起始新細(xì)胞的感染。除了這些位點(diǎn)以外,亞 優(yōu)勢(shì)以及高度保守的表位存在于該結(jié)構(gòu)的干部分上；然而由于免疫等級(jí)，這些位點(diǎn)大部分未能被免疫系統(tǒng)識(shí)別，并且不能產(chǎn)生顯著的抗體應(yīng)答。然而，靶向這些區(qū)域的抗體能夠通過(guò)抑制膜融合并由此抑制病毒進(jìn)入來(lái)阻斷感染。因此，本發(fā)明中描述的疫苗是基于在VLP中表達(dá)的、截短的、重新工程化的并且重塑的HA分子，這些分子缺少主要免疫優(yōu)勢(shì)表位并且主要地展示存在于該分子的干部分上的亞優(yōu)勢(shì)抗原位點(diǎn)。這些結(jié)構(gòu)上修飾的HA被結(jié)合在病毒樣顆粒(VLP)的表面上，從而形成単一非傳染性保護(hù)顆粒(SNIPP)的流感疫苗。在某些方面，修飾(重塑)的HA多肽通過(guò)例如使ー些或所有免疫優(yōu)勢(shì)表位缺失而缺乏HAl區(qū)的一部分，同時(shí)維持含有易位信號(hào)序列的小NH2末端區(qū)域，該易位信號(hào)序列被連接至HAl和HA2亞單位的替代結(jié)構(gòu)。這些缺失(截短)可以是任何長(zhǎng)度，例如10至300個(gè)堿基對(duì)(或它們之間的任何數(shù)值，例如10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300或更多個(gè)堿基對(duì))。另外，這些缺失可以具有連續(xù)的堿基對(duì)，或者可替代地，可以在HA多肽的不同區(qū)域中缺失堿基對(duì)，例如在N末端處缺失10個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)，并且在分子的中心區(qū)域(例如在相對(duì)于易位信號(hào)序列的C末端的10個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域)中缺失另外的堿基對(duì)(10個(gè)至300個(gè)或甚至更多)。另外的修飾包括但是不限于連接子的添加、多肽的ー個(gè)或多個(gè)殘基的突變，等等。HA分子的具體修飾可以容易地在DNA水平上進(jìn) 行，并且隨后與組裝VLP所需的基因組合一起亞克隆。因此，提供在VLP中的抗原流感蛋白(例如HA)可以按任何方式修飾，例如經(jīng)由ー個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失和/或一個(gè)氨基酸的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，流感HA多肽通過(guò)使在HA多肽的N末端附近的氨基酸缺失來(lái)修飾。例如，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編號(hào)，從H24至G240的殘基可以被缺失。任選地，使HA1NH2末端的其他部分缺失，同時(shí)保留氨基酸D17至Y23以及分泌信號(hào)序列。所保留的較小序列維持殘基C20，該殘基促進(jìn)與C483形成鏈間ニ硫鍵并且使該分子穩(wěn)定。HAl的剩余區(qū)域(R241-L333)形成一系列P折疊，這些折疊散布有與C318形成ニ硫鍵的彎曲保守殘基(bend conserving residue) C294。任選地,使位置C290處的殘基突變成G以防止與C294或C318的可能的ニ硫鍵形成。在其他實(shí)施方案中，修飾(重塑)HA包含HAl的NH2末端(例如D17至P65，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編號(hào))，該NH2末端包括促進(jìn)ニ硫鍵合的殘基(例如C20以及C483，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編號(hào))。這類(lèi)修飾的HA多肽可以被連接至HAl的另外的區(qū)域，例如殘基241至346，如相對(duì)于野生型HA序列UniProtKB Q6DQ33所編號(hào)，這些殘基包括酶裂解位點(diǎn)以及未改變的C290以促進(jìn)與C58形成ニ硫鍵。仍然在其他的實(shí)施方案中，提供了包括HAl的NH2末端部分(D17至P65，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編 號(hào))的修飾的HA。任選地，在信號(hào)肽裂解之后，可以例如通過(guò)肽連接子將這個(gè)片段連接至HAl的另一部分(例如M281-R346，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編號(hào))。可以使用任何長(zhǎng)度的任何肽連接子。在某些實(shí)施方案中，肽連接子是5個(gè)與25個(gè)之間的氨基酸(包括其間的任何數(shù)目)，例如12個(gè)氨基酸連接子(DIGPGKVGYGPG，SEQ ID NO :11)。在這個(gè)構(gòu)建體中，促進(jìn)形成ニ硫鍵的殘基(例如C20-C483、C294-C318以及C58-C290配對(duì)殘基，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編號(hào))被維持。在此描述的任何修飾的HAl多肽(片段)可以可操作地連接至包含跨膜區(qū)以及胞質(zhì)尾區(qū)的HA2片段(例如包含殘基G347-I568的HA2片段，如相對(duì)于野生型HA序列UniProtKB Q6DQ33所編號(hào))。參見(jiàn)實(shí)例I以及圖。另外，可以將突變引入HA2多肽的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸中，這些突變例如，抑制或防止蛋白聚集的殘基的突變(例如V412至D412以及L419至G419，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編號(hào))。參見(jiàn)例如圖3。仍然在另外的實(shí)施方案中，修飾的HA包含連接至分泌信號(hào)肽的完整HA2片段。這個(gè)構(gòu)建體包含ー個(gè)分泌信號(hào)序列，HA2細(xì)胞外(例如347-520，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編號(hào))、跨膜以及胞漿(例如521-568，如相對(duì)于野生型HA序列UniProt KB Q6DQ33所編號(hào))區(qū)。該信號(hào)肽在轉(zhuǎn)錄/易位過(guò)程中被去除，并且它不存在于被結(jié)合到VLP疫苗上的HA2結(jié)構(gòu)中；對(duì)于其他重塑的HA，情況同樣如此。應(yīng)當(dāng)清楚的是，在HA2亞單位的羧基末端處的跨膜區(qū)以及胞質(zhì)尾區(qū)可以替換成從其衍生Ml蛋白的流感病毒的類(lèi)似序列或與Ml類(lèi)似物最佳相互作用的序列。參見(jiàn)例如圖4。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將兩個(gè)或更多個(gè)12-mers多堿基溶蛋白性裂解位點(diǎn)插入到該蛋白質(zhì)的序列之內(nèi)來(lái)修飾HA。適合的插入位點(diǎn)的非限制性實(shí)例包括P65與L66之間和/或1280與M281之間，如相對(duì)于野生型HA序列UniProtKB Q6DQ33所編號(hào)。另外，天然溶蛋白性裂解位點(diǎn)的ー個(gè)或多個(gè)殘基(KKR至GGG)也可以突變以防止這個(gè)位置處的裂解。這個(gè)分子的蛋白酶處理使HA的球狀頭部去除，從而使由HA2干以及HAl的剰余部分所形成的保守表位暴露。參見(jiàn)例如圖5A和圖5B。2.多肽編碼序列合宜地使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來(lái)制備如在此描述而產(chǎn)生的VLP。編碼ー種或多種VLP形成蛋白的多核苷酸被引入宿主細(xì)胞中，并且當(dāng)這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它們組裝成VLP。可以使用重組方法來(lái)獲得編碼形成VLP和/或被結(jié)合到VLP中的分子(結(jié)構(gòu)性和/或抗原多肽，包括修飾的抗原(例如HA)多肽)的多核苷酸序列，例如通過(guò)從表達(dá)該基因的細(xì)胞中篩選cDNA以及基因組文庫(kù)，或者通過(guò)從已知包含該基因的載體中得到該基因。例如，可以從例如A. T. C. C.的貯藏所或者從商業(yè)來(lái)源獲得含有編碼天然發(fā)生或者改變的細(xì)胞產(chǎn)物的序列的質(zhì)粒。可以使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶來(lái)消化含有感興趣的核苷酸序列的質(zhì)粒，并且可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將含有這些核苷酸序列的DNA片段插入到基因轉(zhuǎn)移載體中?？商娲兀梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)從表達(dá)或含有這些序列的細(xì)胞中獲得cDNA序列，這些技術(shù)例如苯酚提取以及cDNA或基因組DNA的PCR。關(guān)于用來(lái)獲得并且分離DNA的技術(shù)的描述，參見(jiàn)例如Sambrook等人,上述。簡(jiǎn)言之,可以使用寡聚脫氧胸苷(oligo-dT)或隨機(jī)引物用反轉(zhuǎn)錄酶來(lái)反轉(zhuǎn)錄來(lái)自表達(dá)感興趣的基因的細(xì)胞的mRNA。然后可以使用與所希望序列的任一側(cè)上的序列互補(bǔ)的寡核苷酸引物通過(guò)PCR(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，683，202,4, 683，195以及4，800，159，還參見(jiàn)PCR技術(shù):DNA擴(kuò)增的原理和應(yīng)用(PCR Technology principlesandApplications for DNA Amplification),Erlich(編著)，斯托克頓出版社，1989)來(lái)擴(kuò)增單鏈cDNA。還可以使用DNA合成儀(例如可從加州Foster City的ABI獲得的AppliedBiosystems Model 392DNA合成儀)來(lái)合成地產(chǎn)生(而不是克隆)感興趣的核苷 酸序列。該核苷酸序列還可以被設(shè)計(jì)為具有針對(duì)所希望的表達(dá)產(chǎn)物的適當(dāng)密碼子。該完整序列從重疊寡核苷酸來(lái)組裝，這些重疊寡核苷酸通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法而制備并且被組裝成ー個(gè)完整編碼序列。參見(jiàn)例如 Edge (1981)Nature 292 :756 ;Nambair 等人(1984) Science 223 1299 ；Jay 等人(1984)J. Biol. Chem. 259 :6311。典型地通過(guò)在細(xì)胞中(任選地與M2蛋白一起)表達(dá)編碼Ml抗原以及至少ー種修飾的流感抗原(例如HA抗原)的序列來(lái)形成在此描述的VLP。所表達(dá)的蛋白質(zhì)自組裝成VLP，其中抗原性糖蛋白裝飾VLP的表面。在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)編碼序列是RSV基質(zhì)蛋白。在其他實(shí)施方案中，基質(zhì)編碼序列是流感基質(zhì)蛋白。還應(yīng)當(dāng)清楚的是，基質(zhì)編碼序列可以含有一個(gè)或多個(gè)突變(修飾)，例如在美國(guó)專(zhuān)利公布2008/0031895以及2009/0022762中描述的修飾的基質(zhì)蛋白。在此描述的VLP可以進(jìn)一歩包含另外的流感蛋白(野生型、修飾的(突變體)、和/或野生型或突變體的雜合)。在此處描述的VLP中使用的任何蛋白質(zhì)可以是雜合(或嵌合)蛋白。應(yīng)當(dāng)清楚的是，多肽的全部或部分可以被替換為來(lái)自其他病毒的序列和/或來(lái)自其他流感毒株的序列。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，VLP蛋白的任何ー種可以是雜合體，因?yàn)樗鼈儼ň幋a跨膜和/或胞質(zhì)尾區(qū)(例如來(lái)自流感蛋白如HA或NA的區(qū))的異源序列。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào) 2008/0031895 和 2009/0022762。優(yōu)選地，用于形成流感VLP的序列展現(xiàn)出與天然發(fā)生的流感多核苷酸序列大約60%至 80 %之間(或其間的任何值，包括 61 %、62 %、63 %、64%、65%、66 %、67 %、68 %、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78% 以及 79% )的序列一致性，并且更優(yōu)選地，這些序列展現(xiàn)與天然產(chǎn)生的多核苷酸序列在大約80%與100%之間(或其間的任何值，包括 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 以及 99% )的序列一致性。在此描述的任何序列可進(jìn)ー步包括另外的序列。例如，為了進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗效力，將雜合分子表達(dá)并且結(jié)合在亞病毒結(jié)構(gòu)中。通過(guò)在DNA水平上將編碼基質(zhì)蛋白基因的序列與編碼佐劑或免疫調(diào)節(jié)部分的序列連接來(lái)產(chǎn)生這些雜合分子。在亞病毒結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程中，取決于Ml或可任選的M2是否攜帶佐劑分子，將這些雜合蛋白結(jié)合到顆粒之中或之上。將ー種或多種多肽免疫調(diào)節(jié)多肽(例如以下詳細(xì)描述的佐劑)結(jié)合至在此描述的序列中形成VLP可以增強(qiáng)效價(jià)，并且因此降低為刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答所需的抗原量?？商娲?，如以下描述，在由在此描述的序列產(chǎn)生VLP之后，可以將ー種或多種另外的分子(多肽或小分子)包括于含有VLP的組合物中。這些亞病毒結(jié)構(gòu)不含有傳染性病毒核酸并且它們不具有傳染性，從而消除了化學(xué)滅活的需要。由于不需要化學(xué)處理，因此保存了天然表位和蛋白質(zhì)構(gòu)象，從而增強(qiáng)了疫苗的免疫原性特征。在此描述的序列可按任何組合可操作地彼此連接。例如，ー種或多種序列可以從相同啟動(dòng)子和/或從不同啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)。如以下描述，序列可以被包括在一個(gè)或多個(gè)載體上。2.表達(dá)載體一旦包含編碼所希望結(jié)合至VLP中的一種或多種多肽的序列的構(gòu)建體已經(jīng)被合 成，可以將它們克隆至任何適合的載體或者復(fù)制子中用于表達(dá)。許多克隆載體對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的，并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以鑒于本說(shuō)明書(shū)的傳授內(nèi)容以及本領(lǐng)域中關(guān)于表達(dá)的已知信息而容易地選擇用于任何給定宿主細(xì)胞類(lèi)型的適當(dāng)?shù)妮d體以及控制元件?？傮w上參見(jiàn)Ausubel等人,上述或Sambrook等人,上述?？梢杂脕?lái)表達(dá)組裝成在此描述的VLP的序列的載體的非限制實(shí)例包括基于病毒的載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒)、桿狀病毒載體(參見(jiàn)實(shí)例)、質(zhì)粒載體、非病毒載體、哺乳動(dòng)物載體、哺乳動(dòng)物人工染色體(例如脂質(zhì)體、微粒載體，等等)以及它們的組合。這ー種或多種表達(dá)載體典型地含有編碼序列以及允許編碼區(qū)域在適合的宿主中表達(dá)的表達(dá)控制元件?？刂圃ǔ０▎?dòng)子、翻譯起始密碼子以及翻譯與轉(zhuǎn)錄終止序列，以及用于將插入物引入載體中的插入位點(diǎn)。翻譯控制元件已經(jīng)由M. Kozak綜述(例如 Kozak, M. , Mamm. Genome 7(8) :563-574,1996 ；Kozak, M. , Biochimie 76(9) :815-821,1994 ;Kozak，M.，J Cell Biol 108(2) :229-241,1989 ；Kozak,M. ,&Shatkin,A. J. , MethodsEnzymol 60 :360-375,1979)。例如，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的典型啟動(dòng)子尤其包括SV40早期啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子例如CMV立即早期啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子可包括內(nèi)含子A)、RSV、HIV-LTR、小鼠乳瘤病毒LTR啟動(dòng)子(MMLV-LTR)、FIV-LTR、腺病毒主要晩期啟動(dòng)子(Ad MLP)以及單純皰疹病毒啟動(dòng)子。其他非病毒啟動(dòng)子，例如來(lái)自鼠科動(dòng)物金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子，也可以用于哺乳動(dòng)物表達(dá)。典型地，還將存在轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序列，位于相對(duì)于翻譯終止密碼子的3'端。優(yōu)選地，還存在位于相對(duì)于編碼序列的5'端的用于優(yōu)化翻譯起始的序列。轉(zhuǎn)錄終止子/多聚腺苷酸化信號(hào)的實(shí)例包括如在Sambrook等人(上述)中描述的來(lái)自SV40的轉(zhuǎn)錄終止子/多聚腺苷酸信號(hào)，以及牛生長(zhǎng)激素終止子序列。含有剪接供體以及受體位點(diǎn)的內(nèi)含子也可以被設(shè)計(jì)在此處描述的構(gòu)建體中(Chapman等人，Nuc. Acids Res. (1991) 19:3979-3986)。還可以在此使用增強(qiáng)子元件來(lái)増加哺乳動(dòng)物構(gòu)建體的表達(dá)水平。實(shí)例包括SV40早期基因增強(qiáng)子，如在Dijkema等人，EMBO J. (1985)4:761中所描述；來(lái)自勞氏肉瘤病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，如在Gorman等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1982b) 79 :6777中所描述;以及來(lái)自人CMV的元件，如在Boshart等人，Cell (1985) 41 521中所描述,例如在CMV內(nèi)含子A序列中所包括的元件(Chapman等人，Nuc. Acids Res.(1991)19 :3979-3986)。應(yīng)當(dāng)清楚的是，ー種或多種載體可以含有編碼將要被結(jié)合到VLP中的蛋白質(zhì)的ー個(gè)或多個(gè)序列。例如，單ー載體可以攜帶編碼在VLP中發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)的序列?？商娲兀梢允褂枚喾N載體(例如各自編碼單一多肽編碼序列的多種構(gòu)建體；或各自編碼ー種或多種多肽編碼序列的多種構(gòu)建體)。在單ー載體包含多種多肽編碼序列的實(shí)施方案中，這些序列可以可操作地連接至同一載體之內(nèi)的相同或不同轉(zhuǎn)錄控制元件(例如啟動(dòng)子)。此外，載體可以含有另外的基因表達(dá)控制序列，這些序列包括染色質(zhì)開(kāi)放元件(chromatinopeningelement)，這些染色質(zhì)開(kāi)放元件防止轉(zhuǎn)基因沉默并且賦予一致的、穩(wěn)定的以及高水平的基因表達(dá)，不論染色體整合位點(diǎn)如何。存在位于管家基因附近的DNA序列基元，這些DNA序列基元在載體中在被整合的轉(zhuǎn)基因周?chē)a(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性開(kāi)放染色質(zhì)環(huán)境，從而使轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達(dá)最大化，而不論該轉(zhuǎn)基因在染色體中的位置如何。另外，編碼非流感蛋白的ー個(gè)或多個(gè)序列可以被表達(dá)并且結(jié)合至VLP中，這些序列包括但是不限于包含和/或編碼免疫調(diào)節(jié)分子(例如以下描述的佐劑)的序列，這些免 疫調(diào)節(jié)分子例如為免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸(例如CpG)、細(xì)胞因子、脫毒細(xì)菌毒素等等。3. VLP 產(chǎn)生如以上提及的，已經(jīng)顯示了在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的流感蛋白自組裝成非傳染性病毒樣顆粒(VLP)。因此，在此描述的序列和/或載體然后被用來(lái)轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。編碼形成在此描述的VLP的蛋白的這ー種或多種構(gòu)建體提供了用于使用許多種不同的細(xì)胞類(lèi)型來(lái)產(chǎn)生流感VLP的有效手段，所述細(xì)胞類(lèi)型包括但是不限于昆蟲(chóng)、真菌(酵母)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，在進(jìn)行轉(zhuǎn)染、建立連續(xù)細(xì)胞系(使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案)和/或用攜帯如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的感興趣的流感基因的DNA構(gòu)建體感染之后，在真核細(xì)胞中產(chǎn)生了亞病毒結(jié)構(gòu)疫苗。通過(guò)對(duì)推動(dòng)所選擇基因的轉(zhuǎn)錄的真核或病毒啟動(dòng)子進(jìn)行序列優(yōu)化將形成亞病毒結(jié)構(gòu)所需的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平最大化。該亞病毒結(jié)構(gòu)疫苗被釋放到培養(yǎng)基中，從該培養(yǎng)基中將它純化并且隨后配制成疫苗。亞病毒結(jié)構(gòu)不具有傳染性，并且因此不需要對(duì)VLP進(jìn)行滅活，因?yàn)樵摐缁钍轻槍?duì)ー些被殺滅的病毒疫苗的。從在此描述的序列中表達(dá)的流感多肽自組裝成具有呈現(xiàn)在表面上的抗原性糖蛋白的VLP的能力允許能夠通過(guò)共同引入所希望的序列而在許多宿主細(xì)胞中產(chǎn)生這些VLP。這ー種或多種序列(例如在ー種或多種表達(dá)載體中)可以按不同的組合而被穩(wěn)定地和/或瞬時(shí)地整合入宿主細(xì)胞中。適合的宿主細(xì)胞包括但是不限于細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、桿狀病毒/昆蟲(chóng)、酵母、植物以及非洲爪蟾(Xenopus)細(xì)胞。例如，許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括原代細(xì)胞以及可以從美國(guó)典型物保藏中心(A. T. C. C.)獲得的永生化細(xì)胞系，例如但是不限于MDCK、BHK、VERO,MRC-5、WI-38、HT1080、293、293T、RD、COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、M0LT4/ 克隆 8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、骨髓瘤細(xì)胞(例如SB20細(xì)胞)以及CEMX174 (這類(lèi)細(xì)胞系可以從例如A. T. C. C.獲得)。類(lèi)似地，例如大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)以及鏈球菌屬(Streptococcus spp.)的細(xì)菌宿主可以用于本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中。在本披露中有用的酵母宿主尤其包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麥芽糖念珠菌(Candida maltosa)、多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、李也蒙畢赤酵母(Pichiaguillerimondii)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂通酵母(Schizosaccharomyces pombe)以及解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。真菌宿主包括例如曲霉屬(Aspergillus)。用于桿狀病毒表達(dá)載體的昆蟲(chóng)細(xì)胞尤其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti )、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)、中國(guó)桑香(Bombyx mori)、黑腹果妮(Drosophilamelanogaster)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)以及粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。參見(jiàn) Latham&Galarza (2001) J. Virol. 75(13) :6154-6165 ；Galarza 等人(2005) Viral.Immunol. 18(1) :244-51 ;以及美國(guó)專(zhuān)利公布 200550186621 和 20060263804。

在給出在此提供的披露的情況下，可以通過(guò)穩(wěn)定地整合編碼VLP蛋白的一種或多種表達(dá)載體構(gòu)建體而容易地產(chǎn)生表達(dá)ー種或多種上述序列的細(xì)胞系。調(diào)控這ー種或多種被穩(wěn)定地整合的流感序列的表達(dá)的啟動(dòng)子可以是組成性或者是誘導(dǎo)性的。因此，可以產(chǎn)生一種在其中穩(wěn)定地整合一種或多種基質(zhì)蛋白的細(xì)胞系，使得在將在此描述的序列(例如雜合蛋白)引入宿主細(xì)胞中并且表達(dá)由多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)之后，即形成呈遞抗原性糖蛋白的非復(fù)制性病毒顆粒。在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生了穩(wěn)定地表達(dá)兩種或更多種抗原性不同的流感蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。編碼Ml、M2和/或另外的糖蛋白(例如來(lái)自相同或不同病毒株)的序列可以被引入這種細(xì)胞系中來(lái)產(chǎn)生在此描述的VLP。可替代地，可以生成穩(wěn)定地產(chǎn)生Ml蛋白(以及可任選地M2)的細(xì)胞系，并且將編碼來(lái)自ー種或多種選擇的毒株的ー種或多種抗原性流感蛋白的序列引入該細(xì)胞系中，導(dǎo)致產(chǎn)生呈遞所希望的抗原性糖蛋白的VLP?？梢詮钠浍@得VLP產(chǎn)生細(xì)胞系的親本細(xì)胞系可以選自以上描述的任何細(xì)胞，包括例如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、酵母、細(xì)菌細(xì)胞系。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞系是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如 293、RD、C0S-7、CH0、BHK、MDCK、MDBK、MRC-5、VER0、HT1080 以及骨髓瘤細(xì)胞)。使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生流感VLP提供了 (i)VLP形成；(ii)正確的翻譯后修飾(糖基化、棕櫚?；?以及芽殖(budding) ；(iii)沒(méi)有非哺乳動(dòng)物細(xì)胞污染物，以及(iv)易于純化。除了建立細(xì)胞系以外，也可以將流感編碼序列瞬時(shí)表達(dá)于宿主細(xì)胞中。適合的重組表達(dá)宿主細(xì)胞系統(tǒng)包括但不限于本領(lǐng)域中熟知的細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、桿狀病毒/昆蟲(chóng)、牛痘、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus ;SFV)、甲病毒(例如辛德畢斯(Sindbis)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE))、哺乳動(dòng)物、酵母以及非洲蟾蜍表達(dá)系統(tǒng)。特別優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、牛痘、辛德畢斯、昆蟲(chóng)以及酵母系統(tǒng)。許多適合的表達(dá)系統(tǒng)可以商購(gòu)獲得，包括例如以下系統(tǒng)桿狀病毒系統(tǒng)(Reilly，P. R.等人的桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORS ALABORATORY MANUAL) (1992) ；Beames 等人，Biotechniques 11:378(1991) ；Pharmingen ；Clontech, Palo Alto, Calif.))、牛痘表達(dá)系統(tǒng)(當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(CurrentProtocols in Molecular Biology) (F. M. Ausubel 等人編著)中的Earl, P. L.等人的“使用牛痘在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白(Expression of proteins in mammalian cells usingvaccinia)，，，GreenePublishing Associates&Wiley Interscience, New York(1991)；1992年8月4日頒發(fā)的Moss，B.等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，135，855)、在細(xì)菌中表達(dá)(Ausubel,F.M.等人的當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY)，John Wiley and Sons，Inc.，Media PA ;Clontech)、在酵母中表達(dá)(1998 年 3 月 17 日頒發(fā)的Rosenberg，S. &Tekamp_01son，P.的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)RE35，749，通過(guò)引用將其結(jié)合在此；1997年5月13號(hào)頒發(fā)的Shusten J. R.的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，629，203，通過(guò)引用將其結(jié)合在此；Gellissen，G.等人，Antonie VanLeeuwenhoek, 62 (1-2) :79-93(1992)；Romanos, M. A.等人的酵母(Yeast) 8 (6) :423-488(1992) ;Goeddel，D. V.的酶學(xué)方法(Methods in Enzymology) 185 (1990) ；Guthrie, C.，&G. R. Fink 的酶學(xué)方法(Methods inEnzymology) 194 (1991))、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)(Clontech ;Gibco_BRL，Ground Island，N. Y.;例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary ；CH0)細(xì)胞系(Haynes，J.等人，Nuc.Acid. Res. 11 :687-706(1983) ;1983，Lau，Y. F.等人，Mol. Cell. Biol. 4 :1469-1475(1984)；酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)中第 185 卷第 537-566 頁(yè)的 Kaufman，R. J.的“異源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的選擇和共擴(kuò)增(Selectionand coamplification of heterologousgenes in mammalian ceils)”， Academic Press， Inc. ， San Diego Calif. (1991))、 以及在植物細(xì)胞中表達(dá)(植物克隆載體，ClontechLaboratories, Inc.，Palo-Alto,Calif.以及 Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.，Pistcataway, N.J. ;Hood，E 等人的 J.Bacteriol. 168 :1291-1301(1986) ；NageI, R.等人的 FEMS Microbiol. Lett. 67 325 (1990);植物分子生物學(xué)手冊(cè)(PlantMolecular Biology Manual)中的 An 等人的“雙元載體(Binary Vectors)”以及其他，A3 :1-19(1988);植物DNA傳染原(PlantDNA Infectious Agents) (Hohn，T.等人編著的 Miki，B. L A.等人的第 249-265 頁(yè)以及其他，Springer-Verlag, Wien，Austria，(1987);植物分子生物學(xué)基本技術(shù)(PlantMolecular Biology Essential Techniquesノ，P. G. Jones&J. M.Sutton，New York，J. Wiley, 1997 ;Miglani，Gurbachan 的植物遺傳與分子生物學(xué)詞典(Gurbachan Dictionaryof Plantbenetics and Molecular Biology), New fork， Fooa Products Press，1998 ；Henry, R. J.的植物分子生物學(xué)的實(shí)際應(yīng)用(Practical Applications of PlantMolecularBiology)，New York，Chapman&Hall，1997)。當(dāng)含有編碼用于形成亞病毒結(jié)構(gòu)疫苗所需要的蛋白質(zhì)的改變的基因的表達(dá)載體被引入宿主細(xì)胞中并且隨后在所需水平上表達(dá)時(shí)，亞病毒結(jié)構(gòu)疫苗組裝并且隨后從細(xì)胞表面被釋放至培養(yǎng)基中(圖7)。取決于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，通過(guò)使被表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在以下條件下生長(zhǎng)來(lái)產(chǎn)生VLP，即在這些條件下，一種或多種顆粒形成多肽得被表達(dá)并且可以形成VLP。適當(dāng)生長(zhǎng)條件的選擇在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。如果VLP被形成并且保留在細(xì)胞內(nèi)，則使用化學(xué)、物理或機(jī)械手段來(lái)破壞細(xì)胞，從而使細(xì)胞溶解，而仍然保持VLP基本上完整。這類(lèi)方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的并且描述于例如蛋白質(zhì)純化應(yīng)用實(shí)用方法(Protein PurificationApplications A Practical Approachノ (E. L. V. Harris&S. Angai編著，1990)中?？商娲兀琕LP可以被分泌并且從周?chē)囵B(yǎng)基中收獲。然后使用保存顆粒完整性的方法來(lái)將顆粒分離(或基本上純化)，這些方法例如通過(guò)密度梯度離心(例如鹿糖梯度)、PEG-沉淀、?；?，等等(參見(jiàn)例如，Kirnbauer等人J. Virol. (1993)67 :6929-6936)，以及標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，包括例如離子交換以及凝膠過(guò)濾色譜法。組合物如在此描述而產(chǎn)生的VLP可以用來(lái)在給予受試者時(shí)引出免疫應(yīng)答。如以上論述的，VLP可以包含許多種抗原(例如，來(lái)自ー種或多種毒株或分離物的一種或多種修飾的流感抗原)。純化的VLP可通常以疫苗組合物的形式給予脊椎動(dòng)物受試者。也可以使用組合疫苗，其中這類(lèi)疫苗含有例如來(lái)自流感或其他生物的其他亞單位蛋白和/或編碼這類(lèi)抗原的基因遞送疫苗。VLP免疫刺激(或疫苗)組合物可包括各種賦形劑、佐劑、載體、輔助物質(zhì)、調(diào)節(jié)劑，等等。免疫刺激組合物將包括足以發(fā)動(dòng)免疫應(yīng)答的量的VLP/抗原。適當(dāng)?shù)挠行Я靠捎杀?領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。這種量在可以通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)確定的相對(duì)廣泛范圍內(nèi)，并且通常將為以下數(shù)量級(jí)的量大約0. I ii g至大約10 (或更多)mg,更優(yōu)選地大約I y g至大約300 Ii g的VLP/抗原。亞病毒結(jié)構(gòu)疫苗從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化，并且用適當(dāng)?shù)木彌_劑和添加劑配制，這些緩沖劑和添加劑例如為a)防腐劑或抗生素；b)穩(wěn)定劑，包括蛋白質(zhì)或有機(jī)化合物；c)用于增強(qiáng)效力并且調(diào)節(jié)針對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答(體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答)的佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑；或d)增強(qiáng)疫苗抗原向免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞進(jìn)行呈遞的分子。這種疫苗可以制備成冷凍干燥(凍干)的形式以便提供適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存并且將制備物的貯存期限最大化。這允許能夠長(zhǎng)時(shí)間堆放(stock piling)疫苗,而維持免疫原性、效カ以及功效。載體任選地存在于在此描述的組合物中。典型地，載體是本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接收組合物的個(gè)體有害的抗體的分子。適合的載體典型地是較大、緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚こ醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚集物(例如油滴或脂質(zhì)體)以及非活性病毒顆粒。微粒載體的實(shí)例包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的那些載體，以及衍生自聚(丙交酷)以及稱(chēng)為PLG的聚(丙交酷-こ交酷)共聚物的微粒。參見(jiàn)例如Jeffery 等人，Pharm. Res. (1993) 10 :362-368 ；McGee J P 等人，J Microencapsul. 14 (2)197-210，1997 ;(V Hagan D T 等人，Vaccine 11(2) :149_54，1993。這類(lèi)載體對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的。另外，這些載體可以作為免疫刺激劑(“佐劑”)起作用。示例性佐劑包括但不限于(1)鋁鹽(明礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油乳液制劑(在具有或不具有其他特定免疫刺激劑例如胞壁肽(參見(jiàn)以下)或細(xì)菌細(xì)胞壁組分的情況下)，例如(a)MF59(國(guó)際公布號(hào)W090/14837)，它含有5%角鯊烯、0.5%吐溫80以及0.5%司盤(pán)85 (任選地含有不同量的MTP-PE (參見(jiàn)以下)，但不是必需的)，使用微射流機(jī)例如IlOY型微射流機(jī)(Microfluidics, Newton, Mass.)被配制成亞微米顆粒，(b)SAF,它含有10%角鯊?fù)椤?. 4%吐溫80、5%普盧蘭尼克(pluronic)-嵌段聚合物L(fēng)121以及thr_MDP (參見(jiàn)以下)，被微射流成亞微米乳液或經(jīng)過(guò)渦旋而產(chǎn)生較大粒徑的乳液，以及(c) RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT)，它含有 2%角鯊烯、0. 2%吐溫 80 以及來(lái)自下組的ー種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，該組由以下各項(xiàng)組成單磷酰脂A(MPL)、海藻糖ニ霉菌酸酷(TDM)以及細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選地MPL+CWS (Detoxu) ； (3)可使用的皂角苷佐劑，例如 StimulonTM(Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.),或從其中產(chǎn)生的顆粒,例如ISCOM (免疫刺激復(fù)合物)；(4)完全弗氏佐劑(CFA)以及不完全弗氏佐劑(IFA) ； (5)細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素(IL-1、IL-2等)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、^趨化因子(MIP、I-a U-PRantes等)；(6)細(xì)菌性ADP-核糖基化毒素例如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌不耐熱毒素(LT)的脫毒突變體，尤其是LT-K63(其中賴(lài)氨酸取代位置63處的野生型氨基酸)、LT-R72 (其中精氨酸取代位置72處的野生型氨基酸)、CT-S109 (其中絲氨酸取代位置109處的野生型氨基酸)，以及PT-K9/G129 (其中賴(lài)氨酸取代位置9處的野生型氨基酸并且甘氨酸在位置129處進(jìn)行取代)(參見(jiàn)例如國(guó)際公布號(hào)W093/13202和W092/19265);以及(7)充當(dāng)免疫刺激劑來(lái)增強(qiáng)組合物有效性的其他物質(zhì)。
胞壁酰肽包括但不限于N-こ酰基-胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-こ酰基-正胞壁?；?L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(nor_MDP)、N_こ酰胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(I' -2' - ニ棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-こ胺(MTP-PE)等。適合在此使用的免疫調(diào)節(jié)分子的實(shí)例包括以上描述的佐劑以及以下各項(xiàng)IL-1和 IL-2 (Karupiah 等人(1990) J. Immunology 144 :290-298, Weber 等人(1987) J. Exp.Med. 166 :1716-1733，Gansbacher 等人(1990) J. Exp. Med. 172 :1217-1224，以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，738，927-) ;IL_3 和 IL-4(Tepper 等人(1989)Cell 57 :503-512, Golumbek 等人(1991) Science 254:713-716，以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，017，691) ;IL_5 和 IL-6 (Brakenhof■等人(1987) J. Immunol. 139 :4116-4121，以及國(guó)際公布號(hào) WO 90/06370) ;IL_7(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，965，195) ;IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12 以及 IL_13(細(xì)胞因子公報(bào)(CytokineBulletin), 1994 年夏李);IL_14 和 IL-15 ; a 干擾素(Finter 等人(1991)藥物(Drugs)42 :749-765，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，892，743 以及 4，966，843，國(guó)際公布號(hào) WO 85/02862，Nagata等人(1980)自然(Nature) 284 :316-320, Familletti 等人(1981)Methods in Enz. 78 387-394, Twu 等人(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2046-2050,以及 Faktor 等人(1990)癌基因(Oncogene ) 5 :867-872) ; 3 -干擾素(Seif 等人(1991) J. Virol. 65 664-671); Y-干擾素(Watanabe 等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :9456_9460，Gansbacher 等(1990)癌癥研究(Cancer Research) 50 :7820-7825, Maio 等(1989) Can.Immunol. Immunother. 30 :34-42,以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，762，791 和 4，727，138) ；G-CSF(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,999,291和4,810,643) ;GM_CSF(國(guó)際公布號(hào)WO 85/04188);腫瘤壞死因子(TNFs)(Jayaraman 等(1990)J. Immunology 144 :942-951) ；CD3(Krissanen 等人(1987)Immunogenetics26 :258-266) ;ICAM-1(Altman 等(1989)自然(Nature )338 :512-514,Simmons 等人(1988)自然(Nature )331 :624-627) ； I CAM-2, LFA-U LFA-3 (ffallner 等人(1987) J. Exp. Med. 166 :923-932) ；MHC I 型分子、MHC II 型分子、B7. I-P 2-微球蛋白(Parnes 等人(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2253-2257);伴侶蛋白例如鈣聯(lián)接蛋白；以及MHC-連接的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其類(lèi)似物(Powis等人(1991)自然(Nature) 354:528-531)。免疫調(diào)節(jié)因子也可以是激動(dòng)劑、拮抗劑或這些分子的配體。例如，可溶形式的受體經(jīng)?？梢宰鳛檫@些類(lèi)型的因子的拮抗劑，這些因子本身的突變形式同樣如此。可以容易地從各種來(lái)源獲得編碼以上描述的物質(zhì)的核酸分子、以及能有利地用于本發(fā)明中的其他核酸分子，這些來(lái)源包括例如，如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的貯藏所，或者來(lái)自商業(yè)來(lái)源，例如British Bio-Technology Limited (Cowley,英國(guó)牛津)。代表性實(shí)例包括BBG 12 (含有編碼127個(gè)氨基酸的成熟蛋白的GM-CSF基因)、BBG 6 (含有編碼、干擾素的序列)、A. T. C. C.保藏號(hào)39656 (含有編碼TNF的序列)、A. T. C. C.保藏號(hào)20663 (含有編碼a -干擾素的序列)、A. T. C. C.保藏號(hào)31902、31902以及39517 (含有編碼P -干擾素的序列)、A. T. C. C.保藏號(hào)67024(含有編碼白細(xì)胞介素-Ib的序列)、A. T. C. C.保藏號(hào)39405、39452、39516、39626以及39673 (含有編碼白細(xì)胞介素-2的序列)、A. T. C. C.保藏號(hào)59399,59398以及67326 (含有編碼白細(xì)胞介素-3的序列)、A. T. C. C.保藏號(hào)57592 (含有編碼白細(xì)胞介素_4的序列)、A. T. C. C.保藏號(hào)59394以及59395 (含有編碼白細(xì)胞介素-5的序列)以及A.T.C.C.保藏號(hào)67153(含有編碼白細(xì)胞介素-6的序列)。編碼ー種或多種以上鑒定的多肽的質(zhì)?？梢杂眠m當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶消化，并且可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將含有感興趣的具體基因的DNA片段插入基因轉(zhuǎn)移載體(例如以上描述的表達(dá)載體)中。(參見(jiàn)例如Sambrook等人,上述,或Ausubel等人(編著)當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current Protocols inMolecular Biology),Greene Publishingand ffiley-Interscience)。
給藥可以通過(guò)任何遞送模式將VLP以及包含這些VLP的組合物給予受試者，這些模式包括例如腸胃外注射(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或被給予至組織的間質(zhì)間隙)或經(jīng)過(guò)直腸、口腔(例如片劑、噴霧劑)、陰道、局部、經(jīng)皮(transdermal)(例如參見(jiàn)W099/27961)或經(jīng)皮膚(transcutaneous)(例如參見(jiàn) W002/074244 和 W002/064162)、鼻內(nèi)(例如參見(jiàn)W003/028760)、眼、耳、肺或其他粘膜給予?？梢酝ㄟ^(guò)相同或不同的途徑來(lái)給予多個(gè)劑量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些劑量鼻內(nèi)給予的。VLP(以及含有VLP的組合物)可以在遞送其他疫苗之前、同時(shí)或之后給予。另外，VLP給予部位可以與所給予的其他疫苗組合物相同或不同。用VLP組合物進(jìn)行的給藥治療可以是單劑量方案或者多劑量方案。多劑量方案是如下方案可以用I至10次分開(kāi)的劑量進(jìn)行主要接種過(guò)程，然后在后續(xù)時(shí)間間隔時(shí)給出其他劑量，這些時(shí)間間隔經(jīng)過(guò)選擇以便維持和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，例如第二劑量在I至4個(gè)月時(shí)，并且如果需要，在幾個(gè)月后給予后續(xù)劑量。給藥方案還至少部分地由用藥程式(modality)的效力、所使用的疫苗遞送、受試者的需要來(lái)確定并且取決于從業(yè)者的判斷。在此提到的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)以及公開(kāi)物通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。雖然出于清楚和理解的目的，已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明以及實(shí)例相當(dāng)詳細(xì)地提供了披露，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是，可以實(shí)施不同的變化和修改而不背離本披露的精神或范圍。因此，前述披露以及以下實(shí)例不應(yīng)當(dāng)理解為具有限制性。因此，應(yīng)當(dāng)清楚的是，雖然所披露的修飾是相對(duì)于給定的野生型HA序列(例如UniProt KB Q6DQ33)進(jìn)行編號(hào)的，但是可以容易地在其他HA序列中進(jìn)行相應(yīng)的突變。實(shí)例實(shí)例I :截短、重新工程化以及重塑的HA分子的產(chǎn)牛各種修飾的HA分子設(shè)計(jì)如下。通過(guò)使HAl片段的一部分(217aa，從H23至G240)缺失，從而在去除分泌信號(hào)序列之后保持NH2末端處的氨基酸D17至Y23，產(chǎn)生了重塑HA子。這種較小的序列保持了殘基C20，該殘基促進(jìn)與C483形成鏈間ニ硫鍵并且使該分子穩(wěn)定。HAl的剩余區(qū)域(R241-L333)形成一系列3折疊，這些折疊散布有與C318形成ニ硫鍵的彎曲保守殘基C294。此外，在位置C290處的殘基被突變成G以防止與C294或C318的可能的ニ硫鍵形成。這種HAl片段在基因上連接至包含跨膜區(qū)以及胞質(zhì)尾區(qū)的完整HA2片段。由此產(chǎn)生的構(gòu)建體稱(chēng)為“1TA重塑HA”并且描繪于圖I中。這種構(gòu)建體的DNA以及氨基酸序列如下重塑HA ITA的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACGGAAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA重塑HA-ITA的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKK⑶SHMKSELEYGNGNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI。另ー種重塑HA被設(shè)計(jì)成包含HAl的NH2末端(D17至P65)，這個(gè)NH2末端包括促進(jìn)與C483形成ニ硫鍵的C20以及有助于形成高度保守表位的ー個(gè)部分。這被連接至HAl的剰余部分，即位置241至346，這個(gè)部分包括酶裂解位點(diǎn)以及未改變的C290以促進(jìn)與C58形成ニ硫鍵。這個(gè)HAl片段在基因上連接至包含跨膜區(qū)以及胞質(zhì)尾區(qū)的完整HA2片段(G347-I568)。這個(gè)構(gòu)建體稱(chēng)為重塑HA “2TA”并且描繪于圖2中。DNA和氨基酸序列顯示如下。重塑HA-2TA的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTAGGATGGAGTTCTTCTG GACAATTTTAAAGCCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA重塑HA-2TA的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSHMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRR
KKRGLFGAlAGFlEGGffQGMVDGffYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI另ー種重塑HA顯示在圖3中。這種構(gòu)建體包括HAl的NH2末端部分(D17至P65)，在信號(hào)肽裂解之后，這個(gè)部分通過(guò)所設(shè)計(jì)的12aa肽連接子(DIGPGKVGYGPG，SEQ ID NO :11)而連接至HAl的另ー個(gè)部分(M281-R346)。在這種構(gòu)建體中，保持了 C20-C483、C294-C318以及C58-C290配對(duì)殘基以促進(jìn)ニ硫鍵的形成。整個(gè)HA2區(qū)域(G347至1568)在基因上連接至HAl片段。還在HA2中引入V412至D412以及L419至G419的突變以防止蛋白聚集。這種構(gòu)建體被標(biāo)識(shí)為“3TA重塑HA”并且在圖3中顯示了示意圖。3TA分子的核苷酸以及氨基酸序列顯示如下。重塑HA-3TA的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAAT
GGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTGACATAGGACCAGGAAAGGTAGGATACGGACCAGGAATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAA CACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGACGGAAGGG
AATTTAACAACGGAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA重塑HA-3TA的氨基酸序列(SEQ ID NO 6) MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPDIGPGKVGYGPGMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEADGREFNNGERRIENLNKKMEDGFLDVffTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI修飾的流感HA的另ー個(gè)實(shí)例顯示在圖4中(指定為“4TA”)。這種構(gòu)建體包括連接至分泌信號(hào)肽的HA2片段，這個(gè)片段包括細(xì)胞外區(qū)域(殘基347-520)以及跨膜和胞漿區(qū)(殘基521-568)。信號(hào)肽在轉(zhuǎn)錄/易位過(guò)程中被去除，并且它不存在于被結(jié)合到VLP疫苗上的HA2結(jié)構(gòu)中(對(duì)于其他重塑HA，情況同樣如此)。另外，HA2亞單位的羧基末端處的跨膜區(qū)以及胞質(zhì)尾區(qū)可任選地被替換成從其衍生Ml蛋白的流感病毒的類(lèi)似序列或與Ml類(lèi)似物最佳相互作用的序列。使這些分子接觸優(yōu)化增強(qiáng)了顆粒組裝和釋放。4TA分子的核苷酸和氨基酸序列顯示如下。重塑HA-4TA的核苷酸序列(SEQ ID NO 7)ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGGATTA
TTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTT
AGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGA
ATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA重塑HA-4TA的氡某酸序列(SEQ ID NO 8)MEKIVLLFAIVSLVKSGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI在另ー個(gè)實(shí)例中，通過(guò)將ー個(gè)或多個(gè)裂解位點(diǎn)插入該蛋白質(zhì)的序列中來(lái)重塑流感HA多肽。如在圖5A中所示(指定為“5TA” )，示例性插入位點(diǎn)包括P65與L66之間和/或1280與M281之間。圖5還顯示了 12個(gè)殘基的示例性裂解位點(diǎn)(例如12-mers多堿基溶蛋白性裂解位點(diǎn))。ー個(gè)另外的變化包括天然溶蛋白性裂解位點(diǎn)中的3個(gè)殘基的突變(KKR至GGG)，這種突變也可以包括在內(nèi)以便防止在此位置的裂解。這個(gè)分子的蛋白酶處理(參見(jiàn)圖5B)使HA的球狀頭部去除，從而使由HA2干和HAl的剩余部分形成的保守表位暴露。5TA分子的核苷酸和氨基酸序列顯示如下。重塑HA-5TA的核苷酸序列(SEQ ID NO 9)ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGAAACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAGATGGAGTGAAGCCTCCACAGAGAGAAAGAAGAAGAAAGAAGAGACTAATTTTGAGAGATTGTAGCGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAGTCATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCA
GCATGTCCATACCAGGGAAAGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAAGCTCTATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTCCACAGAGAGAAAGAAGAAGAAAGAAGAGA ATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGCATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATTG
GGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAGAAGAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAAAGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAAGGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAATGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCGAGACTAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAATGCAGAATTTGCATTTAA重塑HA-5TA 的氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)MEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPPQRERRRKKRLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYP⑶FNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIPQRERRRKKRMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINS SMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGS GYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVffTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI這些重塑結(jié)構(gòu)典型地缺乏HAl區(qū)的一大部分，從而缺失了大多數(shù)的免疫優(yōu)勢(shì)表位，但是維持含有易位信號(hào)序列的小NH2末端區(qū)域，該易位信號(hào)序列連接至HAl和HA2亞單位的替代性結(jié)構(gòu)。HA分子的特異性修飾在DNA水平上進(jìn)行，并且隨后與VLP組裝所需的基因組合一起亞克隆。在真核表達(dá)系統(tǒng)中，單獨(dú)或連同在一起或呈組合形式的Ml (或功能相似的基質(zhì)蛋白)、M2、NA以及NP來(lái)合成修飾的HA基因引起在表面上展示一系列修飾的HA分子的泡狀顆粒(vesicular particle)或病毒樣顆粒(VLP)的產(chǎn)生。修飾HA的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了保守亞優(yōu)勢(shì)表位的抗原全貌，在這個(gè)結(jié)構(gòu)中能夠觸發(fā)針對(duì)許多種流感病毒亞型和抗原變體的強(qiáng)而廣泛保護(hù)性的免疫應(yīng)答。因此，這種疫苗提供了克服出現(xiàn)突變型的綜合保護(hù)，從而延長(zhǎng)了其功效。如以上詳細(xì)描述的，產(chǎn)生以及評(píng)估適當(dāng)VLP的許多種方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。例如，形成VLP所需的基因，包括編碼修飾HA的DNA序列，可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。使用質(zhì)粒、載體、病毒或用于在細(xì)胞中引入并且表達(dá)單一或多種基因的其他方法，使用替代的重組表達(dá)系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生VLP，這些系統(tǒng)包括但是不限于桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)、瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物、酵母、植物細(xì)胞或原核細(xì)胞。針對(duì)與識(shí)別免疫優(yōu)勢(shì)與亞優(yōu)勢(shì)區(qū)域的抗體的反應(yīng)性，對(duì)所產(chǎn)生的VLP進(jìn)行測(cè)試。攜帶與識(shí)別保守亞優(yōu)勢(shì)表位的抗體反應(yīng)的修飾HA的VLP結(jié)構(gòu)被用 來(lái)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫并且評(píng)估血清中和野生型完整病毒的能力以及在小鼠和雪貂中引出針對(duì)攻擊病毒的廣泛保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。又如以上所描述，用所描述的VLP疫苗(用與甲型以及乙型病毒的如在此描述的修飾HA —起組裝的VLP來(lái)配制)對(duì)人類(lèi)或易感流感的其他種類(lèi)進(jìn)行免疫將引出一種廣泛中和性免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答能夠針對(duì)甲型流感病毒的亞型和抗原變體以及乙型流感病毒和它們的抗原變體進(jìn)行保護(hù)。實(shí)例2:攜帶用于產(chǎn)生展示獨(dú)特HA分子的病毒樣顆粒(VLP)的多種基因的哺乳動(dòng)物DNA質(zhì)粒載體或重組桿狀病毒的產(chǎn)牛在此實(shí)例中，描述了用于產(chǎn)生VLP所需要的構(gòu)建體的產(chǎn)生。所產(chǎn)生的構(gòu)建體的總體結(jié)構(gòu)顯示在圖6中。感興趣的基因在哺乳動(dòng)物質(zhì)粒(載體，圖6，圖I)中亞克隆，這些質(zhì)粒含有不但增強(qiáng)了高度以及可持續(xù)水平的基因表達(dá)而且提高了產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比率的獨(dú)特調(diào)節(jié)序列。產(chǎn)生VLP的替代方法是利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。所產(chǎn)生的構(gòu)建體的總體結(jié)構(gòu)描繪在圖6的圖II中。使用適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，使得每一種基因處于哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子或啟動(dòng)子A)的轉(zhuǎn)錄控制之下，將流感Ml和M2基因在哺乳動(dòng)物質(zhì)粒表達(dá)載體中相繼地亞克隆。另外，流感Ml和M2基因在其中克隆的質(zhì)粒還含有抗生素選擇標(biāo)記(例如潮霉素、嘌呤霉素或新霉素)以及每種基因上游的特定序列，這些序列在DNA整合入哺乳動(dòng)物染色體中之后保持開(kāi)放染色質(zhì)狀態(tài)。因此，這些構(gòu)建體適合于進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。使用熒光細(xì)胞分選來(lái)選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例顯示在圖8A-C中。此外，M1/M2蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MDCK和CHO細(xì)胞中的表達(dá)水平分別顯示在圖9A以及9B中。使用適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，使得每一種基因處于哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子或啟動(dòng)子A)的轉(zhuǎn)錄控制之下，將重塑的HA以及NA基因在另一種哺乳動(dòng)物質(zhì)粒表達(dá)載體中亞克隆。在完成每一種構(gòu)建體之后，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶分析和測(cè)序來(lái)驗(yàn)證基因定向和完整性。通過(guò)轉(zhuǎn)化MAX Efficiency Stbl2感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞以及進(jìn)行maxi-prep DNA制備(Qiagen, Valencia, CA)來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)增每一種構(gòu)建體的質(zhì)粒DNA。通過(guò)分光光度法來(lái)確定質(zhì)粒DNA的濃度。利用環(huán)狀DNA來(lái)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，而用具有I-SceI限制性?xún)?nèi)切酶切割的線(xiàn)性DNA來(lái)進(jìn)行用于產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生了用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生VLP的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。如在圖6的圖II中所圖解，四種流感基因在單一質(zhì)粒中并且在桿狀病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下進(jìn)行亞克隆。如以前描述的，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶分析和測(cè)序來(lái)驗(yàn)證基因定向和完整性。通過(guò)進(jìn)行maxi-pr印DNA制備來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)增質(zhì)粒DNA。將轉(zhuǎn)移載體(攜帶四種流感基因)與線(xiàn)性化桿狀病毒DNA一起共轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中導(dǎo)致用于產(chǎn)生VLP疫苗的重組桿狀病毒的形成。實(shí)例3 :通過(guò)電穿孔將DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中在如實(shí)例2中所描述在產(chǎn)生所希望的載體之后，將載體用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CH0、Vero、MDCK、WI-38 或 MRC5)中產(chǎn)生 VLP。

為了產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過(guò)電穿孔將線(xiàn)性化的DNA引入細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，在DNA電穿孔之前24小時(shí)，將選擇的細(xì)胞以大約4百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的濃度接種于T-175燒瓶中以允許在24小時(shí)內(nèi)形成80-85%匯合單層。在電穿孔之前，將細(xì)胞單層用8ml的IX PBS(Gibco)洗滌一次，然后用4ml的IX胰蛋白酶-EDTA(Gibco)處理，并且在37°C下孵育5分鐘。通過(guò)添加至含有 10% FBS(Invitrogen，San Diego,CA)的 6ml DMEM(Gibco)燒瓶中將細(xì)胞重懸、收集于試管中并且隨后通過(guò)在500xg下離心5分鐘而沉淀。將細(xì)胞沉淀用5ml的冰冷
IXRPMI 1640 (Cellgro,Mediatech,Manassas, VA)洗滌兩次，并且然后重懸于 500 μ I 的冰冷 Ix RPMI 中。細(xì)胞懸浮液接收6 μ g的表達(dá)M1/M2的線(xiàn)性化的質(zhì)粒，或M1/M2加上表達(dá)Na/重塑HA的質(zhì)粒，通過(guò)吸移(pipeting)輕輕混合，并且然后轉(zhuǎn)移至O. 4cm間隙的電穿孔比色皿(Bio-Rad,Hercules,CA)中。將比色皿放置于Bio-Rad GenePulsar中，并且使用以下參數(shù)將細(xì)胞電穿孔400ν、960μ F。將電穿孔的細(xì)胞在室溫下保持5分鐘，然后轉(zhuǎn)移至6孔板中的具有10% FBS以及青霉素/鏈霉素(Gibco)的DMEM中，并且在37°C下在具有5% C02的情況下進(jìn)行孵育。電穿孔之后六小時(shí)，抽吸培養(yǎng)基，將細(xì)胞用IX PBS洗滌一次，并且添加新鮮的培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37°C下在具有5% CO2的情況下孵育直到開(kāi)始抗生素選擇為止。一個(gè)修改的實(shí)驗(yàn)方案用于對(duì)例如CHO細(xì)胞系的懸浮細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。直接從培養(yǎng)皿中收集細(xì)胞而不需要胰蛋白酶處理。后續(xù)步驟如以上描述來(lái)進(jìn)行。實(shí)例4 :通過(guò)化學(xué)方法將DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中將哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CH0、Vero、MDCK、MRC5或WI-38)通過(guò)以下步驟進(jìn)行制備以進(jìn)行轉(zhuǎn)染在補(bǔ)充有 5%胎牛血清(FBS) (Invitrogen,Carlsbad,CA)的 5ml CHO-S-SFM II 培養(yǎng)基(CH0 細(xì)胞)或 IOml DMEM(Vero、MDCK、MRC5、WI-38)中，以 I. 5 X IO6 至 2. 5 X IO6 個(gè)細(xì)胞/毫升的密度鋪在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿(對(duì)于CHO細(xì)胞為25cm2燒瓶或?qū)τ赩ero、MDCK, MRC5或WI-38細(xì)胞為75cm2燒瓶)中。在開(kāi)始轉(zhuǎn)染程序之前24小時(shí)對(duì)貼壁細(xì)胞(Vero、MDCK、MRC5、WI-38)進(jìn)行鋪板。在此步驟之后，建立包含質(zhì)粒DNA與Iipofectamine的DNA-脂質(zhì)復(fù)合反應(yīng)。將感興趣的質(zhì)粒DNA或其混合物稀釋在一個(gè)試管中的500 μ I的Opti-MEM培養(yǎng)基中并且將20 μ I的Iipofectamine 2000稀釋在另一個(gè)試管中的480 μ I的Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。將 Iipofectamine-OptiMEM 混合物在室溫下孵育 5 分鐘。
在此步驟之后，將質(zhì)粒DNA-OptiMEM混合物與Iipofectamine-OptiMEM混合物組合并且允許反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20分鐘。然后將DNA-Iipofectamine復(fù)合物添加至先前如上所述鋪板的細(xì)胞。在CHO細(xì)胞的情況下，在添加DNA-Iipofectamine復(fù)合物之后五小時(shí)，將25cm2燒瓶的2. 5ml內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)25cm2燒瓶并且將4. 5ml的CH0-S-SFMII培養(yǎng)基添加至這兩個(gè)燒瓶。將貼壁細(xì)胞保持在培養(yǎng)瓶中并且添加5ml的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用的試劑或培養(yǎng)基均不含任何抗生素，因?yàn)檫@些抗生素可以通過(guò)結(jié)合在DNA-脂質(zhì)復(fù)合物中而被遞送至細(xì)胞內(nèi)部，可以證明這對(duì)細(xì)胞是有毒的。為了瞬時(shí)表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生VLP，將質(zhì)粒以DNA-脂質(zhì)復(fù)合物的形式引入細(xì)胞中，在這種復(fù)合物中DNA呈其天然環(huán)狀形式 。在轉(zhuǎn)染后72-96小時(shí)，評(píng)估VLP蛋白在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中以及在培養(yǎng)上清液中的表達(dá)。為了產(chǎn)生其中感興趣的質(zhì)粒與染色體細(xì)胞DNA整合從而建立連續(xù)蛋白質(zhì)表達(dá)的狀態(tài)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，遵循這一轉(zhuǎn)染程序，例外之處在于被引入細(xì)胞中的質(zhì)粒呈線(xiàn)性結(jié)構(gòu)。感興趣的基因在其中克隆的質(zhì)粒還含有抗生素抗性標(biāo)記，例如潮霉素、嘌呤霉素或新霉素。因此，在轉(zhuǎn)染后48-96小時(shí)，基于由質(zhì)粒遞送的抗性基因，將選擇抗生素添加至培養(yǎng)基，由此使細(xì)胞經(jīng)受選擇。在選擇8-10天之后，使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，基于表面蛋白的表達(dá)和檢測(cè)，分離在抗生素的存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞。實(shí)例5 :轉(zhuǎn)染環(huán)狀DNA用于瞬時(shí)表達(dá)蛋白質(zhì)以及組裝展示重塑HA的VLP通過(guò)電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)染將未切割的環(huán)狀質(zhì)粒的組合引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中來(lái)進(jìn)行VLP產(chǎn)生的評(píng)定。在這個(gè)實(shí)例中，將M1/M2載體與Na/HA(重塑的，圖I)組合并且通過(guò)所描述的兩種轉(zhuǎn)染方法中的任一種遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CH0、MDCK、MRC5或WI-38)。細(xì)胞溶解產(chǎn)物、培養(yǎng)上清液以及濃縮的純化上清液的蛋白質(zhì)印跡分析證明，這些蛋白質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞中并且釋放至培養(yǎng)基中，如在圖10中所示。此外，通過(guò)負(fù)染色電子顯微術(shù)和冷凍電子顯微術(shù)來(lái)檢查由這些細(xì)胞產(chǎn)生并且釋放的濃縮且純化的物質(zhì)。這些研究揭示了類(lèi)似于例如流感病毒的有包膜病毒顆粒的病毒樣顆粒的存在(圖11)。實(shí)例6 :轉(zhuǎn)染線(xiàn)件化DNA以產(chǎn)牛穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞將線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)致質(zhì)粒整合到宿主細(xì)胞基因組中。遞送實(shí)例I中描述的線(xiàn)性形式的任何構(gòu)建體導(dǎo)致質(zhì)粒整合以及由載體DNA攜帶的基因的后續(xù)表達(dá)。這一策略允許建立組成性表達(dá)感興趣的基因產(chǎn)物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。遵循這種途徑，將線(xiàn)性化M1/M2載體(圖6A)通過(guò)電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)染引入MDCK、Vero或CHO細(xì)胞中。在這個(gè)步驟之后,將細(xì)胞用一種抗生素(潮霉素、嘌呤霉素或新霉素)處理，該抗生素是基于由質(zhì)粒攜帶的抗生素抗性基因而選擇的。M1/M2載體含有潮霉素抗性基因，因此用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以這種抗生素來(lái)處理以選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。針對(duì)其表面上M2蛋白的表達(dá)來(lái)測(cè)試在抗生素存在下生長(zhǎng)的細(xì)胞并且使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)將其克隆。圖8顯示了 M1/M2轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的FACS直方圖，它證明了表達(dá)M2蛋白的細(xì)胞群的比例。擴(kuò)增了多個(gè)細(xì)胞克隆，并且通過(guò)蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步評(píng)估Ml和M2蛋白兩者的表達(dá)。此外，如在圖9A和圖9B中所示，選擇的M1/M2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MDCK和CHO細(xì)胞系組成性地表達(dá)了這些蛋白質(zhì)。這些細(xì)胞系可以用攜帶NA/HA(重塑)的載體轉(zhuǎn)染以用于組裝和釋放展示出獨(dú)特HA分子的流感病毒樣顆粒(圖1-5)。實(shí)例7 :穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇已經(jīng)用編碼感興趣的一種或多種基因的線(xiàn)性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞然后經(jīng)受抗生素處理，以便選出所轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒已經(jīng)整合到宿主細(xì)胞基因組中的細(xì)胞。所轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒含有抗生素抗性盒，該盒賦予對(duì)于潮霉素、嘌呤霉素或新霉素的抗性。轉(zhuǎn)染后大約48-72小時(shí)，通過(guò)以下步驟使細(xì)胞經(jīng)受選擇壓力將適當(dāng)濃度的抗生素(400 μ g/ml的潮霉素、10 μ g/ml的嘌呤霉素或10 μ g/ml的新霉素)添加至細(xì)胞培養(yǎng)基，并且通過(guò)若干次細(xì)胞傳代將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在此培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。這個(gè)過(guò)程僅僅允許已經(jīng)在其中發(fā)生來(lái)自轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的基因的染色體整合的那些細(xì)胞存活，并且從群體的其余部 分中選出這些細(xì)胞。實(shí)例8 =M1/M2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析將如上所述獲得的細(xì)胞從組織培養(yǎng)瓶中獲取，并且通過(guò)在500xg下連續(xù)離心5min、接著重懸于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌三次。在第三次洗滌之后，將細(xì)胞計(jì)數(shù)并且分成每份5 X IO6個(gè)細(xì)胞的三個(gè)等分部分。將一個(gè)等分部分，即針對(duì)細(xì)胞表面M2表達(dá)來(lái)分選的那個(gè)等分部分，與在PBS中的I : 500稀釋度的抗M2單克隆抗體(Abeam Inc,Cambridge,MA) 一起在室溫下孵育I小時(shí)。，將第二個(gè)等分部分與在PBS中的I : 200稀釋度的針對(duì)甲型流感核蛋白的單克隆抗體(Meridian Life Sciences, Saco, ME) 一起在室溫下孵育I小時(shí)。這個(gè)等分部分充當(dāng)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)的同種型對(duì)照。第三個(gè)等分部分充當(dāng)實(shí)驗(yàn)的未染色對(duì)照。在與對(duì)應(yīng)抗體一起孵育之后，將細(xì)胞用PBS洗滌三次并且與在PBS中的I : 100稀釋度的異硫氰酸突光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠抗體(Abeam Inc,Cambridge,MA) —起在室溫下孵育I小時(shí)。在這些處理之后，將細(xì)胞用PBS洗滌三次并且重懸于3ml最終體積的細(xì)胞培養(yǎng)基中。然后，這些樣品在MoFlo細(xì)胞分選儀中進(jìn)行分析。如它們的特異性綠色熒光光譜所確定，在其細(xì)胞表面上表達(dá)高水平M2蛋白的細(xì)胞按照I個(gè)細(xì)胞/孔被分選至每個(gè)孔含有100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中。圖8描繪了用Μ1/Μ2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行的分選實(shí)驗(yàn)。這個(gè)選擇方法被應(yīng)用于用在此描述的任何構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的鑒定和分離(例如圖1-5)。用攜帶Na/HA重塑1(圖I)的DNA載體所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)NA和HA蛋白兩者，這些蛋白質(zhì)展示于細(xì)胞表面上，從而允許連續(xù)表達(dá)這些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆的鑒定和分離。經(jīng)由HA的選擇使用了可以識(shí)別在重塑HA分子上的保守表位的廣泛中和性單克隆抗體。在建立第一個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系之后，進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染以便將另一組基因引入并且整合到基礎(chǔ)細(xì)胞系的宿主基因組中。這個(gè)策略描繪于圖7B中，并且也通過(guò)FACS分析來(lái)進(jìn)行對(duì)于第二輪轉(zhuǎn)染中所產(chǎn)生的穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定和選擇。由描繪在圖6上的載體構(gòu)建體(在圖I中所示的構(gòu)建體)遞送的具有或不具有NA的重塑HA的五種構(gòu)建體是表面分子并且展示于細(xì)胞膜上，因此適合于FACS策略來(lái)鑒定并且選擇連續(xù)產(chǎn)生具有重塑HA分子的VLP的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。實(shí)例9 :穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并目.組成件地產(chǎn)牛Ml和M2流感蛋白的終點(diǎn)克降和擴(kuò)增為了從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體獲得克隆細(xì)胞系，進(jìn)行了終點(diǎn)克隆。收獲細(xì)胞并且使用血細(xì)胞計(jì)進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后，將細(xì)胞稀釋在適當(dāng)體積的培養(yǎng)基中，使得最終濃度達(dá)到10個(gè)細(xì)胞/毫升。將此細(xì)胞制備物輕輕地?cái)嚢枰源_保均勻的細(xì)胞分布，并且然后以100微升/孔鋪在無(wú)菌96孔板中。然后，將這些板在37°C下在具有5% C02的加濕氣氛下孵育并且針對(duì)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)。在一段時(shí)間內(nèi)鑒定具有活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞的孔。當(dāng)這些孔中的克隆細(xì)胞達(dá)到大約70% -80%匯合時(shí)，將細(xì)胞通過(guò)連續(xù)傳代來(lái)按比例擴(kuò)大至6孔板，25cm2以及75cm2燒瓶。實(shí)例10 :蛋白質(zhì)表達(dá)的分析對(duì)于細(xì)胞沉淀并且對(duì)于轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)分析。收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、用IX PBS洗滌并且重懸于RIPA緩沖液[Tris-HCl (pH7. 4)50mM、氯化鈉150mM、EDTA ImM、Triton X-1001 NP-401 %、十二烷基硫酸鈉0. 1% ]中，并且然后通過(guò)冷凍與解凍循環(huán)以及吸移進(jìn)行破壞，并且最后儲(chǔ)存在-20°C下直到進(jìn)一步使用為止。通過(guò)布拉得福德法來(lái)估計(jì)在每個(gè)樣品中的總蛋白濃度；簡(jiǎn)言之，將10μ I樣品添加至被預(yù)溫至室溫的I. Oml的Ix布拉得福德染料試劑(Bio-Rad Inc. , Hercules, CA)中。然后將此反應(yīng)混合物劇烈振蕩以產(chǎn)生均勻的溶液。在分光光度計(jì)中在595nm波長(zhǎng)處測(cè)量每個(gè)樣品的吸光度。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度，該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是通過(guò)使用布拉得福德測(cè)定法在595nm處測(cè)量已知濃度的牛血清白蛋白的吸光度而繪制的。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，將相等量的蛋白質(zhì)加載于SDS-PAGE上并且通過(guò)在125V下電泳I. 5小時(shí)來(lái)解析。隨后,將蛋白質(zhì)電印跡(electroblotted)至硝酸纖維素或PVDF膜上并且經(jīng)受具有以下步驟的蛋白質(zhì)印跡程序封閉、與一種或多種一級(jí)抗體一起孵育、洗滌、與辣根過(guò)氧物酶偶聯(lián)的二級(jí)抗體一起孵育、再次洗滌，以及最后與化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)以及進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。實(shí)例11 :連續(xù)表汰流感Ml和M2蛋白的細(xì)朐系的詵擇通過(guò)用攜帶Ml和M2流感基因的線(xiàn)性化DNA載體進(jìn)行電穿孔來(lái)轉(zhuǎn)染MDCK和CHO細(xì)胞。用潮霉素選擇之后，在用抗體組合標(biāo)記細(xì)胞之后，使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分離單細(xì)胞克??；首先，與細(xì)胞表面上表達(dá)的M2蛋白反應(yīng)的抗M2小鼠單克隆抗體作為一級(jí)抗體，之后將熒光素偶聯(lián)的抗小鼠抗體作為二級(jí)抗體。將分選的單細(xì)胞擴(kuò)增并且進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)印跡來(lái)評(píng)定Ml和M2蛋白的表達(dá)。將細(xì)胞溶解，加載至SDS-PAGE(10% -20% )上并且通過(guò)電泳進(jìn)行分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜并且用4%脫脂乳封閉I小時(shí)。然后將該膜與小鼠單克隆抗Ml蛋白(I 40，000稀釋度)以及小鼠單克隆抗M2蛋白(I 1000稀釋度)(Abeam，克隆14C2) —起孵育過(guò)夜。將該膜用IX TBST洗滌5分鐘(3次)，并且然后與辣根過(guò)氧物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(在2%脫脂乳中的 I : 50, 000 稀釋度)(ThermoScientific, Rockford, IL) 一起孵育 I 小時(shí)。將該膜用IX TBST洗滌10分鐘(3次)，隨后與SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(ThermoScientific, Rockford, IL) 一起孵育5分鐘。將該膜曝露于HyBlotCL放射自顯影膠片(Denville Scientific, Metuchen, NJ)。如在圖9A泳道3中所示，MDCK細(xì)胞溶解產(chǎn)物產(chǎn)生與分子量(MW)為約27kDA的Ml蛋白以及MW為約IlkDA的M2蛋白相應(yīng)的兩個(gè)主要條帶，而未轉(zhuǎn)染的對(duì)照未顯示這些蛋白質(zhì)的存在。泳道I :蛋白質(zhì)標(biāo)記物，泳道2 :不表達(dá)流感Ml和M2蛋白的MDCK細(xì)胞(陰性對(duì)照)，泳道3 :組成性表達(dá)甲型流感Ml和M2蛋白的MDCK細(xì)胞。對(duì)于引入如在圖9B中所示的CHO細(xì)胞以及VERO細(xì)胞中的相同質(zhì)粒獲得相似的結(jié)果。
實(shí)例12 :重塑HA/NA蛋白在產(chǎn)牛M1/M2的細(xì)朐中的表汰在具有或不具有NA的情況下攜帶重塑HA分子的DNA載體(圖6圖Ι-HA/NA)連同與M1/M2DNA載體(圖I-圖I-M1/M2) —起轉(zhuǎn)染到已經(jīng)表達(dá)M1/M2的細(xì)胞中導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)的表達(dá)，這些蛋白質(zhì)不僅存在于細(xì)胞溶解產(chǎn)物中而且存在于細(xì)胞上清液以及濃縮的純化上清液中。在圖10中顯示了這些樣品的蛋白質(zhì)印跡分析并且顯示了 M1、M2以及HA蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的產(chǎn)生。實(shí)例13 :通討負(fù)染色電子顯微術(shù)檢杳流感VLP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液在4°C下在200，OOOxg下經(jīng)受超速離心I. 5小時(shí)。將來(lái)自超速離心的沉淀重懸于PBS中并且將20μ I的重懸沉淀予以留出用于電子顯微術(shù)分析。將這 20μ I樣品用4%多聚甲醛固定，并且然后將5μ I被固定的材料施用到200網(wǎng)目碳包覆柵格(carbon coated grid) (EMS，Hatfield，PA)上并且允許覆蓋該柵格5分鐘，并且然后用水洗滌三次。此后，將包覆的柵格快速連續(xù)地暴露于五滴2%乙酸雙氧鈾以防止該柵格利用乙酸雙氧鈾而過(guò)度染色。將過(guò)量溶液從該柵格印跡，并且接著空氣干燥，然后將它加載至JOEL JEM 100CX透射電子顯微鏡上。將樣品在60，000X至100，000X的放大率下觀(guān)察。圖11顯示了從Ml/M2_HA/Na CHO細(xì)胞的純化的上清液獲得的圖像。
權(quán)利要求
1.ー種病毒樣顆粒(VLP),包含 至少ー種基質(zhì)蛋白；以及 一種修飾的流感HA多肽，其中該修飾包括該HA多肽的跨膜以及胞質(zhì)尾區(qū)外部的ー個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失。
2.如權(quán)利要求I所述的VLP，其中該缺失包括至少150個(gè)氨基酸殘基的缺失。
3.如權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的VLP，其中該修飾的流感HA多肽中的至少ー個(gè)殘基被突變。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的VLP，其中至少ー個(gè)溶蛋白性裂解位點(diǎn)或至少ー個(gè)連接子被插入該修飾的流感HA多肽中。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的VLP，其中該修飾的流感HA多肽的跨膜區(qū)被替換為來(lái)自與該修飾的流感HA多肽不同的毒株或亞型的ー個(gè)HA跨膜區(qū)，和/或其中該修飾的流感HA多肽的胞漿區(qū)被替換為來(lái)自與該修飾的流感HA多肽不同的毒株或亞型的ー個(gè)HA胞漿區(qū)。
6.如權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的VLP,進(jìn)ー步包含另外的流感蛋白，例如ー種或多種野生型基質(zhì)蛋白、ー種或多種突變基質(zhì)蛋白、ー種或多種雜合基質(zhì)蛋白、ー種或多種突變與雜合基質(zhì)蛋白、ー種或多種野生型抗原性糖蛋白、一種或多種修飾的抗原性糖蛋白、一種或多種雜合抗原性糖蛋白、一種或多種修飾與雜合抗原性糖蛋白、ー種或多種核蛋白(NPs)、ー種或多種PBl蛋白、ー種或多種PB2蛋白、ー種或多種PA蛋白或它們的組合。
7.如權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的VLP，其中該VLP在允許VLP的組裝以及釋放的條件下在ー種真核細(xì)胞中表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7所述的VLP，其中該真核細(xì)胞選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
9.一種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的VLP的方法，該方法包括以下步驟 將編碼至少ー種基質(zhì)蛋白和至少ー種修飾的流感HA多肽的ー種或多種載體轉(zhuǎn)染至適合的宿主細(xì)胞中，并且在允許形成VLP的條件下表達(dá)蛋白質(zhì)的組合。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中至少ー種基質(zhì)蛋白選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成流感Ml蛋白、托高土(thogoto)基質(zhì)蛋白以及RSV基質(zhì)蛋白，并且進(jìn)ー步地,其中至少一種載體任選地進(jìn)一歩包含編碼流感M2蛋白的序列。
11.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的方法，其中該ー種或多種載體被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至該宿主細(xì)胞中并且任選地其中該至少一種基質(zhì)蛋白以及該修飾的流感HA多肽在分開(kāi)的載體上被編碼，并且進(jìn)ー步地，其中在用編碼該修飾的流感HA多肽蛋白的該載體轉(zhuǎn)染之前，將編碼該至少ー種基質(zhì)蛋白的該載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至該細(xì)胞中。
12.ー種免疫原性組合物,包含至少ー種根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的VLP，并且任選地進(jìn)ー步包含佐劑。
13.如權(quán)利要求12所述的免疫原性組合物，其中該組合物包含至少兩個(gè)VLP，這些VLP包括不同的修飾的流感HA多肽。
14.ー種在受試者體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)流感的免疫應(yīng)答的方法,該方法包括向該受試者給予一個(gè)有效量的根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的VLP或根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的免疫原性組合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該組合物是經(jīng)過(guò)粘膜、皮內(nèi)、皮下、肌幾內(nèi)或ロ服給予的。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中該免疫應(yīng)答針對(duì)流感的多種毒株或亞型對(duì)該受試者進(jìn)行接種。
全文摘要
在此描述了流感病毒樣顆粒(VLP)，它們?cè)谄浔砻嫔险故境鲆环N或多種截短、重新工程化或重塑的HA分子。還描述了制造和使用這些VLP的方法。
文檔編號(hào)A61K39/145GK102858368SQ201180019751
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者喬斯·加拉爾薩, 喬治·R·馬丁 申請(qǐng)人:泰科諾瓦有限公司