專(zhuān)利名稱(chēng)：Hcv感染患者中的冷球蛋白血癥性血管炎和b細(xì)胞惡性腫瘤的預(yù)測(cè)標(biāo)志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于與丙型肝炎病毒感染相關(guān)的疾病的早期診斷和治療的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)感染的一種不常見(jiàn)的表現(xiàn)是與II型冷球蛋白血癥(冷球蛋白血癥性血管炎)有關(guān)的系統(tǒng)性血管炎，一種增殖性B細(xì)胞紊亂，其中5% -10%的患者轉(zhuǎn)化為B細(xì)胞惡性腫瘤。產(chǎn)生冷球蛋白血癥性血管炎所需要的HCV感染的持續(xù)時(shí)間尚不明確，但似乎為10年或更長(zhǎng)的時(shí)間。由于大多數(shù)感染者在冷球蛋白血癥性血管炎癥狀發(fā)作之前的這段延長(zhǎng)的時(shí)間期間不表現(xiàn)出任何癥狀，很少做出冷球蛋白血癥性血管炎或相關(guān)的B細(xì)胞惡性腫瘤的早期診斷。由于丙型肝炎患者在其有癥狀前不太可能進(jìn)行治療，本領(lǐng)域中對(duì)于發(fā)現(xiàn)有助于HCV感染患者中的冷球蛋白血癥性血管炎和相關(guān)的B細(xì)胞惡性腫瘤的早期診斷的預(yù)后標(biāo)志物存在著需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括通過(guò)采用檢測(cè)一種特異抗體上的交叉獨(dú)特型表位(cross-idiotypicepitope)來(lái)檢測(cè)在產(chǎn)生疾病的臨床癥狀之前產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞的用于與一種特異性抗體相關(guān)的疾病的早期診斷和治療的方法。具體而言，本發(fā)明提供了一種在這樣的患者產(chǎn)生該感染的這些并發(fā)癥之前利用丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的B細(xì)胞克隆擴(kuò)增(BCE)分析的用于與II型冷球蛋白血癥相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤的早期診斷的方法。在此還描述的是采用針對(duì)檢測(cè)到的交叉獨(dú)特型抗原的抗體進(jìn)行治療的方法。本發(fā)明是基于以下令人驚奇的發(fā)現(xiàn)即，在無(wú)癥狀HCV感染患者中檢測(cè)到的WAB細(xì)胞是產(chǎn)生冷球蛋白血癥性血管炎和相關(guān)的B細(xì)胞惡性腫瘤的一個(gè)標(biāo)志物。在此描述的是用于鑒定具有產(chǎn)生與HCV相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法。首先，提供了一種來(lái)自感染有HCV的受試者的樣品。適合的樣品是一種包括全血的生物流體。如果在樣品中檢測(cè)到WA交叉獨(dú)特型陽(yáng)性(Xid+) B細(xì)胞，則該受試者被鑒定為具有產(chǎn)生與HCV相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的人。一方面，該受試者是被早期鑒定的。優(yōu)選地，該早期鑒定的受試者是在初次HCV感染之后、但在表現(xiàn)與冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤相關(guān)的癥狀之前被鑒定的。一方面，這些WA Xid+B細(xì)胞是通過(guò)鑒定來(lái)自一個(gè)克隆擴(kuò)增的B細(xì)胞群的一種免疫球蛋白核酸序列而檢測(cè)的，其中該免疫球蛋白核酸序列與WA Xid相關(guān)。該與WA Xid相關(guān)的免疫球蛋白核酸序列包含IgH V1-69、或IgHV V3-7或相關(guān)的種系基因、VK325或VK328、JH4或JH3、Jkl、以及一個(gè)D區(qū)共有序列，D區(qū)共有序列包括SEQ ID NO 1(共有序列I)或SEQ ID N0:2(共有序列 2)。可替代地，這些WA Xid+B細(xì)胞是用一種分離的抗WA Xid的抗體檢測(cè)的。任選地，該分離的抗WA Xid的抗體附著到一種標(biāo)記上。一方面，該標(biāo)記是一種異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記或一種藻紅蛋白(PE)標(biāo)記。這些WA Xid+B細(xì)胞是通過(guò)免疫染色或流式細(xì)胞分析進(jìn)行檢測(cè)的。一方面，該方法進(jìn)一步包括用一種抗CDllc抗體來(lái)檢測(cè)該樣品中的CDllC+的細(xì)胞。還提供了用于鑒定具有產(chǎn)生與HCV感染相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法。首先，提供了來(lái)自一位HCV感染患者的克隆擴(kuò)增的B細(xì)胞的一種核酸樣品來(lái)檢測(cè)與WA Xid相關(guān)的免疫球蛋白核酸序列，其中所述免疫球蛋白核酸序列包括IgH V1-69或IgHV3-7或有關(guān)的種系基因、VK325或VK328、JH4或JH3、以及Jkl。隨后，檢測(cè)該樣品中的包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的一個(gè)序列。如果SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2存在于含有與WA Xid相關(guān)的IgH和VK序列的源于HCV感染患者的核酸中， 則預(yù)測(cè)HCV感染相關(guān)性冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤的產(chǎn)生。一方面，該患者缺乏冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤的臨床癥狀。本發(fā)明還提供了早期治療在受試者中的與HCV相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的方法。首先，獲得一種來(lái)自感染有HCV的受試者的樣品。適合的樣品是一種包括全血的生物流體。如果該樣品含有WA Xid+B細(xì)胞，則將一種抗WA的抗體給予該受試者，從而治療受試者中的與HCV相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤。優(yōu)選地，該早期治療是在初次HCV感染之后、但在表現(xiàn)出與冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤相關(guān)的癥狀之前進(jìn)行的。本發(fā)明還提供了一種用于早期檢測(cè)和治療具有產(chǎn)生B細(xì)胞惡性腫瘤(由WA B細(xì)胞引起的那些除外)風(fēng)險(xiǎn)的一位受試者的方法。首先，提供了一種來(lái)自感染有HCV的受試者的樣品。任選地，該特異性非WAXid+B細(xì)胞是用一種分離的抗非WA Xid抗體檢測(cè)的。一方面，該受試者是早期被鑒定的。優(yōu)選地，該早期被鑒定的受試者是在初次HCV感染之后、但在表現(xiàn)出與冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤相關(guān)的癥狀之前被鑒定的。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包含一套第一引物和第二引物，以及用于基于與WA Xid相關(guān)的免疫球蛋白核酸序列的檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)與HCV感染相關(guān)的冷球蛋白血癥血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的說(shuō)明書(shū)，這些免疫球蛋白核酸序列包括IgH V1-69或VIgH V3-7或相關(guān)的種系基因、VK325 或 VK328、JH4 或 JH3、Jkl、以及 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2。該套第一和第二引物包括位于互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)序列的兩側(cè)的一種第一引物和一種第二引物、位于VH-D-JH序列的兩側(cè)的一種第一引物和一種第二引物、以及位于Ig編碼轉(zhuǎn)錄本中的VK-JK序列的兩側(cè)的一種第一引物和一種第二引物。根據(jù)本發(fā)明的以下優(yōu)選實(shí)施方案的描述并且根據(jù)權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。除非另有規(guī)定，在此使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。雖然與在此描述的那些相似或等同的方法和材料可以被用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，以下描述了適合的方法和材料。將所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利、Genbank/NCBI登錄號(hào)、以及其他在此提及的參考文獻(xiàn)以其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用進(jìn)行結(jié)合。在發(fā)生沖突的情況下，將以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)例僅僅是說(shuō)明性的而不旨在進(jìn)行限制。根據(jù)以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。


圖I是一個(gè)B細(xì)胞克隆擴(kuò)增分析凝膠的化學(xué)發(fā)光圖(chemiIumigraph)?；颊叩暮颂呛怂?RNA)被擴(kuò)增?；颊?7、45、71、72、80、84和88被考慮為陽(yáng)性(白色箭頭表示BCE)并且患者17、50、83、85、86和87被考慮為陰性。通過(guò)凝膠圖像的光密度掃描證實(shí)了這些分類(lèi)。圖2顯示了患者127的另外研究結(jié)果。圖2A是外周血瑞氏染色的顯微照片，顯示 了絨毛淋巴細(xì)胞。圖2B是一個(gè)流式細(xì)胞術(shù)直方圖，顯示了一個(gè)⑶llc+、WA+B細(xì)胞群。圖2C和2D是描繪了用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗WA Xid(C)和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗⑶I Ic (D)的⑶IIC分離的細(xì)胞的雙重染色的顯微照片。
具體實(shí)施例方式在美國(guó)，感染有丙型肝炎病毒(HCV)的患者大約有四百萬(wàn)，全世界的感染患者超過(guò)I. 7億。丙型肝炎病毒是黃病毒科中的一種小的(大小為50-65nm)、具包膜的正義單鏈核糖核酸(RNA)病毒。丙型肝炎病毒顆粒由遺傳物質(zhì)核心(RNA)組成，其被一個(gè)二十面體的保護(hù)性蛋白質(zhì)外殼包圍，并且進(jìn)一步包裝在細(xì)胞來(lái)源的脂質(zhì)(脂肪)包膜中。兩種病毒包膜糖蛋白，El和E2，鑲嵌在脂質(zhì)包膜中。丙型肝炎病毒的主要基因型有6個(gè)，用數(shù)字表示，例如，基因型1，基因型2，等等。HCV通過(guò)血液到血液接觸的方式傳播，例如，注射藥物使用(共用針頭)、受感染的血液產(chǎn)品和性傳播，并且在人體中表現(xiàn)為丙型肝炎，一種影響肝臟的感染性疾病。大多數(shù)人在初次感染之后具有很少的癥狀(如果有的話)，然而病毒在大約85%的那些感染者的肝臟中持續(xù)存在。慢性感染一旦建立，可能進(jìn)展成肝臟瘢痕形成(纖維化)和晚期瘢痕形成(肝硬化)，后者通常在許多年之后才明顯。在一些情況下，肝硬化患者發(fā)展成肝衰竭或其他的肝硬化并發(fā)癥，包括肝癌。發(fā)展成肝硬化或肝癌的患者可能需要肝移植；然而，丙型肝炎病毒在移植之后一般會(huì)再出現(xiàn)。急性丙型肝炎是指在HCV感染之后的第一個(gè)6個(gè)月。60%到70%的HCV感染者在急性期期間是無(wú)癥狀的。少數(shù)人經(jīng)歷急性期癥狀，癥狀通常是輕微的和非特異性的，并且很少導(dǎo)致丙型肝炎的特異性診斷。急性丙型肝炎感染的癥狀包括食欲減退、疲勞、腹痛、黃疸、瘙癢和流感樣癥狀。在感染之后的I至3周之內(nèi)，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在血液中通?？蓹z測(cè)到丙型肝炎病毒，并且在感染之后的3至15周之內(nèi)，通?？梢詸z測(cè)到針對(duì)該病毒的抗體。自發(fā)病毒清除率是高度可變的，并且 10%-60% (Caruntu FA和Benea L, 2006J GastrointestinLiver Dis, 15(3) =249-256)的感染有HCV的個(gè)體在急性期期間從其體內(nèi)清除該病毒，這表現(xiàn)為肝臟酶的正?；?丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST))、以及血漿HCV-RNA清除(被稱(chēng)為自發(fā)病毒清除)。然而，持續(xù)感染是常見(jiàn)的，并且大多數(shù)患者發(fā)展為慢性丙型肝炎，即，持續(xù)6個(gè)月以上的感染(Villano等人，1999!fepat0l0gy (肝臟病學(xué))，29(3)908-914)。慢性丙型肝炎經(jīng)常是無(wú)癥狀的(沒(méi)有癥狀)并且大多被偶然發(fā)現(xiàn)。慢性丙型肝炎的自然病程從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體的變化相當(dāng)大。雖然在肝臟活組織檢查時(shí)幾乎所有HCV感染者具有炎癥跡象，肝臟瘢痕形成(纖維化)的進(jìn)展速度在個(gè)體之間變化顯著。已經(jīng)報(bào)告的影響HCV疾病進(jìn)展速度的因素包括年齡(與疾病進(jìn)展速度的增加相關(guān))、性別(男性比女性具有更快的疾病進(jìn)展)、飲酒(與疾病進(jìn)展速度的增加相關(guān))、HIV共感染(與疾病進(jìn)展速度的顯著增加相關(guān))、以及脂肪肝(肝細(xì)胞中的脂肪的存在與疾病進(jìn)展速度的增加相關(guān))。特異性地暗示肝臟疾病的癥狀典型地是缺乏的，直至已經(jīng)出現(xiàn)大量的肝臟瘢痕形成為止。然而，丙型肝炎是一種全身性疾病，并且患者可能經(jīng)歷寬范圍的臨床表現(xiàn)范圍從缺乏癥狀到晚期肝病產(chǎn)生之前的更多的癥狀性疾病。與慢性丙型肝炎相關(guān)的全身體征和癥狀包括疲勞、流感樣癥狀、關(guān)節(jié)痛、瘙癢、睡眠障礙、食欲改變、惡心和抑郁。 一旦慢性丙型肝炎進(jìn)展到肝硬化，可能出現(xiàn)通常由肝功能減弱或肝循環(huán)壓力增加(一種被稱(chēng)為門(mén)靜脈高壓的病癥)引起的體征和癥狀。肝硬化的可能體征和癥狀包括腹水(在腹部中的液體累積)、青腫和出血傾向、靜脈曲張(尤其是在胃和食管中的擴(kuò)大的靜脈)、黃疸以及被稱(chēng)為肝性腦病的認(rèn)知損害綜合征，肝性腦病是由于通常經(jīng)由健康肝臟清除的氨和其他物質(zhì)的積累所致。持續(xù)HCV感染可用藥物進(jìn)行治療，例如聚乙二醇干擾素和利巴制林。由于大多數(shù)感染者在該疾病的急性期期間沒(méi)有經(jīng)歷任何癥狀，因此很少在急性期期間做出“丙型肝炎”的診斷。確實(shí)經(jīng)歷了急性期癥狀的那些感染者很少病到尋求醫(yī)療救助的程度。慢性期丙型肝炎的診斷同樣是挑戰(zhàn)性的，這是由于直到產(chǎn)生晚期肝病時(shí)為止缺乏癥狀特異性，癥狀特異性可能在初次感染之后幾十年后才會(huì)出現(xiàn)。雖然目前HCV疫苗在開(kāi)發(fā)中，尚不存在針對(duì)HCV的疫苗。丙型肝炎的診斷始于用來(lái)檢測(cè)針對(duì)HCV的抗體的血清學(xué)血液試驗(yàn)。在暴露之后15個(gè)星期之內(nèi)，在大約80%的患者體內(nèi)能檢測(cè)到抗HCV抗體；在暴露之后5個(gè)月之內(nèi)，在>90%的患者體內(nèi)能檢測(cè)到抗HCV抗體；在暴露之后6個(gè)月之內(nèi)，在> 97%的患者體內(nèi)能檢測(cè)到HCV抗體?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)于暴露于丙型肝炎病毒感染而言，HCV抗體試驗(yàn)具有強(qiáng)的陽(yáng)性預(yù)期值，但是可能遺漏那些尚未產(chǎn)生抗體的患者(血清轉(zhuǎn)化)，或具有不足以進(jìn)行可靠檢測(cè)的抗體水平的患者。HCV感染的一種不常見(jiàn)的表現(xiàn)是 與II型冷球蛋白血癥相關(guān)的系統(tǒng)性血管炎(冷球蛋白血癥性血管炎)。冷球蛋白血癥是一種由血中的被稱(chēng)為冷球蛋白的異常蛋白引起的血液病癥，該蛋白在血液變冷時(shí)沉淀或凝集成塊，在復(fù)溫時(shí)溶解。這些蛋白質(zhì)可能沉積在小的和中等大小的血管中，可能導(dǎo)致流向關(guān)節(jié)、肌肉和器官血液受限。冷球蛋白血癥的病因不完全清楚，但被認(rèn)為是一種自身免疫疾病(由產(chǎn)生抗體的機(jī)體的免疫系統(tǒng)引起，這些抗體形成沉積在器官中并且引起炎癥的復(fù)合物)。大多數(shù)冷球蛋白血癥，先前因?yàn)椴∫虿磺宄幻麨樵l(fā)性混合型冷球蛋白血癥，目前已知是由HCV感染引起的。有三種類(lèi)型的由免疫球蛋白組成的冷球蛋白血癥(I型、II型和III型)。I型由單克隆免疫球蛋白組成。II型和III型被稱(chēng)為“混合性冷球蛋白”，因?yàn)樗鼈冇啥嗫寺∶庖咔虻鞍譍(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)組成。在II型中，該IgM是單克隆的，而在III型中，該IgM是多克隆的。在這兩種類(lèi)型中，該IgM通常有類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)活性。類(lèi)風(fēng)濕因子是一種在罹患類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(一種慢性自身免疫疾病，其特征為關(guān)節(jié)的炎癥)的人的血液中發(fā)現(xiàn)的抗體。最常見(jiàn)的與冷球蛋白血癥相關(guān)的癥狀和紊亂包括血管炎、腎的(腎臟)疾病、關(guān)節(jié)痛和關(guān)節(jié)炎、瘙癢、疲勞、疼痛、淋巴結(jié)腫大、周?chē)窠?jīng)病變、胃痛和/或出血障礙。治療取決于冷球蛋白的類(lèi)型、基礎(chǔ)疾病以及癥狀的嚴(yán)重性。與自身免疫疾病或原發(fā)性冷球蛋白血癥相關(guān)的更廣泛的血管炎可能對(duì)潑尼松、環(huán)磷酰胺或兩者有反應(yīng)。雖然與丙型肝炎相關(guān)的冷球蛋白血癥的最有效的治療尚未確定，短暫使用潑尼松繼之使用干擾素α 6個(gè)月已經(jīng)產(chǎn)生了臨床及肝功能試驗(yàn)改善，但是當(dāng)結(jié)束干擾素α治療時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)肝病和血管炎的復(fù)發(fā)。II型冷球蛋白血癥由多克隆免疫球蛋白G(IgG)和單克隆IgM類(lèi)風(fēng)濕因子(mRF)組成，它們結(jié)合到一種抗體的Fe部分上，從而形成促成該疾病進(jìn)展的免疫復(fù)合物。與II型冷球蛋白血癥相關(guān)的系統(tǒng)性血管炎(冷球蛋白血癥性血管炎)是一種在5%-10%的患者中轉(zhuǎn)化成B細(xì)胞惡性腫瘤的增殖性B細(xì)胞疾病。80%的mRF (Casato M等人，1997Blood (血液)，90 =3865-3873)是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈兪怯煞N系基因編碼的(Kunkel HG等人，19 73J ExpMed, 37 =331-42)，并且具有一個(gè)稱(chēng)之為“WA”的、限制于HCV感染患者的抗體結(jié)合位點(diǎn)交叉獨(dú)特型(Xid) (Agnello V 和 Barnes 幾，1986J Exp Med，164 :1809-14)。免疫球蛋白可變區(qū)含有被稱(chēng)作“獨(dú)特型”的、能被血清學(xué)技術(shù)識(shí)別的抗原決定簇。(Mackworth-Young等人，1987J Clin Invest, 79 =572-581)該WA交叉獨(dú)特型(Xid)——在人單克隆類(lèi)風(fēng)濕因子(mRF)中的主要交叉獨(dú)特型，是一種構(gòu)象抗原決定簇，包括位于在抗原結(jié)合位點(diǎn)中的H鏈和L 鏈(Kunkel HG 等人，1973J Exp Med, 137 :331 ；Agnello V 和 JL Barnes, 1986J Exp Med,164 1809)。帶有WA交叉獨(dú)特型(Xid)的單克隆類(lèi)風(fēng)濕因子是造成大多數(shù)在HCV感染患者中的冷球蛋白血癥性血管炎的原因。HCV濃集在II型冷球蛋白中(Agnello V等人，1992NEngl J Med, 327 =1490-1495)，并且由該病毒驅(qū)動(dòng)WAmRF的產(chǎn)生，正如抗病毒療法誘導(dǎo)冷球蛋白血癥和產(chǎn)生WA mRF的WA B細(xì)胞的衰退，連同病毒血癥的衰退。(Mazzaro C等人，1996Cancer (癌癥)，77 :2604-13 ；Casato M等人，2002Blood (血液)，99 :2259-61 ；Hermine等人，2002N Engl JMed，347 :89-94)在歐洲南部和美國(guó)，冷球蛋白血癥性血管炎的流行率估計(jì)為2% -5%并且分別小于 HCV 感染患者的 I % (Casato M 和 Agnello V, 2002Mixedcryoglobulinemiasyndrome secondary to hepatitis C virus infection (混合性冷球蛋白血癥次于丙型肝炎病毒感染)· In :N0RD Guide to Rare Disorders (罕見(jiàn)疾病NORD指南)，第3版。National Organization for Rare Disorders (美國(guó)罕見(jiàn)疾病組織)，編者；LippincottWilliams&Wilkins (利平科特威廉斯和威爾金斯)Philadelphia (費(fèi)城)，PA :5)。II型冷球蛋白血癥患者比總HCV感染群體有大得多的產(chǎn)生B細(xì)胞惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。百分之五至百分之十的具有冷球蛋白血癥性血管炎的患者產(chǎn)生B細(xì)胞惡性腫瘤(Invernizzi F等人，1983Acta haematol (血液病學(xué)學(xué)報(bào))，70 :73-82)，而僅百分之O. 2至百分之O. 8的總HCV感染群體(Ohsawa M 等人，1999J Cancer, 80 :237-239 ；Giordano TP 等人，2007JAMA，297 :2011-17)產(chǎn)生B細(xì)胞惡性腫瘤。而且，大約50%的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤似乎起源于WAB 細(xì)胞(Knight G 和 Agnello V, 2001Blood, 97 :3319-21 ；Knight GB. Gao L, Grangnani L,Elfahal M，De rosa FG, Gordon FD, Agnello V. Detectection of WA B cells in HCVinfection A potential prognostic marker forcryoglobulinemic vasculitits and Bcell malignancies (在HCV感染中的WA B細(xì)胞的檢測(cè)一種針對(duì)冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的潛在的預(yù)測(cè)標(biāo)志物).Arth Rheum(關(guān)節(jié)炎風(fēng)濕病學(xué))2010 ；62 :2152)。百分之八十的HCV感染患者不會(huì)產(chǎn)生有癥狀的疾病。因此，這些患者中僅有一小部分用抗病毒療法進(jìn)行了治療。產(chǎn)生冷球蛋白血癥性血管炎所需要的HCV感染的持續(xù)時(shí)間尚不明確，但似乎為至少10年(Monti G等人，1995QJM，88 :115-16)。因此，除非發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)標(biāo)志物，這些患者在變得有癥狀之前是不太可能被治療的。如下面詳細(xì)描述的，WAB細(xì)胞是II型冷球蛋白血癥和/或B細(xì)胞淋巴瘤的一種標(biāo)志物，并且允許用于早期診斷。除了預(yù)防冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率的增加之外，在癥狀發(fā)作之前對(duì)這些患者進(jìn)行早期檢測(cè)和治療可能是有益的，因?yàn)橐坏┭苎装l(fā)作患者會(huì)對(duì)治療產(chǎn)生更強(qiáng)的抵抗(Agnello V, 2000J Rheumatol (風(fēng)濕病學(xué)雜志)，27 :2065-7)。如下面詳細(xì)描述的，無(wú)癥狀HCV感染患者中的WA B細(xì)胞是通過(guò)B細(xì)胞克隆擴(kuò) 增(BCE)的分子分析進(jìn)行檢測(cè)的。B細(xì)胞增殖的早期檢測(cè)是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來(lái)檢測(cè)血液中組成正常B細(xì)胞庫(kù)的Ig基因重排而確定的。以這種方式，檢測(cè)了擴(kuò)增的B細(xì)胞克隆，例如，II型冷球蛋白血癥或B細(xì)胞惡性腫瘤中的過(guò)度表達(dá)的B細(xì)胞克隆。WA B細(xì)胞克隆擴(kuò)增(BCE)是利用已經(jīng)建立的編碼WA mRF的Ig基因的廣泛標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)BCE的序列分析而被鑒定的(Knight GB 等人，1993J Exp Med, 178 :1903-11)。實(shí)例I.在無(wú)癥狀HCV感染患者中的WA B細(xì)胞是產(chǎn)牛冷球蛋白血癥件血管炎和相關(guān)的B細(xì)胞惡件腫瘤的標(biāo)志物。簡(jiǎn)要地說(shuō)，對(duì)無(wú)癥狀HCV感染患者、HCV陰性患者以及具有WA mRF陰性和陽(yáng)性的冷球蛋白血癥性血管炎的對(duì)照患者進(jìn)行了檢查。分離BCE，進(jìn)行測(cè)序，并且鑒定WA BCE。如下面詳細(xì)描述的，在具有冷球蛋白血癥性血管炎的所有陽(yáng)性對(duì)照患者中檢測(cè)到BCE;然而，僅僅HCV感染患者具有WA BCE。33例對(duì)照HCV陰性患者都沒(méi)有BCE。在55位具有無(wú)癥狀HCV感染的患者中的4位(7.4%)體內(nèi)檢測(cè)到WA BCE ;14位具有III型冷球蛋白血癥以及37位具有血清RF的HCV感染患者分別是均沒(méi)有WABCE、5位有WABCE。I位具有WA BCE的患者患有無(wú)癥狀脾淋巴瘤(具有絨毛淋巴細(xì)胞)，這些淋巴細(xì)胞是WA B細(xì)胞。對(duì)無(wú)癥狀HCV感染者、HCV陰性患者以及具有對(duì)WA mRF陰性和陽(yáng)性的冷球蛋白血癥性血管炎的對(duì)照患者進(jìn)行了檢查。在經(jīng)過(guò)6個(gè)月的時(shí)期，從LaheyClinic(伯靈頓，MA)的Gastroenterology Clinic (胃腸病學(xué)診所)的已同意該研究的、具有和不具有HCV感染的連續(xù)的無(wú)癥狀患者獲得用于B細(xì)胞克隆分析的血標(biāo)本。HCV感染患者未曾接受任何抗病毒治療或化療。從Lahey Clinic的不同部門(mén)募集患有冷球蛋白血癥性血管炎或III型冷球蛋白血癥的患者。在一個(gè)兩年的隨訪研究中，從在Veterans Affairs Medical Center (退伍軍人服務(wù)部醫(yī)療中心)的!fepatitis Clinic (肝炎診所)(VAMC ;貝德福德，MA)獲得具有RF陽(yáng)性的、但是沒(méi)有冷球蛋白血癥的無(wú)癥狀HCV感染患者的血樣?；仡欋t(yī)療記錄以決定患者的人口學(xué)特征、冷球蛋白血癥性血管炎或其他肝外病疾病表現(xiàn)的存在、以及肝硬化的存在。為了診斷冷球蛋白血癥性血管炎，需要存在以下各項(xiàng)之一可觸知的紫癜、周?chē)窠?jīng)病變、腎臟病、或活組織檢查證實(shí)的中等大小血管的血管炎。腎臟病標(biāo)準(zhǔn)包括存在以下各項(xiàng)之一蛋白尿> 500mg/die、腎病綜合征、腎小球腎炎、急性或慢性腎衰竭、血清肌酸酐>1.5mg/dl。排除其他疾病(例如，糖尿病或系統(tǒng)性紅斑狼瘡)引起的腎臟病。周?chē)窠?jīng)病變由神經(jīng)病學(xué)家進(jìn)行診斷，具有或不具有經(jīng)過(guò)電生理參數(shù)的證實(shí)。排除繼發(fā)于其他疾病(如糖尿病或酒精中毒)的周?chē)窠?jīng)病變。如前所述，進(jìn)行了 HCV抗體、HCV RNA檢測(cè)和定量、以及冷球蛋白分離、定量和分型(De Rosa FG和Agnello V，2009J Rheumatol (風(fēng)濕病學(xué)雜志)，36 1953)。反復(fù)研究病因不明的具有HCV陰性冷球蛋白血癥性血管炎的患者的血清和冷球蛋白HCV抗體以及HCV RNA檢測(cè)，以證實(shí)沒(méi)有HCV感染。在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，正常范圍7-40IU/ml)和類(lèi)風(fēng)濕因子(RF，正常范圍< 20IU/ml)研究。通過(guò)常規(guī)的Ficoll密度梯度離心從肝素化血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。對(duì)來(lái)自127號(hào)患者的樣品進(jìn)行另外的分析。在臨床實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行血液學(xué)試驗(yàn)和淋巴細(xì)胞的免疫分型。⑶Ilc+的淋巴細(xì)胞(絨毛淋巴細(xì)胞的表型標(biāo)志物(LiuX等人，2003JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 23 :236_8)按如下方法進(jìn)行分離:用小鼠抗CDllc抗體(Beckman Coulter ;富勒頓，CA)在4°C孵育PBMC持續(xù)30分鐘，洗滌，用免疫磁珠(Dynabeads)山羊抗小鼠Ig磁珠(Invitrogen公司；卡爾斯巴德,CA)在4 孵育30分鐘。 通過(guò)磁鐵捕獲CDllc+的細(xì)胞，洗滌，在37°C孵育過(guò)夜以分離附著的磁珠。在孵育之后，用磁鐵將磁鐵將磁珠從細(xì)胞上移去。分離的細(xì)胞用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗WAmRF和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗CDllc進(jìn)行染色，并且通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢查。BCE的檢測(cè)和分析在B細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，免疫球蛋白重鏈基因座重排，使組成重鏈可變部分的第三互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R3)的VH、D和J區(qū)并置。在重排過(guò)程中，在Vh-D(N)和D-J(P)結(jié)點(diǎn)發(fā)生核苷酸添加和缺失。使用位于這個(gè)區(qū)域兩側(cè)的引物進(jìn)行RT-PCR，評(píng)定mRNA中的⑶R3區(qū)重鏈基因的多樣性。將得到的產(chǎn)物解析在測(cè)序膠上，其在正常庫(kù)中代表片段長(zhǎng)度的正常分布(大約CDR3的平均長(zhǎng)度以3個(gè)核苷酸、或I個(gè)密碼子不同)。在特定B細(xì)胞克隆的單克隆擴(kuò)增的情況下，正如出現(xiàn)在II型冷球蛋白血癥中一樣，在測(cè)序膠上的一個(gè)條帶可能過(guò)度表達(dá)。從測(cè)序膠上切下觀察到的克隆擴(kuò)增的條帶并且經(jīng)受直接循環(huán)測(cè)序。序列與GenBank中已知的Ig序列進(jìn)行比較。雖然可以使用Vh3(IGHV3-7)基因，WA mRF主要是IGKV3-20 (Kv325)輕鏈基因和包括16取1-69的VhI基因以及相關(guān)的種系基因的產(chǎn)物(Knight GB等人，1993J Exp Med, 178 1903-11) d區(qū)具有兩種類(lèi)型的序列特征。共有序列I (SEQ ID NO : I)，以谷氨酸開(kāi)始、以脯氨酸結(jié)尾的、與IGHV1-69基因和通常地Jh4相關(guān)的9_11個(gè)氨基酸的區(qū)域，似乎來(lái)自IGHD4-17基因 l(Knight GB 等人，1993J Exp Med, 178 :1903-11)。共有序列 2(AEQ ID NO 2)最初發(fā)現(xiàn)于含有WA RF、M7 (Pinheiro G等人，1993年基因庫(kù)登錄號(hào)U03400和U03401)的VH3-7中，并且后來(lái)發(fā)現(xiàn)與結(jié)合有Jh3和IGKV3-15 (kv328)的其他VH3_7RF相關(guān)(Borretzen M等人，1995J Immunol (免疫學(xué)雜志)，155 :3630-7)。用TRIzoIq(Life Technologies)或 Rneasy RNA 抽提試劑盒(QIAGEN)從外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離總細(xì)胞RNA。如前所述進(jìn)行RT-PCR(KnightGB等人，1993J Exp Med,178:1903-1911)。使用來(lái)自在FW3中的保守區(qū)和μ恒定區(qū)的引物進(jìn)行初次指紋篩查以檢查CDR3多樣性。用恒定區(qū)引物，使用來(lái)自VH前導(dǎo)序列和FWl區(qū)域的上游寡核苷酸獲得VH-D-JH PCR產(chǎn)物。使用來(lái)自VK前導(dǎo)序列的上游寡核苷酸和來(lái)自K恒定區(qū)的下游引物擴(kuò)增VK-JK片段。在各自PCR中的一個(gè)引物用生物素標(biāo)記，用于分離擴(kuò)增子，或者用6-FAM標(biāo)記，以便使用ABI377自動(dòng)DNA測(cè)序儀和GeneScan 軟件快速篩選寡克隆帶。在6%測(cè)序膠上電泳分離PCR產(chǎn)物，通過(guò)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移將其轉(zhuǎn)移到Tropilon-plus膜(Tropix)上，通過(guò)化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。從測(cè)序膠上切除并純化在化學(xué)發(fā)光圖上所觀察到的克隆擴(kuò)增的條帶。使用具有Big Dye終止子的ABI 377自動(dòng)DNA測(cè)序儀或生物素化學(xué)發(fā)光儀(Phototope-star，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)所)使單克隆擴(kuò)增的Ig基因經(jīng)受直接循環(huán)測(cè)序。使用在NCBI的BLAST服務(wù)器，將獲得的Ig基因的推導(dǎo)氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Ig序列的比較進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分析總結(jié)各組的人口學(xué)和臨床特征并且表示為頻率(性別)和平均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差(連續(xù)變量)。將具有BCE和WA BCE的患者的數(shù)目列表，使用Fisher' s精確檢驗(yàn)，將各擴(kuò)增類(lèi)型的流行率在感興趣的關(guān)鍵組之間進(jìn)行比較。以< O. 05的P值用作閾值，推斷組之間的顯著不同的流行率。人口學(xué)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)總結(jié)在以下表I中。采用來(lái)自十位具有冷球蛋白血癥性血管 炎的患者的陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本來(lái)檢驗(yàn)BCE方法。陽(yáng)性和陰性對(duì)照組分別由6個(gè)HCV感染患者(HCV+，II型)和4個(gè)HCV陰性患者(HCV-，II型)組成(表2)。正如對(duì)于具有冷球蛋白血癥性血管炎的患者所預(yù)期的，在兩個(gè)組中的所有患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 BCE。通過(guò)對(duì)檢測(cè)到的BCE的序列分析，鑒定了 WABCE(圖1，表3)。6位HCV+、II型組中的患者中的4位具有WA BCE ;這一發(fā)現(xiàn)與先前報(bào)道的具有冷球蛋白血癥性血管炎的HCV感染患者中的WA mRF的流行率一致(Casato M 等人，1997Blood，90 :3865-3873)。HCV_、II 型組均無(wú) WA BCE，這證實(shí)WA mRF限于HCV感染患者。表I關(guān)于患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)
患者性別女/男年齡$ 谷丙轉(zhuǎn)氨酶"丙型肝炎病毒'
HCV+，II 型 1/554.8(10.2) 47.5 (22.9) 17.8 (38.4)x IO6
HCV-, II 型 3/164.0(14.0) 17.7 (2.0) NA
HCV+16/3943.0 (7.0) 98,0 (83,0)9.8 (16.0) x IO6
HCV-16/1742.3 (11.0) 36.0 (32.5)NA
HCV+，RF 0/3751.8 (6.6) 127.92.8 (4.6；) x Hf
(126.27)
HCV+, ΠΙ 型 5/949.6 (8.0) 114.8 (87.9)3.3 (4.3) χ 10"
平均值(I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差)表2在HCV感染患者和對(duì)照中的BCE的檢測(cè)患者數(shù)目BCEWABCE
HCV+, U 型 064
HCV-, II 型 44O
HCV+ 5594
HCV- 33OO
HCV+, Rr V75
HCV+, III 型 14IO
表3通過(guò)核酸測(cè)序分析鑒定WABCE
克隆DKVH4HVKJK
共有序列 1EG.......NP^eqid wo. I；
HCV 7EGGDSSDYYYiSEQiDiP 3)(GHV1-694IGKV3-201
27EQDSDSSAYY (seqipko； 4jIGHV1-894IGKV3-201
45EGGLTVTNP(seqid no 5j1GHV1-694IGKV3-201
HCV+, HS 1EGRANDYSNPCseqbi^o 6)IGHV1-69 4IGKV3-20 I
57EGRLTVTNP (sbqipko 7)fGHV1-694IGKV3-201
118EGRLTVTNP (seqidno.s)1GHV1-694IGKV3-202
HCVhRR 127EGRGYSGSDPtsEQXE NO s----
137EFSSDSSGYY sseq id κο ο)---- 146EGRGYSGSDP (seoidmo ii)*- — —< -·
148EFSSDSSGYY isEo it 丨 no: 12)..----
共有序列 2GDYYD-S-G-YIDA(seqjx<nc2)
HCV+ 80GDRYYYGYYG fSHQiDNo.u)IGHV1-694IGKV3-202
HCV+, Ι 18GHDTSDYYSPY (seq HeIGHV1-69 4IGKV3-20 1
HCV+. RF+ 141DYGEQREGYYY (seqibko---■·
其他(養(yǎng)S義)
HQV+ 4AGYDFWSGYYSLDYWY(s0 ro>Kiq|GHV1-89 4(GKV3-20 1
84AGEMATN RPQA (s^q id ho 171IGHV1-S9IGKV3-202
88GWGGAGTTTP iseq id lie. w,')IGHV1-694IGKV3-202
HCV+, 11 38DGGTGS (sbq IGHV1-694IGKV3-151
HCV-, Π 壁 11GSSDCSMSQLP fssoxr KoIGHV1-694IGKV3-202
113LHYGSGSYYSisepidno: 21)IGHV1-694IGKV3-201
HCVt HI# 97PXADSXDVAWT m‘::腳ο. 22}1GHV1-6931GKV3-201
HOV+. RF+ 133GGYCSGGSYYis^iDNOA)—一--
138GKTRGNFDV eseqjx>no 24)--—~-為了確定WA BCE是否能在無(wú)癥狀HCV感染患者中檢測(cè)到，對(duì)一組55位無(wú)癥狀HCV感染患者(HCV+)和一組33位HCV陰性患者(HCV-)進(jìn)行了檢查。在HCV+組中的9位患者體內(nèi)(14% )檢測(cè)到BCE。在這個(gè)組中的4位患者(7.4% )具有WA BCE。這些患者的血清中既沒(méi)檢測(cè)到冷球蛋白，也沒(méi)檢測(cè)到RF。對(duì)醫(yī)療記錄的評(píng)論證實(shí)這些患者均不具有冷球蛋白血癥性血管炎或其他的肝外癥狀。在具有非WA BCE的5位患者中一位患者既不具有冷球蛋白也不具有RF ;—位患者具有RF陰性的、與冷球蛋白血癥性血管炎不相關(guān)的II型冷球蛋白血癥(De Rosa FG 和 Agnello V，2009J Rheumatol (風(fēng)濕病學(xué)雜志)，36 :1953);三位患者具有弱陽(yáng)性血清RF (21. 7，23. 7，40. 9IU/ml)。在HCV陰性組中的患者均不具有BCE。具有WA BCE的患者均無(wú)癥狀，但是在一位患者中(127號(hào)患者，表3)，在外周血中存在絨毛淋巴細(xì)胞，并且B淋巴細(xì)胞表型與脾淋巴瘤一致，雖然該患者沒(méi)有淋巴瘤的體征或癥狀。免疫分型顯示為 IgM+、K+、IgD-, CD19+、CD5-、CD10-、CD23-、CDllc+、WA+ 的一個(gè)單克隆B細(xì)胞群。絨毛淋巴細(xì)胞包括5%的外周淋巴細(xì)胞。由于絨毛淋巴細(xì)胞與⑶Ilc相關(guān)，從患者(127號(hào)患者)的外周血淋巴細(xì)胞中分離了⑶Ilc淋巴細(xì)胞。流式細(xì)胞和熒光顯 微鏡研究證明了一個(gè)單克隆的WA+、⑶llc+B細(xì)胞群，這些B細(xì)胞似乎是絨毛淋巴細(xì)胞(圖2)。這一發(fā)現(xiàn)提示一些絨毛淋巴細(xì)胞可能為WA B細(xì)胞。對(duì)27個(gè)BCE中的22個(gè)進(jìn)行了核酸序列分析(表3)。五個(gè)BCE由于序列污染，不能進(jìn)行分析。22個(gè)BCE中的十三個(gè)具有WA序列。十個(gè)具有共有序列ID區(qū)，并且3個(gè)具有共有序列2。后者中的2個(gè)與IGHV1-69而不是IGHV3-7進(jìn)行重組。一個(gè)BCE具有一個(gè)IGKV3-15輕鏈序列；其余的具有在WA mRF中發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的輕鏈序列，IGKV3-20。存在著除了 WA之外的7個(gè)序列；除了 D區(qū)基因之外，所有7個(gè)序列具有與WA相似的Ig基因。與已知的RF或與抗HCV E2包膜蛋白E2(在HCV感染中鑒定的唯一的另一種單克隆蛋白)沒(méi)有同源性(Quinn ER等人,2001Blood, 98 :3745-49)。4個(gè)展示出與GenBank中任何已知的Ig序列沒(méi)有顯著的D區(qū)同源性，一個(gè)顯示出與記憶B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Ig具有微弱的同源性(Stein K等人，1999Blood，94 :2800-8),并且兩個(gè)顯示出與胎Ig具有顯著的同源性(Zemlin M等人，2001Blood，97 :1511-13)。假定隨著HCV感染持續(xù)時(shí)間的增加，mRF從多克隆RF到III型冷球蛋白(多克隆IgG和多克隆IgM RF)到II型冷球蛋白轉(zhuǎn)換(Lunel F等人，1994Gastroenterology (胃腸病學(xué))，106 :1291-300 ；Schifferli JA等人，1995Adv NephrolNecker Hosp, 24 :107-29)而來(lái)。相比于既沒(méi)有RF、也沒(méi)有冷球蛋白血癥的患者，這種“轉(zhuǎn)換”假設(shè)預(yù)測(cè)在具有RF的患者中以及在具有III型冷球蛋白血癥患者中的WABCE流行率增加。為了確定在具有RF的HCV感染患者中的WA BCE的流行率是否增加，對(duì)在血中具有RF、但是沒(méi)有冷球蛋白血癥的一組37位無(wú)癥狀HCV感染患者(HCV+，RF)進(jìn)行了檢查(表2)。這個(gè)組中的7位患者(18.9% )具有BCE，并且5位(13.5% )具有WA BCE。相比于在HCV+組中，在HCV+、RF組中的BCE和WA BCE的流行率沒(méi)有顯著增加(對(duì)于BCE和WA B,分別為 P = O. 78 和 ρ = O. 48)。為了確定BCE和WA BCE的流行率的增加是否存在于在具有III型冷球蛋白血癥的HCV感染患者中(HCV+，III型)，對(duì)具有III型冷球蛋白的14位患者進(jìn)行了檢查(表2)。僅一位具有BCE ;—種非WABCE。相比于HCV+組，在HCV+、III型組中的BCE和WA BCE的流行率沒(méi)有顯著增加(對(duì)于BCE和WA B細(xì)胞，分別為ρ = O. 67和ρ = O. 58)。無(wú)癥狀HCV感染患者中WA BCE的檢測(cè)顯示W(wǎng)A B細(xì)胞是冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)展的一種標(biāo)記物。如上所述，為了支持這個(gè)觀點(diǎn)，具有與絨毛淋巴細(xì)胞脾淋巴瘤一致的單克隆B細(xì)胞群的127患者檢測(cè)到WA B細(xì)胞標(biāo)記物。假定這位患者進(jìn)展到臨床脾淋巴瘤，偶然找到這樣一位患者的機(jī)率大約為I千萬(wàn)分之一，如果以下流行率是獨(dú)立的話在美國(guó)的HCV感染(大約1% )、HCV感染者中的WA BCE的流行率(7. 5% )、非霍奇金淋巴瘤(NHL)的流行率(O. 1% )、以及脾淋巴瘤的流行率(小于NHL的15% )。由于在血中的絨毛淋巴細(xì)胞是WA B細(xì)胞，這位患者也是信息性的。假定具有絨毛淋巴細(xì)胞的脾淋巴瘤與II型冷球蛋白血癥和HCV感染是相關(guān)的(Saadoun D等人，2005Blood，105 :74-6)。以上呈現(xiàn)的結(jié)果表明在HCV感染患者體內(nèi)的一些脾淋巴瘤中的絨毛淋巴細(xì)胞是WAB細(xì)胞。WA BCE解釋為在HCV感染患者中大約一半檢測(cè)到BCE。沒(méi)有鑒定非WA BCE序列。它們與RF無(wú)關(guān)，因?yàn)樗鼈兣c任何已知的RF沒(méi)有顯著的D區(qū)同源性。同樣，它們與HCV感染者中鑒定的除了 WA mRF之外的唯一的單克隆蛋白(抗HCV包膜蛋白E2)無(wú)關(guān)(Quinn ER等人，2001Blood，98 :3745-49)。雖然沒(méi)有D區(qū)同源性，在非WA BCE中的所有其他Ig基因與WA基因相似。編碼WA mRF的Ig基因用于先天宿主防御免疫球蛋白應(yīng)答。這些基因還發(fā)現(xiàn)于胎和B細(xì)胞記憶Ig庫(kù)中(Klein U等人，1997Blood，89 :1288-98)，這可以解釋與在三個(gè)非WA BCE中發(fā)現(xiàn)的這些免疫球蛋白的同源性。在HCV感染者中的BCE的最可能的病因?qū)W的解釋是，在這次感染中產(chǎn)生了多種多樣的天生免疫球蛋白，這些免疫球蛋白被刺激并且隨著延長(zhǎng)的感染持續(xù)時(shí)間而被擴(kuò)增，這是該疾病的特征。在一個(gè)先前的研究中，RF存在于所有具有BCE的HCV感染患者的血清中，這使得 作者推斷出產(chǎn)生RF的克隆(Franzin F等人，1995Br J Haematol，90 :548-52)。在這個(gè)研究中，在沒(méi)有RF的患者的血清中BCE的檢測(cè)以及在具有RF的患者中與RF沒(méi)有顯著同源性的BCE的檢測(cè)證明該推斷不成立。另外，在相同的研究中，在具有III型冷球蛋白的HCV感染患者中沒(méi)有被檢測(cè)到BCE。后面的研究結(jié)果，與這個(gè)研究的結(jié)果一起考慮，提供了反對(duì)人們廣泛認(rèn)為的II型冷球蛋白起源于III型冷球蛋白的證據(jù)。當(dāng)前，大約2%的HCV感染患者用抗病毒療法進(jìn)行了治療(Volk ML等人，2009H印atol，50 :1750-55)。一位將產(chǎn)生冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤的患者接受抗病毒療法的機(jī)率分別小于五百分之一和五千分之一。自動(dòng)高通量測(cè)序儀使得在此描述的方法的臨床應(yīng)用變得可行。例如，HCV的常規(guī)基因分型是通過(guò)有成本效益的、高通量的序列分析來(lái)進(jìn)行的。而且，使用一種抗WA Xid抗體檢測(cè)WA Xid的方法(如上對(duì)于患者127所描述的)可以提供一種更簡(jiǎn)單的、臨床適用的方法學(xué)。在這個(gè)研究中，在HCV感染患者中檢測(cè)到的BCE的56%是WA BCE，這可能是WA B細(xì)胞惡性腫瘤在HCV感染患者中的流行率的一個(gè)合理估計(jì)。當(dāng)前，僅僅在B細(xì)胞惡性腫瘤中鑒定了 WA Xid ;25%的與HCV感染相關(guān)的NHL是WA B細(xì)胞。可能的是，大多數(shù)的(如果不是所有的)Wallenstrom巨球蛋白血癥以及與HCV感染相關(guān)的脾淋巴瘤來(lái)源于WA B細(xì)胞(Agnello V等人，1992NEngl J Med, 327 :1490-5 ；Casato M等人，2002Blood，99 :2259-61)。當(dāng)進(jìn)行更大人群的結(jié)果研究時(shí)，上述Xid的分析方法可以鑒定進(jìn)展到B細(xì)胞惡性腫瘤的其他 BCE。在此描述的這些方法允許具有BCE的無(wú)癥狀HCV患者的鑒定和治療。在此描述的方法還允許WA B細(xì)胞和其他B細(xì)胞增殖的早期檢測(cè)，這在預(yù)防和治療在HCV感染患者中的冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤中是有用的。在這些患者體內(nèi)的B細(xì)胞惡性腫瘤中的Xid的鑒定也提供了一種可替代的治療方式。例如，單克隆mAb抗Xid抗體用作一種治療劑，例如抗WA mAb用來(lái)治療對(duì)抗病毒療法無(wú)反應(yīng)的WA B細(xì)胞惡性腫瘤。其他實(shí)施方案雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其詳盡說(shuō)明進(jìn)行了描述，前述的說(shuō)明旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由所附的權(quán)利要求書(shū)的范圍限定的。其他方面、優(yōu)點(diǎn)和修改是在以下權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。在此參考的專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)建立了所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可獲得的知識(shí)。所有出版的外國(guó)專(zhuān)利和在此引用的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)卮送ㄟ^(guò)引用進(jìn)行結(jié)合。在此以登錄號(hào)引用的Genbank和NCBI提交特此通過(guò)引用進(jìn)行結(jié)合。所有在此引用的其他出版的參考文獻(xiàn)、文獻(xiàn)、手稿和科學(xué)文獻(xiàn)特此通過(guò)引用進(jìn)行結(jié)合。雖然參考其優(yōu)選的實(shí)施方案已經(jīng)具體地展示和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員 將會(huì)理解的是，在不脫離由所附權(quán)利要求書(shū)涵蓋的本發(fā)明的范圍的情況下，可以在其中做出不同的在形式和細(xì)節(jié)上的改變。
權(quán)利要求
1.一種鑒定具有產(chǎn)生與丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，該方法包括 提供一種來(lái)自感染有HCV的受試者的樣品； 檢測(cè)在所述樣品中的WA交叉獨(dú)特型(Xid)+B細(xì)胞； 從而鑒定具有產(chǎn)生與HCV相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的受試者。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述WAXid+B細(xì)胞是通過(guò)鑒定來(lái)自一個(gè)克隆擴(kuò)增的B細(xì)胞群的一種免疫球蛋白核酸序列而檢測(cè)的，其中該免疫球蛋白核酸序列與WA Xid相關(guān)。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述WAXid+B細(xì)胞是用一種分離的抗WA Xid抗體檢測(cè)的。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述受試者是早期被鑒定的。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述早期鑒定的受試者是在初次HCV感染之后、但在表現(xiàn)出與冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)的癥狀之前被鑒定的。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述樣品是一種包括全血的生物流體。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其中與WAXid相關(guān)的所述免疫球蛋白核酸序列包含IgHV1-69或IgHV V3-7或有關(guān)的種系基因，VK325或VK328、JH4或JH3、Jkl、以及一種D區(qū)共有序列，該共有序列包括SEQ ID NO 1(共有序列I)或SEQ ID NO 2(共有序列2)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述SEQID NO :1(共有序列I)包括氨基酸序列EG-------NP。
9.如權(quán)利要求7所述方法，其中所述SEQID N0:2(共有序列2)包括氨基酸序列⑶YYD-S-G-YIDA。
10.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述分離的抗WAXid抗體附著到一種標(biāo)記上，該標(biāo)記選自下組，該組由異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記組成。
11.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述WAXid+B細(xì)胞是通過(guò)流式細(xì)胞分析進(jìn)行檢測(cè)的。
12.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括用一種抗CDlIc抗體來(lái)檢測(cè)在所述樣品中的一種⑶IIC+細(xì)胞。
13.一種用于鑒定具有產(chǎn)生與丙型肝炎病毒(HCV)感染相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，該方法包括 提供一種來(lái)自HCV感染患者的克隆擴(kuò)增的B細(xì)胞的核酸樣品； 檢測(cè)在所述樣品中的序列，包括與WA Xid相關(guān)的免疫球蛋白核酸序列，其中所述序列包含IgH V1-69或IgHV V3-7或有關(guān)的種系基因，VK325或VK328、JH4或JH3、Jkl、以及一個(gè)D區(qū)共有序列，該序列包括SEQ ID NO : I (共有序列I)或SEQ ID NO:2(共有序列2);并且 如果所述WA Xid序列和所述SEQ ID NO 1(共有序列I)或SEQ ID NO 2 (共有序列2)存在于所述HCV感染患者來(lái)源的核酸中，則預(yù)測(cè)與HCV感染相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤的產(chǎn)生。
14.一種治療與受試者體內(nèi)的HCV相關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，該方法包括 提供一種來(lái)自感染有丙型肝炎病毒(HCV)的受試者的樣品； 如果在所述樣品中檢測(cè)到WA Xid+B細(xì)胞,則向所述受試者施用一種抗WA抗體； 從而治療在所述受試者體內(nèi)的所述冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者缺乏冷球蛋白血癥性血管炎或B細(xì)胞惡性腫瘤的臨床癥狀。
16.一種鑒定具有產(chǎn)生與丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，該方法包括 提供一種來(lái)自感染有HCV的受試者的樣品； 檢測(cè)在所述樣品中的非WA交叉獨(dú)特型陽(yáng)性(非WA Xid+) B細(xì)胞； 從而鑒定具有產(chǎn)生與丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的受試者。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述非WAXid+B細(xì)胞是通過(guò)鑒定來(lái)自一個(gè)克隆擴(kuò)增的B細(xì)胞群的免疫球蛋白核酸序列而檢測(cè)的，其中所述免疫球蛋白核酸序列與特異性非WA Xid相關(guān)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述特異性非WAXid+B細(xì)胞是用一種分離的抗非WA Xid抗體檢測(cè)的。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述診斷是一種早期診斷。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述早期診斷是在初次HCV感染之后、但在表現(xiàn)出與B細(xì)胞惡性腫瘤相關(guān)的體征或癥狀之前。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述樣品是一種包括全血的生物流體。
22.—種試劑盒，該試劑盒包含一套第一引物和第二引物，以及用于基于與WA Xid相關(guān)的免疫球蛋白核酸序列的檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)與HCV感染相關(guān)的冷球蛋白血癥血管炎和B細(xì)胞惡性腫瘤的說(shuō)明書(shū)，這些免疫球蛋白核酸序列包括IgHVl-69或VIgH V3-7或有關(guān)的種系基因，VK325 或 VK328、JH4 或 JH3、Jkl、以及 SEQ ID NO : I (共有序列 I)或 SEQ ID NO:2(共有序列2)，其中所述套的第一和第二引物包括位于互補(bǔ)決定區(qū)3 (CDR3)序列的兩側(cè)的一種第一引物和一種第二引物、位于VH-D-JH序列的兩側(cè)的一種第一引物和一種第二引物、以及位于Ig編碼轉(zhuǎn)錄本中的VK-JK序列的兩側(cè)的一種第一引物和一種第二引物。
全文摘要
本發(fā)提供了通過(guò)采用檢測(cè)一種特異抗體上的交叉獨(dú)特型表位(cross-idiotypic epitope)來(lái)檢測(cè)在產(chǎn)生疾病的臨床癥狀之前產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞的用于與一種特異性抗體相關(guān)的疾病的早期診斷和治療的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61P31/12GK102859360SQ201180020700
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者文森特·阿格內(nèi)洛 申請(qǐng)人:文森特·阿格內(nèi)洛