專利名稱：穩(wěn)定的水性mia/cd-rap制劑的制作方法
穩(wěn)定的水性MIA/CD-RAP制劑本發(fā)明涉及穩(wěn)定的水性制劑，所述制劑包含至少5 mg/mL⑶-RAP和帶電荷的氨基酸，所述氨基酸優(yōu)選在約6至8的pH下具有凈電荷。所述制劑的成分優(yōu)選經(jīng)過(guò)重復(fù)凍融循環(huán)仍穩(wěn)定。在優(yōu)選方面，所述制劑用于治療，優(yōu)選用于治療炎性障礙，優(yōu)選骨關(guān)節(jié)炎。此外，提供包含本發(fā)明的制劑的試劑盒。蛋白質(zhì)用于藥物、獸醫(yī)產(chǎn)品、化妝品和其它消費(fèi)產(chǎn)品、食品 、飼料、診斷用品、工業(yè)化學(xué)和去污領(lǐng)域的多種應(yīng)用中。有時(shí)，這類用途受到蛋白質(zhì)本身固有的或者其使用環(huán)境或介質(zhì)造成的限制所限。這類限制可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差、性能變化或成本高。由于生物技術(shù)的出現(xiàn)，可以生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)用于治療用途。蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)后，通常在其使用前予以儲(chǔ)存。由于蛋白質(zhì)通常比“傳統(tǒng)”藥物大且復(fù)雜這一事實(shí)，適于儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)藥物的配制和處理可能特別具有挑戰(zhàn)性。關(guān)于蛋白質(zhì)藥物制劑和方法設(shè)計(jì)，參見Carpenter等人(1997), Pharm. Res. 14: 969-975 ；ffang (2000), Int. J. Pharmaceutics 203: I -60;以及 Tang 和 Pikal (2004)，Pharm. Res. 21: 191-200。在設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)的制劑和方法時(shí)，可考慮若干因素。主要考慮因素是蛋白質(zhì)在制造、運(yùn)輸和操作步驟(可包括組合物的制備、冷凍、干燥、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、重構(gòu)、凍/融循環(huán)、和最終用戶的重構(gòu)后儲(chǔ)存)中任何或全部步驟中的穩(wěn)定性。其它可能的考慮因素包括制造、操作和分配的容易程度和經(jīng)濟(jì)性；對(duì)患者給藥的成品的組成；以及最終用戶使用的容易程度，包括凍干制劑重構(gòu)后的溶解度。液體制劑可滿足某些目標(biāo)。液體制劑的可能優(yōu)點(diǎn)包括制造容易且經(jīng)濟(jì)以及最終用戶便利。通常，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存時(shí)，多肽在溶液中是不穩(wěn)定的(Manning等人(1989)，Pham.Res. 6: 903-918)。因此，已開發(fā)了另外的處理步驟來(lái)使得保質(zhì)期更長(zhǎng)，所述步驟包括干燥，例如凍干。凍干制劑還可以提供某些優(yōu)點(diǎn)。凍干的可能有益之處包括蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性提高以及運(yùn)輸和儲(chǔ)存容易且經(jīng)濟(jì)。然而，對(duì)于最終用戶來(lái)說(shuō)，凍干的藥物組合物可能不太便利。除了選擇組合物的基本形式(例如，凍干的、液體、冷凍等)之外，蛋白質(zhì)制劑的優(yōu)化通常涉及改變所述制劑的組分及其各濃度，以使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性最大化。多種因素可影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，包括離子強(qiáng)度、pH、溫度、凍/融循環(huán)、剪切力、冷凍、干燥、攪拌、和重構(gòu)。物理降解(例如，變性、聚集、或沉淀)或化學(xué)降解(例如，脫酰胺、氧化、或水解)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。制劑組分和濃度的優(yōu)化主要基于經(jīng)驗(yàn)研究和/或推理方法，以克服不穩(wěn)定原因。有時(shí)，由于聚集和/或降解，在含有多肽的藥物組合物的長(zhǎng)期儲(chǔ)存中，活性多肽可能會(huì)損失。因此，通過(guò)改變制劑內(nèi)元素的濃度或通過(guò)加入賦形劑來(lái)修飾制劑，解決改善多肽穩(wěn)定性的通常問(wèn)題(美國(guó)專利No. 5，580，856和No. 6，171，586以及美國(guó)專利申請(qǐng)No. US2003/0202972,No. US 2003/0180287)。US 5，580，856為可加入試劑來(lái)使干燥蛋白質(zhì)在再水合期間或之后穩(wěn)定的原型應(yīng)用，所述試劑例如天然聚合物、表面活性劑、硫酸多糖、蛋白質(zhì)和緩沖劑。然而，除了多個(gè)選擇之外，美國(guó)專利5，580，856并未教導(dǎo)應(yīng)對(duì)哪個(gè)蛋白質(zhì)加入哪個(gè)再水合穩(wěn)定劑。因此，盡管技術(shù)人員已經(jīng)了解該多個(gè)選擇，但是其仍需在US 5，580，856描述的多個(gè)選擇中為其蛋白質(zhì)找到最佳條件。美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0202972描述了抗Her2抗體的穩(wěn)定的凍干制劑，其中所述穩(wěn)定劑為糖、海藻糖、或緩沖劑。但是，盡管這些穩(wěn)定劑可能可用于抗體，但是不能推導(dǎo)出它們可用于其它蛋白質(zhì)。美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0180287在以下方面類似于US 2003/0202972 :它也描述了免疫球蛋白樣蛋白質(zhì)即含F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定溶液。所述穩(wěn)定劑可以為磷酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、馬來(lái)酸、乙酸銨、tris-緩沖劑、乙酸鹽、二乙醇胺、組氨酸、賴氨酸或半胱氨酸。在這些可以由技術(shù)人員選擇的化學(xué)上不同的穩(wěn)定劑中，證明賴氨酸是適合的。然而，與US 2003/0202972相同，特定穩(wěn)定劑僅適于特定蛋白質(zhì)，該 文中為含F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，而本身不能推導(dǎo)到另一蛋白質(zhì)。因此，添加劑的使用無(wú)法從特定蛋白質(zhì)推到到另一不相關(guān)蛋白質(zhì)。事實(shí)上，添加劑的使用——盡管改善儲(chǔ)存——仍然導(dǎo)致多肽無(wú)活性。此外，在凍干的情況下，再水合步驟可引入導(dǎo)致例如由聚集或變形所致的多肽失活的條件(Hora等人(1992)，Pharm. Res. , 9:33-36 ;Liu等人(1991)，Biotechnol. Bioeng. , 37: 177-184)。事實(shí)上，由于其可能導(dǎo)致免疫原性，多肽的聚集是不期望的(Cleland等人(1993)，Crit. Rev. Therapeutic DrugCarrier Systems, 10: 307-377 ;和 Robbins 等人(1987)，Diabetes, 36: 838-845)。生物活性在藥物產(chǎn)品開發(fā)和制造期間的保持取決于大分子的固有穩(wěn)定性以及采用的穩(wěn)定化技術(shù)。存在多種蛋白質(zhì)穩(wěn)定化技術(shù)，包括向蛋白質(zhì)的水性溶液或懸浮液中加入化學(xué)“穩(wěn)定劑”。例如，美國(guó)專利4，297，344公開了通過(guò)加入選擇的氨基酸使凝血因子II和VIII、抗凝血酶111和血纖溶酶原抗熱而穩(wěn)定。美國(guó)專利4，783，441公開了用于通過(guò)加入表面活性物質(zhì)來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法。美國(guó)專利4，812，557公開了用于使用人血清白蛋白來(lái)穩(wěn)定白介素-2的方法。其中將制備物與冷凍保護(hù)劑混合然后儲(chǔ)存于極低溫度下的凍/融方法為使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的另一選擇。然而，不是所有的蛋白質(zhì)都會(huì)在凍/融循環(huán)中存活。與冷凍保護(hù)劑添加劑(通常為甘油)一起冷儲(chǔ)存是又一選擇。還可以進(jìn)行描述于美國(guó)專利5，098，893中的以玻璃形式儲(chǔ)存。在這種情況下，將蛋白質(zhì)溶解于為無(wú)定形或玻璃狀態(tài)的水溶性或水可溶脹物質(zhì)中。用于使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的最廣泛使用的方法冷凍-干燥或凍干。無(wú)論是否能夠在水溶液中獲得足夠的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，凍干為最可行的備選方案。凍干的一個(gè)缺點(diǎn)為其需要復(fù)雜的處理、耗時(shí)且昂貴。此外，如果沒有仔細(xì)進(jìn)行凍干，則大多數(shù)制備物會(huì)至少部分地被該技術(shù)的冷凍和脫水步驟變性。結(jié)果是一部分蛋白質(zhì)分子往往不可逆地聚集，導(dǎo)致制劑無(wú)法用于腸胃外給藥。通常而言，蛋白質(zhì)的降解已充分描述于文獻(xiàn)中，但是儲(chǔ)存和溶解度、特別是⑶-RAP/MIA (進(jìn)一步稱為⑶-RAP)的儲(chǔ)存和溶解度尚未得以描述。⑶-RAP為由惡性黑素瘤細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌的可溶小蛋白。近來(lái)，有證據(jù)將⑶-RAP鑒定為采用SH3結(jié)構(gòu)域樣折疊的胞外蛋白小家族的原型。據(jù)認(rèn)為，CD-RAP與胞外基質(zhì)蛋白中的特定表位之間的相互作用調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的附著(Moser等人(2002)，Mol Cell Biol. 5:1438-45)。同時(shí)，US 2002/0103360和WO 2004/015078公開了 CD-RAP-相關(guān)蛋白。然而，兩件申請(qǐng)都沒有⑶-RAP-相關(guān)蛋白的凈電荷穩(wěn)定的制劑。迄今為止，WO 2008/040556公開了基于脂質(zhì)體的⑶-RAP制劑。具體而言，公開了干燥的藥物組合物，所述藥物組合物重構(gòu)后包含含有CD-RAP的多層囊泡，由此CD-RAP蛋白被包封和/或夾帶于脂質(zhì)體中以用于持續(xù)CD-RAP遞送，使得其可以在期望作用位點(diǎn)保留更長(zhǎng)的時(shí)間段。CD-RAP的一個(gè)功能是其用作間質(zhì)干細(xì)胞上的趨化因子。盡管CD-RAP不能誘導(dǎo)鼠或人間質(zhì)干細(xì)胞(HMSC)的分化，但是其影響骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-P 3在間質(zhì)干細(xì)胞分化期間的作用，從而支持軟骨形成顯型，同時(shí)抑制成骨分化。此外，CD-RAP減量調(diào)節(jié)骨橋蛋白和骨鈣蛋白在經(jīng)BMP-2處理的HMSC培養(yǎng)物中的基因表達(dá)，從而抑制BMP-2的成骨潛力。在人原代軟骨細(xì)胞的情況下，CD-RAP刺激胞外基質(zhì)沉積，從而增加氨基葡聚糖含量。因此據(jù)信，CD-RAP為軟骨形成分化和軟骨維持期間的重要調(diào)節(jié)因子。因此，據(jù)信⑶-RAP為有希望用于軟骨修復(fù)的候選物。因此可期望的是，可得到以足夠量包含CD-RAP的藥物制劑，其在儲(chǔ)存期間長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定。事實(shí)上，具有高濃度CD-RAP的穩(wěn)定制劑將使得患者的注射體積減少，這會(huì)將少由于大體積注射導(dǎo)致的如疼痛的副作用，并自然允許提高每個(gè)劑量。此外，盡管本領(lǐng)域已知蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的多個(gè)選擇并且可得到允許高濃度蛋白質(zhì)存在且使其保持穩(wěn)定的試劑，本領(lǐng)域仍未認(rèn)識(shí)到，包含高濃度CD-RAP蛋白的制劑是不穩(wěn)定的，并因此需要改進(jìn)。從而，本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題為滿足上文所述的需要。
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本發(fā)明解決了這些需要，并因而提供了所述技術(shù)問(wèn)題的解決方案，涉及制劑的實(shí)施例，以及將這些制劑應(yīng)用于治療受試者的方法和用途，所述受試者患有將會(huì)從CD-RAP給藥受益的疾病。本文以實(shí)施例的方式表征和描述了這些實(shí)施方案，并反映在權(quán)利要求書中。必須注意的是如本文所用，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確指示。因此，例如，提到“抗體”包括一個(gè)或多個(gè)此類不同抗體，提到“方法”包括提到本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的等同步驟和方法，所述步驟和方法可以被修改或者代替本文所述的方法。本發(fā)明引用的所有出版物和專利均通過(guò)引用全文并入本文。當(dāng)通過(guò)引用并入的材料與本說(shuō)明書沖突或不符合本說(shuō)明書時(shí)，本說(shuō)明書優(yōu)先于任何此類材料。除非另有指示，在一系列元素之前的術(shù)語(yǔ)“至少”應(yīng)理解為是指該系列中每一個(gè)元素。僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文描述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等同方式。此類等同方式意在被本發(fā)明涵蓋。除非上下文另有指示，在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書全文中，詞語(yǔ)“包含/包括”和變型將理解為表示包括所指出的整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組，而不排出任何其它整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組。當(dāng)本文使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“包含/包括”可以被替代為術(shù)語(yǔ)“含有”，或者當(dāng)本文使用時(shí)，有時(shí)可以被替代為術(shù)語(yǔ)“具有”。當(dāng)本文使用時(shí)，“由……組成”排除在要求的元素中被指明的任何元素、步驟或成分。當(dāng)本文使用時(shí)，“基本上由……組成”不排除不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響該權(quán)利要求的基本和新穎特征的材料或步驟。在本文的每個(gè)情況下，術(shù)語(yǔ)“包含/包括”、“由……組成”和“基本上由……組成”中的任一個(gè)可被另外兩個(gè)術(shù)語(yǔ)中任一個(gè)替代。如本文所用，在多個(gè)所述元素之間的連接術(shù)語(yǔ)“和/或”理解為涵蓋兩個(gè)單獨(dú)的選擇和組合選擇。例如，當(dāng)兩個(gè)元素被“和/或”連接時(shí)，第一選擇是指應(yīng)用第一元素而無(wú)第二元素。第二選擇是指應(yīng)用第二元素而無(wú)第一元素。第三選擇是指一起應(yīng)用第一和第二元素。這些選擇中的任一個(gè)都理解為落入該含義中，因此滿足如本文所用的術(shù)語(yǔ)“和/或”的要求。同時(shí)應(yīng)用超過(guò)一個(gè)選擇也理解為落入該含義中，因此滿足如本文所用的術(shù)語(yǔ)“和/或”的要求。本說(shuō)明書的文本中引用了若干文件。無(wú)論上下文，本文應(yīng)用的每個(gè)文件(包括所有專利、專利申請(qǐng)、科學(xué)出版物、制造商的說(shuō)明書、指示等)均通過(guò)引用全文并入本文。不能將本文理解為承認(rèn)本文不在現(xiàn)有發(fā)明的這些公開內(nèi)容之前。本發(fā)明人的目標(biāo)是提供一種制劑，所述制劑具有大量CD-RAP，以便當(dāng)所述制劑注射到有此需要的受試者中時(shí)可以采用小體積，從而減少由于大體積注射導(dǎo)致的副作用如疼痛，本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，CD-RAP蛋白在高濃度下可能是不穩(wěn)定的，并且在經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后也可能是不穩(wěn)定的。鑒于此，在本發(fā)明人以提供高度濃縮的穩(wěn)定制劑為目標(biāo)的研究期間已觀察到，他們已觀察到CD-RAP蛋白的特定不穩(wěn)定性，因而，致力于改善此不期望的觀察結(jié)果。因此，他們致力于濃縮CD-RAP，同時(shí)在溶液中保持CD-RAP，即在溶解階段。通過(guò)這樣做，他們可獲得多個(gè)選擇和備選，然后卻不具有這些選擇和備選中任何一個(gè)將適于解決目標(biāo)問(wèn)題的任何指
/Jn ο “溶解階段”表示，⑶-RAP蛋白為在溶液中，優(yōu)選地以至少5 mg/ml⑶-RAP的濃度，即直接溶解和/或分散于制劑的水性溶液中(即在水相中)。優(yōu)選地，CD-RAP蛋白均勻地溶解和/或分散。“均勻地”表示，溶解和/或分散于穩(wěn)定的水性制劑中的CD-RAP蛋白的量是幾乎均一地、優(yōu)選均一地分散于水性制劑中，以使得⑶-RAP蛋白的量(在摩爾質(zhì)量的情況下為“n”，或在質(zhì)量的情況下為“m”)的濃度(“c”)是在水性溶液的體積(“V”)中(或整個(gè)體積中)幾乎同一地，優(yōu)選同一地，即c=n/v或c=m/v分別為幾乎恒定的，優(yōu)選恒定的。優(yōu)選地，在制劑內(nèi)無(wú)濃度梯度。因此，包含⑶-RAP蛋白的本發(fā)明的穩(wěn)定水性制劑可以優(yōu)選地被認(rèn)為是水性溶液，其中CD-RAP直接溶解和/或分散于其中。更優(yōu)選地，本發(fā)明的穩(wěn)定水性制劑可以被認(rèn)為是至少5 mg/ml的水性⑶-RAP蛋白和帶電荷的氨基酸。這表示，所述制劑基于水性溶液，其中至少5 mg/ml⑶-RAP蛋白與至少帶電荷的氨基酸一起溶解和/或分散?；蛘撸景l(fā)明的穩(wěn)定水性制劑可以更優(yōu)選地被認(rèn)為是基于水性溶液的穩(wěn)定的制齊U，所述制劑包含至少濃度(重量/體積)為5 mg/ml的CD-RAP蛋白和帶電荷的氨基酸。“溶液”為一種或兩種或更多種物質(zhì)/組分的均勻混合物。在這種混合物中，溶質(zhì)(在本發(fā)明中為⑶-RAP蛋白，優(yōu)選至少5 mg/ml⑶-RAP蛋白)溶解于(如上文所述的)另一物質(zhì)(在本發(fā)明中，優(yōu)選水性制劑)中，所述另一物質(zhì)也稱為溶劑。鑒于上文，⑶-RAP蛋白優(yōu)選非不均勻地溶解和/或分散于所述水性溶液中。術(shù)語(yǔ)“溶解狀態(tài)”還包括，所述CD-RAP蛋白優(yōu)選基本上不乳化于所述水性溶液中，或更優(yōu)選根本不乳化于所述水性溶液中。并且，術(shù)語(yǔ)“溶解狀態(tài)”包括，所述⑶-RAP蛋白優(yōu)選基本上不被包封和/或捕集(優(yōu)選小于2%、1%、或O. 5%的所述CD-RAP蛋白可以被包封和/或捕集)于例如脂質(zhì)體、多層脂質(zhì)體等中，或更優(yōu)選根本不被包封和/或捕集于例如脂質(zhì)體、多層脂質(zhì)體等中。因此，在優(yōu)選方面，本發(fā)明包括穩(wěn)定的水性的基本上不含脂質(zhì)體(優(yōu)選小于2%、1%、或O. 5%脂質(zhì)體)、優(yōu)選不含脂質(zhì)體的制劑，所述制劑包含至少5 mg/ml⑶-RAP蛋白和帶電荷的氨基酸。在備選的更優(yōu)選方面，本發(fā)明包括穩(wěn)定的水性制劑，所述制劑包含至少5 mg/mlCD-RAP蛋白和帶電荷的氨基酸，其中所述CD-RAP蛋白基本上不被包含(優(yōu)選小于2、I、或O. 5%)、優(yōu)選不被包含(包封和/或捕集)于脂質(zhì)體中。實(shí)際上，存在蛋白質(zhì)可能不穩(wěn)定多種方式。例如，可以通過(guò)蛋白質(zhì)聚集導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，還可以通過(guò)由脫氨基、氧化、二硫鍵斷裂和形成、水解、琥珀酰亞胺化、非二硫鍵交聯(lián)、去糖基化或“酶促褐化”(Maillard反應(yīng))或這些現(xiàn)象的任何組合所致的化學(xué)不穩(wěn)定導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定；參見，例如，Wang等人(1999)，Int. J. Pharm. 185: 129-188和圖I。此外，物理化學(xué)參數(shù)例如溫度、PH值、表面吸附、鹽、金屬離子、螯合劑、物質(zhì)力量例如剪切力、蛋白質(zhì)變性劑、非水性溶劑、蛋白質(zhì)濃度、蛋白質(zhì)的來(lái)源和純度、蛋白質(zhì)型態(tài)或壓力可以影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。盡管存在可以影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的多個(gè)因素，但是可以采取多種手段使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。例如，可以內(nèi)部地(通過(guò)改變氨基酸)或外部地使蛋白質(zhì)穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^(guò)螯合劑、金屬離子、還原劑、聚合物、聚乙二醇/多元醇、血清白蛋白、表面活性劑、糖和多元醇、脂肪酸和磷脂、氨基酸、緩沖劑等實(shí)現(xiàn)外部穩(wěn)定化；參見，例如，Wang, Y和Hanson M (1988)，J. Parental Sci. & Technology, 42, Supplement: 4-26 ;Wang 等人(1999)，Int. J.Pharm. 185: 129-188，和圖2。簡(jiǎn)而言之，為了使制劑中的⑶-RAP蛋白穩(wěn)定化，技術(shù)人員可以利用多種選擇。在這種情況下，本發(fā)明人觀察到，所述CD-RAP蛋白表現(xiàn)出聚集。多種不同因素可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)制劑中的蛋白質(zhì)聚集。典型的純化和儲(chǔ)存程序可以將蛋白質(zhì)制劑暴露于導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集的條件和組分。例如，蛋白質(zhì)制劑中的蛋白質(zhì)由于以下因素中的一種或多種而聚集儲(chǔ)存、暴露于高溫、制劑的pH、制劑的離子強(qiáng)度、和某些表面活性劑的存在(例如，聚山梨醇酯-20和聚山梨醇酯-80)和乳化劑。類似地，當(dāng)暴露于剪切應(yīng)力時(shí),例如,將凍干的蛋白質(zhì)餅在溶液中重構(gòu)、用過(guò)濾器純化蛋白質(zhì)樣品、凍融、振搖、或經(jīng)由注射器轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)溶液，蛋白質(zhì)可聚集。還可由于多肽分子在溶液中和在儲(chǔ)存瓶?jī)?nèi)的液體-空氣界面處的相互作用而發(fā)生聚集。在運(yùn)輸期間由于攪拌導(dǎo)致的界面壓縮或延伸過(guò)程中，吸附至空氣-液體和固體-液體界面的多肽中可發(fā)生構(gòu)象變化。該攪拌可以導(dǎo)致制劑的蛋白質(zhì)聚集，并且最終與吸附的其它蛋白質(zhì)一起沉淀。。 此外，蛋白質(zhì)制劑暴露于光可導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。因而，本發(fā)明提供能夠獲得高濃度CD-RAP和降低蛋白質(zhì)減少的制劑。在不被理論所限的情況下，通過(guò)控制上述聚集機(jī)制中的一種或多種來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集的減少。這可導(dǎo)致例如改善產(chǎn)品穩(wěn)定性，使制造過(guò)程和儲(chǔ)存條件更靈活。具體而言，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在約6至約8的pH下攜帶凈電荷的多種被測(cè)試試劑氨基酸可用于使高濃度的CD-RAP蛋白穩(wěn)定，例如通過(guò)介導(dǎo)蛋白質(zhì)溶解度和/或抑制蛋白質(zhì)聚集。當(dāng)在本文中提及時(shí)，氨基酸優(yōu)選表示L-氨基酸。較不優(yōu)選地為D-氨基酸。優(yōu)選地，所述氨基酸為L(zhǎng)-組氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸或其鹽；優(yōu)選地，所述鹽為氯化鹽、磷酸鹽、乙酸鹽或硫酸鹽。因此，本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)，S卩，下述制劑對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和/或一個(gè)或多個(gè)凍/融循環(huán)來(lái)說(shuō)是充分穩(wěn)定的所述制劑包含至少5 mg/mL CD-RAP和帶電荷的氨基酸或其鹽(優(yōu)選地，所述鹽為氯化鹽、磷酸鹽、乙酸鹽或硫酸鹽)，更優(yōu)選地，所述制劑包含緩沖齊U、二糖、增量劑、和任選的表面活性劑。相比標(biāo)準(zhǔn)緩沖制劑，本發(fā)明的制劑具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一方面，所述制劑包含高CD-RAP蛋白濃度，例如30 mg/mL或更高。令人吃驚的是，盡管包含高濃度的蛋白質(zhì)，所述制劑的聚集極少，并且可以使用多種方法和形式儲(chǔ)存，例如冷凍，而不具有高蛋白質(zhì)制劑預(yù)期具有的有害作用。在一些較不優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑不需要賦形劑，例如，表面活性劑和緩沖體系，所述賦形劑用于傳統(tǒng)制劑中，以使溶液中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定。此外，本文描述的制劑優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)制劑，其原因?yàn)?，?yōu)于缺少用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定化所需的額外的試劑，它們具有的免疫原性低。因而，本發(fā)明涉及液體制劑，優(yōu)選涉及穩(wěn)定的液體制劑，其令人吃驚地允許長(zhǎng)期儲(chǔ)存CD-RAP多肽或其生物活性類似物和帶電荷的氨基酸或其鹽，所述生物活性類似物的氨基酸序列與⑶-RAP的4個(gè)半胱氨酸骨架(如下文描述的SEQ ID No. I的氨基酸12至107)共有至少63%序列同源性；所述⑶-RAP多肽或其生物活性類似物的濃度為至少5 mg/mL，優(yōu)選至少7. 5 mg/mL,更優(yōu)選至少10 mg/mL,甚至更優(yōu)選至少15 mg/mL,特別優(yōu)選至少20 mg/mL更特別優(yōu)選至少25 mg/mL,甚至更特別優(yōu)選至少30 mg/mL ;所述帶電荷的氨基酸的鹽優(yōu)選氯化鹽、磷酸鹽、乙酸鹽或硫酸鹽。此制劑是有用的，部分原因?yàn)?，此制劑更便于患者?用，因?yàn)榇酥苿┑腃D-RAP多肽高度濃縮，從而減少副作用，例如由高體積注射導(dǎo)致的疼痛。此外，在低水平的動(dòng)態(tài)流體壓力下將所述制劑關(guān)節(jié)內(nèi)注射施用給患者，會(huì)增加軟骨發(fā)生。本發(fā)明的制劑(本文中有時(shí)還稱為“主題組合物”或“組合物”)可以優(yōu)選地處于各種物理狀態(tài)，例如液體的、冷凍的、凍干的、冷凍-干燥的、噴霧-干燥的和重構(gòu)的制劑，其中優(yōu)選液體的和凍干的。優(yōu)選地，所述制劑的PH為6. 0，并且更優(yōu)選地，pH為5. 5至9. 0，更優(yōu)選地，所述制劑的pH為6. O至8. 0，再更優(yōu)選地，pH為6. 5至7. 6，最優(yōu)選地，pH為7. O至
7.5。如本文所用的“液體制劑”是指可見主題組合物為液體的，其特征在于，它們中的組成分子自由運(yùn)動(dòng)，但是無(wú)在室溫下分離的傾向。液體制劑包括水性和非水性液體，其中優(yōu)選水性制劑。水性制劑為其中溶劑為水的制劑。CD-RAP多肽在所述制劑中的溶解可以為均勻的或不均勻的，其中如上文所述優(yōu)選均勻的?？梢圆捎萌魏芜m合的非水性液體，條件是它給本發(fā)明的制劑提供穩(wěn)定性。優(yōu)選地，所述非水性液體為親水液體。適合的非水性液體的示例性實(shí)例包括甘油；二甲基亞砜(DMSO);聚二甲基硅氧烷(PMS);乙二醇，例如乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(“PEG”)200,PEG 300、和PEG 400 ;和丙二醇，例如二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(“PPG”)425 和 PPG 725。如本文所用的“混合的水性/非水性液體制劑”是指液體制劑，其含有水和另外的液體組合物的混合物。當(dāng)本文使用時(shí)，“制劑”為CD-RAP多肽(S卩，活性藥物/物質(zhì))和藥物產(chǎn)品所需的其它化學(xué)物質(zhì)和/或添加劑的混合物，其優(yōu)選處于液體狀態(tài)。本發(fā)明的制劑包括藥物制劑。術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”是指處于下述形式的制劑所述形式允許活性成分的生物活性為有效的，并因此可以被施用給受試者以用于如本文描述的治療用途。所述制劑的制備包括以下方法在所述方法中，將不同化學(xué)物質(zhì)，包括所述活性藥物，組合以形成最終的藥物產(chǎn)品，例如藥物組合物。本發(fā)明的制劑的活性藥物為CD-RAP多肽。術(shù)語(yǔ)“多肽”可以在本文中與術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”互換地使用，并且如本文所用，包括肽、多肽、蛋白質(zhì)和融合蛋白?？梢酝ㄟ^(guò)重組或合成方法制備蛋白質(zhì)。
在某些實(shí)施方案中，要進(jìn)行配制的⑶-RAP蛋白為基本上純的和/或基本上同種類的(B卩，，基本上不含污染性蛋白質(zhì)等)。術(shù)語(yǔ)“基本上純的”蛋白質(zhì)表示這樣的組合物所述組合物包含至少約80重量％、優(yōu)選90重量％的蛋白質(zhì)級(jí)份,優(yōu)選包含至少約95重量％的蛋白質(zhì)級(jí)份，更優(yōu)選包含97重量％的蛋白質(zhì)級(jí)份或最優(yōu)選包含98重量％的蛋白質(zhì)級(jí)份。術(shù)語(yǔ)“基本上同種類的”蛋白質(zhì)表示這樣的組合物除了溶液中的各種穩(wěn)定劑和水的質(zhì)量，所述組合物包含至少約99重量％的蛋白質(zhì)級(jí)份。本發(fā)明的制劑的⑶-RAP多肽為本領(lǐng)域已知的(參見EP-Bl 710 248或EP-Bl I146 897)和/或?yàn)楸疚乃枋?。?yīng)用于本發(fā)明的制劑中的CD-RAP (軟骨源性視黃酸敏感蛋白)多肽為⑶-RAP多肽，也稱為MIA (黑素瘤抑制活性)、OTOR (纖維細(xì)胞源性蛋白FDP，MIA-類，MIAL)和屬于分泌蛋白類別的TANGO 130，如Bosserhoff 等人(2004)，Gene Expr.Patterns. 4: 473-479 ;Bosserhoff和Buettner (2003), Biomaterials 24: 3229-3234;Bosserhoff 等人(1997)，Dev. Dyn. 208: 516-525 ；W0 00/12762 ；W0 2004/015078 ；EP-Bl 710 248 ；US 2002/0103360 ;或EP-Bl I 146 897中所述。應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中的CD-RAP蛋白優(yōu)選為重組人CD-RAP蛋白(rh CD-RAP)。還優(yōu)選的是，本發(fā)明的制劑的⑶-RAP多肽為包含或具有⑶-RAP的成熟序列(SEQID No. I)及其功能片段或變體的多肽；b)與⑶-RAP的4個(gè)半胱氨酸骨架(SEQ ID No. I的氨基酸12至107)具有至少63%、更優(yōu)選70%、甚至更優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%、最優(yōu)選95%氨基酸序列同源性的多肽；或c)具有本文限定的通用序列I至3 (SEQ ID No. 2、3和4)中任一個(gè)的多肽。⑶-RAP的變體為具有SEQ ID NO: 4的蛋白質(zhì)或如WO 2004/015078中所 述的其成熟形式或者具有SEQ ID NO. 14的蛋白質(zhì)或如US 2002/0103360中所述的其成熟形式。本文中鑒定的相對(duì)于CD-RAP序列的“氨基酸序列同源性百分比(%)”定義為，在將序列和引入間隙(如果需要)進(jìn)行比對(duì)以實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分比之后(并且將任何保守置換考慮為序列同一性的一部分)之后，候選序列中的氨基酸殘基與CD-RAP序列中的氨基酸殘基相同的百分比?？梢砸远喾N方式實(shí)現(xiàn)以測(cè)定氨基酸序列同一性百分比為目的的比對(duì)，所述方式在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)，例如使用公眾可得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST、ALIGN、或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括在進(jìn)行比較的序列全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。具有與⑶-RAP相同的生物學(xué)功能的功能片段優(yōu)選具有SEQ ID No. I中所示序列的至少20、特別是至少40、更優(yōu)選至少50、最優(yōu)選80個(gè)鄰近氨基酸長(zhǎng)度。優(yōu)選地，所示功能片段包含SEQ ID No I的第I至50位、第I至70位、第I至80位、第20至80位、第20至107位的氨基酸。成熟的CD-RAP 序列(SEQ ID No. I)GPMPKLADRKLCADQECSHPISMAVALQDYMAPDCRFLTIHRGQVVYVFSKLKGRGRLFWGGSVQGDYY⑶LAARLGYFPSSIVREDQTLKPGKVDVKTD KffDFYCQ通用序列I (SEQ ID No. 2)C X4 C X17 C X12 V X n_13 W X7_18 F X4 V X21 C X通用序列2 (SEQ ID No. 3)K X C X D X E C X11 D X3 P D C X12 V X2 K L X7_9 WXGS X5_13 G Y F P X3 VX18 D F X C X
通用序列3 (SEQ ID No. 4)KXCXD X2 C X8 A X2 D X3 PDCRF X5 GXV X5 KL X7 WXGSV X12 GYF P X22 D F X C Q其中每次出現(xiàn)的“X”獨(dú)立地表示任何氨基酸，下標(biāo)數(shù)字指示任何氨基酸的數(shù)量。優(yōu)選地，“X”獨(dú)立地表示天然存在的氨基酸，且特別是表示A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。“X”還可以表示非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，例如羊毛硫氨酸、2-氨基異丁酸、脫氫丙氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、β丙氨酸或正亮氨酸。當(dāng)然，還預(yù)見到本領(lǐng)域熟知的翻譯后修飾。因而，本發(fā)明的CD-RAP多肽可以經(jīng)翻譯后修飾?？梢栽谠嘶蛘婧怂拗骷?xì)胞中由完整的或截短的基因組DNA或cDNA或者由合成的DNA表達(dá)應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中的CD-RAP蛋白?？梢詮呐囵B(yǎng)基或內(nèi)含體中分離蛋 白質(zhì)和/或再折疊以形成生物活性組合物。參見例如EP-Bl 710 248和Lougheed等人(2001)，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98: 5515-5520 的用于 CD-RAP 的重組蛋白質(zhì)純化的示例性規(guī)程。如何測(cè)試此類分離蛋白質(zhì)的活性(例如軟骨發(fā)生)的詳細(xì)說(shuō)明描述于Tscheudschilsuren等人(2005)，Exp. Cell Res. 1-10 ;或Stoll 等人(2003)，ProteinSci. 12: 510-519中。軟骨誘導(dǎo)的生物檢測(cè)描述于EP-Bl I 146 897的實(shí)施例2至5。下文且在實(shí)施例7和8中描述了其它生物檢測(cè)?；蚬こ碳?xì)胞生產(chǎn)多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，Ausubel等人，eds.(1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)。此類方法包括將編碼且允許多肽表達(dá)的核酸引入到活宿主細(xì)胞中。這些宿主細(xì)胞可以為細(xì)菌細(xì)胞，真菌細(xì)胞，或者優(yōu)選為在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞包括、但不限于，大腸桿菌細(xì)胞。適合的大腸桿菌菌株的實(shí)例包括HB101、DH5a、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539jP無(wú)法切除外源DNA的任何大腸桿菌菌株?？梢允褂玫恼婢拗骷?xì)胞包括、但不限于，釀酒酵母、畢氏酵母和黃曲霉細(xì)胞?？梢允褂玫亩鄠€(gè)動(dòng)物細(xì)胞系實(shí)例為CHO、VERO、BHK、HeLa、CoS、MDCK、293、3T3、和WI38?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法建立新的動(dòng)物細(xì)胞系(例如，通過(guò)轉(zhuǎn)化、病毒感染和/或選擇)。任選地，宿主細(xì)胞可以將所述多肽分泌到培養(yǎng)基中。用于多肽純化的技術(shù)例如離子交換柱分級(jí)、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠色譜、肝素SEPHAR0SET色譜、陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂色譜(例如聚天冬氨酸柱)、色譜聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀可以根據(jù)需要進(jìn)行使用?？梢匀鏓P-Bl I 697 523的實(shí)施例中所述表達(dá)和純化應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中的⑶-RAP蛋白。在一些實(shí)施方案中，⑶-RAP蛋白在本發(fā)明的制劑中的濃度為至少5 mg/mL，優(yōu)選為至少7. 5 mg/mL,更優(yōu)選為至少10 mg/mL,甚至更優(yōu)選為至少15 mg/mL,特別優(yōu)選為至少20mg/mL,更特別優(yōu)選為至少25 mg/mL,甚至更特別優(yōu)選為至少30 mg/mL。在一些實(shí)施方案中，⑶-RAP蛋白在本發(fā)明的制劑中的濃度選自下述范圍約5mg/mL 至約 10 mg/mL,約 10 mg/mL 至約 20 mg/mL,約 15 mg/mL 至約 25 mg/mL,約 20 mg/mL至約 30 mg/mL,或約 5 mg/mL 至約 30 mg/mL。在優(yōu)選方面，本發(fā)明的CD-RAP制劑、特別是穩(wěn)定水性制劑不包含脂質(zhì)體和/或基質(zhì)材料。優(yōu)選地，本發(fā)明的CD-RAP制劑不包含脂質(zhì)體和/或選自下述的基質(zhì)材料透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、膠原、肝素、纖維蛋白、纖維蛋白原、脫礦骨、丙交酯-乙交酯共聚物和/或丙交酯-乙交酯共聚物衍生物或它們的組合。更優(yōu)選地，所述CD-RAP制劑不含有脂質(zhì)雙層。
在其它優(yōu)選方面，所述⑶-RAP蛋白不以1-4 mg/mL的濃度(包括I. O mg/mLU. 5mg/mL、2. O mg/mL、2. 5 mg/mL、3. O mg/mL、3. 5 mg/mL>4. 0 mg/mL)包含在精氛酸/H3PO4 中，所述精氨酸/H3PO4的濃度優(yōu)選為350-420 mM。更優(yōu)選地，所述⑶-RAP蛋白不以I. 15 mg/mL或3 mg/mL的濃度包含在pH 7. 5的350 mM或420 mM精氨酸/H3PO4中。當(dāng)本文使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”理解為表示所描述制劑的CD-RAP蛋白的濃度存在變動(dòng)，所述變動(dòng)可以為給定值的5%、10%、15%或高達(dá)且包括20%。例如，如果制劑具有約5 mg/mL⑶-RAP多肽，則理解為表示制劑可以具有3至7 mg/mL、更優(yōu)選4至6 mg/mL。因而，如本文所用，限定為“X至Y”的濃度區(qū)間等于限定為“X和Y之間”的區(qū)間。兩個(gè)時(shí)間區(qū)間均特別包括上限值以及下限值。這表示，例如“5 mg/mL至10 mg/mL”或“5 mg/mL至10 mg/mL”之間的區(qū)間包括5、6、7、8、9、和/或10 mg/mL的濃度?！胺€(wěn)定的”制劑為這樣的制劑在所述制劑中的蛋白質(zhì)經(jīng)儲(chǔ)存基本上保持其物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性，和/或優(yōu)選經(jīng)顏色和/或澄清度的視覺檢查，或通過(guò)UV光散射或尺寸排阻色譜測(cè)定，與對(duì)照樣品相比顯示出基本上無(wú)聚集、沉淀和/或變 性的跡象。本領(lǐng)域可得到用于測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種其它分析技術(shù)，所述技術(shù)綜述于例如 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301，Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker,Inc. , New York, N. Y., Pubs. (1991)和 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90(1993)。優(yōu)選地，相對(duì)于本發(fā)明的制劑的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的”理解為表示，相對(duì)于⑶-RAP多肽在儲(chǔ)存開始時(shí)和/或凍融期間或之后的活性，所述制劑的CD-RAP多肽在儲(chǔ)存期間不失去其生物活性的超過(guò)15%、或更優(yōu)選10%、或甚至更優(yōu)選5%、以及最優(yōu)選3%。可以通過(guò)描述于EP-BlI 146 897中的實(shí)施例2至5的用于軟骨誘導(dǎo)的生物檢測(cè)來(lái)測(cè)定⑶-RAP生物活性。其它生物檢測(cè)為 Stoll 等人，(2006)，Biol. Chem. , Vol. 387，pp. 1601 - 1606 或?qū)嵤├?7 和8中描述的侵入檢測(cè)。如本文所用的“儲(chǔ)存期間”表示這樣的制劑所述制劑在制備后不立即使用；相反，在其制備后，將其包裝進(jìn)行儲(chǔ)存，以冷凍狀態(tài)或以干燥形式以之后重構(gòu)成液體形式或其它形式?！爸貜?fù)凍融循環(huán)”包括本發(fā)明的制劑進(jìn)行一次或多次凍融循環(huán)，例如1、2、3、4、5或更多次凍融循環(huán)。然而，如本文所述且示于實(shí)施例中，本發(fā)明的制劑在重復(fù)凍融循環(huán)下保持穩(wěn)定。因此，所述⑶-RAP多肽優(yōu)選在重復(fù)(1、2、3、優(yōu)選4、5或更多次)凍融循環(huán)下為穩(wěn)定的，優(yōu)選地，所述凍融循環(huán)如下5° C至-25° C，冷卻和加熱速率I. O ° C/min，其中各循環(huán)之間的等溫步驟為15 min。不被理論所限，優(yōu)選在本發(fā)明上下文中應(yīng)用的凍融循環(huán)模擬可能在大量溶解蛋白冷凍期間產(chǎn)生的冷凍應(yīng)力。因此，由于本發(fā)明的制劑證明能夠在凍融循環(huán)期間保持CD-RAP在溶液中穩(wěn)定，本發(fā)明的制劑是卓越的，且具有有利特性。儲(chǔ)存期間可能會(huì)形成聚集體，例如由于暴露于高溫?！案邷亍北硎靖哂谡?chǔ)存本發(fā)明的包含CD-RAP多肽的制劑的溫度的任何溫度正常儲(chǔ)存溫度為約4° C至10° C，優(yōu)選約4° C至8° C，更優(yōu)選約4° C至6° C，甚至更優(yōu)選在約4° C的溫度。形成聚集體的其它原因可以為制劑的pH、制劑的離子強(qiáng)度、某些表面活性劑(例如，聚山梨醇酯-20和聚山梨醇酯-80)的存在、乳化劑，和/或由于多肽具有形成此類聚集體的固有傾向。不被理論所限，估計(jì)CD-RAP多肽的聚集體形成可能由前述原因中的一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致，并且可能造成活性的損失。因此，預(yù)見到CD-RAP多肽優(yōu)選為穩(wěn)定的，程度為其在儲(chǔ)存期間和/或凍融期間或之后基本上不形成聚集體(例如，因?yàn)榍笆鲈蛑械囊粋€(gè)或多個(gè))。因此，優(yōu)選預(yù)見到，相對(duì)于⑶-RAP多肽在儲(chǔ)存開始時(shí)的量，⑶-RAP多肽的不超過(guò)10%、更優(yōu)選不超過(guò)8%、甚至更優(yōu)選不超過(guò)5%、甚至更優(yōu)選不超過(guò)3%、特別優(yōu) 選不超過(guò)1%形成聚集體。在備選方案中，預(yù)見到CD-RAP多肽優(yōu)選為穩(wěn)定的，程度為其不形成二聚體或寡聚體。換而言之，可以根據(jù)溶液中單體蛋白質(zhì)的百分比與降解的(例如，片段化的)和/或聚集的蛋白質(zhì)的低百分比測(cè)定CD-RAP蛋白的穩(wěn)定性。例如，本發(fā)明的包含CD-RAP蛋白的制劑可以包括至少90%、更優(yōu)選至少92%、甚至更優(yōu)選至少95%、進(jìn)一步甚至更優(yōu)選至少97%、特別優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選99%的單體⑶-RAP蛋白?！熬奂w”表示蛋白質(zhì)分子之間導(dǎo)致共價(jià)或非共價(jià)二聚體或寡聚體(S卩，高分子量實(shí)體)形成的物理相互作用，所述共價(jià)或非共價(jià)二聚體或寡聚體可以保持可溶或形成從溶液中沉淀出來(lái)的不溶的聚集體。“聚集體”還包括降解的和/或片段化的CD-RAP蛋白?？梢栽谙蛑苿┲屑尤肴绫疚拿枋龅膸щ姾傻陌被嶂啊⒒旧贤瑫r(shí)或之后測(cè)量制劑中蛋白質(zhì)聚集的水平。在某些實(shí)施方案中，在向制劑中加入如本文描述的帶電荷的氨基酸之后的約I天至約12周至少一次測(cè)量聚集的水平。在其它實(shí)施方案中，在向制劑中加入如本文描述的帶電荷的氨基酸之后的約I個(gè)月至36個(gè)月至少一次測(cè)量聚集的水平。如上文所述，可以使用多種不同分析方法來(lái)檢測(cè)包含蛋白質(zhì)的制劑中聚集體的存在和水平。這些方法包括、但不限于，例如，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、尺寸排阻色譜(SEC)、分析超離心(AUC)、場(chǎng)流分級(jí)(FFF)、光散射檢測(cè)、沉降速度、紫外光譜、差異掃描量熱法、濁度測(cè)定法、比濁法、顯微法、尺寸排阻色譜-高效液相色譜(SEC-HPLC)、反相高效液相色譜(RP-HPLC)、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS)、和串聯(lián)RP-HPLC/ESI-MS、流場(chǎng)流分級(jí)技術(shù)以及靜態(tài)和/或動(dòng)態(tài)光散射?？梢詥为?dú)或組合使用這些方法。優(yōu)選地，檢測(cè)包含蛋白質(zhì)、優(yōu)選CD-RAP的制劑中聚集體的存在和水平的分析方法為尺寸排阻色譜-高效液相色譜(SEC-HPLC)和流場(chǎng)流分級(jí)技術(shù)穩(wěn)態(tài)和/或動(dòng)態(tài)光散射。包含蛋白質(zhì)的制劑的常見問(wèn)題是聚集體隨時(shí)間、熱或剪切應(yīng)力的不可逆累積。通常，當(dāng)聚集體沉淀時(shí)，它們形成易于檢測(cè)的大顆粒。然而，通常是沉淀大顆粒的前體的較小、非共價(jià)可溶聚集體更難以檢測(cè)和定量。因而，檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)制劑中蛋白質(zhì)聚集的方法需要基于進(jìn)行評(píng)估的聚集體的類別。在上述方法中，測(cè)定蛋白質(zhì)制劑中可溶、共價(jià)聚集體的存在和/或量的推薦方法為SEC/光散射、SDS-PAGE、CGE、RP-HPLC/ESI-MS、FFF和AUC。測(cè)定蛋白質(zhì)制劑中可溶、非共價(jià)聚集體的存在和/或量的推薦方法為SEC、PAGE、SDS-PAGE、CGE、FFF、AUC、和動(dòng)態(tài)光散射。測(cè)定蛋白質(zhì)制劑中不可溶、非共價(jià)聚集體的存在和/或量的推薦方法為紫外光譜、濁度測(cè)定法、比濁法、顯微法、AUC、和動(dòng)態(tài)光散射。鑒于上文，本發(fā)明的另一實(shí)施方案是提供用于本發(fā)明的制劑中CD-RAP多肽的穩(wěn)定性的快速穩(wěn)定性檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟測(cè)試根據(jù)本發(fā)明配制的多肽在儲(chǔ)存之前(即，時(shí)間為零)的活性，將所述組合物儲(chǔ)存于約37° C至42° C、優(yōu)選約37° C至少一個(gè)月并測(cè)量所述多肽的穩(wěn)定性，然后將時(shí)間為零的穩(wěn)定性與一個(gè)月時(shí)間點(diǎn)的穩(wěn)定性進(jìn)行比較。此信息有助于較早去除看起來(lái)初始具有良好穩(wěn)定性、但無(wú)法更長(zhǎng)時(shí)間良好儲(chǔ)存的批次或批號(hào)。此外，本發(fā)明的制劑優(yōu)選提供改善的長(zhǎng)期儲(chǔ)存，使得所述CD-RAP蛋白以液體或冷凍狀態(tài)(優(yōu)選以液體形式)經(jīng)儲(chǔ)存期為穩(wěn)定的。如本文所用，短語(yǔ)“長(zhǎng)期”儲(chǔ)存理解為表示，所述制劑可以儲(chǔ)存至少I個(gè)月、2或3個(gè)月或者更長(zhǎng)、6個(gè)月或更長(zhǎng)、并優(yōu)選I年或更長(zhǎng)。長(zhǎng)期儲(chǔ)存還理解為表示，所述藥物組合物以2-8 C下液體或-20° C下或更冷的冷凍儲(chǔ)存，從而所述制劑優(yōu)選如本文描述的程度不失去其生物活性和/或如本文描述的程度不形成聚集體和/或如本文描述的程度包含單體。本文別處描述了用于這些性質(zhì)的測(cè)試。還預(yù)見到并在實(shí)施例中證明了所述制劑可以被冷凍和融解超過(guò)一次。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述制劑中的⑶-RAP蛋白以液體形式穩(wěn)定至少I個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月；至少4個(gè)月、至少5個(gè)月；至少6個(gè)月；至少12個(gè)月。同樣預(yù)期上述時(shí)間段中間的范圍也是本發(fā)明的一部分，例如9個(gè)月等等。此外，預(yù)期包括使用任何上述數(shù)值作為上限 值和/或下限值的組合的數(shù)值范圍。優(yōu)選地，所述制劑在室溫(約20° C)或30° C下穩(wěn)定至少I個(gè)月和/或在約2-8° C下穩(wěn)定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月，或更優(yōu)選在約2-8° C下穩(wěn)定至少2年。此外，所述制劑優(yōu)選在制劑的冷凍(至例如-80° C)和融解之后(本文還稱為“凍/融循環(huán)”)為穩(wěn)定的。出乎意料地，旨在使⑶-RAP蛋白在高濃度下穩(wěn)定的本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在約6至8的PH下具有凈電荷的氨基酸允許制備高度濃縮的CD-RAP制劑，并且所述氨基酸起到長(zhǎng)期減少CD-RAP多肽在這種制劑中聚集的作用，由此得到如本文描述的穩(wěn)定的制劑。因此，在優(yōu)選方面，由本發(fā)明的穩(wěn)定制劑包含的帶電荷的氨基酸在在約6至8的pH下具有凈電荷。術(shù)語(yǔ)“凈電荷”表示，取決于蛋白質(zhì)的氨基酸的性質(zhì)，在所述氨基酸或蛋白質(zhì)的表面上的正和負(fù)電荷不為零。所述凈電荷取決于帶電荷的氨基酸的數(shù)量和性質(zhì)，并取決于PH以及氨基酸在多肽一級(jí)序列內(nèi)的位置。在特定pH下，所述正和負(fù)電荷被平衡，凈電荷將為零。這種pH稱為等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)處蛋白質(zhì)具有其最低溶解度。更優(yōu)選地，氨基酸或帶電荷的氨基酸選自甘氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及它們的鹽。組氨酸、谷氨酸鹽、精氨酸或其鹽是特別優(yōu)選的。在一些實(shí)施方案中，將前述氨基酸或它們的鹽的組合應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中。在其它實(shí)施方案中，所述氨基酸為精氨酸、賴氨酸或組氨酸的類似物，所述類似物保持優(yōu)選在PH6. O或更高下增強(qiáng)CD-RAP溶解度的能力。這種類似物包括、但不限于含有精氨酸、賴氨酸或組氨酸的二肽和三肽。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸鹽為精氨酸鹽酸鹽(優(yōu)選在pH 6. O至8. O、更優(yōu)選在pH 6. 5至7. 5、最優(yōu)選在pH 6. O或7. 4的溶液中)、精氨酸磷酸鹽(優(yōu)選在pH 6. O至
8.O、更優(yōu)選在pH 6. 5至7. 5、最優(yōu)選在pH 6. O或7. 4的溶液中)、組氨酸磷酸鹽(優(yōu)選在pH6. O至8. O、更優(yōu)選在pH 6. 5至7. 5、最優(yōu)選在pH 6. O或7. 4的溶液中)、組氨酸鹽酸鹽(優(yōu)選在pH 6. O至8. O、更優(yōu)選在pH 6. 5至7. 5、最優(yōu)選在pH 6. O或7. 4的溶液中)、谷氨酸鉀和谷氨酸鈉(優(yōu)選在PH 6. O至8. O、更優(yōu)選在pH 6. 5至7. 5、最優(yōu)選在pH 6. O或7. 4的溶液中)。應(yīng)用于本發(fā)明的氨基酸以及它們的鹽為本領(lǐng)域熟知的，通過(guò)已知方法制造且可從商業(yè)供應(yīng)商得到。
帶電荷的氨基酸、其鹽或任何特定氨基酸例如甘氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及它們的鹽在所述制劑中的濃度優(yōu)選為約O. 5% (w/v)至約8% (w/v), 1%(w/v)至約 8% (w/v) > 1% (w/v)至約 5% (w/v)、I. 5% (w/v)至約 5% (w/v) >2. % (w/v)至約5% (w/v) >0. 5% (w/v)至約3% (w/v)、更優(yōu)選約I. 0% (w/v)至約3% (w/v)、甚至更優(yōu)選約I. 5% (w/v)至約3% (w/v)、甚至進(jìn)一步優(yōu)選2. 0% (w/v)至約3% (w/v)、以及特別優(yōu)選約2. 5% (w/v)?？蓮纳虡I(yè)供應(yīng)商得到所述帶電荷的氨基酸。除了如本文描述的⑶-RAP多肽之外，通過(guò)將在約6至8的pH下具有凈電荷的氨基酸組合在例如水性溶液中來(lái)制備本發(fā)明的制劑。此外,可以根據(jù)需要加入緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑(tonicity modifier)和/或穩(wěn)定劑以及任選的另外的賦形劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解，可以以任何合適的順序組合要被包括在所述制劑中的各種組分。例如，可以首先、中間或最后加入緩沖劑，或者還可以首先、中間或最后加入張力調(diào)節(jié)劑。還將會(huì)被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的是，這些化學(xué)品中的一些可能在某些組合中不相容，因此，容易地用具有類似特定但在相關(guān)混 合物中相容的不同化學(xué)品進(jìn)行替代。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇包含在本發(fā)明的制劑中的氨基酸和其它成分(例如可被包含在所述制劑中的緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、賦形劑)中的任何一種，使得其提供⑶-RAP蛋白經(jīng)過(guò)重復(fù)凍/融循環(huán)(優(yōu)選經(jīng)過(guò)5個(gè)凍/融循環(huán)(5° C至-25° C，冷卻和加熱速率I. O ° C/min,其中各循環(huán)之間的等溫步驟為15 min))的穩(wěn)定性。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述制劑包含緩沖劑。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“緩沖劑”包括將PH維持在所需范圍內(nèi)的那些試劑。緩沖劑為由弱酸及其綴合的堿或者由弱堿及其綴合的酸組成的水性溶液。其具有下述特定當(dāng)加入少量強(qiáng)酸或堿時(shí)，所述溶液的PH變化非常小。在多種化學(xué)應(yīng)用中，緩沖溶液用作將PH保持在接近恒定的數(shù)值的方式。緩沖溶液用于維持PH量級(jí)的某個(gè)水平。通常而言，當(dāng)緩沖劑應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中時(shí)，其優(yōu)選使CD-RAP蛋白穩(wěn)定。當(dāng)本文使用時(shí)，“氨基酸緩沖劑”包括例如氨基酸堿，例如精氨酸及其綴合的鹽。氨基酸緩沖劑的實(shí)例為精氨酸/精氨酸鹽酸鹽、精氨酸/精氨酸磷酸鹽、組氨酸/組氨酸鹽酸鹽、組氨酸/組氨酸磷酸鹽、谷氨酸/谷氨酸鈉或谷氨酸鉀。優(yōu)選將這些實(shí)例應(yīng)用于本發(fā)明。如本文描述的制劑的優(yōu)選pH可選擇下述范圍約4至約10，約5至約9，優(yōu)選約6至約8。因此，優(yōu)選使用可以將溶液維持在pH 6.0至8.0的緩沖劑。當(dāng)用于pH值/范圍的上下文中時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”優(yōu)選表示具有圍繞所述數(shù)值的+/_ 25%的范圍的數(shù)值。當(dāng)將藥物組合物的PH設(shè)定在生理水平或附近時(shí)，使給藥后患者的舒適情況最大化。一般而言，緩沖劑的性質(zhì)和/或氨基酸及其濃度為使得所述制劑的重量滲克分子濃度為280 - 320 mosmol/kg。具體而言，優(yōu)選的是，pH在pH約5. 8至8. 4的范圍內(nèi)，約
6.2至7. 4為優(yōu)選的，更優(yōu)選pH為pH 5. 8至8. 4，最優(yōu)選6. 2至7. 4，然而應(yīng)該理解，可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)PH，以使具體制劑中的多肽的穩(wěn)定性和溶解度最大化，并因此，生理范圍之外、但優(yōu)選患者仍耐受的PH在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？捎糜诒疚拿枋龅闹苿┲械木彌_劑的非限制性實(shí)例包括，組氨酸、琥珀酸鹽、葡萄酸鹽、檸檬酸鹽、三(氨基丁三醇)、Bis-Tris、MOPS、ACES、TES、HEPES、EPPS、乙二胺、磷酸、馬來(lái)酸/磷酸鹽、檸檬酸鹽、2-嗎啉乙磺酸(MES)、磷酸鈉、乙酸鈉和二乙醇胺。
優(yōu)選緩沖劑為磷酸鹽緩沖劑、Tris緩沖劑、氨基酸緩沖劑，例如但不限于精氨酸、組氨酸和谷氨酸鹽緩沖劑。更優(yōu)選地，將下述緩沖劑應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中精氨酸磷酸鹽(優(yōu)選pH 6. O至8. O、更優(yōu)選pH 6. 5至7. 5、最優(yōu)選pH 6. O或7. 4 )、組氨酸磷酸鹽(優(yōu)選pH 6. O至8. O、更優(yōu)選pH 6. 5至7. 5、最優(yōu)選pH 6. O或7. 4)、組氨酸鹽酸鹽(優(yōu)選pH 6.0至8. O、更優(yōu)選pH 6. 5至7. 5、最優(yōu)選pH 6. O或7. 4)。應(yīng)用于本發(fā)明的緩沖劑為本領(lǐng)域熟知的，通過(guò)已知方法制造且可從商業(yè)供應(yīng)商得到。氨基酸、其鹽、甘氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及它們的鹽、緩沖劑(例如但不限于Tris緩沖劑、組氨酸緩沖劑、精氨酸磷酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖劑)在本發(fā)明的組合物中的濃度可以選自下述范圍約I至約500 mM、約I至約450 mM、約I至約400 mM、約I至約350 mM、約I至約300 mM、約I至約250 mM、約I至約200 mM、約I至約150 mM、約I至約100 mM、約I至約50 mM、約I至約40 mM、約I至約30 mM、約I至約20mM、約 I 至約 10 mM、約 10 至約 500 mM、10 至約 450 mM、10 至約 400 mM、10 至約 350 mM、10至約 300 mM、10 至約 250 mM、10 至約 200 mM、10 至約 150 mM、約 30 至約 500 mM、30 至約450 mM、30 至約 400 mM、30 至約 350 mM、30 至約 300 mM、30 至約 250 mM、30 至約 200 mM、或30至約150 mM。對(duì)于Tris緩沖劑，最優(yōu)選的濃度為30至100 mM ;對(duì)于組氨酸緩沖劑，優(yōu)選濃度為45至60 mM或250至350 mM,最優(yōu)選50 mM至300 mM ;對(duì)于磷酸鹽緩沖劑，優(yōu)選濃度為45至60 mM;對(duì)于精氨酸緩沖劑，優(yōu)選濃度為250至380 mM ;對(duì)于谷氨酸鹽緩沖劑，優(yōu)選濃度為250 至 360 mM，最優(yōu)選 280 至 360 mM。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述制劑包含張力調(diào)節(jié)劑。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“張力調(diào)節(jié)劑”旨在表示可以用于調(diào)節(jié)液體制劑的張力的化合物。適合的張力調(diào)節(jié)劑包括甘油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、硫酸鎂、氯化錳、氯化鉀、硫酸鈉、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉籽糖、麥芽糖和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的那些。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體制劑的張力近似血液或血漿的張力。張力調(diào)節(jié)劑有助于組合物的重量滲克分子濃度。人血清的重量滲克分子濃度為約250-350 mOsM/kg。為了維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和使患者的不舒適性最小化，通常優(yōu)選的是，所述制劑為等滲的，即，具有與人血清或或滑液大致相等的重量滲克分子濃度。因此，所述組合物的重量滲克分子濃度優(yōu)選為180至420 mOsM/kg,更優(yōu)選280至320 mOsM/kg。在此范圍內(nèi)最理想的重量滲克分子濃度即等滲。術(shù)語(yǔ)“等滲的”表示，目標(biāo)制劑具有與人血液基本上相同的滲透壓。等滲制劑通常具有約270-328 mOsM的滲透壓。稍低張力的滲透壓為250-269，稍高張力的滲透壓為328-350 mOsm。例如可以使用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計(jì)測(cè)量滲透壓。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，根據(jù)所需具體條件，組合物的重量滲克分子濃度可以更高或更低。本領(lǐng)域已知多種張力調(diào)節(jié)劑(參見，例如美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0180287的段)。所述制劑的其它組分，包括、但不限于鹽(例如，氯化鈉、氯化鉀和檸檬酸鈉)、緩沖劑、二糖(例如，蔗糖、葡萄糖和甘露醇)、增量劑、和表面活性劑，也可有助于所述組合物的重量滲克分子濃度。張力調(diào)節(jié)劑在所述制劑中的濃度優(yōu)選為約I mM至1000 mM、更優(yōu)選約10 mM至約200 mM。應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中的優(yōu)選張力調(diào)節(jié)劑為氯化鉀或氯化鈉，優(yōu)選濃度為小于150 mM、小于100 mM、小于80 mM、小于50 mM、濃度為10至50 mM、40至90 mM、40 至 120 mM、50 至 120 mM、50 至 150 mM、80 至 150 mM、80 至 120 mM、40 至 45 mM、80 至 90mMUOO 至 150 mMUOO 至 120 mM,42. 5 mM,89. 5 mMU16. 5 mM 或 150 mM。在一些實(shí)施方案中，所述制劑還包含氯化鈉(NaCl)。在具體實(shí)施方案中，所述制劑包含1-200 mM、或小于50 mM、小于40 mM、小于35 mM、小于30 mM、小于25 mM、小于20 mM、小于15 mM、小于10 mM、或小于5 mM NaCl。在某些條件下，NaCl可造成凍干期間出現(xiàn)困難或?qū)е略谥貥?gòu)的凍干物中出現(xiàn)乳白色物。因此，在較不優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述制劑不包含NaCl。除了所述⑶-RAP蛋白，如本文描述的制劑還可含有其它物質(zhì)。這些物質(zhì)包括、但不限于，穩(wěn)定試劑(穩(wěn)定劑)。因此，在優(yōu)選方面，所述制劑包含穩(wěn)定劑。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定試劑”是指改善或者說(shuō)是增強(qiáng)所述制劑、特別是CD-RAP蛋白的穩(wěn)定性的試劑。穩(wěn)定試劑可以為二糖、糖醇、金屬螯合劑或金屬螯合劑的組合、自由基清除劑或它們的組合。·優(yōu)選地，用作穩(wěn)定試劑的二糖可以為非還原糖，例如蔗糖、海藻糖或甘露醇。在某些實(shí)施方案中，二糖在所述組合物中的濃度選自下述范圍0. 5至5%、0. 5至4%、0. 5至3%、O. 5 至 2. 5%、0· 5 至 2%、0· 5 至 I. 5%、0· 5 至 I %、I 至 I. 5%、I. 5 至 2%、2 至 2. 5%、2· 5 至 3%、3至4%、4至5%或超過(guò)5% (w/v)。在具體實(shí)施方案中，二糖在所述組合物中的濃度為約O. 5至5%，例如約O. 5至2. 0% (w/v)。應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中的優(yōu)選穩(wěn)定劑為蔗糖(優(yōu)選為5. 0%)或甘露醇(優(yōu)選為5. 0% (w/v))。所述穩(wěn)定試劑還可以為糖醇，例如乙二醇、甘油、赤蘚醇、蘇糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露醇、山梨糖醇、衛(wèi)矛醇、艾杜糖醇、異麥芽、麥芽糖醇、乳糖醇或氫化葡萄糖(polyglycitol)。另一種穩(wěn)定劑可以為金屬螯合劑或金屬螯合劑的組合。在具體實(shí)施方案中，所述金屬螯合劑為DTPA、EGTA和DEF。在一些實(shí)施方案中，DTPA或EGTA在所述蛋白質(zhì)制劑中的濃度為約I μ M至約10 mM、約I μΜ至約5mM、約10 μΜ至約10mM、50 μΜ至約5mM、或約75 μΜ至約2.5mM。在一些實(shí)施方案中，DEF在所述蛋白質(zhì)制劑中的濃度為約I μΜ至約10 mM、約I μ M至約5 mM、約10 μ M至約I mM、或約20 μ M至約250 μ Μ。所述穩(wěn)定劑還可以為自由基清除劑，特別是氧自由基的清除劑。在具體實(shí)施方案中，所述自由基清除劑為甘露醇或組氨酸。在一些實(shí)施方案中，甘露醇在所述蛋白質(zhì)制劑中的濃度為約0. 01%至約5%、約0. 1%至約5%、約0. 5%至約5%、或約1%至約5%。在其它實(shí)施方案中，減少蛋白質(zhì)在所述制劑中的聚集的試劑為金屬螯合劑和自由基清除劑的組合。在一些實(shí)施方案中，減少蛋白質(zhì)在所述制劑中的聚集的試劑為檸檬酸鹽。在某些實(shí)施方案中，檸檬酸鹽在所述蛋白質(zhì)制劑中的濃度為約0.5 mM至約50 mM、約0. 5 mM至約25 mM、約I mM至約35 mM、約5 mM至約25 mM、或約5 mM至約10 mM。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文描述的制劑包含賦形劑。優(yōu)選地，所述賦形劑選自冷凍保護(hù)劑、凍干保護(hù)劑、表面活性劑、增量劑、抗氧化劑以及它們的組合?？梢詫①x形劑加入到本發(fā)明的制劑中，所述賦形劑也被稱為化學(xué)添加劑、共溶質(zhì)、或共溶劑，其優(yōu)選使CD-RAP多肽在溶液中(還以干燥或冷凍形式)穩(wěn)定。優(yōu)選地，賦形劑有助于所述CD-RAP蛋白的穩(wěn)定性，但是應(yīng)該理解的是，賦形劑另外可以有助于所述制劑的物理、化學(xué)、和生物特性。賦形劑為本領(lǐng)域熟知的，通過(guò)已知方法制造且可從商業(yè)供應(yīng)商得到。賦形劑的實(shí)例包括但不限于糖/多元醇，例如蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麥芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，例如血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、人SA或重組HA)、葡聚糖、PVA、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚乙烯亞胺、明膠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羥乙基纖維素(HEC)、羥乙基淀粉(HES);非水性溶劑，例如多元醇(例如，PEG、乙二醇和甘油)、二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF);氨基酸，例如脯氨酸、L-絲氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、鹽酸賴氨酸、肌氨酸和Y-氨基丁酸；表面活性劑，例如Tween-80、Tween-20、SDS、聚山梨醇酯、聚氧乙烯共聚物；和各種賦形劑,例如磷酸鉀、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、三甲基胺N-氧化物、甜菜堿、金屬離子(例如，鋅、銅、鈣、錳、和鎂)、CHAPS、單月桂酸鹽、2-0-β-單甘油酸鹽或上述的任何組合。在某些實(shí)施方案中，表面活性劑在所述制劑中的濃度為O. 001至5. 0%、0· 001至2. 5%、0· 001至1%、0· 001至O. 5%、0· 001 至 O. 2%、0· 001 至 O. 1%、0· 001 至 O. 05%、O. 001 至 O. 01%、或 O. 001 至 O. 005%/重量?！袄鋬霰Ｗo(hù)劑”包括給冷凍的蛋白質(zhì)提供生產(chǎn)、冷凍、儲(chǔ)存、操作、分配、重構(gòu)、或使用期間的穩(wěn)定性的物質(zhì)。在特定方面，“冷凍保護(hù)劑”包括保護(hù)蛋白質(zhì)免于由冷凍過(guò)程導(dǎo)致的應(yīng)力影響的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑可以具有凍干保護(hù)劑作用。冷凍保護(hù)劑的非限制性實(shí)例包括糖，例如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露醇、和乳糖；聚合物，例如葡聚糖、羥乙基淀粉和聚乙二醇；表面活性劑，例如聚山梨醇酯(例如，PS-20或PS-80);和氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、和絲氨酸。通常使用在生物體系中顯示具有低毒性的冷凍保護(hù)劑。加入冷凍保護(hù)劑(如果被包括在所述制劑中的話)至約1%至約10% (w/v)的終濃度，優(yōu)選至下述終濃度:0· 5 至 8% (w/V)、0· 5 至 6% (w/V)、0· 5 至 8% (w/ν)、0· 5 至 5% (w/v)、I 至 8% (w/v)、I 至 6% (w/v)、I 至 8% (w/v)、I 至 5% (w/v)、I. 5 至 8% (w/v)、I. 5 至 6% (w/v)、I. 5 至 8%(w/v)、I. 5 至 5% (w/v)、2 至 8% (w/v)、2 至 6% (w/v)、2 至 8% (w/v)、2 至 5. 5% (w/v)。如本文描述的二糖可以起凍干保護(hù)劑或冷凍保護(hù)劑的作用。“凍干保護(hù)劑”包括預(yù)防或減少蛋白質(zhì)凍干和后續(xù)儲(chǔ)存后的化學(xué)或物理不穩(wěn)定性的物質(zhì)。在一個(gè)方面，隨著在干燥過(guò)程中從組合物中去除水，所述凍干保護(hù)劑預(yù)防或減少蛋白質(zhì)的化學(xué)或物理不穩(wěn)定性。在其它方面，所述凍干保護(hù)劑通過(guò)經(jīng)氫鍵幫助維持蛋白質(zhì)的適當(dāng)構(gòu)象來(lái)使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。因此，在一個(gè)方面，如本文描述的二糖可以用于使所述CD-RAP蛋白在冷凍期間穩(wěn) 定。因?yàn)槔鋬銎陂g的保護(hù)可取決于所述二糖的絕對(duì)濃度(Carpenter等人，Pharm. Res.(1997)，14:969-975)，因此大于5%的濃度可能是使穩(wěn)定性最大化所必需的。在一個(gè)方面，所述二糖使CD-RAP蛋白在干燥期間穩(wěn)定。干燥期間的保護(hù)可以取決于所述二糖和蛋白質(zhì)之間的最終質(zhì)量比。Carpenter等人，Pharmaceutical Research14:969-975 (1997)。因此，在一些實(shí)施方案中，選擇二糖的濃度以實(shí)現(xiàn)二糖與蛋白質(zhì)的所需質(zhì)量比，通常為至少I: I。在一些實(shí)施方案中，二糖蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為約5:1使穩(wěn)定性為最優(yōu)的。在其它實(shí)施方案中，二糖蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、或大于 1000:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，將凍干保護(hù)劑加入到本文描述的制劑中。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“凍干保護(hù)劑”包括給蛋白質(zhì)提供冷凍-干燥或脫水過(guò)程中的穩(wěn)定性的試劑(第一和第二冷凍-干燥循環(huán))，其通常提供無(wú)定形玻璃基質(zhì)和通過(guò)氫鍵結(jié)合蛋白質(zhì)、替代在干燥過(guò)程中去除的水分子。這幫助維持蛋白質(zhì)構(gòu)象、使凍干循環(huán)期間的蛋白質(zhì)降解最小化、和改善長(zhǎng)期產(chǎn)品穩(wěn)定性。以“凍干保護(hù)量”將凍干保護(hù)劑加入到預(yù)凍干制劑中，所述“凍干保護(hù)量”表示，在凍干保護(hù)量的凍干保護(hù)劑存在下凍干所述CD-RAP蛋白之后，所述蛋白質(zhì)在凍干和儲(chǔ)存后基本上保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性以及完整性。凍干保護(hù)劑的非限制性實(shí)例包括糖，例如蔗糖或海藻糖；氨基酸，例如谷氨酸一鈉、甘氨酸或組氨酸；甲基胺，例如甜菜堿；易溶鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三元或更高糖醇，例如阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、和甘露醇；聚乙二醇；普流羅尼(pluixmics)以及它們的組合。加入到制劑中的凍干保護(hù)劑的量通常為這樣的量當(dāng)凍干所述蛋白質(zhì)制劑時(shí)，所述量不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不可接受量的降解/聚集。在所述凍干保護(hù)劑為糖(例如蔗糖或海藻糖)并且所述蛋白質(zhì)為抗體的情況下，蛋白質(zhì)制劑中凍干保護(hù)劑濃度的非限制性實(shí)例為約10 mM至約400 mM、優(yōu)選為約30 mM至約300 mM、最優(yōu)選為約50 mM至約100 mM。 在某些實(shí)施方案中，表面活性劑可以被包括在所述制劑中。另一種優(yōu)選賦形劑為表面活性劑。術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”通常包括保護(hù)所述⑶-RAP蛋白免于空氣/溶液界面導(dǎo)致的應(yīng)力和溶液/表面導(dǎo)致的應(yīng)力影響的那些試劑。例如表面活性劑可以保護(hù)所述蛋白質(zhì)免于聚集。表面活性劑的實(shí)例包括、但不限于,非離子表面活性劑,例如聚山梨醇酯(例如,聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20);帕洛沙姆(例如，帕洛沙姆188) ;Triton、十二烷基硫酸鈉(SDS ;月桂基硫酸鈉、葡萄糖苷辛基鈉；月桂基磺基甜菜堿、肉豆蘧基-磺基甜菜堿、亞油基-磺基甜菜堿、硬脂基-磺基甜菜堿、月桂基-肌氨酸、肉豆蘧基-肌氨酸、亞油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亞油基-甜菜堿、肉豆蘧基-甜菜堿、十四烷基-甜菜堿、月桂酰胺丙基-甜菜堿、椰油酰胺丙基-甜菜堿、亞油酰胺丙基-甜菜堿、肉豆蘧酰胺丙基-甜菜堿、棕櫚酰胺丙基-甜菜堿、異硬脂酰胺丙基-甜菜堿(例如，月桂酰胺丙基)、肉豆蘧酰胺丙基-二甲基胺、棕櫚酰胺丙基-二甲基胺、或異硬脂酰胺丙基-二甲基胺；甲基椰油?；；撬徕c、或甲基油基牛橫酸二鈉；以及 Monaquat 系列(Mona Industries, Inc. , Paterson, NJ.)、聚乙二醇、聚丙二醇、和乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，普流羅尼、PF68)。加入的表面活性劑的量使得具有以下效果其將重構(gòu)蛋白質(zhì)的聚集維持在可接受的水平(如使用例如用于測(cè)定高分子量(HMW)物質(zhì)或低分子量(LMW)物質(zhì)百分比的SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)定)，并且使本文描述的蛋白質(zhì)制劑的凍干物重構(gòu)后顆粒形成最小化。例如，存在于制劑(液體的，或凍干物重構(gòu)之前)中的表面活性劑的量可以為約O. 001至約O. 5%，例如約O. 05至約O. 3%。應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中的優(yōu)選表面活性劑為聚山梨醇酯20或80。其它優(yōu)選的賦形劑可以為增量劑。即，在本發(fā)明的一個(gè)方面，預(yù)見到本發(fā)明的制劑以大批量制劑制備，由此調(diào)節(jié)所述藥物組合物的組分，以使得其高于給藥所需，并且在給藥之前適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行稀釋。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“增量劑”包括提供冷凍-干燥產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)而不與藥物產(chǎn)品直接反應(yīng)的試劑。除了提供藥學(xué)精致餅劑之外，增量劑還可以賦予關(guān)于下述方面的有用質(zhì)量改變塌縮溫度，提供凍融保護(hù)，和增強(qiáng)經(jīng)長(zhǎng)期儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。增量劑的非限制性實(shí)例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖、和蔗糖，增量劑可以為晶體的(例如甘氨酸、甘露醇、或氯化鈉)或無(wú)定形的(例如葡聚糖、羥乙基淀粉)，并且通常以O(shè). 5%至10%的量用于蛋白質(zhì)制劑中。優(yōu)選地，應(yīng)用于本發(fā)明的制劑中的增量劑促進(jìn)形成美學(xué)上可接受的、均一的或機(jī)械上強(qiáng)的餅劑。增量劑還優(yōu)選促進(jìn)形成開孔結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)重構(gòu)的容易性和速度。增量劑同樣優(yōu)選減少或防止餅劑塌縮、共晶熔化或保持殘留水分。另一方面，增量劑優(yōu)選幫助保護(hù)所述CD-RAP蛋白免于應(yīng)力(例如物理和化學(xué)應(yīng)力)影響，并且?guī)椭S持蛋白質(zhì)活性。在某些實(shí)施方案中，增量劑在所述組合物中的濃度選自下述范圍1至10%、I至8%、I 至 5%、2 至 8%、2 至 6%、2，5 至 6%、0· 5 至 1%、I 至 I. 5%、I. 5 至 2%、2 至 2. 5%、2· 5 至 3%、3 至 3. 5%、3· 5 至 4%、4 至 4. 5%、4· 5 至 5%、超過(guò) 5%、0· 5 至 5%、0· 5 至 4%、0· 5 至 3%、0· 5 至
2.5%、0. 5至2%、0. 5至I. 5%、或O. 5至1%。在某些實(shí)施方案中，增量劑在所述組合物中的濃度為O. 5至5%，例如O. 5至3%，甚至更精確地為I. 8至2%。另一種優(yōu)選的賦形劑可以為抗氧化劑。如本文所用，“抗氧化劑”為能夠減慢或預(yù)防其它分子氧化的分子。氧化為將電子從某物質(zhì)轉(zhuǎn)移至氧化試劑的化學(xué)反應(yīng)。對(duì)于用于本發(fā)明的方法，生理上可接受的抗氧化劑是感興趣的。此類抗氧化劑包括、但不限于，還原劑、抗壞血酸(維生素C)、硫辛酸、褪黑激素、尿酸、胡蘿卜素、視黃醇、生育酚和生育三烯酸例如α -生育酚(維生素Ε)、泛醌(輔酶Q)等。 在一些實(shí)施方案中，所述制劑可以任選地含有防腐劑?！胺栏瘎睘榭梢约尤氲奖疚牡闹苿┲幸詼p少細(xì)菌活性的化合物。加入防腐劑可以例如有利于生產(chǎn)多用途(多劑)制齊U?？赡艿姆栏瘎┑膶?shí)例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六烴季銨、苯扎氯銨(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基為長(zhǎng)鏈化合物)、和芐索氯銨。其它類型的防腐劑包括芳族醇，例如酚、丁基和芐基醇、對(duì)羥基苯甲酸烷基酯例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇、和間甲酚。本文最優(yōu)選的防腐劑為芐基醇。所附實(shí)施例(參見實(shí)施例3和4)證明(還參見圖6、7、10和11)，所測(cè)試制劑(除50mM磷酸鉀/5%蔗糖和150 mM甘氨酸pH 6. O中的⑶-RAP之外)的冷凍融化循環(huán)對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性沒有影響。在后一情況下，可見第三次凍/融循環(huán)后CD-RAP的濃度顯著降低。然而，在全部其它制劑中，在每一個(gè)冷凍循環(huán)之后溶液為澄清的。與通過(guò)UV/Vis對(duì)rhCD-RAP進(jìn)行定量的結(jié)果相組合，這解決了本發(fā)明的問(wèn)題，從而得到高濃度rhCD-RAP的適合條件。因此，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑為液體的、優(yōu)選水性的制劑，所述制劑包含至少5、10、15、20、25或30 mg/mL⑶-RAP和緩沖劑以及氨基酸，所述緩沖劑選自磷酸鉀或磷酸鈉、TRIS、組氨酸、精氨酸和谷氨酸鹽緩沖劑，所述氨基酸選自天冬酸鹽、谷氨酸鹽(優(yōu)選谷氨酸鹽磷酸鹽)、精氨酸(優(yōu)選精氨酸磷酸鹽或精氨酸鹽酸鹽)、組氨酸(優(yōu)選組氨酸鹽酸鹽或組氨酸磷酸鹽)、賴氨酸和甘氨酸。優(yōu)選地，存在于所述制劑中的谷氨酸鹽、天冬酸鹽、精氨酸、組氨酸、賴氨酸和甘氨酸的量為2. 5% (w/v)。優(yōu)選地，選擇所述緩沖劑和所述氨基酸以使得它們給所述CD-RAP蛋白提供經(jīng)過(guò)5個(gè)凍/融循環(huán)(5° C至-25° C，冷卻和加熱速率I. O ° C/min，其中各循環(huán)之間的等溫步驟為15 min)的穩(wěn)定性。因此，在具體優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑為液體的、優(yōu)選水性的制劑，所述制劑包含至少30 mg/mL CD-RAP和50 mM TRIS氯化物以及2. 5%谷氨酸鹽；50 mM組氨酸和2. 5% (w/v)甘氨酸、2. 5% (w/v)谷氨酸鹽(w/v)或2. 5%賴氨酸(w/v) ；300 mM組氨酸鹽酸鹽pH 6.0 ;50、100、200或300 mM組氨酸磷酸鹽pH 6.0 ；350 mM精氨酸鹽酸鹽pH 6.0 ；350mM精氨酸磷酸鹽pH 6. O ；350 mM精氨酸磷酸鹽pH 7. 4;或300 mM谷氨酸鉀pH 6. O。這些制劑可以任選地包含如本文描述的穩(wěn)定劑、張力調(diào)節(jié)劑和/或賦形劑。應(yīng)該理解的是，所述組合物中的某些組分可以與本領(lǐng)域已知的備選物互換。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，加入某些組分會(huì)排除其它組分、濃度、或制劑制備方法的使用，其原因包括、但不限于，化學(xué)相容性、pH、張力、和穩(wěn)定性。如本文所述，此應(yīng)用通常涉及下述發(fā)現(xiàn)將帶電荷的氨基酸加入到制劑中可以減少高濃度CD-RAP蛋白在制劑中的聚集。無(wú)論造成高濃度CD-RAP蛋白在制劑中聚集的原因如何，加入如本文描述的帶電荷的氨基酸或帶電荷的氨基酸的組合，減少CD-RAP蛋白在所述制劑中的聚集。在某些實(shí)施方案中，加入帶電荷的氨基酸減少由例如儲(chǔ)存、暴露于高溫、暴露于光、暴露于剪切應(yīng)力、存在表面活性剤、PH和離子條件以及它們的組合導(dǎo)致的制劑中的聚集。由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的此方法可以用于減少配制的CD-RAP蛋白(尤其以液體形式)的聚集。因而優(yōu)選在液體制劑中觀察到聚集減少。估計(jì)，當(dāng)直接以液體形式儲(chǔ)存以用于之后使用、以冷凍狀態(tài)儲(chǔ)存并在使用之前融化、或以干燥形式(例如凍干的、風(fēng)干的、或噴霧-干燥形式)制備以之后重構(gòu)成液體形式或其它形式然后使用吋，也可以觀察到聚集減少。
因而，預(yù)見到可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法儲(chǔ)存本文描述的制劑。非限制性實(shí)例包括冷凍、凍干、和噴霧干燥所述制劑。在一些情況下，所述蛋白質(zhì)制劑為冷凍的以進(jìn)行儲(chǔ)存。因此，理想的是，所述制劑在此類條件下、包括在凍融循環(huán)下為相對(duì)穩(wěn)定的。確定制劑的合適性的ー種方法為，將樣品制劑進(jìn)行至少2個(gè)、例如3至10個(gè)冷凍和融化循環(huán)(例如通過(guò)在室溫下快速融化或在冰上緩慢融化)，測(cè)定在凍融循環(huán)之后累積的低分子量(LMW)物質(zhì)和/或高分子量(HMW)物質(zhì)的量，然后將其與在凍融程序之前樣品中存在的LMW物質(zhì)或HMW物質(zhì)的量進(jìn)行比較。LMW或HMW物質(zhì)的增加指示作為所述制劑的一部分儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低?？梢詫⒊叽缗抛韪咝б合嗌V(SEC-HPLC)用于測(cè)定LMW和HMW物質(zhì)的存在。在一些情況下，所述蛋白質(zhì)制劑可以作為液體儲(chǔ)存。因此，如本文描述的，理想的是所述液體制劑在此類條件下、包括在各種溫度下為穩(wěn)定的。例如，確定制劑的合適性的一種方法為將所述樣品制劑儲(chǔ)存于若干溫度(例如2-8、15、20、25、30、35、40、和50° C)下，然后檢測(cè)隨時(shí)間變化累積的HMW和/或LMW物質(zhì)的量。隨時(shí)間變化累積的HMW和/或LMW物質(zhì)的量越少，用于所述制劑的儲(chǔ)存條件越好。另外，可以通過(guò)陽(yáng)離子交換-高效液相色譜(CEX-HPLC)檢測(cè)所述蛋白質(zhì)的電荷情況?；蛘撸梢栽趦龈芍髢?chǔ)存制劑。術(shù)語(yǔ)“凍干的”或“冷凍-干燥的”包括已進(jìn)行干燥程序例如凍干的物質(zhì)的狀態(tài)，其中已去除至少90%、優(yōu)選95%、最優(yōu)選98%的水分。因此，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“凍干”是指這樣的過(guò)程通過(guò)所述過(guò)程，首先冷凍要被干燥的物質(zhì)，然后通過(guò)在真空環(huán)境下升華去除冰凍或冷凍的溶剤。可以將賦形劑(例如，凍干保護(hù)劑)包括在要被凍干的制劑，從而增強(qiáng)凍干產(chǎn)品經(jīng)儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“重構(gòu)的制劑”是指通過(guò)下述方式制備的制劑在稀釋劑中溶解凍干的蛋白質(zhì)制劑以使得蛋白質(zhì)分散在所述稀釋劑中。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“稀釋劑”為藥學(xué)上可接受的(對(duì)于施用給人而言安全且無(wú)毒的)且可用于制備液體制劑的物質(zhì)，所述液體制劑例如凍干之后重構(gòu)的制劑。稀釋劑的非限制性實(shí)例包括無(wú)菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)、無(wú)菌鹽水溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液、或鹽和/或緩沖劑的水性溶液。針對(duì)制劑測(cè)試所述制劑的蛋白質(zhì)組分在凍干之后的穩(wěn)定性，可用于確定制劑的適合性。所述方法類似于上文針對(duì)冷凍描述的方法，不同之處在于所述樣品制劑為凍干的，而非冷凍的，使用稀釋劑重構(gòu)，然后測(cè)試重構(gòu)制劑的LMW物質(zhì)和/或HMW物質(zhì)的存在。相比于未凍干的對(duì)應(yīng)樣品制劑，LMW或HMW物質(zhì)在凍干樣品中的増加指示所述凍干樣品的穩(wěn)定性下降。在一些情況下，將制劑噴霧-干燥，然后儲(chǔ)存。對(duì)于噴霧-干燥，在干燥氣體流的存在下將液體制劑煙霧化。將水從制劑小滴中去除到氣流中，從而得到藥物制劑的干燥顆粒。所述制劑中可以包括賦形劑，以(i)在噴霧-干燥脫水期間保護(hù)蛋白質(zhì)，(ii)在噴霧-干燥之后的儲(chǔ)存期間保護(hù)蛋白質(zhì)，和/或iii)孵育適于煙霧化的溶液特性。所述方法類似于上文針對(duì)冷凍描述的方法，不同之處在于所述樣品制劑為噴霧-干燥的，而非冷凍的，在稀釋劑中重構(gòu)，然后測(cè)試重構(gòu)制劑的LMW物質(zhì)和/或HMW物質(zhì)的存在。相比于未凍干的對(duì)應(yīng)樣品制劑，LMW或HMW物質(zhì)在噴霧-干燥樣品中的増加指示所述噴霧-干燥樣品的穩(wěn)定性下降。 通常通過(guò)加入水性溶液以溶解凍干制劑，而重構(gòu)所述凍干制劑以進(jìn)行使用?？梢詫⒍喾N水性溶液用于重構(gòu)凍干制劑。優(yōu)選地，使用水來(lái)重構(gòu)凍干制劑。優(yōu)選用基本上由水組成的溶液(例如，USP WFI、或注射用水(WFI))或抑菌水(例如，具有0.9%芐基醇的USP WFI)來(lái)重構(gòu)凍干制劑。然而，還可以使用包含緩沖劑和/或賦形劑和/或一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的溶液。通常由液體制備冷凍-干燥制劑或凍干制劑，所述液體為溶液、懸浮液、乳液等。因而，要進(jìn)行冷凍-干燥或凍干的液體優(yōu)選包含最后重構(gòu)液體制劑中期望的全部組分。因此，當(dāng)重構(gòu)時(shí)，所述冷凍-干燥制劑或凍干制劑將經(jīng)重構(gòu)后得到期望的液體制劑。在本發(fā)明的另一方面，預(yù)見到所述制劑用于治療。因此，本發(fā)明預(yù)見到包含本文描述的制劑的藥物組合物(或藥物)。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療受試者的方法，所述方法包括施用治療有效量的本文描述的制劑，其中所述受試者具有可以有益地用CD-RAP多肽進(jìn)行治療的疾病或障礙。優(yōu)選地，在預(yù)防和/或治療可以用CD-RAP預(yù)防和/或治療的疾病時(shí)應(yīng)用本文描述的制劑。術(shù)語(yǔ)“受試者”預(yù)期包括活生物體。受試者的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物，例如，人、狗、牛、馬、豬、綿羊，山羊、貓、小鼠，兔、大鼠、轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述受試者為人。術(shù)語(yǔ)“有效劑量”定義為足以實(shí)現(xiàn)或至少部分實(shí)現(xiàn)所需效果的量。術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”定義為足以治愈或至少部分制止已經(jīng)患有疾病的受試者的所述疾病及其并發(fā)癥。有效用于此用途的量將取決于感染的嚴(yán)重性和受試者自身免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)。術(shù)語(yǔ)“患者”包括接受預(yù)防性或治療性處理的人和其它哺乳動(dòng)物受試者。所述制劑的合適劑量或治療有效量將取決于要治療的病癥、病癥的嚴(yán)重性、之前的治療、和患者的臨床史以及對(duì)于治療試劑的反應(yīng)。可以根據(jù)臨床醫(yī)師的判斷調(diào)節(jié)合適的劑量，以使得可以一次或經(jīng)過(guò)一系列給藥將所述合適的劑量施用給患者?？梢宰鳛槲ㄒ坏闹委焺┗蛘吒鶕?jù)需要與另外的療法組合，將所述藥物組合物進(jìn)行給藥。本發(fā)明的藥物組合物特別可用于腸胃外給藥，S卩，皮下地、肌肉內(nèi)地、靜脈內(nèi)地、關(guān)節(jié)內(nèi)地和/或滑膜內(nèi)地給藥。腸胃外給藥可以通過(guò)弾丸注射或連續(xù)輸注。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述注射為局部或全身注射，優(yōu)選地進(jìn)入滑膜、滑膜空間、滑液、或進(jìn)入優(yōu)選膝、肩、髖、拇指、顳頜關(guān)節(jié)或小關(guān)節(jié)的滑膜關(guān)節(jié)、軟骨下區(qū)、骨軟骨缺損、關(guān)節(jié)內(nèi)空間，纖維環(huán)、髓核、髓核空間，間盤內(nèi)地或間盤間地。更優(yōu)選地，所述注射為關(guān)節(jié)內(nèi)注射，優(yōu)選進(jìn)入膝、肩、髖、拇指、顳頜關(guān)節(jié)或小關(guān)節(jié)。更優(yōu)選地，所述關(guān)節(jié)內(nèi)注射為關(guān)節(jié)內(nèi)注射進(jìn)入小關(guān)節(jié)或顳頜關(guān)節(jié)的滑液中。進(jìn)ー步優(yōu)選的注射為進(jìn)入滑膜下室或區(qū)域的注射，或者為進(jìn)入軟骨或骨軟骨缺損的注射。還涵蓋了在用膜閉合缺損之前或之后進(jìn)入軟骨或骨軟骨缺損的注射。所述膜可以為、但不限于骨膜或膠原膜。在另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述膜為包含I型膠原、III型膠原、豬或大鼠I型或III型膠原、透明質(zhì)酸或其衍生物的膜。在注射所述制劑之前閉合該缺損的優(yōu)點(diǎn)在于減少所述制劑的稀釋，或提高所述制劑的活性成分的局部濃度。所述膜進(jìn)一歩起用于附著細(xì)胞的生物粘合劑的作用。如果所述蛋白質(zhì)制劑已被凍干，在給藥之前，首先將凍干物質(zhì)在合適的液體中重構(gòu)。凍干物質(zhì)可以在例如抑菌性注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、水性溶液、或所述蛋白質(zhì)在凍干之前所在的相同制劑中重構(gòu)。用于注射的藥物組合物可以以添加有防腐劑的單位劑型存在，例如在安瓿或多 劑量容器中。此外，已經(jīng)開發(fā)了多種新藥物遞送方法，本發(fā)明的藥物組合物適于使用這些新方法給藥，所述新方法例如Inject-ease、Genject、注射筆例如Genen和無(wú)針裝置例如MediJector和Biojector。本發(fā)明的藥物組合物還可以適于尚未發(fā)現(xiàn)的給藥方法。還參見Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533。所述藥物組合物還可以配制為儲(chǔ)庫(kù)制備物(depot preparation)。此類長(zhǎng)效制劑可以通過(guò)植入(例如皮下地、進(jìn)入韌帶或腱、滑膜下地或肌肉內(nèi)地)、通過(guò)滑膜下注射或通過(guò)肌肉內(nèi)注射施用。因而，例如，所述制劑可以用適合的聚合物或疏水物質(zhì)改性(例如作為在可接受的油中的乳液)或用離子交換樹脂改性或作為難溶衍生物，例如難溶鹽。所述藥物組合物還可以為多種常規(guī)儲(chǔ)庫(kù)形式，采用所述形式給藥以提供活性組合物。這些包括，例如，固體、半固體和液體劑型，例如液體溶液或懸浮液、漿劑、凝膠、霜?jiǎng)?、油劑、乳液、洗液、粉末、噴劑、泡沫、糊劑、膏劑、油膏、軟膏劑和滴劑。如果需要，所述藥物組合物可以存在于小瓶、包裝或分配裝置中，所述小瓶、包裝或分配裝置可含有ー個(gè)或多個(gè)含活性成分的單位劑型中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分配裝置可以包括具有準(zhǔn)備用于注射的單個(gè)劑量的液體制劑的注射器。所述注射器可以伴有給藥說(shuō)明。所述藥物組合物還可以包含其它藥學(xué)上可接受的組分。其它藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑，例如描述于Remington 的Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol, A. Ed. (1980)中的那些，也可以被包括在本文描述的蛋白質(zhì)制劑中，條件是它們不會(huì)不利地影響所述制劑的所需特性。如本文所用“藥學(xué)上可接受的載體”表示與藥物給藥相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑。用于藥物活性物質(zhì)的此類介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域熟知的。在采用的劑量和濃度下的可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑對(duì)受體是無(wú)毒的，并且包括另外的緩沖劑、防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑，例如EDTA ;金屬絡(luò)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物);可生物降解的聚合物，例如聚酯；成鹽反離子，例如鈉、多元糖醇；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯基丙氨酸、和蘇氨酸；糖或糖醇，例如乳糖醇、水蘇糖、甘露醇、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環(huán)多醇(例如，肌醇)、聚こ二醇；含硫還原劑，例如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代こ醇酸鈉、硫代甘油、[a]-單硫代甘油、和硫代硫酸鈉；低分子量蛋白，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠、或其它免疫球蛋白；和親水聚合物，例如聚こ烯吡咯烷酮。在治療和/或預(yù)防有此需要的患者的疾病或障礙時(shí)，本文描述的制劑可用作藥物組合物。術(shù)語(yǔ)“治療”是指治療性處理和預(yù)防性或防止性方法。治療包括將所述制劑應(yīng)用或施用至身體、分離的組織或來(lái)自具有疾病/障礙、疾病/障礙的癥狀、或疾病/障礙的傾向的患者的細(xì)胞，其目的為治愈、恢復(fù)、緩和、緩解、改變、治療、減輕、改善、影響所述疾病、所述疾病的癥狀、或所述疾病的傾向。那些“有治療需要”包括已具有障礙的那些以及要預(yù)防障礙的那些。術(shù)語(yǔ)“障礙”為將受益于用本文描述的蛋白質(zhì)制劑治療的任何病癥。這包括慢性和急性障礙或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易于患有目標(biāo)障礙的那些病理病癥。本文要治療的障礙的非限制性實(shí)例包括退行性疾病、骨和/或軟骨和/或關(guān)節(jié)軟骨缺損、免疫學(xué)疾病(優(yōu)選關(guān)節(jié)、骨或軟骨組織的慢性炎癥，例如關(guān)節(jié)炎(包括但不限于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎))和脊柱障礙例如退行性椎間盤疾病。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脊柱障礙為特發(fā)性腰痛、椎間盤突出、椎間盤內(nèi)破裂或椎間盤裂縫、神經(jīng)根病、椎管狹窄、髓核突出誘發(fā)的坐骨神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、特發(fā)性脊椎側(cè)彎或脊椎病。術(shù)語(yǔ)“退行性疾病”表示具有受損軟骨結(jié)構(gòu)的疾病或缺損，例如涉及或不涉及骨骼結(jié)構(gòu)的軟骨退變或破壞。優(yōu)選地，退行性疾病為退行性軟骨疾病。這些包括頜顳關(guān)節(jié)障礙(TMD)、髖臼春障礙、關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān) 節(jié)炎、rhizomelic pseudoarthritis、類風(fēng)濕性多關(guān)節(jié)炎、退行性椎間盤疾病、軟骨或骨軟骨缺損、局灶性軟骨缺損、局灶性骨軟骨缺損、表層軟骨缺損、剝脫性骨軟骨炎、全層軟骨缺損、半層軟骨缺損、軟骨軟化癥，與膝關(guān)節(jié)內(nèi)和周圍的腱和韌帶相關(guān)的創(chuàng)傷、外側(cè)或內(nèi)側(cè)半月板創(chuàng)傷、半月板撕裂、前十字韌帶損傷、滑膜骨軟骨瘤病、脊椎炎、僵直性脊椎炎、滑膜炎、絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎。
術(shù)語(yǔ)“軟骨缺損”是指任何軟骨異常，包括軟骨疾病、例如由創(chuàng)傷或退行性過(guò)程導(dǎo)致的軟骨改變。術(shù)語(yǔ)“關(guān)節(jié)軟骨”覆蓋關(guān)節(jié)中一部分骨的表面，并且起到兩個(gè)骨自檢的墊的作用，以允許在關(guān)節(jié)內(nèi)移動(dòng)。將正常健康的關(guān)節(jié)軟骨描述為透明軟骨。關(guān)節(jié)軟骨由嵌入到胞內(nèi)物質(zhì)的基質(zhì)中的特化細(xì)胞(軟骨細(xì)胞)組成，所述胞內(nèi)物質(zhì)的基質(zhì)富含蛋白聚糖，主要為蛋白聚糖聚合物、II型膠原纖絲、其它蛋白質(zhì)和水。所述基質(zhì)由嵌入其內(nèi)的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生和維持。軟骨組織不受神經(jīng)支配和血管化，并且由下層組織滋養(yǎng)。除了⑶-RAP蛋白之外，本發(fā)明的藥物組合物可以包含另外的治療劑或生物活性齊U。例如，可以存在可用于治療特定適應(yīng)癥(例如骨關(guān)節(jié)炎)的治療因子，例如涉及于關(guān)節(jié)軟骨或滑膜組分破壞的ー種或多種抑制劑，不限于抗金屬蛋白酶、環(huán)狀化合物、細(xì)胞因子拮抗齊U、皮質(zhì)類固醇、TNF抑制劑、IL-抑制劑、抗血管新生物質(zhì)、聚蛋白多糖抑制劑、P38激酶抑制劑、細(xì)胞凋亡抑制劑、透明質(zhì)酸酶抑制劑和蛋白水解酶的抑制劑?？刂蒲装Y的因子可以為所述組合物的一部分，所述因子包括英夫利西單抗、依那西普、阿達(dá)木單抗、nerelimonmab、來(lái)納西普等或它們的組合。還預(yù)見到，藥物脂質(zhì)體組合物可以包括胞外基質(zhì)組分，例如透明質(zhì)酸或其衍生物，包括鹽、酷、內(nèi)酯和硫化衍生物，優(yōu)選透明質(zhì)酸的偏酷。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及試劑盒(制造制品)或容器，其含有本發(fā)明的制齊U。所述制劑可以優(yōu)選地已經(jīng)是液體狀態(tài)。然而，或者，其可以優(yōu)選為凍干狀態(tài)。其還可以為冷凍的、凍干的、冷凍-干燥的或噴霧-干燥的狀態(tài)。因此，如果所述制劑為不是液體的狀態(tài)，其可以被從業(yè)者制備成(液體)水性藥物組合物。例如，所述制劑可以為凍干的，因此需要進(jìn)行重構(gòu)。因此，所述試劑盒還可以包括分別用于重構(gòu)冷凍的、凍干的、冷凍-干燥的或噴霧-干燥的制劑的手段和/或用于稀釋所述制劑的手段和/或用于施用所述制劑或藥物組合物的手段。所述試劑盒還可以伴有使用說(shuō)明。因而，提供了制造制品，其含有本文描述的制劑，并且優(yōu)選地其提供使用說(shuō)明。所述制造制品包括適于含有所述制劑的容器。適合的容器包括、但不限于，瓶、小瓶(例如，雙室小瓶)、注射器(例如，單或雙室注射器)、測(cè)試管、噴霧器、吸入器(例如，計(jì)量劑量的吸入器或干粉吸入器)或儲(chǔ)藥罐(depot)。所述容器可以由各種材料形成，所述材料例如玻璃、金屬或塑料(聚碳酸酷、聚苯こ烯、聚丙烯、多烯烴)。所述容器容納該制劑，并且所述容器上 或與所述容器相關(guān)的標(biāo)簽可以指示重構(gòu)和/或使用說(shuō)明。所述標(biāo)簽還可以指示該制劑可用于或預(yù)期用于皮下給藥。容納制劑的所述容器可以為多用途小瓶，其允許制劑的重復(fù)給藥(例如，1-6次給藥)。所述制造制品還可以包括包含適合的稀釋劑(例如，WFI、0. 9% NaCl,BWFI、磷酸鹽緩沖鹽水)的第二容器。當(dāng)所述制造制品包含凍干形式的蛋白質(zhì)制劑時(shí)，將稀釋劑與所述凍干制劑混合將得到重構(gòu)制劑中通常至少20 mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度。所述制造制品還可以包括出于商業(yè)和用戶角度有利的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭、注射器、和具有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，提供了制造制品，其含有本發(fā)明的水性制劑并提供了其使用說(shuō)明。所述制造制品包括容器。適合的容器包括例如，瓶、小瓶(例如，雙室小瓶)、注射器(例如，雙室注射器)、含有注射器的自動(dòng)注射筆、和測(cè)試管。所述容器可以由各種材料形成，所述材料例如玻璃、塑料或聚碳酸酷。所述容器容納該水性制劑，并且所述容器上或與所述容器相關(guān)的標(biāo)簽可以指示使用說(shuō)明。例如，所述標(biāo)簽可以指示該制劑可用于或預(yù)期用于皮下給藥。容納制劑的所述容器可以為多用途小瓶，其允許該水性制劑的重復(fù)給藥(例如，1-6次給藥)。所述制造制品還可以包括第二容器。所述制造制品還可以包括出于商業(yè)和用戶角度有利的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭、注射器、和具有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。本發(fā)明中還包括可用于遞送本發(fā)明的制劑的裝置。此類裝置的實(shí)例包括、但不限于，注射器、筆、植入器、無(wú)針頭注射裝置、吸入裝置和貼劑。通過(guò)附圖和實(shí)施例進(jìn)ー步示例了本發(fā)明，所述附圖和實(shí)施例僅為示例性的，且不被理解為限制本發(fā)明的范圍。所述附圖示出圖I :影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素。圖2 :可以采取的使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的示例性方法。圖3 :rh⑶-RAP在磷酸鉀中的連續(xù)濃度。圖4 :rh⑶-RAP在TRIS氯化物中的連續(xù)濃度。圖5 :rh⑶-RAP在組氨酸鹽酸鹽中的連續(xù)濃度。圖6 :高濃度rh⑶-RAP在不同緩沖體系中的穩(wěn)定性。圖7 :高濃度rh⑶-RAP在不同緩沖體系中的穩(wěn)定性。
圖8 :不同pH值下甘氨酸和rh⑶-RAP的凈電荷。圖9 :pH對(duì)rh⑶-RAP在150 mM甘氨酸中的溶解度的作用。

圖10 :組氨酸磷酸鹽摩爾濃度對(duì)rh⑶-RAP的溶解度的作用。圖11 :組氨酸磷酸鹽(調(diào)節(jié)成具有氯化鉀的等滲的重量滲克分子濃度)對(duì)rhCD-RAP溶解度的作用。請(qǐng)注意在圖3-11中，添加于柱狀例的編號(hào)屬于所述圖中所示的每個(gè)“塊”的柱條(從左至右)。例如，“0”屬于最左邊的柱條，“I”屬于與標(biāo)注“0”的柱條相鄰的柱條，等
坐寸o下述實(shí)施例示例了本發(fā)明。基于本發(fā)明人以高濃度CD-RAP的穩(wěn)定制劑為目標(biāo)、從而得到用于患者的較小體積的注射劑(這會(huì)減少由于大體積注射劑導(dǎo)致的副作用，如疼痛)的考慮，測(cè)試了多個(gè)制劑對(duì)CD-RAP蛋白穩(wěn)定化的作用。這些制劑中的一些示例性地示出于下文實(shí)施例中。然而，如本文所述，當(dāng)以本發(fā)明的目的開始時(shí)，發(fā)現(xiàn)滿足所述目的的制劑的適當(dāng)成分屬于經(jīng)驗(yàn)性的工作，原因在于，每個(gè)蛋白質(zhì)具有不同的性質(zhì)，因此，無(wú)法從ー個(gè)實(shí)施例得到哪些成分為適當(dāng)成分的結(jié)論。實(shí)施例I :對(duì)于rh⑶-RAP分析不同緩沖體系用36種緩沖體系透析rhCD-RAP (50 mM氯化鉀、50 mM組氨酸鹽酸鹽或50 mMTRIS氯化物，每個(gè)pH 6.0)，每種緩沖劑加入或未加入下述穩(wěn)定劑中的ー種，所述穩(wěn)定劑選自蔗糖、甘露醇、甘氨酸、賴氨酸和谷氨酸，具有或不具有0. 1% Tween 20。在通過(guò)透析至30 mg/mL的rh⑶-RAP的后續(xù)濃縮過(guò)程期間,用UV/Vis分析過(guò)濾樣品。通過(guò)凍融循環(huán)給穩(wěn)定的制劑施加應(yīng)力。在每個(gè)循環(huán)之后，將所述樣品離心，然后用UV/Vis定量rhCD-RAP。透析在4° C和溫和攪拌下，通過(guò)使用6-8 kDa分子量截留管，用500 mL所需緩沖劑透析2.0 ml的rh⑶-RAP散裝料(pH 7. 4的350 mM精氨酸/磷酸鹽中)，歷時(shí)24小時(shí)。16小時(shí)之后，用500 mL新鮮緩沖劑交換該透析緩沖劑。將所得蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)存于2-8° C下，以用于進(jìn)ー步分析。UV-VIS以13. 000 rcf離心經(jīng)透析的rh⑶-RAP 5分鐘之后，用UV/Vis測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量。對(duì)應(yīng)的樣品緩沖劑用于空白減去。為計(jì)算蛋白質(zhì)濃度[mg/ml],使用280 nm下的吸光度和rhCD-RAP在280 nm下的比吸光系數(shù)[I. 649 mL/ (mg*cm)]。rhCD-RAP-濃度的提高將經(jīng)透析的rh⑶-RAP轉(zhuǎn)移到2 mL離心濃縮機(jī)中。在后續(xù)離心步驟(4000 rcf, 4° C)之后，rh⑶-RAP溶液的體積降低。測(cè)定剩余rh⑶-RAP溶液的體積，然后用UV/Vis定量rhCD-RAP濃度。熱穩(wěn)定性(冷凍/融化-循環(huán))通過(guò)使用深凍機(jī)施加5個(gè)溫度5 ° C至-25 ° C的凍/融循環(huán)，評(píng)估rh⑶-RAP的熱穩(wěn)定性。冷卻和加熱速率為1.0 ° C/min，其中各循環(huán)之間的等溫步驟為15 min。將蛋白質(zhì)溶液儲(chǔ)存于4° C - 8 ° C下，直到分析。將濃度為30 mg/mL的300 W rh⑶-RAP轉(zhuǎn)移到1.5 mL PP小瓶中，然后如上文所述通過(guò)限定的凍融步驟施加應(yīng)力。
實(shí)施例2: rh⑶-RAP在不同緩沖體系中的穩(wěn)定性測(cè)定了實(shí)施例I的全部不同緩沖體系的穩(wěn)定化作用。磷酸鉀緩沖體系將下述物質(zhì)溶解在WFI中至最終重量為I kg得到50 mM的緩沖劑濃度。通過(guò)分別加入KOH和HCl，將pH調(diào)節(jié)至pH 6. O0a) 6，8 g 磷酸鉀、12. 4 g KCl，具有和不具有 I. 0 g Tween 80b)6. 8 g 磷酸鉀、50 g 蔗糖、4. 9 g KC1，具有和不具有 I. 0 g Tween 80c)6. 8 g磷酸鉀、50 g甘露醇，具有和不具有I. 0 g Tween 80 d)6. 8 g磷酸鉀、25 g甘氨酸，具有和不具有I. 0 g Tween 80e)6. 8 g磷酸鉀、25 g谷氨酸，具有和不具有I. 0 g Tween 80f)6. 8 g磷酸鉀、25 g賴氨酸，具有和不具有1.0 g Tween 80g)61. 0 g精氨酸,用磷酸(對(duì)照)調(diào)節(jié)pH 7.4。如果需要,用氯化鉀調(diào)節(jié)300 - 400 mOsm/kg的等滲。姆種緩沖劑的重量滲克分子濃度不于表I。蓋！:磷酸鉀緩沖劑的重量滲克分子濃度
制劑重量滲克分子濃度[mOsm/kg]
50 mM磷酸鉀345
50 mM憐酸鉀+ 5% (w/v)鹿糖34O
50 mM磷酸鉀+ 5% (w/v)甘露醇376
50 mM憐酸鉀+ 2. 5% (w/v)甘氨酸 371 50 mM憐酸鉀+ 2. 5% (w/v)谷氨酸 3M 50 mM憐酸鉀+ 2. 5% (w/v)賴氨酸 3〇2然后基于表I所列的緩沖體系，用磷酸鉀透析rh⑶-RAP，并且在過(guò)濾裝置中通過(guò)離心濃縮。在限定的緩沖劑連續(xù)減少后，測(cè)定維持的蛋白質(zhì)溶液體積，然后用UV/Vis定量rh⑶-RAP濃度。圖3示出了在透析5 mg/mL⑶-RAP溶液之前和之后以及濃縮至10、20和30 mg/mL之后的所得⑶-RAP濃度。所述精氨酸/磷酸鹽緩沖劑用作對(duì)照。如圖3中所示，所述制劑在精氨酸/磷酸鹽緩沖體系中顯示出全部濃縮步驟中的最佳溶解度。甚至在最高濃縮步驟，所測(cè)得的蛋白質(zhì)含量達(dá)到rhCD-RAP的理論含量。因而，由于在精氨酸/磷酸鹽中無(wú)rhCD-RAP的蛋白質(zhì)損失，這種緩沖劑為最優(yōu)選的增溶溶液之一。相比于精氨酸/磷酸鹽，使用磷酸鉀作為制劑緩沖劑需要ー個(gè)額外的補(bǔ)充物，以達(dá)到足夠的溶解。由于50 mM的磷酸鉀(包含氯化鉀作為離子添加物，以達(dá)到等滲狀態(tài))顯示出最高僅達(dá)到10 mg/mL rhCD-RAP的良好溶解度，因此需要加入補(bǔ)充物，以便實(shí)現(xiàn)濃度水平為高達(dá)30 mg/mL rh⑶-RAP和更好的溶解度。在大量穩(wěn)定劑中，僅蔗糖得到甚至rh⑶-RAP在30 mg/mL濃度下的極好的溶解度。其它穩(wěn)定劑顯示出在不同濃縮步驟中具有部分可見沉淀蛋白的聚集作用。Tris緩沖體系將TRIS氯化物與不同穩(wěn)定劑(例如蔗糖、甘露醇、甘氨酸、谷氨酸和賴氨酸，具有或不具有Tween80 )作為溶解促進(jìn)劑溶解在WFI中至最終重量為I kg得到50 mM的緩沖劑濃度。通過(guò)分別使用額外的HC1，將pH調(diào)節(jié)至pH 6.0。a) 6. 05 g TRIS 堿、9. 7 g NaCl，具有和不具有 I. 0 g Tween 80b)6. 05 g TRIS 堿、50 g 蔗糖、3. 9 g NaCl，具有和不具有 l.Og Tween 80c)6. 05 g TRIS 堿、50 g 甘露醇，具有和不具有 I. 0 g Tween 80d)6. 05 g TRIS 堿、25 g 甘氨酸，具有和不具有 I. 0 g Tween 80e)6. 05 g TRIS 堿、25 g 谷氨酸，具有和不具有 I. 0 g Tween 80f)6. 05 g TRIS 堿、25 g 賴氨酸，具有和不具有 I. 0 g Tween 80如果需要,用氯化鉀調(diào)節(jié)300 - 400 mOsm/kg的等滲。姆種緩沖劑的重量滲克分子濃度不于表2。直！TRIS緩沖劑的重量滲克分子濃度
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的水性制劑，其包含至少5 mg/mL⑶-RAP和帶電荷的氨基酸，其中所述CD-RAP蛋白直接溶解于其中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制劑，其中所述氨基酸在約6至8的pH下具有凈電荷。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其包含緩沖劑。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其包含張力調(diào)節(jié)劑。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其包含穩(wěn)定劑。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其還包含賦形劑。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述制劑具有約6至8的pH。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制劑，其中所述帶電荷的氨基酸選自精氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其可以為冷凍干燥的、凍干的、或噴霧-干燥的。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其中所述制劑的成分經(jīng)過(guò)重復(fù)凍融循環(huán)具有穩(wěn)定性。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其用于治療。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其用于治療炎性障礙，優(yōu)選骨關(guān)節(jié)炎。
13.—種試劑盒，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其包含至少30mg/mL⑶-RAP，其中所述緩沖劑選自磷酸鉀、TRIS氯化物、組氨酸、精氨酸和谷氨酸鹽，并且所述氨基酸選自天冬酸鹽、谷氨酸鹽(優(yōu)選谷氨酸磷酸鹽)、精氨酸(優(yōu)選精氨酸磷酸鹽或精氨酸鹽酸鹽)、組氨酸(優(yōu)選組氨酸鹽酸鹽或組氨酸磷酸鹽)、賴氨酸和甘氨酸。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的制劑，其包含至少30mg/mL⑶-RAP和 (i)50 mM TRIS氯化物和2. 5%谷氨酸鹽； (ii)50 mM組氨酸和2. 5% (w/v)甘氨酸、2. 5% (w/v)谷氨酸鹽(w/v)或2. 5%賴氨酸(w/v); (iii)300mM組氨酸鹽酸鹽pH 6.0 ；(iv)50、100、200或 300 mM 組氨酸磷酸鹽 pH 6. O ； (V) 350 mM精氨酸鹽酸鹽pH 6. O ； (vi)350 mM精氨酸磷酸鹽pH 6. O ； (vii)350 mM精氨酸磷酸鹽pH 7. 4 ;或(viii)300 mM 谷氨酸鉀 pH 6.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的水性制劑，其包含至少5mg/mL CD-RAP和帶電荷的氨基酸，所述氨基酸優(yōu)選在約6至8的pH下具有凈電荷。所述制劑的成分優(yōu)選經(jīng)過(guò)重復(fù)凍融循環(huán)具有穩(wěn)定性。在優(yōu)選方面，所述制劑用于治療，優(yōu)選用于治療炎性障礙，優(yōu)選骨關(guān)節(jié)炎。此外，提供了包含本發(fā)明制劑的試劑盒。
文檔編號(hào)A61K9/00GK102869679SQ201180021207
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者K·海勒布蘭德, R·西格 申請(qǐng)人:Scil技術(shù)股份有限公司