專利名稱：針對組織因子途徑抑制劑(tfpi)的優(yōu)化的單克隆抗體的制作方法
針對組織因子途徑抑制劑(TFPI)的優(yōu)化的單克隆抗體
Zhuozhi Wang, Junliang Pan，Joanna Grudzinskaj Christian Votsmeierj Jan Tebbej Joerg Birkenfeldj Nina Wobstj Simone Briicknerj Susanne Steinigj Peter Scholz
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提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的分離的單克隆抗體及其片段。
發(fā)明背景
血液凝固(blood coagulation)是血液形成穩(wěn)定的凝塊以使流血停止的過程 (process) 0該過程牽涉血液中循環(huán)的許多酶原和輔因子原(或“凝固因子”)。那些酶原和輔因子原經(jīng)由序貫或同時將它們轉(zhuǎn)化成活化形式的數(shù)種途徑而相互作用。最后，所述過程導(dǎo)致在存在因子Va、離子鈣、和血小板的情況中由激活的因子X(FXa)將凝血酶原激活為凝血酶。激活的凝血酶繼而誘導(dǎo)血小板聚集，而且將血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成血纖蛋白，其然后被激活的因子XIII (FXIIIa)交聯(lián)以形成凝塊。
可以通過兩種獨(dú)特的途徑來實施導(dǎo)致因子X激活的過程接觸激活途徑(以前稱為內(nèi)源性途徑)和組織因子途徑(以前稱為外源性途徑)。先前認(rèn)為，凝固級聯(lián)由連接至共同途徑的同等重要的兩種途徑組成?，F(xiàn)在知道用于啟動血液凝固的主要途徑是組織因子途徑。
因子X可以被與激活的因子VII (FVIIa)聯(lián)合的組織因子(TF)激活。因子VIIa和其必需的輔因子TF的復(fù)合物是凝固(clotting)級聯(lián)的一種有力的引發(fā)劑(initiator)。
凝固的組織因子途徑受組織因子途徑抑制劑(“TFPI，，)負(fù)控制。TFPI是FVIIa/TF 復(fù)合物的一種天然的、FXa依賴性反饋抑制劑。它是多價Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的成員。在生理學(xué)上，TFPI結(jié)合激活的因子X(FXa)以形成異二聚體復(fù)合物，其隨后與FVIIa/ TF復(fù)合物相互作用以抑制其活性，如此關(guān)閉凝固的組織因子途徑。原則上，阻斷TFPI活性可以恢復(fù)FXa和FVIIa/TF活性，如此延長組織因子途徑作用的持續(xù)時間，而且放大FXa的生成，所述FXa是血友病A和B的共同缺陷。
實際上，一些初步實驗證據(jù)已經(jīng)指明，通過針對TFPI的抗體來阻斷TFPI活性使延長的凝固時間正?；蛘呖s短流血時間。例如，Nordfang等顯示了血友病血漿的延長的稀釋凝血酶原時間(dilute prothrombin time)在用針對TFPI的抗體處理血楽■后正?；?Thromb. Haemost, 1991, 66 (4) : 464-467)。類似地，Erhardtsen 等顯不了通過抗TFPI抗體顯著縮短血友病A兔模型中的流血時間(Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995，6:388-394)。這些研究提示了抗TFPI抗體對TFPI的抑制對于治療血友病A或B可以是有用的。在這些研究中僅使用多克隆抗TFPI抗體。
使用雜交瘤技術(shù)，制備并鑒定針對重組人TFPI (rhTFPI)的單克隆抗體。參見 Yang等，Chin. Med. J.，1998，111(8) : 718-721。測試了單克隆抗體對稀釋凝血酶原時間(PT)和激活部分促凝血酶原激酶時間(APTT)的影響。實驗顯示了抗TFPI單克隆抗體縮短因子IX缺乏型血漿的稀釋促凝血酶原激酶凝固時間。提示了組織因子途徑不僅在生理學(xué)凝固而且在血友病出血中發(fā)揮重要作用(Yang等，Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997，22(4) : 297-300)。
因而，需要對TFPI特異性的抗體來治療血液學(xué)疾病和癌癥。
一般而言，已經(jīng)使用遺傳工程來創(chuàng)建鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗體以生成用于人疾病的治療性抗體。顯示了鼠單克隆抗體作為治療劑具有有限的用途， 這是由于短的血清半衰期、不能觸發(fā)人效應(yīng)器功能、和人抗小鼠抗體的生成(Brekke 和 Sandlie, “Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century, ” Nature 2, 53, 52-62，(2003 年 I 月)。已經(jīng)顯不了嵌合抗體引起人抗嵌合抗體應(yīng)答。人源化抗體進(jìn)一步使抗體的小鼠構(gòu)件最小化。然而，完全人抗體完全避免與鼠元件有關(guān)的免疫原性。如此，需要開發(fā)完全人抗體以避免與其它形式的遺傳工程化單克隆抗體有關(guān)的免疫原性。特別地，若使用具有鼠構(gòu)件或鼠起源的抗體，則諸如用抗 TFPI單克隆抗體的血友病治療會需要的長期(chronic)預(yù)防處理具有形成對該治療的免疫應(yīng)答的高風(fēng)險，這是由于需要的頻繁劑量給藥和長的療法持續(xù)時間。例如，血友病A的抗體療法可以每周需要劑量給藥，持續(xù)患者一生。這對免疫系統(tǒng)會是連續(xù)的考驗。如此，需要用于血友病和相關(guān)的遺傳性和獲得性凝固缺乏或缺陷的抗體療法的完全人抗體。
已經(jīng)經(jīng)由由Koehler 和 Milstein 在“Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity, Mature 256, 495-497 (1975)中所描述的雜交瘤技術(shù)來生成治療性抗體。也可以在原核生物和真核生物中重組生成完全人抗體。 治療性抗體優(yōu)選抗體在宿主細(xì)胞中的重組生成而不是雜交瘤生成。重組生成具有如下的優(yōu)點(diǎn)，即較大的產(chǎn)物一致性、可能地較高的生產(chǎn)水平、和受控制的制備，其使動物衍生的蛋白質(zhì)的存在最小化或消除動物衍生的蛋白質(zhì)的存在。出于這些原因，想要具有重組生成的單克隆抗TFPI抗體。
另外，因為TFPI以高親和力結(jié)合活化的因子X(FXa)，所以有效的抗TFPI抗體應(yīng)當(dāng)具有相當(dāng)?shù)挠H和力。如此，期望具有可以與TFPI/FXa結(jié)合競爭的結(jié)合親和力的抗TFPI抗體。
發(fā)明概述
提供了針對人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的單克隆抗體。進(jìn)一步提供了編碼其的分離的核酸分子。還提供了包含抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和治療遺傳性和獲得性凝固缺乏或缺陷諸如血友病A和B的方法。還提供了用于縮短出血時間的方法，其通過對有此需要的患者施用抗TFPI單克隆抗體進(jìn)行。還提供了用于生成依照本發(fā)明的結(jié)合人 TFPI的單克隆抗體的方法。
在一些實施方案中，已經(jīng)優(yōu)化提供的針對TFPI的單克隆抗體，例如以具有升高的親和力或升高的功能活性。
附圖
簡述
圖I描繪的柱狀圖顯示了具有單個氨基酸取代的選擇的2A8變體，其使用dPT測定法在人血友病A血漿中在縮短凝固時間上顯示更多的效力。
圖2描繪的圖顯示了選擇的單個氨基酸突變的抗TFPI抗體對抗因子VIII抗體誘導(dǎo)的人血友病血液的凝固時間的影響。
圖3描繪的圖顯示了與親本4B7抗體相比且在更小程度上與2A8內(nèi)的單個氨基酸取代相比，4B7-D62R在人抗體誘導(dǎo)的血友病A血液中在縮短凝固時間上具有多得多的效力。
圖4描繪的兩幅圖顯示了與對照小鼠IgGl (CTX IgGl)相比以劑量依賴性方式用親本抗體2A8和具有多個氨基酸取代的2A8變體(A200)處理的血友病A小鼠的存活。
圖5描繪的圖顯示了 2A8變體以劑量依賴性方式增強(qiáng)人血友病C (FXI缺乏的) 血漿中的凝固，并且其效果與重組FVIIa的效果相當(dāng)。
發(fā)明詳述
定義
如本文中所使用的，術(shù)語“組織因子途徑抑制劑”或“TFPI”指由細(xì)胞天然表達(dá)的人TFPI的任何變體、同等型和物種同系物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體對TFPI的結(jié)合減少血液凝固時間。
如本文中所使用的，“抗體”指整個抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈。該術(shù)語包括天然存在的或由正常的免疫球蛋白基因片段重組過程形成的全長免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)，或免疫球蛋白分子中保留特異性結(jié)合活性的免疫學(xué)活性部分諸如抗體片段。不管結(jié)構(gòu)，抗體片段與由全長抗體識別的相同抗原結(jié)合。例如，抗 TFPI單克隆抗體片段結(jié)合TFPI的表位?？贵w的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段執(zhí)行。 抗體的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”內(nèi)涵蓋的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即一種由\、VH、 (^和Cm域構(gòu)成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，即一種包含由鉸鏈區(qū)處的二硫化物橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由Vh和Chi域構(gòu)成；(iv)Fv片段，其由抗體的單條臂的 Vl 和 Vh 域構(gòu)成，(v)dAb 片段(Ward 等，(1989) Nature 341:544-546),其由 Vh 域構(gòu)成；(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) ； (vii)微型抗體(minibody)、雙抗體、三抗體、四抗體、和 kappa 體(見例如 Ill 等，Protein Eng 1997; 10:949-57) ； (viii)胳馬它 IgG ;和(ix) IgNAR0此外，雖然Fv片段的兩個域，即\和Vh是由不同基因編碼的，但是可以使用重組方法通過合成的接頭來連接它們，所述合成的接頭使它們能夠作為單條蛋白質(zhì)鏈生成，其中Vl和區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等(1988) Science 242:423-426;及 Huston 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意圖涵蓋在抗體的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來獲得這些抗體片段，并以與完整的抗體相同的方式來對片段分析功效。
此外，涵蓋的是，抗體模擬物中可以涵蓋抗原結(jié)合片段。如本文中所使用的，術(shù)語 “抗體模擬物”或“模擬物”意指展現(xiàn)出與抗體類似的結(jié)合，但是是更小的備選抗體或非抗體蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。此類抗體模擬物可以包含在支架中。術(shù)語“支架”指用于以改編的功能和特征工程化改造新產(chǎn)物的多肽平臺。
如本文中所使用的，術(shù)語“抑制結(jié)合”和“阻斷結(jié)合”(例如，指抑制/阻斷TFPI配體對TFPI的結(jié)合)可互換使用，涵蓋部分和完全抑制或阻斷兩者。抑制和阻斷還意圖包括與不與抗TFPI抗體接觸的TFPI相比在與抗TFPI抗體接觸時TFPI對生理學(xué)底物的結(jié)合親和力的任何可測量降低，例如阻斷TFPI與因子Xa的相互作用或者阻斷TFPI-因子Xa復(fù)合物與組織因子、因子VIIa或組織因子/因子VIIa的復(fù)合物的相互作用達(dá)至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%。
如本文中所使用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一分子組成的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物展示對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。因而，術(shù)語“人單克隆抗體”指具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變區(qū)和恒定區(qū)的展示單一結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。
如本文中所使用的，“分離的抗體”意圖指基本上沒有具有不同抗原性特異性的其它抗體的抗體(例如結(jié)合TFPI的分離的抗體基本上沒有結(jié)合與TFPI不同的抗原的抗體)。 然而，結(jié)合人TFPI的表位、同等型或變體的分離的抗體可以具有與其它相關(guān)抗原(例如來自其它物種的(例如TFPI物種同系物))的交叉反應(yīng)性。此外,分離的抗體可以基本上沒有其它細(xì)胞材料和/或化學(xué)物。
如本文中所使用的，“特異性結(jié)合”指抗體對預(yù)定抗原的結(jié)合。典型地，抗體以至少約IO5M4的親和力結(jié)合，而且以比其結(jié)合與預(yù)定抗原或緊密相關(guān)抗原不同的無關(guān)抗原(例如BSA、酪蛋白)的親和力高(例如大至少兩倍)的親和力結(jié)合預(yù)定抗原。短語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異性的抗體”在本文中與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”可互換使用。
如本文中所使用的，關(guān)于IgG抗體的術(shù)語“高親和力”指至少約IO7M'在一些實施方案中至少約IO8M'在一些實施方案中至少約IO9M-1UOkT1UO11M-1或更大，例如多至 IO13M-1或更大的結(jié)合親和力。然而，對于其它抗體同種型，“高親和力”結(jié)合可以有所變化。 例如，IgM同種型的“高親和力”結(jié)合指至少約LOx IO7IT1的結(jié)合親和力。如本文中所使用的，“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如IgM或IgGl)。
“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”指抗體分子的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)內(nèi)形成與結(jié)合的抗原的三維結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的N端抗原結(jié)合表面的三個高變區(qū)之一。從重鏈或輕鏈的N端出發(fā)，這些互補(bǔ)決定區(qū)分別表示為“⑶R1”、“⑶R2”和“⑶R3”。⑶R牽涉抗原-抗體結(jié)合，而且⑶R3 包含對于抗原_抗體結(jié)合特異性的獨(dú)特區(qū)域。因此，抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包括6個CDR，其包含來自各個重鏈和輕鏈V區(qū)的CDR區(qū)。
如本文中所使用的，“保守取代”指牽涉用一種或多種氨基酸取代具有相似生物化學(xué)特性的氨基酸且不導(dǎo)致多肽的生物學(xué)或生物化學(xué)功能損失的多肽修飾?！氨Ｊ匕被崛〈敝赣镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基替換氨基酸殘基的。本領(lǐng)域中已經(jīng)限定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta-分支的側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。涵蓋的是，本發(fā)明的抗體可以具有保守的氨基酸取代，而且仍保留活性。
對于核酸和多肽，術(shù)語“實質(zhì)的同源性”指明在最佳比對和比較時兩個核酸或兩個多肽或其指定序列在至少約80%的核苷酸或氨基酸，通常至少約85%，優(yōu)選地約90%、91%、 92%、93%、94%、或 95%,更優(yōu)選地至少約 96%、97%、98%、99%、99· 1%、99· 2%,99. 3%,99. 4%、或 99. 5%的核苷酸或氨基酸中是相同的，具有適當(dāng)?shù)暮塑账峄虬被岵迦牖蛉笔??；蛘?，區(qū)段會在選擇性雜交條件下與該鏈的互補(bǔ)物雜交時存在核酸的實質(zhì)同源性。本發(fā)明包括與本文中所列舉的特定核酸序列和氨基酸序列具有實質(zhì)同源性的核酸序列和多肽序列。
兩個序列間的百分比同一性是序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(S卩，%同源性= 相同位置的數(shù)目/位置總數(shù)X 100)，其考慮缺口的數(shù)目和每個缺口的長度，它們需要被引入以進(jìn)行兩個序列的最佳比對?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法(諸如不限于Vect0rNTITM(InVitr0gen Corp. , Carlsbad, CA)的AlignX 模塊)來實現(xiàn)兩個序列間的序列比較和百分比同一性測定。對于AlignX ，多重比對的缺省參數(shù)是缺口開放罰分10;缺口延伸罰分 O. 05 ;缺口分開罰分范圍8 ;比對延遲的％同一性40。(進(jìn)一步的詳情參見http: // www. invitrogen. com/site/us/en/home/T,TNNRA-QnI ine-Gui des/T.TNNF,A-Communi ti es/ Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/ AlignX-Module for-Vector-NTI-Advance. reg. us. html)。
可以使用CLUSTALW 計算機(jī)程序(Thompson 等，Nucleic Acids Research, 1994，2(22) :4673-4680)來測定用于測定詢問序列(本發(fā)明的序列)與主題序列之間的最好總體匹配的另一種方法(也稱為全局序列比對)，所述CLUSTALW計算機(jī)程序基于 Higgins 等(Computer Applications in the Biosciences (CABIOS)，1992，8 (2):189-191) 的算法。在序列比對中，詢問和主題序列都是DNA序列。所述全局序列比對的結(jié)果按百分比同一性計。DNA序列的CLUSTALW比對中經(jīng)由成對比對來計算百分比同一性所使用的優(yōu)選參數(shù)是矩陣=IUB,k-元組=1,頂部對角線的數(shù)目=5,缺口罰分=3,缺口開放罰分=10,缺口延伸罰分=0. I。對于多重比對，優(yōu)選下列CLUSTALW參數(shù)缺口開放罰分=10，缺口延伸參數(shù) =0. 05 ;缺口分開罰分范圍=8 ;比對延遲的％同一性=40。
核酸可以存在于全細(xì)胞中、細(xì)胞溶胞物中，或者以部分純化的或基本上純的形式存在。核酸在純化得離開與其在天然環(huán)境中正常相關(guān)的其它細(xì)胞成分時是“分離的”或“給予基本上純的”。為了分離核酸，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)諸如下列各項堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域中公知的其它技術(shù)。
在高親和力和功能活性方面優(yōu)化的單克隆抗體
幾種抗TFPI抗體在先前的研究中鑒定并且記載于2009年8月4日提交的PCT申請No. PCT/US2009/052702，在此為了所有目的通過提及而將其收錄。這些抗TFPI抗體可以例如通過改善其對TFPI的親和力和阻斷活性來進(jìn)一步優(yōu)化?？梢岳缤ㄟ^利用對抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或與CDR緊密接近的殘基，即與CDR相鄰的約3或4個殘基的位點(diǎn)飽和誘變實施此類優(yōu)化。
還提供了對TFPI具有升高或高的親和力的單克隆抗體。在一些實施方案中，抗 TFPI抗體具有至少約IO7M'在一些實施方案中，至少約IO8M'在一些實施方案中，至少約 IO9M^1UO1VUO11M^1或更大，例如多至IO13M-1或更大的結(jié)合親和力。
利用兩種抗TFPI親本抗體(本文中稱為2A8和4B7)的⑶R中及附近的位點(diǎn)飽和誘變來對抗體優(yōu)化親和力和功能活性。還涵蓋的是，可以對先前PCT/US2009/052702中描述的任何抗體實施相同優(yōu)化。
在一些實施方案中，可以對抗TFPI抗體完成⑶R的位點(diǎn)飽和誘變。對于 2A8，SEQ ID NO: I中顯示的重鏈中的CDR對應(yīng)于殘基FTFRSYGMS (殘基27至35)、 SIRGSSSSTYYADSVKG(殘基 50 至 66)和 KYRYWFDY(殘基 99 至 106)。對于 SEQ ID NO: 2 中顯示的2A8輕鏈，CDR對應(yīng)于殘基S⑶NLRNYYAH(殘基23至33)、YYDNNRPS (殘基48至55)25和QSWDDGVPV (殘基88至96)。對于4B7，SEQ ID NO: 3中顯示的重鏈中的⑶R對應(yīng)于殘基 DSVSSNSAAWS(殘基 27 至 37)、IIYKRSKWYNDYAVSVKS(殘基 52 至 70)和 WHSDKHWGFDY(殘基102至112)。對于SEQ ID NO:4中顯示的4B7輕鏈，CDR對應(yīng)于SEQ ID NO:4的殘基 RSSQSLVFSDGNTYLN (殘基 24 至 39)、KGSNRAS (殘基 55 至 61)和 QQYDSYPLT (殘基 94 至 102)。 可以在6種⑶RA之任一中單獨(dú)或組合做出修飾。此外,可以在單一⑶R中做出兩個或多個修飾。在其它實施方案中，也可以極其接近CDR(例如在每個CDR的任一側(cè)的約3或4個殘基)引入修飾。
簡言之，引入并分析單個和/或多個(single and/or multiple)氨基酸修飾以優(yōu)化，例如改善親本抗體2A8和4B7的親和力。首先，將單個氨基酸修飾引入每個抗體的6個 CDR中或CDR附近，接著分析TFPI結(jié)合特性。選擇對TFPI的結(jié)合信號升高的修飾以與一個或多個其它修飾組合，并分析結(jié)合信號的進(jìn)一步升高。在每次分析后，使用選定的抗體變體來測量其對TFPI的親和力和在阻斷TFPI活性和縮短凝固時間方面的活性。如此，在一些實施方案中，提供了與未修飾的親本抗體相比對TFPI具有升高的親和力的結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體。此外，在一些實施方案中，提供了與未修飾的親本抗體相比具有升高對TFPI的阻斷活性的結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體。在一些實施方案中，提供了與未修飾的親本抗體相比具有縮短的凝固時間的結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體。
在一些實施方案中，引入其它氨基酸修飾以降低與種系序列的趨異。在其它實施方案中，弓I入氨基酸修飾以便于大規(guī)模生產(chǎn)方法的抗體生成。
抗體可以是物種特異性的或者可以與多種物種起交叉反應(yīng)。在一些實施方案中， 抗體可以與人、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、豬、犬、貓或其它哺乳動物物種的TFPI特異性起反應(yīng)或起交叉反應(yīng)。
抗體可以是各類抗體之任一種的,諸如但不限于IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl ，IgA2,分泌性IgA, IgD和IgE抗體。
在一個實施方案中，提供了針對人組織因子途徑抑制劑的分離的完全人的單克隆抗體。
在另一個實施方案中，提供了針對人組織因子途徑抑制劑的Kunitz域2的分離的完全人的單克隆抗體。
2A8 變體
因而，在一些實施方案中，提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO: I中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。在一些實施方案中，2A8的重鏈的修飾是取代、插入或缺失。
在一些實施方案中，取代位于2A8的重鏈的⑶R中。在其它實施方案中，取代位于 2A8的重鏈的⑶R外部。
在一些實施方案中，2A8的重鏈的取代在選自下組的位置處 S31,G33, S35, 151，S54，S55，K99和F104。在一些實施方案中，2A8的重鏈的取代還可以包括選自下組的位置Q1，R30，M34，S50，R52和S56。例如，取代可以選自Q1E, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54F, S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L和F104Y。此外，在一些實施方案中，抗體可以包含選自下述的兩個或多個取代Q1E, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54F, S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L 和 F104Y。
在一些實施方案中，2A8的重鏈相對于SEQ ID NO: I具有下列取代 S31V+I51D+S54F+K99V ；G33P+S35D+S54F+K99L;S35D+I51D+S55R+K99V ；S35L+S54F+K99V ；S 31V+G33P+S35D;S35D+I51D+K99L;S31V+I51D+S55R+K99L;S31V+S35D+I51D+K99V;G33P+I51 D+S54F;151D+S54F+K99L;S35D+K99L;S31V+G33P+151D+S54F+K99V ； S35D+151E+S55R+K99L; S31V+K99V;S31V+I51E+S55R+K99V ；S35D+S55R+K99L;S31V+S54F+K99L;S31V+I51D+S55R+K9 9V ；S31V+S35D+S55R;S31V+S35D;S31V+I51D+S55R;S35D+S54F+S55R+K99L;S31V+S35D+S54F S31V+S35L+151D+S54F+K99V ;和 S31V+S35L+I51E+S54F+K99V。
在一些實施方案中，2A8的重鏈相對于SEQ ID NO: I具有下列取代G33A+S35D+S5 5R+K99L;G33P+I51D+S54F;G33P+S35D+S54F+K99L;I51D+S54F+K99L;M34I+S35D+S55R+K99L ;M34K+S35D+S55R+K99L;Q1E+R30S+S35D+S55G+S56G+K99L;
Q1E+R30S+S35D+S55R+S56G+K99L;
Q1E + S31V + S50A + I51D + S55R+S56G+K99V ； Q1E + S35D + S55R+K99L ; R30S +S31V+I51D+S55R+K99V ；R30S+S35D+S55R+K99L;S31V+G33A+I51D+S55R+K99V ； S31V+G33P+151D+S54F+K99V ；
S31V+G33P+S35D;S31V+151D+R52S+S55R+K99V ；S31V+I51D+S54F+K99V ；
S31V + I51D + S55R; S3 IV+I 5 1D + S55R + K99L ; S3 IV+I 5 1D + S5 5R + K99V ； S31V+151D+S55R+S56G+K99V ；S31V+I51E+S55R+K99V ；S31V+K99V ；S31V+S35D;
S31V+S35D+I51D+K99V ；S31V+S35D+S54F;S31V+S35D+S55R;S31V+S35L+I51D+S54F +K99V ；S31V+S35L+I51E+S54F+K99V ；S31V+S50A+I51D+S55R+K99V ；S31V+S54F+K99L;S35D+ 151D+K99L;S35D+I51D+S55R+K99V ；S35D+I51E+S55R+K99L;S35D+K99L;S35D+R52S+K99L;
S35D+R52S+S55R+K99L;S35D+S50A+K99L;S35D+S50A+S55R+K99L;S35D+S54F+S5 5R+K99L;S35D+S55G+K99L;S35D+S55R+K99L;S35D+S55R+S56G+K99L;S35D+S56G+K99L;和 S35L+S54F+K99V。
在一些實施方案中，2A8的重鏈具有一個或多個缺失。在一些實施方案中，缺失位于2A8的重鏈的⑶R中。在其它實施方案中，缺失位于2A8的重鏈的⑶R外部。在一些實施方案中，例如，缺失在選自下組的位置處I51，S56和S57。
此外，提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。在一些實施方案中，修飾是取代、插入或缺失。
在一些實施方案中，取代位于2A8的輕鏈的CDR中。在其它實施方案中，取代位于 2A8的輕鏈的⑶R外部。
在一些實施方案中，2A8的輕鏈的取代在選自下組的位置處 A32, Y48, N51, N52, P54, D91, D92和V96。在一些實施方案中，2A8的輕鏈的取代還可以包括選自下組的位置D1, 12，A13, S21, N26, R28, N29, H33, Y49, G56, E80, S89, G93, V94 和 P95。 例如，取代可以選自D1S, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L, G56D, E80M, S89A, D91L, D91R, D91W, D91K, D92S, D92T, G93S, V94T, P95V, P95A, V96G, V96M和V96W。此外，在一些實施方案中，抗體可以包含選自下組的兩個或多個 DlS, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L, G56D ，E80M, S89A, D91L, D91R, D91ff,D91K, D92S, D92T, G93S, V94T, P95V, P95A, V96G, V96M和 V96W。
在一些實施方案中，2A8的輕鏈相對于SEQ ID NO: 2具有下列取代Y48F+N51V ; Y48F+N52G;Y48F+D91K;Y48F+D91L+V96ff;Y48F+D91ff;Y48F+N52G+D91L+V96ff;Y48F+N51 V+V96W;D9IL+V96W;Y48F+N51V+D91W;Y48F+N5IV+D91L+V96W;N51V+D91W;Y48F+N5IV+-G56D+V96W;Y48F+N5IV+D9IL;和 N51V+D91K。
在一些實施方案中，2A8的輕鏈相對于SEQ ID NO: 2具有下列取代 A13S+Y48F+N51V+D91W;
D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W;
DIS+I2Y+AI3S+S2IT+R28P+N29K+Y48F+N5IS+E80M+D9IL+D92S+V94T+V96W;DIS+I2 Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51V+E80M+D91W;D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N5 1V+E80M+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T;
DIS+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+Y49R+N5IS+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W ;D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N51V+E80M+D91W;D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N51 V+E80M+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T;DIS+Y48F+N5IV+D9Iff;D91L+V96W;H33Y+Y48F+N5IV +D91W;I2Y+Y48F+N51V+D9Iff;N26A+Y48F+N51V+D9Iff;N29K+Y48F+N51V+D9Iff;N51V+D9IK; N51V+D9Iff;R28P+Y48F+N51V+D9Iff;S21T+Y48F+N51V+D9Iff;Y48F+D9IK;Y48F+D91L+D92S+ V96W;Y48F+D91L+G93S+V96W;Y48F+D91L+P95V+V96W;Y48F+D91L+V94T+V96W;Y48F+D91L+ V96W;Y48F+D9Iff;Y48F+N51S+D91L+V96W;Y48F+N51V ;Y48F+N51V+D9IL;Y48F+N51V+D9IL +V96W;Y48F+N51V+D9Iff;Y48F+N51V+D91W+D92S;Y48F+N51V+D91W+G93S;Y48F+N51V+D9Iff +P95V;Y48F+N5IV+D9IW+V94T;Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;Y48F+N51V+G56D+V96W;Y48F+N5I V+S89A+D9Iff;Y48F+N5IV+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T+P95A;Y48F+N51V+V96W;Y48F+N52 G;Y48F+N52G+D91L+V96W;和 Y48F+S89A+D91L+V96W。
還提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含a)包含SEQ ID NO: I中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾；和b)包含SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。上文提供了可以做出修飾的例子。
在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含含有選自下組的氨基酸序列的重鏈SEQ ID NO:5, 6, 7,8,9, 10和11。
在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含含有選自下組的氨基酸序列的輕鏈SEQ ID NO: 12, 13，14，15，16，17和18。
在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含選自下組的氨基酸序列的重鏈SEQ ID N0:5，6，7，8，9，10和11 ;和b)包含選自下組的氨基酸序列的輕鏈SEQ ID NO: 12, 13，14，15，16，17和18。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:5中顯示的氨基酸序列的重鏈；和幻包含SEQ ID NO: 12中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:6中顯示的氨基酸序列的重鏈；和幻包含SEQ ID NO: 13中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:7中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID NO: 14中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:8中顯示的氨基酸序列的重鏈；和幻包含SEQ ID NO: 15中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:9中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID NO: 16中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID NO: 10中顯示的氨基酸序列的重鏈；和幻包含SEQ ID NO: 17中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID NO: 11中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID NO: 18中顯示的氨基酸序列的輕鏈。
4B7 變體
還提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含SEQ ID NO:3中顯示且包含一個或多個氨基酸修飾的氨基酸序列。在一些實施方案中， 4B7的重鏈的修飾是取代、插入或缺失。
在一些實施方案中，取代位于4B7的重鏈的⑶R中。在其它實施方案中，取代位于 4B7的重鏈的⑶R外部。
在一些實施方案中，4B7的重鏈的取代在選自下組的位置處S30，N32，S57，K58，N 61，D62, H103, H107, G109和Y112。在一些實施方案中，4B7的重鏈的取代還可以包括選自下組的位置Q1, S37,G44, 153 和 K55。另外，取代可以選自 QlE, S30R, N32D, N32E, S33G, S37 N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M, N61G, N61T, D62I, D62R, D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N, D62K, H103D, H103G, H107M, G109A和Yl 12D。此外，在一些實施方案中，抗體可以包含選自下組的兩個或多個取代Q1E, S30R, N32D, N32E, S33G. S37N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M ，N61G, N61T, D62I, D62R, D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N, D62K, H103D, H103G, H107M, G109A 和 Y112D。
在一些實施方案中，4B7的重鏈相對于SEQ ID N0:3具有下列取代N32D+D62Q+ H107M+Y112D;N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D;N32D+D62R+H107M+Y112D;N32D+D62R+Y1I 2D;D62Q+Y112D;D62R+Y112D;D62R+H107M+Y112D;N32D+D62Q+Y112D;N32D+D62R+H107M;N 32D+D62S+H107M+Y112D;D62Q+H107M+Y112D;N32D+D62R+H103D;D62S+H107M+Y112D; S30R+ S57K;N61G+D62V ;和K58M+D62N。在一些實施方案中，4B7的重鏈相對于SEQ ID N0:3具有下列取代D62Q+H107M+Y112D;D62Q+Y112D;D62R+H107M+Y112D;D62R+Y112D;D62S+H10 7M+Y112D;N32D+D62K+Y112D;N32D+D62Q+H107M+Y112D;N32D+D62Q+Y112D;N32D+D62R+H10 3D;N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D;N32D+D62R+H107M;N32D+D62R+H107M+Y112D;N32D+D6 2R+Y112D;N32D+D62S+H107M+Y112D;N32D+G44S+D62R+Y112D;N32D+I53T+D62Q+Y112D;N32 D+I53T+D62R+Y112D;N32D+K55Y+D62Q+Y112D;N32D+K55Y+D62R+Y112D;N32D+S37N+D62R+Y 112D;Q1E+N32D+D62R+Y112D;Q1E+N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D;N32D+G44S+K55Y+D62R+ Yl12D;S30R+S57K;N61G+D62V ;和 K58M+D62N。
此外，提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含SEQ ID NO:4中顯示且包含一個或多個氨基酸修飾的氨基酸序列。在一些實施方案中，4B7的輕鏈的修飾選自取代、插入或缺失。
在一些實施方案中，取代位于4B7的輕鏈的CDR中。在其它實施方案中，取代位于 4B7的輕鏈的⑶R外部。
在一些實施方案中，4B7的輕鏈的⑶R在選自下組的位置處F31，S32, D 33，N35, Y37, Y54, G56, S57, S61和D97。在一些實施方案中，4B7的輕鏈的CDR還可以包括選自下組的位置M4，V30，T36，N39，L42，K44，Q50，L51，K55，A60 和 S98。 例如，取代可以選自 M4I，M4L, V30L，F(xiàn)31I，F(xiàn)31M，F(xiàn)31Y，F(xiàn)31H, S32L, S32R, S32Y， D33F, D33R, N35I, N35L, N35T, N35V, T36N, Y37F, N39D, L42Q, K44R, Q50R, L51R, Y54F, K55L, G5 6D，G56A，G56V，S57Y，A60D, S61C, D97M, D97T和S98H。此外，在一些實施方案中，抗體可以包含選自下組的兩個或多個取代M4I, M4L, V30L, F31I, F31M, F31Y, S32L, S32R, S32Y, D33F, D 33R, N35I, N35L, N35T, N35V, T36N, Y37F, N39D, L42Q, K44R, Q50R, Y54F, K55L, G56D, G56A, G56 V, S57Y, A60D, S61C, D97M, D97T 和 S98H。
在一些實施方案中，4B7的輕鏈相對于SEQ ID NO: 4具有下列取代S32R+N35T; S3 2R+N35T+D97T;S32R+D33F+N35I;S32R+D33F+N35I+D97T;S32R+D33F+N35T;S32R+D33F;S32R +D33R+N35I;S32R+D33R+N35I+D97T;S32R+D33R;S32R+D33R+N35T;N35T+D97T;D33F+N35I;D 33F+N35I+D97T;D33F+N35T+Y37F;D33R+N35I;D33R+N35I+D97T;D33R+N35T;F31I+S32R+N35 I+D97T;F31I+S32R+D33F+N35I+D97T;F31I+S32R+D33F+N35T;F31I+S32R+D33R+N35I+D97T; F31I+N35I;F31I+D33F+N35I;F31I+D33F+N35I+D97T;F31I+D33R+N35I;F31I+D33R;F31M+S3 2L+D33R+N35I+D97T;F31M+S32R+D33F+N35I;F31M+S32R+D33F+N35I+D97T;F31M+S32R+D33F +D97T;F31M+S32R+D33R+N35I;F31M+S32R+D33R+N35I+D97T;F31M+S32R+D33R;F31M+S32R+D 33R+N35T;F31M+D33F+N35I;F31M+D33F;F31M+D33F+N35T;F31M+D33R+N35I;F31M+D33R;S32 R+N35I;F31M+D33F+N35T+Y37F;N35V+G56D;N35L+G56A;和 D33F+Y54F。
在一些實施方案中，4B7的輕鏈相對于SEQ ID NO:4具有下列取代D33F+N35I;D3 3F+N35I+D97T;D33F+N35T+Y37F;D33R+N35I;D33R+N35I+D97T;D33R+N35T;F31H+S32R+D33F +N35I+D97T;F31I+D33F+N35I;F31I+D33F+N35I+D97T;F31I+D33F+N35I+K44R;F31I+D33F+N 35I+L42Q;F31I+D33F+N35I+S98H;F31I+D33F+N35I+T36N;F31I+D33R;F31I+D33R+N35I;F31 I+N35I;F31I+S32R+D33F+N35I+D97T;F31I+S32R+D33F+N35T;F31I+S32R+D33R+N35I+D97T; F31I+S32R+N35I+D97T;F31M+D33F;F31M+D33F+N35I;F31M+D33F+N35T;F31M+D33F+N35T+Y3 7F;F31M+D33R;F31M+D33R+N35I;F31M+S32L+D33R+N35I+D97T;F31M+S32R+D33F+D97T;F31M +S32R+D33F+N35I;F31M+S32R+D33F+N35I+D97T;F31M+S32R+D33R;F31M+S32R+D33R+N35I;F 31M+S32R+D33R+N35I+D97T;F31M+S32R+D33R+N35T;F31Y+S32R+D33F+N35I+D97T;M4I+S32R +D33F+N35I+D97T;M4L+S32R+D33F+N35I+D97T;N35T+D97T;S32R+D33F;S32R+D33F+N35I;S3 2R+D33F+N35I+A60D+D97T;S32R+D33F+N35I+D97T;S32R+D33F+N35I+D97T+S98H;S32R+D33F +N35I+G56V+D97T;S32R+D33F+N35I+K44R+D97T;S32R+D33F+N35I+K55L+D97T;S32R+D33F+N 35I+L42Q+D97T;S32R+D33F+N35I+L51R+D97T;S32R+D33F+N35I+N39D+D97T;S32R+D33F+N35 I+Q50R+D97T;S32R+D33F+N35I+T36N+D97T;S32R+D33F+N35T;S32R+D33R;S32R+D33R+N35I; S32R+D33R+N35I+D97T;S32R+D33R+N35T;S32R+N35I;S32R+N35T;S32R+N35T+D97T;V30L+F3 II+D33F+N35I;V30L+S32R+D33F+N35I+D97T;V30L+S32R+D33F+N35I+T36N+D97T;V30L+S32R +N35I+T36N;N35V+G56D;N35L+G56A;和 D33F+Y54F。
還提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含a)包含SEQ ID N0:3中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾；和b)包含SEQ ID N0:4中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。上文提供了可以做出的修飾的例子。
在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含含有選自下組的氨基酸序列的重鏈SEQ ID NO: 19，20，21，22，23，24，25和26。
在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含含有選自下組的氨基酸序列的輕鏈SEQ ID NO:27, 28，29，30，31，32，33和34。
在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含選自下組的氨基酸序列的重鏈SEQ ID NO: 19，20，21，22，23，24，25和26 ;和幻包含選自下組的氨基酸序列的輕鏈SEQ ID NO:27，28，29，30，31，32，33和34。在一些實施方案中， 結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID NO: 19中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID N0:27中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:20中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID NO:28中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:21中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID N0:29中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:22中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID NO:30中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:23中顯示的氨基酸序列的重鏈；和幻包含SEQ ID N0:31中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:24中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID N0:32中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID N0:25中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID N0:33中顯示的氨基酸序列的輕鏈。在一些實施方案中，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體包含a)包含SEQ ID NO:26 中顯示的氨基酸序列的重鏈；和b)包含SEQ ID NO:34中顯示的氨基酸序列的輕鏈。
2A8/4B7 變體組合
還涵蓋的是，結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體可以包含2A8和 4B7的重和輕鏈的組合。
因而，提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含a)包含SEQ ID NO: I中顯示的氨基酸序列的2A8重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾；和b)包含SEQ ID NO:4中顯示的氨基酸序列的4B7輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。上文提供了可以做出的修飾的例子。
還提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含a)包含SEQ ID NO:3中顯示的氨基酸序列的4B7重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾；和b)包含SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列的2A8輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。上文提供了可以做出的修飾的例子。
在一些實施方案中，提供了一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含a)包含選自下組的氨基酸序列的重鏈SEQ ID NO:5, 6，7，8，9，10，11，19，20，21，22，23，24，25和26 ;和b)包含選自下組的氨基酸序列的輕鏈SEQ ID NO: 12 ，13，14，15，16，17，18，27，28，29，30，31，32，33 和 34。
核酸、載體和宿主細(xì)胞
還提供了編碼上文所描述的任何單克隆抗體的分離的核酸分子。
如此，提供了一種編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體的分離的核酸分子，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO: I中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。上文描述了此類修飾的例子。
還提供了一種編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體的分離的核酸分子，其中所述抗體包含含有SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。上文描述了此類修飾的例子。
還提供了一種編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體的分離的核酸分子，其中所述抗體包含含有SEQ ID N0:3中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。上文描述了此類修飾的例子。
還提供了一種編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體的分離的核酸分子，其中所述抗體包含含有SEQ ID N0:4中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。上文描述了此類修飾的例子。
此外，還提供了包含編碼上文所描述的任何單克隆抗體的分離的核酸分子的載體和包含此類載體的宿主細(xì)胞。
制備針對TFPI的抗體的方法
可以通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼依照本發(fā)明的實施方案的單克隆抗體的可變區(qū)的核苷酸序列來重組生成單克隆抗體。借助于表達(dá)載體，可以將含有所述核苷酸序列的核酸在適合于生成的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染并表達(dá)。因而，還提供了一種用于生成與人TFPI結(jié)合的單克隆抗體的方法，包括
(a)將編碼本發(fā)明的單克隆抗體的核酸分子轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，
(b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以便在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述單克隆抗體，和任選地
(c)分離并純化所生成的單克隆抗體，其中所述核酸分子包含編碼本發(fā)明的單克隆抗體的核苷酸序列。
在一個例子中，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，將通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)獲得的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達(dá)載體中以使基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列可操作連接。在此背景中，術(shù)語“可操作連接”意圖指將抗體基因連接入載體中以使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列服務(wù)其預(yù)期的調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。表達(dá)載體和表達(dá)控制序列選擇為與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？梢詫⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入分開的載體中，或者更典型地，將這兩種基因都插入同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)的方法來將抗體基因插入表達(dá)載體中(例如，連接抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)的限制性位點(diǎn)，或者若沒有限制性位點(diǎn)存在，則為平端連接)?？梢允褂帽疚闹兴枋龅目贵w的輕鏈和重鏈可變區(qū)來創(chuàng)建任何抗體同種型的全長抗體基因，其通過將它們插入已經(jīng)編碼想要的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中以使Vh區(qū)段與載體內(nèi)的Ch區(qū)段可操作連接并使' 區(qū)段與載體內(nèi)的Q區(qū)段可操作連接來實現(xiàn)。另外/或者，重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)抗體鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號肽?？梢詫⒖贵w鏈基因克隆入載體中以使信號肽以符合讀碼框方式與抗體鏈基因的氨基末端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。
在抗體鏈編碼基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體攜帶調(diào)節(jié)序列，其在宿主細(xì)胞中控制抗體鏈基因的表達(dá)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意圖包括啟動子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)，其控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。此類調(diào)節(jié)序列記載于例 如 Goeddel;Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會的是,表達(dá)載體的設(shè)計(包括調(diào)節(jié)序列的選擇)可以取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、想要的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。供哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)用的調(diào)節(jié)序列的例子包括指導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，諸如自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤衍生的啟動子和/增強(qiáng)子?；蛘撸梢允褂梅遣《菊{(diào)節(jié)序列，諸如泛素啟動子或β_珠蛋白啟動子。
在抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，重組表達(dá)載體可以攜帶別的序列，諸如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)志基因。選擇標(biāo)志基因促進(jìn)已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞的選擇(參見例如均為AxeI等的美國專利號4，399，216、4，634，665和 5，179,017)。例如，典型地，選擇標(biāo)志基因?qū)σ呀?jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞賦予對藥物諸如 G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。選擇標(biāo)志基因的例子包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因 (用于通過甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增在dhfr-宿主細(xì)胞中使用)和neo基因(用于G418選擇)。
對于輕鏈和重鏈的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式意圖涵蓋極其多種通常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-右旋糖苷轉(zhuǎn)染等。雖然理論上有可能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是抗體在真核細(xì)胞，且最優(yōu)選地哺乳動物宿主細(xì)胞中的表達(dá)是最優(yōu)選的，這是因為此類真核細(xì)胞，且特別地哺乳動物細(xì)胞比原核細(xì)胞更有可能裝配并分泌正確折疊且有免疫學(xué)活性的抗體。
用于表達(dá)重組抗體的哺乳動物宿主細(xì)胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CH0細(xì)胞)(包括與DHFR選擇標(biāo)志(例如如記載于R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621 的)一起使用的 dhfr-CHO 細(xì)胞，其記載于 Urlaub 和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)、NSO 骨髓瘤細(xì)胞、COS 細(xì)胞、HKBll 細(xì)胞和 SP2 細(xì)胞。 在將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞中時，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞達(dá)足以容許抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)或?qū)⒖贵w分泌入培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中的一段時間來生成抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化方法諸如超濾、大小排阻層析、離子交換層析和離心來從培養(yǎng)基回收抗體。
部分抗體序列表達(dá)完整抗體的用途
抗體主要經(jīng)由位于6個重鏈和輕鏈⑶R的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。出于此原因，CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外部的序列在各抗體間更加多種多樣。因為CDR 序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體_抗原相互作用，所以有可能表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體，其通過構(gòu)建包含嫁接到來自具有不同特性的不同抗體的框架序列的來自特定天然存在抗體的⑶R序列的表達(dá)載體來實現(xiàn)(參見例如Riechmann, L.等，1998，Nature 332:323-327; Jones, P.等，1986，Nature 321:522-525;及 Queen, C.等，1989，Proc. Natl.Acad. Sci. U. S.A. 86:10029-10033)。此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共 DNA數(shù)據(jù)庫獲得。這些種系序列會與成熟的抗體基因序列不同，因為它們不會包括完全裝配的可變基因，其在B細(xì)胞成熟過程中通過V(D) J連接而形成。獲得特定抗體的整個DNA序列以再創(chuàng)建具有與初始抗體的那些結(jié)合特性相似的結(jié)合特性的完整重組抗體是不必要的 (參見WO 99/45962)。跨越⑶R區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列對于此目的通常是足夠的。使用部分序列來確定哪些種系可變和連接基因區(qū)段促成重組的抗體可變基因。然后，使用種系序列來填充可變區(qū)的缺少部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白質(zhì)成熟過程中被切割，而且不促成最終抗體的特性。出于此原因，對表達(dá)構(gòu)建體使用相應(yīng)的種系前導(dǎo)序列是必要的。為了添加缺少的序列，可以通過連接或PCR擴(kuò)增來組合克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸。 或者，整個可變區(qū)可以合成為一套短的、重疊的寡核苷酸，并通過PCR擴(kuò)增來組合以創(chuàng)建完全合成的可變區(qū)克隆。此方法具有某些優(yōu)點(diǎn)，諸如消除或包含特定的限制性位點(diǎn)，或優(yōu)化特定的密碼子。
使用重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列來設(shè)計重疊的一組合成的寡核苷酸，以創(chuàng)建與天然序列具有相同的氨基酸編碼能力的合成的V序列。合成的重鏈和輕鏈序列可以與天然序列不同。例如，中斷重復(fù)核苷酸堿基串以便于寡核苷酸合成和PCR擴(kuò)增；依照Kozak的規(guī)則(Kozak, 1991，J. Biol. Chem. 266:19867-19870)來摻入最佳的翻譯起始位點(diǎn)；及在翻譯起始位點(diǎn)上游或下游工程化改造限制位點(diǎn)。
對于重鏈和輕鏈可變區(qū)兩者，近似地在相應(yīng)的非編碼寡核苷酸的中點(diǎn)將經(jīng)優(yōu)化的編碼和相應(yīng)的非編碼鏈序列分解為30-50個核苷酸的部分。如此，對于每條鏈，可以將寡核苷酸裝配成跨越150-400個核苷酸的區(qū)段的重疊雙鏈組。然后，使用集合作為模板來生成 150-400個核苷酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。典型地，會將單一可變區(qū)寡核苷酸組分解為兩個集合， 對它們進(jìn)行分開擴(kuò)增以生成兩種重疊的PCR產(chǎn)物。然后，通過PCR擴(kuò)增來組合這些重疊的產(chǎn)物以形成完整的可變區(qū)?？赡苓€想要包括PCR擴(kuò)增中的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的重疊片段以生成可以容易地克隆入表達(dá)載體構(gòu)建體中的片段。
然后，將再構(gòu)建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子、翻譯啟動、恒定區(qū)、3’非翻譯的多聚腺苷酸化、和轉(zhuǎn)錄終止序列組合以形成表達(dá)載體構(gòu)建體?？梢詫⒅劓満洼p鏈表達(dá)構(gòu)建體組合入單一載體中，共轉(zhuǎn)染、連續(xù)轉(zhuǎn)染、或分開轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，然后將所述宿主細(xì)胞融合以形成表達(dá)這兩條鏈的宿主細(xì)胞。
如此，在另一個方面，使用人抗TFPI抗體的結(jié)構(gòu)特征來創(chuàng)建保留結(jié)合TFPI的功能的結(jié)構(gòu)相關(guān)人抗TFPI抗體。更具體地，可以將本發(fā)明的單克隆抗體的明確鑒定的重鏈和輕鏈區(qū)的一個或多個CDR與已知的人框架區(qū)和CDR重組組合以創(chuàng)建本發(fā)明的別的、經(jīng)重組工程化改造的人抗TFPI抗體。
藥物組合物
還提供了藥物組合物，其包含治療有效量的抗TFPI單克隆抗體和藥學(xué)可接受載體?！八帉W(xué)可接受載體”是可以添加至活性成分以幫助配制或穩(wěn)定制劑而不對患者引起顯著不利的毒物學(xué)效果的物質(zhì)。此類載體的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括水、糖諸如麥芽糖或鹿糖、清蛋白、鹽諸如氯化鈉等。其它載體記載于例如E. ff. Martin的Remington’ s Pharmaceutical Sciences。此類組合物會含有治療有效量的至少一種抗TFPI單克隆抗體。
藥學(xué)可接受載體包括無菌水溶液或分散體和和供即時制備無菌可注射溶液或分散體用的無菌粉劑。對藥學(xué)活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域中已知的。優(yōu)選地，組合物配制用于胃腸外注射。組合物可以配制為溶液、微乳、脂質(zhì)體、或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液態(tài)聚乙二醇等)、及其合適的混合物。在一些情況中，它在組合物中會包含等張劑， 例如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、或氯化鈉。
可以如下制備無菌可注射溶液，即根據(jù)需要在具有上文所列舉的一種成分或成分組合的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物，接著過濾滅菌。一般而言，通過將活性化合物摻入無菌媒介中來制備分散體，所述無菌媒介含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)及來自那些上文所列舉的成分的其它所需成分。在供制備無菌可注射溶液用的無菌粉劑的情況中，一些制備方法是自其先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分和任何其它想要成分的粉末的真空干燥和冷凍干燥(凍干)。
藥學(xué)用途
可以為治療目的使用單克隆抗體來制備遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷。例如， 可以使用上文所描述的實施方案中的單克隆抗體來阻斷TFPI與FXa的相互作用，或者以阻止對TF/FVIIa活性的TFPI依賴性抑制。另外，還可以使用單克隆抗體來恢復(fù)TF/FVIIa驅(qū)動的FXa生成以回避FVIII或FIX依賴性FXa擴(kuò)增的不足。
單克隆抗體在止血病癥諸如血小板減少(thrombocytopenia)、血小板病癥和流血病癥(例如血友病A、血友病B和血友病C)的治療中具有治療用途。可以通過對所有需要的患者施用治療有效量的抗TFPI單克隆抗體來治療此類病癥。單克隆抗體在治療諸如外傷和出血性中風(fēng)(hemorrhagic stroke)等的適應(yīng)癥中不受控制的流血中也具有治療用途。 如此，還提供了一種用于縮短流血時間的方法，包括對所有需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗TFPI單克隆抗體。
抗體可以作為單一療法或者與其它療法聯(lián)合使用以解決止血病癥。例如,認(rèn)為本發(fā)明的一種或多種抗體與凝固因子諸如因子Vila、因子VIII或因子IX的共施用對于治療血友病是有用的。在一個實施方案中，提供了一種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷的方法，包括施用(a)第一量的結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的單克隆抗體和(b)第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量在一起對于治療所述缺乏或缺陷是有效的。 在另一個實施方案中，提供了一種用于治療遺傳性和獲得性凝結(jié)缺乏或缺陷的方法，包括施用(a)第一量的結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的單克隆抗體和(b)第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量在一起對于治療所述缺乏或缺陷是有效的，且進(jìn)一步其中因子VII不是共施用的。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的單克隆抗體和因子VIII或因子IX的組合，其中所述組合物不含因子VII?！耙蜃覸II”包括因子 VII和因子Vila。這些聯(lián)合療法有可能降低凝固因子的必要輸注頻率。共施用或聯(lián)合療法意指各自分開配制或在一種組合物中共同配制且當(dāng)分開配制時在近似相同時間或在不同時間，但在相同治療期里施用的兩種治療藥物的施用。
在一些實施方案中，本文中所描述的一種或多種抗體可以組合使用以決定止血病癥。例如，認(rèn)為本文中所描述的兩種或更多種抗體的共施用可用于治療血友病或其它止血病癥。
可以以如下劑量和頻率對患有血友病A或B的受試者胃腸外施用藥物組合物,所述劑量和頻率可以隨流血事件的嚴(yán)重程度而變化，或者在預(yù)防療法的情況中，可以隨患者的凝固缺乏的嚴(yán)重程度而變化。
可以以推注或者通過連續(xù)輸注來對有所需要的患者施用組合物。例如，作為Fab 片段存在的發(fā)明性抗體的推注施用可以在O. 0025至100mg/kg體重、O. 025至O. 25mg/kg、 O. 010至O. 10mg/kg或O. 10-0. 50mg/kg的量中。對于連續(xù)輸注，可以以O(shè). 001至100mg/kg 體重 / 分鐘、0. 0125 至 I. 25mg/kg/ 分鐘、0. 010 至 0. 75mg/kg/ 分鐘、0. 010 至 I. 0mg/kg/ 分鐘或0. 10-0. 50mg/g/分鐘施用作為Fab片段存在的發(fā)明性抗體，持續(xù)一段1_24小時、1_12 小時、2-12小時、6-12小時、2-8小時、或1_2小時的時間。對于施用作為全長抗體(具有完整的恒定區(qū))存在的發(fā)明性抗體，劑量量可以是約l-10mg/kg體重、2-8mg/kg、或5_6mg/kg。 此類全長抗體通常會通過延續(xù)一段30分鐘至3小時的時間的輸注來施用。施用頻率會取決于狀況的嚴(yán)重程度。頻率范圍可以為每周三次至每兩周至六個月一次。
另外，可以經(jīng)由皮下注射來對患者施用組合物。例如，可以經(jīng)由皮下注射每周、每兩周或每月對患者施用10至IOOmg抗TFPI抗體的劑量。
如本文中所使用的，“治療有效量”指有效增加體內(nèi)的凝固時間或者在其它情況中對有所需要的患者引起可測量的體內(nèi)益處所需要的抗TFPI單克隆抗體或所述抗體與因子 VIII或因子IX的組合的量。精確量會取決于許多因素，包括但不限于治療性組合物的成分和物理特征、預(yù)期的患者群體、個體患者考慮等,而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定。實施例
實施例I :克隆、表達(dá)和抗體表達(dá)水平的量化
將在重鏈C端攜帶c-myc標(biāo)簽和六組氨酸標(biāo)簽的野生型Fab 2A8和4B7的重和輕鏈亞克隆入 pET28a 細(xì)菌表達(dá)載體(Novagen/Merck Chemicals Ltd. , Nottingham, UK) 中，并轉(zhuǎn)化入 Top 10F 細(xì)胞(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)中?；蛘撸梢允褂闷渌?xì)菌表達(dá)載體(例如，PQE載體系統(tǒng)，Qiagen GmbH, Hilden, Germany)和菌株(例如， DH5 a，Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)。通過標(biāo)準(zhǔn)的基于寡聚物的定點(diǎn)誘變來生成變體，并通過DNA測序來確認(rèn)。具體地，在重和/或輕鏈內(nèi)修飾互補(bǔ)決定區(qū)內(nèi)或周圍的氨基酸殘基。
為了能夠使用野生型或突變體抗體作為競爭物，使用標(biāo)準(zhǔn)的基于PCR的技術(shù)來除去或替換位于重鏈C端的表位標(biāo)簽。具體地，對于4B7，對分析的所有變體將c-myc標(biāo)簽更換成血細(xì)胞凝集素(HA)表位標(biāo)簽。比較而言，作為競爭物使用的4B7野生型或變體攜帶 c-myc標(biāo)簽。在2A8的情況中，將c_myc表位標(biāo)簽用HA標(biāo)簽替換或刪除,生成僅在其C端展現(xiàn)出6x組氨酸表位標(biāo)簽的變體。
對于表達(dá),將變體轉(zhuǎn)化入BL21starDE3大腸桿菌菌株(Invitrogen, C6010-03)中， 將其接種入含有卡那霉素(30 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中的過夜培養(yǎng)物中，并于37° C溫育18 小時。通過將過夜培養(yǎng)物以1:20接種入具有卡那霉素(30 μ g/ml)的新鮮LB培養(yǎng)基中來生成表達(dá)培養(yǎng)物。在6小時后，添加ImM異丙基-b-D-Ι-硫代半乳糖吡喃糖苷(Roth, 2316. 5) 以誘導(dǎo)抗體表達(dá)，并將培養(yǎng)物于30° C再溫育18小時。或者，將過夜培養(yǎng)物以I: 20接種入自身誘導(dǎo)培養(yǎng)基過夜表達(dá)(Overnight Express) TB培養(yǎng)基(Merck, 71491),并于30° C溫育24小時。
對于量化表達(dá)水平，使用ELISA方法。簡言之，將MTP板(Nunc maxisorpblack, 460518)與在包被緩沖液(Candor Bioscience GmbH, 121500)中稀釋的 Fab 特異性抗體(Sigma，15260)于4° C 一起溫育過夜，用PBST(磷酸鹽緩沖液鹽水137mMNaCl, Merck I. 06404. 5000 ; 2. 7mM KCl, Merck I. 04936. 1000; IOmM Na2HPO4, MerckI. 06586. 2500, I. 8mM KH2PO4, Merck I. 04871. 5000 ；含有 0. 05%Tween 20AcrosOrganics, 233360010)清洗，用I3BST中的2%乳于室溫封閉I小時，并再次清洗。將培養(yǎng)物在PBS中的O. 25%脫脂乳(Fluka analytical, 70166)中稀釋，并于室溫結(jié)合MTP板達(dá)I小時。在用PBST清洗后，將捕獲的抗體與經(jīng)HRP偶聯(lián)的抗Fab抗體(Sigma，A0293) —起溫育，并通過將板與10 μ MAmplex紅底物(Invitrogen，Α12222)于室溫在黑暗中一起溫育10至30分鐘來檢測，接著進(jìn)行熒光測量。在測定濃度后相對于野生型純化的抗體(2A8或4B7)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平。
實施例2 :測定生成的抗體變體的活性和物種間交叉反應(yīng)性為了測定突變的抗體變體對人或小鼠TFPI (分別為AmericanDiagnostica, 4900B和R&D Systems, 2975-P1)的活性，使用平衡或競爭性ELISA測定法形式。簡言之，用分別在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或包被緩沖液(Candor BioscienceGmbH, 121500)中稀釋的 0. 04-2 μ g/ml 人或小鼠 TFPI 包被 MTP 板(MesoscaleDiscovery, L21XA-4 或 Nunc maxisorp 黑色(black)，460518),并于 4。C 溫育過夜。在清洗后，將板用PBST中的3%牛血清清蛋白(Sigma，A4503)于室溫封閉I小時，并重復(fù)清洗步驟。對于抗體的結(jié)合，10-25 μ I相對于其相應(yīng)的抗體表達(dá)水平(若沒有另外指示)標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)上清液于RT添加至板達(dá)I小時，接著用PBST清洗。然后，通過表位標(biāo)簽特異性抗體檢測結(jié)合的野生型和變體或者包括競爭步驟。對于競爭，添加50-300ηΜ競爭物或游離的抗原，并于室溫溫育20分鐘至24小時。在清洗后，用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的表位標(biāo)簽特異性抗體(Biomol,抗-c-myc A190-105P (對于2A8變體)和抗-HA A190-108P (對于4B7變體)或者通過先前依照制造商的關(guān)于電化學(xué)發(fā)光檢測檢測(MesoscaleDiscovery, R91AN-1)的用法說明書用sulfo_NHS試劑標(biāo)記的抗myc (Sigma, C3956)或抗HA抗體(Sigma, H6908)檢測剩余的變體。對于maxisorp板中的信號檢測,添加10 μ M Amplex紅底物(Invitrogen，A12222)，并于室溫在黑暗中溫育10至30分鐘，接著進(jìn)行熒光測量。對于MSD板中的檢測，將MSD閱讀緩沖液T在H2O (Mesoscale Discovery, R92TC-1)中稀釋2x,添加至板,并使用Mesoscale Discovery Sector成像儀6000于620nm檢測電化學(xué)發(fā)光信號。實施例3 :單個和多個氨基酸取代表I中提供了引入2A8重鏈或輕鏈中的單個氨基酸取代的幾個例子。在量化ELISA中一式四份分析變體的表達(dá)水平。在相對于相應(yīng)的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化后，對人和鼠TFPI在競爭性ELISA中一式四份分析性能，并且測定變體與野生型(wt)比率。自標(biāo)準(zhǔn)差通過誤差傳
播計算誤差。表I :對2A8內(nèi)單個氨基酸取代的分析。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO: I中所顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
2.權(quán)利要求I的分離的單克隆抗體，其中所述修飾選自下組取代、插入或缺失。
3.權(quán)利要求2的分離的單克隆抗體，其中所述修飾是取代。
4.權(quán)利要求3的分離的單克隆抗體，其中所述取代在選自下組的位置處Q1，R30S31, G33, M34, S35, S50, 151，R52, S54, S55, S56, K99 和 F104。
5.權(quán)利要求4的分離的單克隆抗體，其中所述取代選自下組Q1E，R30S,S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54F, S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L 和 F104Y。
6.權(quán)利要求I的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組IgGl,IgG2, IgG3, IgG4, I gM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗體。
7.權(quán)利要求I的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含選自下組的兩個或多個取代Q1E, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52 S，S54F, S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L 和 F104Y。
8.權(quán)利要求7的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含SEQIDN0:1中顯示的氨基酸序列，其中所述序列包含選自下組的下列取代(a)G33A+S35D+S55R+K99L;(b)G33P+I51D+S54F;(c)G33P+S35D+S54F+K99L;(d)I51D+S54F+K99L;(e)M34I+S35D+S55R+K99L;(f)M34K+S35D+S55R+K99L;(g)Q1E+R30S+S35D+S55G+S56G+K99L;(h)Q1E+R30S+S35D+S55R+S56G+K99L;(i)Q1E+S31V+S50A+151D+S55R+S56G+K99V；(j)QlE+S35D+S55R+K99L;(k)R30S+S31V+I51D+S55R+K99V ；(I)R30S+S35D+S55R+K99L;(m)S31V+G33A+I51D+S55R+K99V ；(n)S31V+G33P+I51D+S54F+K99V ；(o)S31V+G33P+S35D;(p)S31V+I51D+R52S+S55R+K99V ；(q)S31V+I51D+S54F+K99V ；(r)S31V+I51D+S55R;(s)S31V+I51D+S55R+K99L;(t)S31V+I51D+S55R+K99V ；(u)S31V+I51D+S55R+S56G+K99V ；(v)S31V+I51E+S55R+K99V ；(w)S31V+K99V ；(x)S31V+S35D;(y)S31V+S35D+I51D+K99V ；(z)S31V+S35D+S54F;(aa)S31V+S35D+S55R;(bb)S31V+S35L+I51D+S54F+K99V ；(cc)S31V+S35L+I51E+S54F+K99V ；(dd)S31V+S50A+I51D+S55R+K99V ；(ee)S31V+S54F+K99L;(ff)S35D+I51D+K99L;(gg)S35D+I51D+S55R+K99V ；(hh)S35D+I51E+S55R+K99L;(ii)S35D+K99L ；(jj)S35D+R52S+K99L;(kk)S35D+R52S+S55R+K99L;(11)S35D+S50A+K99L;(mm)S35D+S50A+S55R+K99L;(nn)S35D+S54F+S55R+K99L;(oo)S35D+S55G+K99L;(pp)S35D+S55R+K99L;(qq)S35D+S55R+S56G+K99L;(rr)S35D+S56G+K99L;和 (ss)S35L+S54F+K99V0
9.一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
10.權(quán)利要求9的分離的單克隆抗體，其中所述修飾選自下組取代、插入或缺失。
11.權(quán)利要求10的分離的單克隆抗體，其中所述修飾是取代。
12.權(quán)利要求11的分離的單克隆抗體，其中所述取代在選自下組的位置處D1，I2，A1 3，S21, N26, R28, N29, A32, H33, Y48, Y49, N51, N52, P54, G56, E80, S89, D91, D92, G93, V94, P95 和 V96。
13.權(quán)利要求12的分離的單克隆抗體，其中所述取代選自下組D1S，I2Y， A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L, G56D, E80M, S8 9A, D91L, D91R, D91W, D91K, D92S, D92T, G93S, V94T, P95V, P95A, V96G, V96M 和 V96W。
14.權(quán)利要求9的分離的單克隆抗體,其中所述抗體選自下組IgGl,IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗體。
15.權(quán)利要求9的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含選自下組的兩個或多個取代D1S, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P5 4L, G56D, E80M, S89A, D91L, D91R, D91W, D91K, D92S, D92T, G93S, V94T, P95V, P95A, V96G, V96M 和 V96W。
16.權(quán)利要求15的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含SEQIDN0:2中顯示的氨基酸序列，其中所述序列包含選自下組的下列取代(a)Al3S+Y48F+N5IV+D9Iff;(b)DlS+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+E80M+D91L+D92S+V94T+V96ff;(c)DlS+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51S+E80M+D91L+D92S+V94T+V96ff;(d)DIS+I2Y+AI3S+S2IT+R28P+N29K+Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;(e)DlS+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51V+E80M+S89A+D91ff+D92S+G93S+V94T;(f)DIS+I2Y+AI3S+S2IT+R28P+N29K+Y48F+Y49R+N5IS+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W;(g)DIS+I2Y+AI3S+S2IT+R28P+Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;(h)DlS+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N51V+E80M+S89A+D91ff+D92S+G93S+V94T;(i)DlS+Y48F+N51V+D91ff;(j)D91L+V96ff;(k)H33Y+Y48F+N51V+D9Iff;(I)I2Y+Y48F+N51V+D91ff;(m)N26A+Y48F+N51V+D9Iff;(n)N29K+Y48F+N5IV+D9Iff;(o)N51V+D91K;(p)N51V+D91ff;(q)R28P+Y48F+N51V+D9Iff;(r)S21T+Y48F+N51V+D91W;(s)Y48F+D91K;(t)Y48F+D91L+D92S+V96ff;(u)Y48F+D91L+G93S+V96W;(V)Y48F+D91L+P95V+V96W;(w)Y48F+D9IL+V94T+V96W;(X)Y48F+D91L+V96W;(y)Y48F+D91W;(z)Y48F+N5IS+D9IL+V96W;(aa)Y48F+N51V ；(bb)Y48F+N51V+D91L;(cc)Y48F+N5IV+D91L+V96W;(dd)Y48F+N51V+D91W;(ee)Y48F+N5IV+D91W+D92S;(ff)Y48F+N5IV+D91W+G93S;(gg)Y48F+N51V+D91W+P95V ；(hh)Y48F+N5IV+D91W+V94T;(ii)Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;(jj)Y48F+N51V+G56D+V96W;(kk)Y48F+N5IV+S89A+D9Iff;(II)Y48F+N5IV+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T+P95A;(mm)Y48F+N51V+V96W;(nn)Y48F+N52G;(00)Y48F+N52G+D91L+V96ff;和 (pp)Y48F+S89A+D91L+V96W。
17.一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含(a)包含SEQID NO: I中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾；和(b)包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
18.權(quán)利要求17的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈修飾是取代。
19.權(quán)利要求18的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈取代包含選自下組的取代 QlE, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54 F，S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L 和 F104Y。
20.權(quán)利要求17的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含兩個或多個取代。
21.權(quán)利要求20的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含選自下組的取代(a)G33A+S35D+S55R+K99L;(b)G33P+I51D+S54F;(c)G33P+S35D+S54F+K99L;(d)I51D+S54F+K99L;(e)M34I+S35D+S55R+K99L;(f)M34K+S35D+S55R+K99L;(g)Q1E+R30S+S35D+S55G+S56G+K99L;(h)Q1E+R30S+S35D+S55R+S56G+K99L;(1)Q1E+S31V+S50A+151D+S55R+S56G+K99V；(j)QlE+S35D+S55R+K99L;(k)R30S+S31V+I51D+S55R+K99V ；(I)R30S+S35D+S55R+K99L;(m)S31V+G33A+I51D+S55R+K99V ；(n)S31V+G33P+I51D+S54F+K99V ；(o)S31V+G33P+S35D;(p)S31V+I51D+R52S+S55R+K99V ；(q)S31V+I51D+S54F+K99V ；(r)S31V+I51D+S55R;(s)S31V+I51D+S55R+K99L;(t)S31V+I51D+S55R+K99V ；(u)S31V+I51D+S55R+S56G+K99V ；(v)S31V+I51E+S55R+K99V ；(w)S31V+K99V ；(x)S31V+S35D;(y)S31V+S35D+I51D+K99V ；(z)S31V+S35D+S54F;(aa)S31V+S35D+S55R;(bb)S31V+S35L+I51D+S54F+K99V ；(cc)S31V+S35L+I51E+S54F+K99V ；(dd)S31V+S50A+I51D+S55R+K99V ；(ee)S31V+S54F+K99L;(ff)S35D+I51D+K99L;(gg)S35D+I51D+S55R+K99V ；(hh)S35D+I51E+S55R+K99L;(ii)S35D+K99L;(jj)S35D+R52S+K99L;(kk)S35D+R52S+S55R+K99L;(11)S35D+S50A+K99L;(mm)S35D+S50A+S55R+K99L;(nn)S35D+S54F+S55R+K99L;(00)S35D+S55G+K99L;(pp)S35D+S55R+K99L;(qq)S35D+S55R+S56G+K99L;(rr)S35D+S56G+K99L;和 (ss)S35L+S54F+K99V0
22.權(quán)利要求17的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈修飾是取代。
23.權(quán)利要求22的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈取代包含選自下組的取代 DlS, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L, G56D ，E80M, S89A, D91L, D91R, D91ff,D91K, D92S, D92T, G93S, V94T,P95V,P95A, V96G，V96M和 V96W。
24.權(quán)利要求17的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含兩個或多個取代。
25.權(quán)利要求24的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含選自下組的取代(a)Al3S+Y48F+N5IV+D9Iff;(b)DlS+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+E80M+D91L+D92S+V94T+V96ff;(c)DIS+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N5IS+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W;(d)DIS+I2Y+AI3S+S2IT+R28P+N29K+Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;(e)DlS+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51V+E80M+S89A+D91ff+D92S+G93S+V94T;(f)DIS+I2Y+AI3S+S2IT+R28P+N29K+Y48F+Y49R+N5IS+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W;(g)DIS+I2Y+AI3S+S2IT+R28P+Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;(h)DlS+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N51V+E80M+S89A+D91ff+D92S+G93S+V94T;(1)DlS+Y48F+N51V+D91ff;(j)D91L+V96ff;(k)H33Y+Y48F+N51V+D9Iff;(l)I2Y+Y48F+N51V+D91ff;(m)N26A+Y48F+N51V+D9Iff;(n)N29K+Y48F+N5IV+D9Iff;(o)N51V+D91K;(p)N51V+D91ff;(q)R28P+Y48F+N51V+D9Iff;(r)S21T+Y48F+N51V+D91W;(s)Y48F+D91K;(t)Y48F+D91L+D92S+V96ff;(u)Y48F+D91L+G93S+V96W;(V)Y48F+D91L+P95V+V96W;(w)Y48F+D9IL+V94T+V96W;(X)Y48F+D91L+V96W;(y)Y48F+D91W;(z)Y48F+N5IS+D9IL+V96W;(aa)Y48F+N51V ；(bb)Y48F+N51V+D91L;(cc)Y48F+N5IV+D91L+V96W;(dd)Y48F+N51V+D91W;(ee)Y48F+N5IV+D91W+D92S;(ff)Y48F+N5IV+D91W+G93S;(gg)Y48F+N51V+D91W+P95V ；(hh)Y48F+N5IV+D91W+V94T;(ii)Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;(jj)Y48F+N51V+G56D+V96W;(kk)Y48F+N5IV+S89A+D9Iff;(II)Y48F+N5IV+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T+P95A;(mm)Y48F+N51V+V96W;(nn)Y48F+N52G;(oo)Y48F+N52G+D91L+V96ff;和 (pp)Y48F+S 89A+D9IL+V96W。
26.權(quán)利要求17的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組IgGl，IgG2,IgG3, IgG4 ，IgM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗體。
27.一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含SEQ ID NO: 3中顯示的且包含一個或多個氨基酸修飾的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求27的分離的單克隆抗體，其中所述修飾選自下組取代、插入或缺失。
29.權(quán)利要求28的分離的單克隆抗體，其中所述修飾是取代。
30.權(quán)利要求29的分離的單克隆抗體，其中所述取代在選自下組的位置處Q1，S30,N3 2，S37, G44, 153，K55, S57, K58, N61, D62, H103, H107, G109 和 Y112。
31.權(quán)利要求30的分離的單克隆抗體，其中所述取代選自下組QlE, S30R, N32D, N32E, S33G, S37N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M, N61G, N61T, D62I, D62 R,D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N,D62K, H103D, H103G, H107M,G109A 和 Y112D。
32.權(quán)利要求27的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含選自下組的兩個或多個取代Q1E, S30R, N32D, N32E, S33G, S37N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M, N61G, N61T, D 621，D62R, D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N, D62K, H103D, H103G, H107M, G109A 和 Y112D。
33.權(quán)利要求32的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含SEQIDN0:3中顯示的氨基酸序列，其中所述序列包含選自下組的下列取代(a)D62Q+H107M+Y112D;(b)D62Q+Y112D;(c)D62R+H107M+Y112D;(d)D62R+Y112D;(e)D62S+H107M+Y112D;(f)N32D+D62K+Y112D;(g)N32D+D62Q+H107M+Y112D;(h)N32D+D62Q+Y112D;(i)N32D+D62R+H103D;(j)N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D;(k)N32D+D62R+H107M;(I)N32D+D62R+H107M+Y112D;(m)N32D+D62R+Y112D;(n)N32D+D62S+H107M+Y112D;(o)N32D+G44S+D62R+Y112D;(p)N32D+I53T+D62Q+Y112D;(q)N32D+I53T+D62R+Y112D;(r)N32D+K55Y+D62Q+Y112D;(s)N32D+K55Y+D62R+Y112D;(t)N32D+S37N+D62R+Y112D;(u)Q1E+N32D+D62R+Y112D;(V)Q1E+N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D;(w)N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D (x)S30R+S57K;(y) N61G+D62V ;和 (z)K58M+D62N。
34.權(quán)利要求27的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組IgGl，IgG2,IgG3, IgG4 ，IgM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗體。
35.一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含SEQ ID NO: 4中顯示的且包含一個或多個氨基酸修飾的氨基酸序列。
36.權(quán)利要求35的分離的單克隆抗體，其中所述修飾選自下組取代、插入或缺失。
37.權(quán)利要求36的分離的單克隆抗體，其中所述修飾是取代。
38.權(quán)利要求37的分離的單克隆抗體，其中所述取代在選自下組的位置處:M4，V30，F(xiàn)3 1，S32，D33，N35，T36，Y37，N39，L42, K44，Q50，L51, Y54，K55，G56，S57，A60，S61，D97 和 S98。
39.權(quán)利要求38的分離的單克隆抗體，其中所述取代選自下 a:M4I，M4L，V30L，F(xiàn)31I，F(xiàn)31M，F(xiàn)31Y， F31H，S32L，S32R，S32Y， D33F，D33R，N35I，N35L, N35T，N35V，T36N，Y37F，N39D，L42Q, K44R，Q50R，L51R, Y54F，K55L, G5 6D，G56A，G56V，S57Y，A60D，S61C，D97M，D97T 和 S98H。
40.權(quán)利要求35的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含選自下組的兩個或多個取 Χ M4I, M4L, V30L, F31I, F31M, F31Y, F31H, S32L, S32R, S32Y, D33F，D33R，Ν35Ι，N35L, Ν35Τ，N35V，Τ36Ν，Y37F，N39D，L42Q, K44R，Q50R，L51R, Y54F，K55L, G5 6D，G56A，G56V，S57Y，A60D，S61C，D97M，D97T 和 S98H。
41.權(quán)利要求40的分離的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體包含SEQIDN0:4中顯示的氨基酸序列，其中所述序列包含選自下組的下列取代ID33F+N35I;D33F+N35I+D97T;D33F+N35T+Y37F; d)D33R+N35I;D33R+N35I+D97T;D33R+N35T;F31H+S32R+D33F+N35I+D97T;F31I+D33F+N35I;F31I+D33F+N35I+D97T;F31I+D33F+N35I+K44R; k)F31I+D33F+N35I+L42Q;F31I+D33F+N35I+S98H; m；F31I+D33F+N35I+T36N; n；F31I+D33R; o；F31I+D33R+N35IF31I+N35I;F31I+S32R+D33F+N35I+D97T;F31I+S32R+D33F+N35T;F31I+S32R+D33R+N35I+D97T;F31I+S32R+N35I+D97T; u；F31M+D33F; v；F31M+D33F+N35I; w；F31M+D33F+N35T; x；F31M+D33F+N35T+Y37F;F31M+D33R;F31M+D33R+N35I; aa)F31M+S32L+D33R+N35I+D97T;(bb)F31M+S32R+D33F+D97T;(cc)F31M+S32R+D33F+N35I;(dd)F31M+S32R+D33F+N35I+D97T; (ee)F31M+S32R+D33R;(ff)F31M+S32R+D33R+N35I;(gg)F31M+S32R+D33R+N35I+D97T;(hh)F31M+S32R+D33R+N35T;(ii)F31Y+S32R+D33F+N35I+D97T; (jj)M4I+S32R+D33F+N35I+D97T;(kk)M4L+S32R+D33F+N35I+D97T;(II)N35T+D97T;(mm)S32R+D33F;(nn)S32R+D33F+N35I;(oo)S32R+D33F+N35I+A60D+D97T;(pp)S32R+D33F+N35I+D97T;(qq)S32R+D33F+N35I+D97T+S98H;(rr)S32R+D33F+N35I+G56V+D97T;(ss)S32R+D33F+N35I+K44R+D97T;(tt)S32R+D33F+N35I+K55L+D97T;(uu)S32R+D33F+N35I+L42Q+D97T;(vv)S32R+D33F+N35I+L51R+D97T;(ww)S32R+D33F+N35I+N39D+D97T;(XX)S32R+D33F+N35I+Q50R+D97T;(yy)S32R+D33F+N35I+T36N+D97T; (zz)S32R+D33F+N35T;(aaa)S32R+D33R;(bbb)S32R+D33R+N35I;(ccc)S32R+D33R+N35I+D97T; (ddd)S32R+D33R+N35T;(eee)S32R+N35I;(fff)S32R+N35T;(ggg)S32R+N35T+D97T;(hhh)V30L+F31I+D33F+N35I;(iii)V30L+S32R+D33F+N35I+D97T; (jjj)V30L+S32R+D33F+N35I+T36N+D97T; (kkk)V30L+S32R+N35I+T36N;(III)N35V+G56D;(mmm)N35L+G56A;和 (nnn)D33F+Y54F。
42.權(quán)利要求35的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組IgGl，IgG2，IgG3，IgG4 ，IgMj IgAlj IgA2，分泌性 IgAj IgD 和 IgE 抗體。
43.—種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含(a)包含SEQID N0:3中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾；和(b)包含SEQID N0:4中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
44.權(quán)利要求43的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈修飾是取代。
45.權(quán)利要求44的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈取代包含選自下組的取代Q1E， S30R，N32D，N32E，S33G，S37N，G44S，I53T，K55Y，S57K，S57R，K58M，N61G，N61T，D62I，D62R，D6 2Q，D62L, D62S，D62V，D62N，D62K，H103D，H103G，H107M，G109A 和 Y112D。
46.權(quán)利要求43的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含兩個或多個取代。
47.權(quán)利要求46的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含選自下組的取代 D62Q+H107M+Y112D;D62Q+Y112D;D62R+H107M+Y112D;d)D62R+Y112D;D62S+H107M+Y112D;N32D+D62K+Y112D;N32D+D62Q+H107M+Y112D;N32D+D62Q+Y112D;N32D+D62R+H103D;N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D; k)N32D+D62R+H107M;N32D+D62R+H107M+Y112D;N32D+D62R+Y112D;N32D+D62S+H107M+Y112D;N32D+G44S+D62R+Y112D;N32D+I53T+D62Q+Y112D;N32D+I53T+D62R+Y112D;N32D+K55Y+D62Q+Y112D;N32D+K55Y+D62R+Y112D;N32D+S37N+D62R+Y112D;Q1E+N32D+D62R+Y112D;Q1E+N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D;N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D S30R+S57K;N61G+D62V ;和 K58M+D62N。
48.權(quán)利要求43的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈修飾是取代。
49.權(quán)利要求48的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈取代包含選自下組的取代M4I，M4L,V30L, F31I，F(xiàn)31M，F(xiàn)31Y，F(xiàn)31H，S32L,S32R，S32Y， D33F，D33R，N35I，N35L, N35T，N35V，T36N，Y37F，N39D，L42Q, K44R，Q50R，L51R, Y54F，K55L, G5 6D，G56A，G56V ;S57Y，A60D，S61C，D97M，D97T 和 S98H。
50.權(quán)利要求43的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含兩個或多個取代。
51.權(quán)利要求50的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含選自下組的取代 D33F+N35I;D33F+N35I+D97T;D33F+N35T+Y37F;d)D33R+N35I;D33R+N35I+D97T;D33R+N35T;F31H+S32R+D33F+N35I+D97T;F31I+D33F+N35I;F31I+D33F+N35I+D97T;F31I+D33F+N35I+K44R; F31I+D33F+N35I+L42Q; F31I+D33F+N35I+S98H; F31I+D33F+N35I+T36N; F31I+D33R;F31I+D33R+N35I;F31I+N35I;F31I+S32R+D33F+N35I+D97T; F31I+S32R+D33F+N35T; F31I+S32R+D33R+N35I+D97T; F31I+S32R+N35I+D97T; F31M+D33F;F31M+D33F+N35I; F31M+D33F+N35T; F31M+D33F+N35T+Y37F; F31M+D33R;F31M+D33R+N35I; aa)F31M+S32L+D33R+N35I+D97T; bb)F31M+S32R+D33F+D97T; cc)F31M+S32R+D33F+N35I; dd)F31M+S32R+D33F+N35I+D97T; ee)F31M+S32R+D33R; ff)F31M+S32R+D33R+N35I;(gg)F31M+S32R+D33R+N35I+D97T;(hh)F31M+S32R+D33R+N35T;(ii)F31Y+S32R+D33F+N35I+D97T;(jj)M4I+S32R+D33F+N35I+D97T;(kk)M4L+S32R+D33F+N35I+D97T;(II)N35T+D97T;(mm)S32R+D33F;(nn)S32R+D33F+N35I;(oo)S32R+D33F+N35I+A60D+D97T;(pp)S32R+D33F+N35I+D97T;(qq)S32R+D33F+N35I+D97T+S98H;(rr)S32R+D33F+N35I+G56V+D97T;(ss)S32R+D33F+N35I+K44R+D97T;(tt)S32R+D33F+N35I+K55L+D97T;(uu)S32R+D33F+N35I+L42Q+D97T;(vv)S32R+D33F+N35I+L51R+D97T;(ww)S32R+D33F+N35I+N39D+D97T;(XX)S32R+D33F+N35I+Q50R+D97T;(yy)S32R+D33F+N35I+T36N+D97T;(zz)S32R+D33F+N35T;(aaa)S32R+D33R;(bbb)S32R+D33R+N35I;(ccc)S32R+D33R+N35I+D97T;(ddd)S32R+D33R+N35T;(eee)S32R+N35I;(fff)S32R+N35T;(ggg)S32R+N35T+D97T;(hhh)V30L+F31I+D33F+N35I;(iii)V30L+S32R+D33F+N35I+D97T;(jjj)V30L+S32R+D33F+N35I+T36N+D97T;(kkk)V30L+S32R+N35I+T36N;(III)N35V+G56D;(mmm)N35L+G56A;和 (nnn)D33F+Y54F。
52.權(quán)利要求43的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組IgGl，IgG2,IgG3, IgG4 ，IgM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗體。
53.一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含(a)包含SEQ ID N0:1中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾；和(b)包含SEQ ID NO: 4中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
54.權(quán)利要求53的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈修飾是取代。
55.權(quán)利要求54的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈取代包含選自下組的取代 QlE, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54 F，S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L,和 F104Y。
56.權(quán)利要求53的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含兩個或多個取代。
57.權(quán)利要求56的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含選自下組的取代 IG33A+S35D+S55R+K99L;G33P+I51D+S54F;G33P+S35D+S54F+K99L;I51D+S54F+K99L;M34I+S35D+S55R+K99L;M34K+S35D+S55R+K99L;Q1E+R30S+S35D+S55G+S56G+K99L;Q1E+R30S+S35D+S55R+S56G+K99L;Q1E+S31V+S50A+151D+S55R+S56G+K99V ；Q1E+S35D+S55R+K99L;R30S+S31V+I51D+S55R+K99V ；R30S+S35D+S55R+K99L;m)S31V+G33A+I51D+S55R+K99V ； n)S31V+G33P+I51D+S54F+K99V ；IS31V+G33P+S35D;S31V+151D+R52S+S55R+K99V ；S31V+I51D+S54F+K99V ；S31V+I51D+S55R;S31V+I51D+S55R+K99L;S31V+I51D+S55R+K99V ；S31V+151D+S55R+S56G+K99V ；S31V+I51E+S55R+K99V ；S31V+K99V ；S31V+S35D;S31V+S35D+I51D+K99V ；S31V+S35D+S54F; aa)S31V+S35D+S55R; bb)S3IV+S35L+I51D+S54F+K99V cc)S3IV+S35L+I51E+S54F+K99V dd)S3IV+S50A+I51D+S55R+K99V ee)S31V+S54F+K99L;(ff)S35D+I51D+K99L;(gg)S35D+I51D+S55R+K99V ；(hh)S35D+I51E+S55R+K99L;(ii)S35D+K99L ；(jj)S35D+R52S+K99L;(kk)S35D+R52S+S55R+K99L;(11)S35D+S50A+K99L;(mm)S35D+S50A+S55R+K99L;(nn)S35D+S54F+S55R+K99L;(00)S35D+S55G+K99L;(pp)S35D+S55R+K99L;(qq)S35D+S55R+S56G+K99L;(rr)S35D+S56G+K99L;和 (ss)S35L+S54F+K99V0
58.權(quán)利要求53的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈修飾是取代。
59.權(quán)利要求58的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈取代包含選自下組的取代M4I, M4L, V30L, F31I, F31M, F31Y，F(xiàn)31H, S32L, S32R, S32Y， D33F, D33R, N35I, N35L, N35T, N35V, T36N, Y37F, N39D, L42Q, K44R, Q50R, L51R, Y54F, K55L, G56D, G56A, G56V, S57Y, A60D, S61C, D97M, D97T 和 S98H。
60.權(quán)利要求53的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含兩個或多個取代。
61.權(quán)利要求60的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含選自下組的取代(a)D33F+N35I;(b)D33F+N35I+D97T;(c)D33F+N35T+Y37F;(d)D33R+N35I;(e)D33R+N35I+D97T;(f)D33R+N35T;(g)F31H+S32R+D33F+N35I+D97T;(h)F31I+D33F+N35I;(1)F31I+D33F+N35I+D97T;(j)F3II+D33F+N35I+K44R;(k)F3II+D33F+N35I+L42Q;(1)F31I+D33F+N35I+S98H;(m)F31I+D33F+N35I+T36N;(n)F31I+D33R;(o)F31I+D33R+N35I;(p)F31I+N35I;(q)F31I+S32R+D33F+N35I+D97T;(r)F31I+S32R+D33F+N35T;s)F31I+S32R+D33R+N35I+D97T; t)F31I+S32R+N35I+D97T; u)F31M+D33F;V)F31M+D33F+N35I; w)F31M+D33F+N35T; x)F31M+D33F+N35T+Y37F; y)F31M+D33R; z)F31M+D33R+N35I;aaF31M+S32L+D33R+N35I+D97TbbF31M+S32R+D33F+D97T;CCF31M+S32R+D33F+N35I;ddF31M+S32R+D33F+N35I+D97TeeF31M+S32R+D33R;ffF31M+S32R+D33R+N35I;ggF31M+S32R+D33R+N35I+D97ThhF31M+S32R+D33R+N35T;iiF31Y+S32R+D33F+N35I+D97TjjM4I+S32R+D33F+N35I+D97T;kkM4L+S32R+D33F+N35I+D97T;11N35T+D97T;mmS32R+D33F;nnS32R+D33F+N35I;OOS32R+D33F+N35I+A60D+D97TPPS32R+D33F+N35I+D97T;qqS32R+D33F+N35I+D97T+S98HrrS32R+D33F+N35I+G56V+D97TSSS32R+D33F+N35I+K44R+D97TttS32R+D33F+N35I+K55L+D97TUUS32R+D33F+N35I+L42Q+D97TVVS32R+D33F+N35I+L51R+D97TWWS32R+D33F+N35I+N39D+D97TXXS32R+D33F+N35I+Q50R+D97TyyS32R+D33F+N35I+T36N+D97TZZS32R+D33F+N35T;aaa)S32R+D33R; bbb)S32R+D33R+N35I; ccc)S32R+D33R+N35I+D97T; ddd)S32R+D33R+N35T; eee)S32R+N35I;(fff)S32R+N35T;(ggg)S32R+N35T+D97T;(hhh)V30L+F31I+D33F+N35I;(iii)V30L+S32R+D33F+N35I+D97T;(jjj)V30L+S32R+D33F+N35I+T36N+D97T;(kkk)V30L+S32R+N35I+T36N;(111)N35V+G56D;(mmm)N35L+G56A;和 (nnn)D33F+Y54F。
62.權(quán)利要求53的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組IgGl，IgG2,IgG3, IgG4 ，IgM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗體。
63.一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含(a)包含SEQID N0:3中顯示的氨基酸序列的重鏈，其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾；和(b)包含SEQID NO: 2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
64.權(quán)利要求63的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈修飾是取代。
65.權(quán)利要求64的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈取代包含選自下組的取代 QlE, S30R, N32D,N32E, S33G, S37N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M,N61G, N61T, D62I, D62R, D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N, D62K, H103D, H103G, H107M,G109A 和 Y112D。
66.權(quán)利要求63的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含兩個或多個取代。
67.權(quán)利要求66的分離的單克隆抗體，其中所述重鏈包含選自下組的取代(a)D62Q+H107M+Y112D;(b)D62Q+Y112D;(c)D62R+H107M+Y112D;(d)D62R+Y112D;(e)D62S+H107M+Y112D;(f)N32D+D62K+Y112D;(g)N32D+D62Q+H107M+Y112D;(h)N32D+D62Q+Y112D;(i)N32D+D62R+H103D;(j)N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D;(k)N32D+D62R+H107M;(I)N32D+D62R+H107M+Y112D;(m)N32D+D62R+Y112D;(n)N32D+D62S+H107M+Y112D;(o)N32D+G44S+D62R+Y112D;(p)N32D+I53T+D62Q+Y112D;(q)N32D+I53T+D62R+Y112D;(r)N32D+K55Y+D62Q+Y112D;(s)N32D+K55Y+D62R+Y112D;(t)N32D+S37N+D62R+Y112D;(u)Q1E+N32D+D62R+Y112D;(V)Q1E+N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D;(w)N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D (x)S30R+S57K;(y) N61G+D62V ;和 (z)K58M+D62N。
68.權(quán)利要求63的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈修飾是取代。
69.權(quán)利要求68的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈取代包含選自下組的取代 DlS, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L, G56D ，E80M, S89A, D91L, D91R, D91ff,D91K, D92S, D92T，G93S, V94T, P95V,P95A, V96G，V96M和 V96W。
70.權(quán)利要求63的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含兩個或多個取代。
71.權(quán)利要求70的分離的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含選自下組的取代(a) A13S+Y48F+N51V+D91W;IDlS+I2Y+AI3S+S21T+R28P+N29K+Y48F+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W;IDIS+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51S+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W; d)DIS+I2Y+AI3S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N5IV+E80M+D9Iff; ID1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51V+E80M+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T;DIS+I2Y+AI3S+S2IT+R28P+N29K+Y48F+Y49R+N5IS+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W;DIS+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N51V+E80M+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T; D1S+Y48F+N51V+D91W;D91L+V96W;H33Y+Y48F+N51V+D91W;I2Y+Y48F+N51V+D91W; mjN26A+Y48F+N5IV+D9Iff; n；N29K+Y48F+N5IV+D9Iff;N51V+D91K;N51V+D91W;R28P+Y48F+N51V+D91W;S21T+Y48F+N51V+D91W;Y48F+D91K;Y48F+D91L+D92S+V96W Y48F+D91L+G93S+V96W Y48F+D91L+P95V+V96W Y48F+D91L+V94T+V96W Y48F+D91L+V96W;(y)Y48F+D91W;(z)Y48F+N5IS+D9IL+V96W;(aa)Y48F+N51V ；(bb)Y48F+N51V+D91L;(cc)Y48F+N5IV+D91L+V96W;(dd)Y48F+N51V+D91W;(ee)Y48F+N5IV+D91W+D92S;(ff)Y48F+N5IV+D91W+G93S;(gg)Y48F+N51V+D91W+P95V ；(hh)Y48F+N5IV+D91W+V94T;(ii)Y48F+N5IV+E80M+D9Iff;(jj)Y48F+N51V+G56D+V96W;(kk)Y48F+N5IV+S89A+D9Iff;(II)Y48F+N5IV+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T+P95A;(mm)Y48F+N51V+V96W;(nn)Y48F+N52G;(oo)Y48F+N52G+D91L+V96ff;和 (pp)Y48F+S89A+D91L+V96ff0
72.權(quán)利要求63的分離的單克隆抗體，其中所述抗體選自下組IgGl，IgG2,IgG3, IgG4 ，IgM, IgAl, IgA2,分泌性 IgA, IgD 和 IgE 抗體。
73.前述權(quán)利要求中任一項的權(quán)利要求的抗體，其中在存在所述抗體的情況中的血液凝固時間是縮短的。
74.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體具有升高的對TFPI的親和力。
75.前述權(quán)利要求中任一項的抗體，其中所述抗體具有升高的對TFPI的阻斷活性。
76.—種藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求1-72中任一項的單克隆抗體和藥學(xué)可接受載體。
77.一種用于治療遺傳性或獲得性凝固缺乏或缺陷的方法，包括對患者施用治療有效量的權(quán)利要求76的藥物組合物。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述方法治療血友病A，B或C。
79.一種用于縮短出血時間的方法，包括對患者施用治療有效量的權(quán)利要求76的藥物組合物。
80.一種編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體的分離的核酸分子，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO: I中顯不的氨基酸序列的重鏈,其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
81.—種編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體的分離的核酸分子，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
82.—種編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體的分離的核酸分子，其中所述抗體包含含有SEQ ID NO:3中顯不的氨基酸序列的重鏈,其中所述重鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
83.—種編碼結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的抗體的分離的核酸分子，其中所述抗體包含含有SEQ ID N0:4中顯示的氨基酸序列的輕鏈，其中所述輕鏈氨基酸序列包含一個或多個氨基酸修飾。
84.—種載體，其包含權(quán)利要求80，81，82或83的核酸分子。
85.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求84的載體。
86.—種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含含有選自下組的氨基酸序列的重鏈SEQ ID NO:5, 6，7，8，9，10，11，19，20，21，22，23，24，25 和 26。
87.一種結(jié)合人組織因子途徑抑制劑的分離的單克隆抗體，其中所述抗體包含含有選自下組的氨基酸序列的輕鏈SEQ ID NO: 12, 13，14，15，16，.17，18，27，28，29，30，31，32，33 和34。
全文摘要
本發(fā)明提供了結(jié)合人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的分離的單克隆抗體。還涵蓋編碼結(jié)合TFPI的單克隆抗體的分離的核酸分子。還提供了包含抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和通過施用該抗體治療凝固缺乏或缺陷的方法。還提供了生成所述抗體的方法。
文檔編號A61K39/00GK102939098SQ201180022078
公開日2013年2月20日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者王卓智, 潘俊亮, J.格魯?shù)陆蛩箍? C.沃特斯梅爾, J.特貝, J.伯肯菲爾德, N.沃布斯特, S.布呂克納, S.施泰尼希, P.肖爾茨 申請人:拜耳醫(yī)藥保健有限公司