專利名稱：脂質(zhì)囊泡組合物和使用方法
脂質(zhì)囊泡組合物和使用方法相關(guān)申請根據(jù)35 U. S. C. § 119(e)，本申請要求于2010年3月19日提交的題為“MICR0-ANDNANOPARTICLES WITH SELF-ASSEMBLED LIPID COATINGS FOR SURFACE DISPLAY OF DRUGSSUCH AS VACCINE ANTIGENS AND ADJUVANTS”的美國臨時申請序列號61/315，485和于2010年3月 31 提交的題為 “INTERBILAYER CROSSLINKED MULTI LAMELLAR VESICLES” 的美國臨時申請序列號61/319，709的權(quán)益，二者的全部內(nèi)容通過引用并入本文。聯(lián)邦政府資助研究在NIH的資助No. CA140476和國防部的資助No. W911NF-07-D-0004號的政府支持下進行本發(fā)明。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體被廣泛用作小分子的遞送載劑；但是，在脂質(zhì)體中實現(xiàn)許多大分子藥物的高水平包封仍然是困難的，而且許多藥物制劑從脂質(zhì)體泄露得太快而不能維持有用的藥物遞送動力學(xué)。雖然通過微顆粒和納米顆粒進行的藥物遞送可以包封蛋白質(zhì)和小分子藥物，但其仍通常產(chǎn)生總質(zhì)量非常低的單位顆粒質(zhì)量的包封藥物，通常為 10 μ g藥物/mg顆粒左右。此外，用于合成高分子顆粒的有機溶劑以及這些顆粒中的疏水/酸性環(huán)境可破壞治療。(參見 Zhu 等，Nat. Biotechnol. 2000 18:52-57。)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了具有較高負(fù)載能力和較長釋放譜的具有新穎性和創(chuàng)造性的藥物遞送系統(tǒng)，所述較高負(fù)載能力是同時封閉(sequester)高水平的疏水和親水試劑二者的能力。這些遞送系統(tǒng)的一些方面包括具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層的穩(wěn)定化多層脂質(zhì)囊泡(在本文中稱為雙層間交聯(lián)多層囊泡(interbilayer-crosslinked multilamellar vesicle)或 ICMV)。如實施例所示，本發(fā)明的囊泡具有出乎意料的提高的包封效力(例如，在一些情況下，是簡單脂質(zhì)體效率的100倍)，并且它們能夠通過緩慢且持續(xù)的動力學(xué)釋放所包封的(或者以另外方式截留的)試劑，即使在血清的存在下也是如此，這使得它們成為高度符合理想的體內(nèi)持續(xù)遞送載劑。此外，如在本文中更詳細(xì)地描述的，本發(fā)明的囊泡可以在水性環(huán)境中合成，從而避免常見于多種現(xiàn)有技術(shù)方法的嚴(yán)苛條件，包括使用有機溶劑和/或酸性環(huán)境。因此，這些合成方法更適于多種試劑，包括使用這些現(xiàn)有技術(shù)方法通常會在結(jié)構(gòu)上和/或功能上受影響的那些。因此，所得囊泡不含有機溶劑，并可以僅包含脂質(zhì)(包括生物可降解脂質(zhì))和包封或嵌入其中的任意試劑。本發(fā)明部分基于如在本文中更詳細(xì)地描述的本發(fā)明囊泡的這些和其他令人驚訝且出乎意料的性質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了這些穩(wěn)定化囊泡，包含這些囊泡的組合物、制造這些囊泡的方法及其使用方法。因此，一方面，本發(fā)明提供了在脂質(zhì)雙層之間具有交聯(lián)的多層脂質(zhì)囊泡，或者在脂質(zhì)雙層之間具有交聯(lián)的多個多層脂質(zhì)囊泡或多層脂質(zhì)囊泡群。所述多個可以是但不限于1-103、1-104、1-105、1-106、1-107、1-108或1-109。在下文中描述了囊泡的多個方面，應(yīng)當(dāng)理解除非另有說明，否則這些方面等同地應(yīng)用多個囊泡或囊泡群。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的囊泡包含內(nèi)部鄰近(或并列)雙層的組分之間的連接，而非僅僅是外部(或者最外面)的雙層或雙層表面的組分之間的交聯(lián)。在一些實施方案中，囊泡包含官能化脂質(zhì)。在一些實施方案中，官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。官能化脂質(zhì)可以是磷酸乙醇胺但不限于此。在一些實施方案中，囊泡包含官能化的脂質(zhì)雙層組分，并優(yōu)選直接地官能化。在一些實施方案中，囊泡包含磷酸膽堿，例如但不限于D0PC。在一些實施方案中，囊泡包含磷酸甘油，例如但不限于D0PG。在一些實施方案中，囊泡包含DOPC、DOPG和官能化脂質(zhì)例如但不限于官能化磷酸乙醇胺。官能化脂質(zhì)可以是包含馬來酰亞胺的。在一些實施方案中，囊泡包含DOPC、DOPG和馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。官能化脂質(zhì)可以是馬來酰亞胺官能化的磷酸乙醇胺例如但不限于MPB。在一些實施方案中，DOPC DOPG 官能化脂質(zhì)的摩爾比是40 10 50。在一些實施方案中，囊泡可以包含DOPC和MPB。在一些實施方案中，囊泡可以包含D0PC、D0TAP和MPB。在一些實施方案中，DOPC DOTAP :官能化脂質(zhì)的摩爾比是40 10 50。在一些實施方案中，官能化脂質(zhì)以至少25%的摩爾百分比存在。
在一些實施方案中，囊泡包含試劑，包括一種或者更多種試劑。本文所使用的一種或更多種試劑意指彼此不同的一種或者更多種試劑。在一些實施方案中，所述試劑是預(yù)防齊U、治療劑或診斷劑。在一些實施方案中，所述試劑是抗原。在一些實施方案中，所述試劑是蛋白質(zhì)抗原，包括全蛋白抗原。在一些實施方案中，所述試劑是佐劑。佐劑可以是但不限于TLR激動劑如TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑和TLR9激動劑。在一些實施方案中，囊泡包含抗原和至少兩種佐劑如TLR4激動劑和TLR7激動劑。在一些實施方案中，所述試劑是蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，囊泡的每mg脂質(zhì)(或顆粒)包含超過300 μ g試劑,或者每mg脂質(zhì)(或顆粒)超過400yg試劑。在一些實施方案中，囊泡的每mg脂質(zhì)(或顆粒)包含300 試劑。在一些實施方案中，囊泡的每mg脂質(zhì)(或顆粒)包含325 μ g試劑，或者每mg脂質(zhì)(或顆粒)407 μ g試劑。在一些相關(guān)實施方案中，試劑可以是蛋白質(zhì)抗原。在一些實施方案中，試劑被包封于囊泡中。在一些實施方案中，試劑存在于囊泡的核心。在一些實施方案中，試劑存在于脂質(zhì)雙層之間。在一些實施方案中，囊泡包含核心中的一種試劑和脂質(zhì)雙層之間的另一種試劑。在一些實施方案中，核心中的試劑可以是抗原如蛋白質(zhì)抗原，脂質(zhì)雙層之間的試劑可以是佐劑例如但不限于MPLA。在一些實施方案中，抗原在核心中，兩種佐劑在內(nèi)部脂質(zhì)雙層之間。在一些實施方案中，兩種佐劑是MPLA和R-848。在一些實施方案中，囊泡包含核心中的一種試劑和外部雙層中的另一種試劑。在一些實施方案中，核心中的試劑可以是抗原如蛋白質(zhì)抗原，外部雙層中的試劑可以是佐劑例如但不限于MPLA。在一些實施方案中,抗原在核心中,兩種佐劑在外部雙層中。在一些實施方案中，抗原在核心中，一種或更多種佐劑在內(nèi)部雙層之間和/或在外部雙層表面上。在一些實施方案中，兩種佐劑是MPLA和R-848。在一些實施方案中，囊泡綴合聚乙二醇(PEG)。在一些實施方案中，囊泡可以表面綴合PEG。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含任意前述多層脂質(zhì)囊泡(或囊泡群)和可藥用載體的組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了包含任意前述多層脂質(zhì)囊泡(或囊泡群)和適于凍干的賦形劑的組合物。在一些實施方案中，適于凍干的賦形劑包含蔗糖。囊泡可以單獨使用或者與其他試劑(包括本文所述的任意試劑)組合使用。在一些實施方案中，他們不與細(xì)胞一起施用，他們也不與細(xì)胞綴合(或者以另外的方式物理連接)(例如在施用于對象之前)。但是，囊泡可以綴合靶配體以將他們靶向特定細(xì)胞或機體中的位點。在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括使包含官能化脂質(zhì)的脂質(zhì)體與多價(例如，二價)陽離子接觸以形成融合脂質(zhì)體，并使融合脂質(zhì)體與交聯(lián)劑接觸以形成在脂質(zhì)雙層之間有交聯(lián)的多層脂質(zhì)囊泡，包括任意前述囊泡。在一些實施方案中，官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。在一些實施方案中，官能化脂質(zhì)是官能化磷酸乙醇胺。在一些實施方案中，官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。在一些實施方案中，官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化的磷酸乙醇胺。在一些實施方案中，月旨 質(zhì)體包含磷酸膽堿例如但不限于D0PC。在一些實施方案中，脂質(zhì)體包含磷酸甘油例如但不限于D0PG。在一些實施方案中，脂質(zhì)體包含馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)、磷酸膽堿和磷酸甘油。在一些實施方案中，脂質(zhì)體包含摩爾比為40 10 50的DOPC、DOPG和馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)(如MPB)。在一些實施方案中，脂質(zhì)體包含DOPC和馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)如MPB。在一些實施方案中，脂質(zhì)體包含D0PC、D0TAP和馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)(如MPB)，任選地以40 10 50的摩爾比。在一些實施方案中，連接劑是膜可滲透性連接劑。在一些實施方案中，交聯(lián)劑是二硫醇交聯(lián)劑。在一些實施方案中，交聯(lián)劑是二硫蘇糖醇(DTT)。在一些實施方案中，二硫醇交聯(lián)劑與馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)的摩爾比為I : 2。在一些實施方案中，該方法進一步包括將聚乙二醇(PEG)綴合到在脂質(zhì)雙層之間具有交聯(lián)的多層脂質(zhì)囊泡的表面。在一些實施方案中，多價陽離子是二價陽離子例如但不限于Ca2+或Mg2+。這些可以單獨使用或組合使用。在一些實施方案中，接觸發(fā)生于水性緩沖液中。在一些實施方案中，脂質(zhì)體包含試劑。在一些實施方案中，試劑是預(yù)防劑、治療劑或診斷劑。在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括使包含官能化脂質(zhì)雙層組分(如官能化脂質(zhì))的多層脂質(zhì)囊泡與交聯(lián)劑接觸以形成在脂質(zhì)雙層之間具有交聯(lián)的多層脂質(zhì)囊泡。在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括以有效量將具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層且包含試劑的多層脂質(zhì)囊泡施用于對象。具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層的多層脂質(zhì)囊泡可以是任意前述具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層的多層脂質(zhì)囊泡或者任意本文所述的那些。在一些實施方案中，多層脂質(zhì)囊泡包含生物可降解脂質(zhì)。在一些實施方案中，多層脂質(zhì)囊泡包含磷脂。在一些實施方案中，多層脂質(zhì)囊泡包含磷酸膽堿、磷酸甘油和/或磷酸乙醇胺。在一些實施方案中，多層脂質(zhì)囊泡包含官能化脂質(zhì)。在一些實施方案中，官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。在一些實施方案中，馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化的磷酸乙醇胺。在一些實施方案中，試劑是預(yù)防劑。在一些實施方案中，試劑是治療劑。在一些實施方案中，試劑是抗原。在一些實施方案中，試劑是佐劑。在一些實施方案中，囊泡包含兩種或更多種試劑。在一些實施方案中，囊泡包含抗原和佐劑。在一些實施方案中，囊泡包含抗原和兩種佐劑。在一些實施方案中，囊泡包含蛋白質(zhì)抗原以及TLR4激動劑和TLR7激動齊U。在一些實施方案中，抗原如蛋白質(zhì)抗原存在于囊泡的核心，佐劑存在于囊泡的內(nèi)部雙層之間。
在一些實施方案中，多層脂質(zhì)囊泡綴合在其外表面上的PEG。在一些實施方案中，對象患有癌癥或者有發(fā)生癌癥的風(fēng)險。在一些實施方案中，對象有感染或者有發(fā)生感染的風(fēng)險。在一些實施方案中，對象有變態(tài)反應(yīng)或哮喘或者有發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或哮喘的風(fēng)險，或者正在經(jīng)歷哮喘發(fā)作或有經(jīng)歷哮喘發(fā)作的風(fēng)險。在一些實施方案中，有效量是在對象中刺激免疫應(yīng)答的量。免疫應(yīng)答可以是體液應(yīng)答或細(xì)胞應(yīng)答，或者可以為體液和細(xì)胞應(yīng)答的組合。細(xì)胞應(yīng)答可涉及刺激CD8 T細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括通過對有此需要的對象施用具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層且包含抗原的多層脂質(zhì)囊泡來在對象中刺激免疫應(yīng)答，其中將有效量的抗原施用于對象。具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層的多層脂質(zhì)囊泡可以是任意前述的這樣的囊泡或任意本文所述的那些。囊泡可進一步包含一種或更多種佐劑。在一些實施方案中，囊泡包含其核心中的抗原(包括蛋白質(zhì)抗原)和其脂質(zhì)雙層之間的佐劑。蛋白質(zhì)抗原可以是全蛋白抗原。佐劑可以是但不限于TLR4激動劑(如MPLA)和TLR7激動劑(如R-848)。在一些實施方案中，囊泡的每mg脂質(zhì)包含300 400 μ g抗原。在一些實施方案中,囊泡僅施用一次(即，初始(priming)劑量是足夠的)。在一些實施方案中，囊泡施用多于一次(例如，初始和加強劑量)。在一些實施方案中，抗原是細(xì)菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生蟲抗原或分枝桿菌抗原。在一些實施方案中，抗原是癌抗原。在一些實施方案中，免疫應(yīng)答是協(xié)同免疫應(yīng)答。在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括在體外使具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層且包含試劑的多層脂質(zhì)囊泡與細(xì)胞或細(xì)胞群接觸。細(xì)胞或細(xì)胞群可以是樹突狀細(xì)胞或其他抗原呈遞細(xì)胞。具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層的多層脂質(zhì)囊泡可以是任意前述具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層的多層脂質(zhì)囊泡或任意本文所描述的那些。應(yīng)當(dāng)理解，認(rèn)為在下文中更詳細(xì)地討論的前述概念和其他概念的所有組合(前提是這些概念彼此不矛盾)是本發(fā)明公開的部分發(fā)明主題。特別地，認(rèn)為在公開內(nèi)容的末尾出現(xiàn)的所要求保護的對象的所有組合理解是本文公開的部分發(fā)明主題。還應(yīng)當(dāng)理解，明確地用于本文中且還可出現(xiàn)于通過引用并入的任意公開內(nèi)容中的術(shù)語應(yīng)當(dāng)與同本文所公開的特定概念的最一致的含義一致。


圖1A.雙層間交聯(lián)多層囊泡(ICMV)的合成的示意圖。二價陽離子介導(dǎo)的融合導(dǎo)致形成多層囊泡，其中鄰近雙層通過DTT交聯(lián)。在用PEG-硫醇進行的反應(yīng)中將所得ICMVPEG 化。圖1B.通過將多層囊泡中的兩個脂質(zhì)頭部基團綴合在一起而形成的ICMV的圖示。圖2A-D. ICMV的合成。㈧ICMV合成的示意圖和冷凍電子顯微鏡圖像⑴從干燥脂質(zhì)膜制備陰離子的馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)體，(ii)添加二價陽離子以誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合并形成MLV，(iii)添加膜可滲透性二硫醇，其在囊泡壁的并列脂質(zhì)雙層上交聯(lián)馬來酰亞胺脂質(zhì)，以及(iv)用硫醇端化的PEG對所得脂質(zhì)顆粒進行PEG化。合成的每個步驟的冷凍電子顯微鏡圖像示出⑴初始脂質(zhì)體，(ii)MLV，以及(iii)具有厚脂質(zhì)壁的ICMV。比例尺=lOOnm。(iii)的右手邊圖像示出ICMV壁的放大圖像，其中堆疊的雙層解析為電子致密條紋；比例尺=20nm。(B)通過動態(tài)光散射測量的ICMV顆粒大小柱狀圖。(C，D)來自冷凍電子顯微鏡圖像ICMV特性的柱狀圖示出(C)每個顆粒的脂質(zhì)雙層數(shù)目，(D)顆粒半徑與脂質(zhì)壁厚度的比率。(η = 165個所分析的顆粒)。圖3Α-Β. (A)通過動態(tài)光散射測量的顆粒直徑的柱狀圖。⑶ICMV顆粒的冷凍電子顯微鏡圖像。圖4Α-Ε.蛋白質(zhì)包封和從ICMV的釋放。(A)在ICMV合成的每個步驟收集的脂質(zhì)囊泡中球狀蛋白質(zhì)SIV-gag、FLT-3L或OVA的包封效率。(B，C)比較ICMV與脫水-再水化囊泡(DRV)或PLGA納米顆粒的OVA包封效率(B)和單位顆粒質(zhì)量的總蛋白質(zhì)負(fù)載(C)。(D)在體外經(jīng)30天測量的來自在37°C下孵育于具有10%血清的RPMI培養(yǎng)基中的簡單脂質(zhì) 體、MLV或ICMV (均具有基本組成4 5 I DOPC MPB DOPG) OVA釋放動力學(xué)。還示出用膽固醇和PEG脂質(zhì)穩(wěn)定的脂質(zhì)體(38 57 5D0PC chol PEG-D0PE)的釋放動力學(xué)的比較。(E)在模擬內(nèi)溶酶體環(huán)境的不同方面的緩沖液中測量來自ICMV的OVA釋放還原性緩沖液，IOOmM β -巰基乙醇(β -ME)(在PBS中);酸性緩沖液，50mM檸檬酸鈉(ρΗ5· O)；包含脂肪酶的緩沖液、500ng/mL脂肪酶A(在PBS中)。數(shù)據(jù)表示至少三個實驗的平均值土 s_ θ. m (n — 3) ο圖5Α-Β.傳統(tǒng)脂質(zhì)體、脂質(zhì)包被的PLGA顆粒和ICMV中的OVA包封的比較，示出(A)顆粒中包封的OVA的比例和⑶單位總顆粒質(zhì)量所包封的OVA的量。圖6Α-Β6.從(A)PBS和(B)具有10%血清的RPMI培養(yǎng)基中的經(jīng)超聲波處理脂質(zhì)體、通過Mg2+融合的MLV和通過Mg2+和DTT形成的ICMV釋放的0VA。圖7A-C.通過添加有TLR激動劑MPLA的ICMV在體外刺激的免疫應(yīng)答。(A)在存在或不存在O. I μ g/mL MPLA時，用O. 7 μ g/mL可溶性O(shè)VA、負(fù)載于ICMV中的等劑量OVA或負(fù)載有不相關(guān)蛋白質(zhì)(間日瘧蛋白，VMP)的ICMV孵育18小時后，脾樹突細(xì)胞(DC)的細(xì)胞表面共刺激標(biāo)志物⑶40、⑶80和⑶86的表達(dá)的流式細(xì)胞分析。(B)在存在或不存在0. 05 μ g/mLMPLA 時，將脾 DC 用 10 μ g/mL SI INFEKL 肽(OVA257^264)、5· O μ g/mL 可溶性 OVA、負(fù)載于 ICMV中的等量OVA或負(fù)載VMP的ICMV孵育18小時，通過流式細(xì)胞分析染有識別復(fù)合了 H_2Kb的SIINFEKL的25-D1. 16 mAb的細(xì)胞來測定OVA的交叉呈遞程度。(C)將5-(6)-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺二酯(CFSE)標(biāo)記的OVA特異性幼稚OT-I⑶8+T細(xì)胞與用與0. I μ g/mLMPLA混合的0. 7 μ g/mL可溶性O(shè)VA或等量的與MPLV混合的負(fù)載OVA的ICMV脈沖的同基因脾DC共培養(yǎng)。包括無抗原的空ICMV或負(fù)載有無關(guān)抗原VMP的ICMV作為陰性對照。在第3天通過流式細(xì)胞分析OT-I⑶8+ T細(xì)胞中CFSE的稀釋度來評價⑶8+T細(xì)胞的增殖；所示出的是CFSE熒光的柱狀圖。每個柱狀圖上的門(gate)示出各樣本中分裂細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)代表至少三個實驗的平均值土 s. e. m(n = 3-4)。圖8A-B. (A) DC成熟程度和(B)應(yīng)答于整合有MPLV和/或R-848的ICMV的活化。圖9A-F.用ICMV相對于包封于非交聯(lián)囊泡中的可溶性抗原或抗原進行體內(nèi)免疫。a, b，通過皮下(s. c.)單次注射可溶性制劑、脂質(zhì)體制劑、MLV制劑或ICMV制劑(分別與O. I μ gMPLA混合)中遞送的10 μ gOVA來免疫C57B1/6小鼠。(A)在用熒光OVA肽-MHC四聚體免疫7天后，通過流式細(xì)胞分析外周血單核細(xì)胞(PBMC)來測定抗原特異性CD8+T-細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(B)在用OVA特異性IgG免疫21天后，通過ELISA分析來自免疫小鼠的血清。(C，D)用與O. I μ g MPLA混合的10 μ g熒光團綴合OVA作為可溶性制劑、脂質(zhì)體制劑或ICMV制劑注射C57B1/6小鼠，在第2天測定內(nèi)化OVA的引流腹股溝淋巴結(jié)(dLN)細(xì)胞。(C)示出的是OVA攝取陽性的DC(CDllc+)、巨噬細(xì)胞(F4/80+)、B細(xì)胞(B220+)和漿細(xì)胞樣DC(CDllc+B220+)的百分?jǐn)?shù)，(D) OVA+群的平均熒光密度(MFI)。(E，F(xiàn))用與O. I μ g MPLA混合的10μ g OVA作為可溶性制劑、脂質(zhì)體制劑或ICMV制劑注射C57B1/6小鼠，2天后，通過流式細(xì)胞分析分離自引流腹股溝LN的DC以測定DC活化和抗原交叉呈遞。(E)重疊頻率曲線示出DC中共刺激標(biāo)記(⑶40和⑶86)和MHC-II的表達(dá)。(F)左圖示出轉(zhuǎn)染有SIINFEKL-Kb+復(fù)合物的腹股溝LN DC的重疊頻率曲線，而平均MFI水平示于右圖中。數(shù)據(jù)表示所進行的
2-3 個獨立實驗的平均值土 s. e. m(n = 3-4), * p < O. 05, * * p < O. 01,按照 Tukey’ sHSD通過單因素ANOVA進行分析。
圖10A-B. (A)加強7天后，外周血中的OVA特異性⑶8+T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染有抗CD8抗體和與OVA衍生肽SIINFEKL復(fù)合的肽-MHC四聚體的細(xì)胞測定的。(B)在免疫的第21天通過ELISA測量抗OVA抗體滴度。圖11A-E.攜帶水性核心中的抗原和嵌入囊泡壁中的MPLA的ICMV誘發(fā)強抗體應(yīng)答和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。(A)疫苗基團的示意圖可溶性O(shè)VA與MPLA混合(MPLA)、僅在外表面具有MPLA的負(fù)載OVA的ICMV(ext-MPLA LCMV)或者MPLA遍及脂質(zhì)多層的負(fù)載OVA的ICMVQnt-MPLA ICMV) (B-G)在第 0、21 和 35 天用制備為MPLA、ext_MPLA ICMV或 int-MPLAICMV的10 μ g OVA和O. I μ g或I. O μ gMPLA以尾基皮下注射(s. c.)免疫C57B1/6小鼠。(B)血清中總OVA特異性IgG的ELISA分析。(C)通過流式細(xì)胞儀分析接種有10 μ gOVA和O. I μ g MPLA的四聚體+⑶8+T細(xì)胞隨時間測定外周血中OVA特異性T細(xì)胞的頻數(shù)(frequency)。還示出用可溶性0VA+1 μ g MPLA (MPLA 10X)接種的應(yīng)答用于比較。所示出的是第41天來自一只小鼠的示例性流式細(xì)胞散點圖，和來自各組小鼠的平均四聚體+值隨時間的變化。(D)在第41天，通過染色于來自外周血的四聚體+細(xì)胞的⑶44/⑶62L來分析外周血中的T細(xì)胞效應(yīng)因子表型/效應(yīng)記憶表型/中心記憶表型。所示出的是第41天來自一只小鼠的示例性細(xì)胞散點圖，和⑶8+ T細(xì)胞中tet+CD44+⑶62L+細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)。(E)在第49天，在體外用OVA肽離體再刺激PBMC之后，通過胞內(nèi)IFN- Y染色測定抗原特異性CD8+T細(xì)胞的功能性。示出一只小鼠的IFN- Y +CD8+T細(xì)胞的示例性流式細(xì)胞柱狀圖以及得自組的平均結(jié)果。數(shù)據(jù)表示所進行的2個獨立實驗的平均值±^!11(11 = 3)。與可溶性0VA+MPLV 相比，*，p < O. 05，與 ext-MPLA ICMV 相比，#，p < O. 05，(D，E) *，p < O. 05，**，P < O. 01，按照Tukey ’ s HSD通過兩因素ANOVA進行分析。圖12A-B.使用“點擊”化學(xué)的替代性雙層間交聯(lián)反應(yīng)。(A)從DOPE和炔前體合成炔-頭部基團脂質(zhì)。(B)用炔端化脂質(zhì)形成脂質(zhì)體，并由Mg2+誘導(dǎo)形成MLV。然后，用二疊氮化物和如所示出的催化劑孵育含有炔的MLV導(dǎo)致成功地形成ICMV，如用低速離心條件進行顆?；厥蘸笏鶞y量，顆粒產(chǎn)率為83%。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了特別是用于遞送試劑的穩(wěn)定化多層脂質(zhì)囊泡。基于重組蛋白質(zhì)的現(xiàn)有技術(shù)疫苗避免了毒性和與活疫苗(例如，病毒)載體相關(guān)的抗載體免疫，但它們的致免疫力不佳，特別是CD8+T細(xì)胞(CD8T)應(yīng)答。已開發(fā)了攜帶抗原和佐劑分子的合成顆粒以增強亞單位疫苗，但總體來講這些物質(zhì)不能在臨床前動物模型中引發(fā)比得上活載體的CD8T應(yīng)答。與這些現(xiàn)有技術(shù)組合物和方法不同，本發(fā)明提供了穩(wěn)定化多層囊泡，如通過在多層囊泡中交聯(lián)鄰近脂質(zhì)雙層的頭部基團而形成的雙層間交聯(lián)多層囊泡(ICMV)。在胞外條件下，這些囊泡穩(wěn)定地在囊泡核心中截留尤其是蛋白質(zhì)抗原，并在囊泡壁中截留基于脂質(zhì)的免疫刺激分子，但在內(nèi)溶酶體脂肪酶的存在下表現(xiàn)出快速的釋放。當(dāng)用于遞送單獨的抗原或在佐劑的存在下遞送時，本發(fā)明的囊泡形成極強的疫苗(例如，全蛋白疫苗)，引發(fā)比得上最強疫苗載體的內(nèi)源T細(xì)胞應(yīng)答和抗體應(yīng)答。囊泡通過其脂質(zhì)雙層的內(nèi)部連接(例如，交聯(lián))而穩(wěn)定化。與簡單的脂質(zhì)體或脂質(zhì)包被的納米顆粒或微顆粒相比，這些囊泡的穩(wěn)定化性質(zhì)使得它們整合更大量的試劑并在更長時間中保留該試劑。它們的持續(xù)釋放動力學(xué)(特別是在血清的存在下)使得它們可用于試劑的體內(nèi)遞送，就體內(nèi)遞送而言，期望緩慢、穩(wěn)定和延長的釋放，或者期望在胞外環(huán)境 中緩慢釋放而在細(xì)胞中快速釋放。如在本文中更詳細(xì)地描述的，本發(fā)明涵蓋使用具有多個和多種試劑(包括預(yù)防劑、治療劑和/或診斷劑)的這種囊泡。因此，本發(fā)明提供了包含前述囊泡的組合物，其合成方法和其使用方法。穩(wěn)定化多層脂質(zhì)囊泡(MLV)本發(fā)明提供了通過將鄰近(或并列)脂質(zhì)雙層彼此連接而穩(wěn)定化的MLV。如本文所使用的，多層囊泡是具有殼的納米球或微球，其包含兩個或更多個同心排布的脂質(zhì)雙層。如本文所使用的，鄰近或并列的脂質(zhì)雙層(或脂質(zhì)雙層表面)意指彼此緊密接近而否則則獨立且通常物理分開的雙層或表面。該術(shù)語并非通常地指一個雙層的兩個單層之間的關(guān)系O如本文所使用的，“連接”意指兩個實體通過任意物理化學(xué)方式彼此穩(wěn)定地結(jié)合?？墒褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意連接包括共價或非共價連接，但優(yōu)選共價連接。在本文所述的一些重要實施方案中，MLV中鄰近(或并列)脂質(zhì)雙層之間的共價連接通過使用交聯(lián)劑和脂質(zhì)雙層的官能化組分來實現(xiàn)。但是，本發(fā)明考慮了可以以其它方式實現(xiàn)連接，包括共價連接。作為示例，本發(fā)明考慮了以下方法，其中互補反應(yīng)基團存在于鄰近雙層表面的組分上，通過使這些基團彼此反應(yīng)(即使在不存在交聯(lián)劑的情況下)來完成雙層表面之間的連接。合適的互補反應(yīng)基團在本領(lǐng)域中已知并描述于本文中。囊泡的內(nèi)部通常是水性環(huán)境的，并且其可包含試劑例如但不限于預(yù)防劑、治療劑或診斷劑。在一些情況中，囊泡不包含固體核心，如固體聚合物核心(例如，合成的聚合物核心)。代替地，如上所述，它們可以具有包含目的試劑的流體核心。在一些情況中，核心可包含用于聚合成為水凝膠核心的單體。在本文中，還可將囊泡稱為顆粒，包括納米顆?；蛭㈩w粒，但應(yīng)當(dāng)理解，這樣的納米顆?；蛭㈩w粒具有本發(fā)明的穩(wěn)定化MLV和雙層間交聯(lián)多層脂質(zhì)囊泡(ICMV)的特性。如圖1A、IB和2A所示，囊泡可以在其核心具有空隙體積和/或它們可以在其核心和/或鄰近(或并列)脂質(zhì)雙層之間包含一種或更多種試劑。試劑通常在合成過程中包含于脂質(zhì)溶液中，并且以該方式在合成過程中整合(例如通過包封)入囊泡中。在形成囊泡時親脂分子還可以被直接整合入脂質(zhì)雙層中，或者在囊泡形成過程中具有親脂性尾的分子可錨定至脂質(zhì)雙層?？梢栽诓淮嬖诹倚?harsh)溶劑(如有機溶劑)時生成囊泡，因此，它們可以包封多種試劑，包括易受有機溶劑等影響的那些。囊泡中試劑的量可以不同并且可取決于試劑的性質(zhì)。如實施例中所表明的,每mg脂質(zhì)可將300 400 μ g蛋白質(zhì)試劑整合入本發(fā)明的囊泡中。在一些實施方案中，對于每mg脂質(zhì)，囊泡可包含約100 μ g試劑，或約150 μ g試劑，或約200 μ g試劑，或約250 μ g試劑，或約300 μ g試劑，或約325 μ g試劑，或約350 μ g試劑，或約375 μ g試劑，或約400 μ g試齊U，或約410 μ g試劑。在一些實施方案中，試劑可以是蛋白質(zhì)如蛋白質(zhì)抗原。本發(fā)明的囊泡還可以表征為其滯留特性(retention profile)。在一些實施方案中，當(dāng)置于含血清的基質(zhì)(例如，10%血清)中且保持在37°C下時，囊泡以每周約25%的速率釋放試劑。在一些實施方案中，在這些條件下，囊泡在第一周釋放約25 %的試劑，在約30天后釋放多至約90%。在一些實施方案中，當(dāng)在4°C下于緩沖液(如PBS)中保存30天時，囊泡保持其試劑的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。 每個囊泡中脂質(zhì)雙層的數(shù)目可不同，通常范圍為至少2個至約50個，或者至少2個至約25個，或者至少2個至約15個，或者至少2個至約10個，或者至少2個至約5個。囊泡的直徑可不同。在一些情況中，囊泡的直徑范圍為約IOOnm至約500nm,包括約125nm至約300nm,包括約150nm至約300nm,包括約175nm至約275nm。在一些情況中，直徑范圍為約150nm至約250nm。如本實施例中所述制備的ICMV的直徑特性示于圖2B和3A中。應(yīng)當(dāng)理解，在任意囊泡制劑中，在涉及囊泡直徑、脂質(zhì)雙層數(shù)目、所負(fù)載的試劑的量等時，囊泡之間會有異質(zhì)性。這些的分布示于實施例中。如本文所使用的，本發(fā)明的囊泡還可以稱為脂質(zhì)體(例如穩(wěn)定化多層脂質(zhì)體，或如下所述，雙層間交聯(lián)多層脂質(zhì)體)。因此，術(shù)語“囊泡”的使用并不意在表示囊泡的來源或起源。如將在下文中更詳細(xì)地描述的，本發(fā)明的囊泡是合成囊泡(即，它們在體外生成)。囊泡可以被分離，意指將它們從合成其的環(huán)境中整體或部分地物理上分離。作為示例，包含試劑(即，它們的“負(fù)載物(cargo)”或“裝載物(payload)”)的囊泡可以與缺少試劑的囊泡(即，空囊泡)整體或部分地分離，于是可以被稱為“分離的囊泡”。分離可以基于重量(或質(zhì)量)、密度(包括浮力密度)、大小、顏色(例如其中囊泡的裝載物可通過其能量發(fā)射檢測)等分離。如實施例中所述，可使用離心將本發(fā)明的囊泡與簡單脂質(zhì)體或不具有交聯(lián)雙層的相同脂質(zhì)組成的MLV分離。以約14000g離心約4分鐘足以將本發(fā)明的囊泡(其沉淀)與這些其它顆粒類型分離。雙層間交聯(lián)多層脂質(zhì)囊泡本發(fā)明的穩(wěn)定化MLV的一個例子是雙層間交聯(lián)多層(脂質(zhì))囊泡(ICMV)。如同上述穩(wěn)定化MLV, ICMV是具有殼的納米球或微球，其包含本文所述的彼此綴合的兩個或更多個同心排布的脂質(zhì)雙層。穩(wěn)定化多層囊泡(包括ICMV)中脂質(zhì)雙層的數(shù)目可以為約2 30不等，但更通常在2 15的范圍內(nèi)。因此，在多個實施方案中，層的數(shù)目可以是2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多。得自一個ICMV示例性合成的雙層數(shù)目的頻數(shù)分布示于圖2C中。雙層通常包含具有以類似于細(xì)胞膜的方式(即，親水頭部通常暴露于水性環(huán)境而疏水尾部包埋于雙層中)排布的親水頭部和疏水尾部的脂質(zhì)。ICMV通過其脂質(zhì)雙層之間的交聯(lián)而穩(wěn)定化，并且因此將它們稱為“雙層間交聯(lián)”MLV。如本文所使用的，這意味著在囊泡的殼中至少兩個脂質(zhì)雙層彼此交聯(lián)。交聯(lián)的雙層通常是彼此并列或鄰近的那些。殼中的大多數(shù)或所有脂質(zhì)雙層可以與殼中與其并列的脂質(zhì)雙層交聯(lián)。在脂質(zhì)雙層之間可以有一個或更多個交聯(lián)。通常，脂質(zhì)雙層之間將有多個交聯(lián)。這樣的交聯(lián)的排布和位置可以是隨機的或非隨機的。交聯(lián)程度(以及所產(chǎn)生的囊泡的穩(wěn)定性)將取決于用于形成囊泡的官能化脂質(zhì)(或其它脂質(zhì)雙層組分)的比例和交聯(lián)條件(包括，例如用交聯(lián)劑孵育囊泡的時間)。應(yīng)當(dāng)理解，所有其它因素和參數(shù)相同的情況下，囊泡中官能化脂質(zhì)(或其它脂質(zhì)雙層組分)的比例越高，就會形成越多交聯(lián)。類似地，條件越有利于交聯(lián)，就會獲得越大程度的交聯(lián)。合成方法示例性合成方法如下合并脂質(zhì)和任選的其它雙層組分以形成均勻混合物。這可以在其中脂質(zhì)被干燥以形成脂質(zhì)膜的干燥步驟中發(fā)生。然后將該脂質(zhì)與水性溶劑合并(例如，再水化)。水性溶劑的pH可以為約6至約8，包括pH為約7。使用與囊泡融合相容的緩沖液，通常用低濃度鹽。實施例中所使用的溶劑是IOmM bis-tris丙烷(BTP)緩沖液(pH7.0)。如表IA所示，緩沖液的性質(zhì)可以影響孵育時長。例如，所有其它條件相同的情況下，·與緩沖液如BTP相比，緩沖液如PBS可需要更長的孵育時間。如果緩沖液是PBS，孵育時間則可以是約6-24小時，或8-16小時，或10-12小時。如果緩沖液是BTP，孵育時間則可以較短，包括1-4小時或1-2小時。因此，可以使用多種水性緩沖液，前提是還使用足夠的孵育時間。該步驟還可以包括存在待被整合入囊泡的試劑。然后，用一種或更多種二價陽離子孵育所得脂質(zhì)體以將它們?nèi)诤蠟槎鄬幽遗?。合適的二價陽離子包括Mg2+、Ca2+、Ba2+或Sr2+。多價或聚合陽離子也可用于囊泡融合。囊泡融合也可以通過將陽離子囊泡與二價或更高價陰離子混合來獲得；一個例子是將陽離子脂質(zhì)體與DNA寡核苷酸或DNA質(zhì)粒融合。這可在攪拌如超聲、漩渦等條件下完成。如果脂質(zhì)體在試劑的存在下制成，那么MLV將在其核心中和/或同心排布的脂質(zhì)雙層之間包含試劑。本發(fā)明考慮了融合攜帶不同試劑的脂質(zhì)體以形成包含這些試劑的MLV。然后用交聯(lián)劑孵育所得MLV，優(yōu)選膜可滲透性交聯(lián)劑。如本文所述，交聯(lián)劑的性質(zhì)根據(jù)被連接在一起的反應(yīng)基團的性質(zhì)而不同。如實施例中所表明的，可以使用包含二硫醇的交聯(lián)劑如DTT或(1，4_ 二-[3’_(2’_吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷)交聯(lián)包含馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)(或其它官能化脂質(zhì)雙層組分)的MLV，或者如圖12所示，可以使用二疊氮化物交聯(lián)劑通過“點擊”化學(xué)交聯(lián)炔頭部基團脂質(zhì)。這些多種孵育均在PH范圍為約6至約8或者約6. 5至約7. 5或約7的水性條件下進行。交聯(lián)步驟可以在室溫(例如，20-25°C )或升高的溫度(包括例如多至或高于37°C )下進行。然后，可以收集(例如通過離心或其它沉淀方法)所得交聯(lián)囊泡，洗滌然后通過用硫醇-PEG孵育在其最外面或外表面(例如，如本文所使用的，囊泡可稱為“表面PEG化”或與PEG “表面綴合”)PEG化。PEG可以為任意大小，包括但不限于O. l_10kDa、0. 5_5kDa或l-3kDa。2kDa用硫醇官能化的PEG用于實施例中。孵育時間可以為約10分鐘至2小時，但根據(jù)其它條件如溫度、濃度等其可以更短或更長。PEG化步驟可以在室溫(例如，20-25°C)或升高的溫度(包括例如多至或高于37°C )下進行。在實施例的示例性性合成方法中使用30分鐘的孵育時間。然后，可以收集囊泡(例如，通過離心或其他沉淀方法)并用水或其它水性緩沖液洗滌。
可以在4°C下將囊泡保存與緩沖溶液例如但不限于PBS中，或者可以在合適的凍存劑的存在將它們凍干，然后在_20°C下保存。合適的凍存劑包括含蔗糖的那些(例如，1-5%蔗糖溶液，優(yōu)選約3%蔗糖溶液)。還可以通過使一個雙層中的反應(yīng)基團與鄰近雙層中的互補反應(yīng)基團結(jié)合來完成交聯(lián)。例如，包含琥珀酰亞胺酯官能化脂質(zhì)(A)頭部基團和含有伯胺(B)頭部基團的融合囊泡可以通過鄰近雙層的A脂質(zhì)與B脂質(zhì)之間的原位反應(yīng)完成交聯(lián)。可以以類似的方式使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種其它互補官能化脂質(zhì)。官能化脂質(zhì)(或脂質(zhì)雙層的其它官能化組分)與交聯(lián)劑的摩爾比可以根據(jù)條件而不同。在一些情況下，它可以為約I至約5。在一些實施方案中，摩爾比為2(即官能化脂質(zhì)(或組分)與交聯(lián)劑的摩爾比為2 I)就足夠了。一些實施例中描述了使用摩爾比為2 I的馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)與DTT來交聯(lián)囊泡的脂質(zhì)雙層的合成方法。孵育時間可以為I小時至24小時、2-18小時、2小時至12小時，或者2小時至6小時。在一些情況下，其 可以為約2小時。在另一些情況下，其可以為過夜(例如，約12小時)。囊泡中官能化脂質(zhì)的摩爾％可以為1%至100%，或者在一些情況下為約10%至約60%，或者在一些情況下為約25%至約55%。在一些情況下，囊泡中官能化脂質(zhì)的摩爾％通常為至少10%，優(yōu)選至少15%，更優(yōu)選至少20%，甚至更優(yōu)選至少25 %。表IA和IB示出在不存在官能化脂質(zhì)時，未形成囊泡。相反，非官能化脂質(zhì)可以以約0%至99%的摩爾％存在。更通常地，非官能化脂質(zhì)可以以約40% -75%或40%至60%的摩爾％存在。在一個重要實施方案中，使用DOPC、DOPG和馬來酰亞胺官能化DSPE合成囊泡。這些脂質(zhì)彼此之間的比率可不同。表IA和IB示出改變DOPC DOPG :馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)的比率對囊泡產(chǎn)率的影響。DOPC的摩爾％可以為1-50%，DOPG的摩爾％可以為1-50%，馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)的摩爾％可以為1-80%。本發(fā)明的一些實施方案提供了DOPC DOPG 馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)比率為40 10 50的囊泡。一些實施方案提供了 DOPC DOPG :馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)比率為60 15 25的囊泡。一些實施方案提供了包含DOPG和馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)的囊泡。脂質(zhì)囊泡包含一種或更多種脂質(zhì)。脂質(zhì)的類型、數(shù)目和比率可不同，前提是它們共同形成球狀雙層(即，囊泡)。脂質(zhì)可以從天然來源分離，或者它們可以無需任何天然來源地合成。脂質(zhì)的至少一種(或一些)是兩親脂質(zhì)，定義為具有親水部分和疏水部分(通常為親水頭部和疏水尾部)。疏水部分通常朝向疏水相(例如，雙層內(nèi))，而親水部分通常朝向水相(例如，雙層外，并且可能在鄰近并列的雙層表面之間)。親水部分可包含極性或帶電基團如碳水化合物、磷酸、羧基、硫酸根、氨基、巰基、硝基、羥基以及其它類似基團。疏水部分可包含非極性基團，包括但不限于長鏈飽和和不飽和脂肪族烴基和由一種或更多種芳族基團、脂環(huán)族基團或雜環(huán)基團取代的基團。兩親化合物的例子包括但不限于磷脂、氨脂和鞘脂。通常，脂質(zhì)是磷脂。磷脂包括但不限于磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸等。應(yīng)當(dāng)理解，可以使用其它脂質(zhì)膜組分，如膽固醇、鞘磷脂、心磷月旨等。脂質(zhì)可以是陰離子脂質(zhì)和中性(包括兩性離子和極性)脂質(zhì)，包括陰離子磷脂和中性磷脂。在選定pH下，中性脂質(zhì)以不帶電或中性兩性離子的形式存在。在生理pH下，這樣的脂質(zhì)包括例如，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二酰磷脂酰膽堿、二酰磷脂酰乙醇胺、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂和二酰甘油。兩性脂質(zhì)的例子包括但不限于二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)和二油酰磷脂酰絲氨酸(DOPS)。陰離子脂質(zhì)是在生理PH下帶負(fù)電的脂質(zhì)。這些脂質(zhì)包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰磷脂酰絲氨酸、二酰磷脂酸、N-十二酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、賴氨酰磷脂酰甘油、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(POPG)以及與中性脂質(zhì)結(jié)合的其它陰離子修飾基團。陰離子脂質(zhì)和中性脂質(zhì)在本文中共同稱為非陽離子脂質(zhì)。這樣的脂質(zhì)可以包含磷但它們并不限于此。非陽離子脂質(zhì)的例子包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蘧酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕櫚 酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)、蛋磷脂酰膽堿(EPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、16-0-單甲基PE、16-0- 二甲基PE、18_1_反式PE、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、I-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、磷酸二鯨蠟和膽固醇。另一些不含磷的脂質(zhì)包括硬脂胺、十二胺、十六胺、棕櫚酸乙酰酯、蓖麻醇酸甘油酯、硬脂酸十六酯、肉豆蘧酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、三乙醇胺十二烷基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化的脂肪酰胺、雙十八基二甲基溴化銨等、二?；字Ｄ憠A、二?；字Ｒ掖及贰⑸窠?jīng)酰胺、鞘磷脂、腦磷脂和腦苷脂。在一些情況下，可以使用脂質(zhì)如溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺。非陽離子脂質(zhì)還包括聚乙二醇基聚合物如PEG 2000、PEG 5000和與磷脂或神經(jīng)酰胺綴合的聚乙二醇(稱為PEG-Cer)。在一些情況下，可以使用經(jīng)修飾形式的脂質(zhì)，包括用可檢測標(biāo)記如熒光素修飾的形式。在一些情況下，脂質(zhì)是發(fā)出信號(例如，熒光信號)的脂質(zhì)類似物。實例包括但不限于1，1’ -雙十八基-3，3，3’，3’ -四甲基吲哚苯基三碳菁碘化物(DiR)和1，1’ -雙十八基-3，3，3’，3’ -四甲基吲哚二碳菁(DiD)。優(yōu)選地，脂質(zhì)是生物可降解的以使得在體內(nèi)和/或在體外釋放所包封的試劑。生物可降解脂質(zhì)包括但不限于I，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(二油酰-磷酸膽堿，D0PC)、陰離子I，2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油基-3-磷基-(I' -rac-甘油)(二油酰磷酸甘油，D0PG)和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(二硬脂酰磷酸乙醇胺，DSPE)。還可以整合和非脂質(zhì)膜組分如膽固醇。官能化脂質(zhì)或雙層組分脂質(zhì)雙層的至少一種組分必須是官能化的(或者有反應(yīng)性)。如本文所使用的，官能化組分是包含可用于交聯(lián)多層囊泡的鄰近雙層的反應(yīng)基團的組分?？蓪㈦p層組分修飾為包含反應(yīng)基團。用于合成囊泡的一種或更多種脂質(zhì)可以是官能化脂質(zhì)。如本文所使用的，官能化脂質(zhì)是具有可用于交聯(lián)多層囊泡的鄰近雙層的反應(yīng)基團的脂質(zhì)。在一些實施方案中，反應(yīng)基團是與交聯(lián)劑(或其它部分)反應(yīng)以在這些官能化脂質(zhì)之間(因而在囊泡中的脂質(zhì)雙層之間)形成交聯(lián)。反應(yīng)基團可以位于允許其接觸交聯(lián)劑并與鄰近并列雙層中的另一種脂質(zhì)交聯(lián)的脂質(zhì)上的任意位置。在一些實施方案中，其在脂質(zhì)(包括例如磷脂)的頭部基團中。反應(yīng)基團的一個例子是馬來酰亞胺基團。馬來酰亞胺基團可以在二硫醇交聯(lián)劑(例如但不限于二硫醇蘇糖醇(DTT))存在下彼此交聯(lián)。官能化脂質(zhì)的一個例子是1，2_ 二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(對-馬來酰亞胺苯基)丁酰胺，其在本文中稱為MPB0這些實施例說明官能化脂質(zhì)在合成本發(fā)明的囊泡中的用途。官能化脂質(zhì)的另一例子是I，2- 二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[馬來酰亞胺(聚乙二醇)2000](也稱為馬來酰亞胺-PEG 2k-PE)。官能化脂質(zhì)的又一例子是二油?；?磷脂酰乙醇胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)_環(huán)己烷-I-羧酸酯(DOPE-mal)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明涵蓋使用其它官能化脂質(zhì)、其它官能化脂質(zhì)雙層組分、其它反應(yīng)基團以及其它交聯(lián)劑。除馬來酰亞胺基團以外，反應(yīng)基團的另一些例子包括但不限于其它硫醇反應(yīng)基團、氨基如伯胺和仲胺、羧基、羥基、醛基、炔基、疊氮基、羰基、鹵代?；?例如 碘代酰基)、酰亞胺酯基、N-羥基琥珀酰亞胺酯、巰基、吡啶二硫基等。官能化和非官能化脂質(zhì)可得自多種商業(yè)來源，包括Avanti PolarLipids (Alabaster, Alabama)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明涵蓋使多層囊泡中的鄰近雙層彼此連接的多種方法。在一些情況下，使用交聯(lián)劑以形成鄰近雙層之間的連接。但本發(fā)明并不限于此。作為示例，可以采用點擊化學(xué)形成囊泡。如下，一種示例性合成方法使用炔修飾的脂質(zhì)和炔-疊氮化物化學(xué)。通過將脂質(zhì)如1，2-二油?；?Sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE，744mg, ImmoI)與丙炔酸的N-輕基琥拍酰亞胺酯(167mg, Immol)和Et3N(202mg, 2mmol)在5mL⑶Cl3中混合以形成炔修飾的脂質(zhì)。通過NMR監(jiān)測該反應(yīng)。室溫下3小時之后，反應(yīng)完成。用5mL 5% Na2CO3^ I % HCl和鹽水洗滌該有機溶液之后，經(jīng)Na2SO4干燥并蒸發(fā)，并對炔修飾的DOPE進行稱重。制備DOPC與炔-DOPE的摩爾比為I : I的I. 26 μ mo I脂質(zhì)膜，水化、超聲處理并如上所述用IOmM Mg2+誘導(dǎo)融合。在室溫下，將具有炔官能化脂質(zhì)的MLV用
2.5mM CuSO4、銅線和I. 5mM 1，14-二疊氮基-3，6，9，12-四氧雜十四烷孵育24小時。洗滌三次之后通過離心測量顆粒產(chǎn)率。交聯(lián)劑根據(jù)脂質(zhì)雙層中彼此連接的反應(yīng)基團的性質(zhì)，交聯(lián)劑可以是同型雙功能交聯(lián)劑(homobifunctional crosslinker)或異型雙功能交聯(lián)劑(heterobifunctionalcrosslinker)。在本文中可互換使用術(shù)語“交聯(lián)劑”和“交聯(lián)試劑”。同型雙功能交聯(lián)劑具有兩個相同反應(yīng)基團。異型雙功能交聯(lián)劑具有兩個不同反應(yīng)基團。在一種情況下，鄰近雙層使用相同官能化脂質(zhì)(或其它雙層組分)和交聯(lián)劑(如同型雙功能交聯(lián)劑)彼此交聯(lián)。在另一情況下，鄰近雙層使用不同官能化脂質(zhì)(或其它雙層組分)和交聯(lián)劑(如異型雙功能交聯(lián)劑)彼此交聯(lián)。多種類型的市售交聯(lián)劑與以下基團中一種或更多種反應(yīng)馬來酰亞胺基、伯胺、仲胺、巰基、羧基、羰基和碳水化合物。胺特異性交聯(lián)劑的例子是雙(璜基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯、雙[2-(琥珀酰亞胺基氧基羰基氧基)乙基]砜、二琥珀酰亞胺基辛二酸酯、二琥珀酰亞胺基酒石酸酯、二甲基己二酯·2Ηα、二甲基庚二亞胺酯·2Ηα、二甲基辛二亞胺酯·2Ηα和乙二醇雙-[琥珀酰亞胺-[琥珀酸酯]]。與巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑包括雙馬來酰亞胺基己燒、1，4_ 二-[3' -(2 '-批唳基二硫代)-丙酰胺基)]丁燒、I-[對-疊氮基水楊酰胺基]-4-[碘代乙酰胺基]丁烷和N-[4-(對-疊氮基水楊酰胺基)丁基]-3' -[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺。優(yōu)先與碳水化合物反應(yīng)的交聯(lián)劑包括疊氮基苯甲酰肼。優(yōu)先與羧基反應(yīng)的交聯(lián)劑包括4-[對-疊氮基水楊酰胺基]丁胺。二硫醇交聯(lián)劑如二硫蘇糖醇(DTT)、1，4-二-[3’_(2’_吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷(DTOPB)，在一些情況下，可以使用包含硫醇的聚合物(如(PEG)-SH2)交聯(lián)馬來酰亞胺反應(yīng)基團。DTT的結(jié)構(gòu)是
權(quán)利要求
1.多層脂質(zhì)囊泡，其在脂質(zhì)雙層之間具有交聯(lián)。
2.權(quán)利要求I所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述囊泡包含官能化脂質(zhì)。
3.權(quán)利要求I或2所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述囊泡包含磷酸膽堿。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述囊泡包含磷酸甘油。
5.權(quán)利要求2、3或4所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。
6.前述權(quán)利要求中任一項所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述囊泡包含試劑。
7.權(quán)利要求6所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述試劑是預(yù)防劑、治療劑或診斷劑。
8.權(quán)利要求6所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述試劑是抗原。
9.權(quán)利要求6所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述試劑是佐劑。
10.權(quán)利要求6所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述試劑是蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求6所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述試劑包封于所述囊泡中。
12.權(quán)利要求6或11所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述試劑包封于所述脂質(zhì)雙層之間。
13.權(quán)利要求I至12中任一項所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述囊泡與聚乙二醇(PEG)三雙口 ο
14.權(quán)利要求I至13中任一項所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述囊泡包含DOPC、DOPG和馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。
15.權(quán)利要求14所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化磷酸乙醇胺。
16.組合物，其包含權(quán)利要求I至15中任一項所述的多層脂質(zhì)囊泡和可藥用載體。
17.組合物，其包含權(quán)利要求I至15中任一項所述的多層脂質(zhì)囊泡和適于凍干的賦形劑。
18.組合物，其包含權(quán)利要求17所述的多層脂質(zhì)囊泡，其中所述適于凍干的賦形劑包含蔗糖。
19.方法，其包括 使包含官能化脂質(zhì)的脂質(zhì)體與二價陽離子接觸以形成融合的脂質(zhì)體，和 使所述融合的脂質(zhì)體與交聯(lián)劑接觸以形成在脂質(zhì)雙層之間具有交聯(lián)的多層脂質(zhì)囊泡。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。
21.權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述脂質(zhì)體包含磷酸膽堿。
22.權(quán)利要求19、20或21所述的方法，其中所述脂質(zhì)體包含磷酸甘油。
23.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述脂質(zhì)體包含馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)、磷酸膽堿和磷酸甘油。
24.權(quán)利要求19至23中任一項所述的方法，其中所述官能化脂質(zhì)是官能化磷酸乙醇胺。
25.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化磷酸乙醇胺。
26.權(quán)利要求19至25中任一項所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是二硫醇交聯(lián)劑。
27.權(quán)利要求19至25中任一項所述的方法，其中所述交聯(lián)劑是二硫蘇糖醇(DTT)。
28.權(quán)利要求19至27中任一項所述的方法，其還包括使聚乙二醇(PEG)綴合到在脂質(zhì)雙層之間具有交聯(lián)的所述多層脂質(zhì)囊泡的表面。
29.權(quán)利要求19至28中任一項所述的方法，其中所述二價陽離子是Ca2+。
30.權(quán)利要求19至29中任一項所述的方法，其中所述二價陽離子是Mg2+。
31.權(quán)利要求19至30中任一項所述的方法，其中所述接觸發(fā)生于水性緩沖液中。
32.權(quán)利要求19至31中任一項所述的方法，其中所述脂質(zhì)體包含試劑。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述試劑是預(yù)防劑、治療劑或診斷劑。
34.權(quán)利要求I至15中任一項所述的方法，其中使用摩爾比為40 10 50的DOPC、DOPG和馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)制備所述脂質(zhì)體。
35.權(quán)利要求8中任一項所述的方法，其中二硫醇交聯(lián)劑與馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)的摩爾比為I : 2。
36.方法，其包括 使包含官能化脂質(zhì)的多層脂質(zhì)囊泡與交聯(lián)劑接觸以形成在脂質(zhì)雙層之間具有交聯(lián)的多層脂質(zhì)囊泡。
37.方法，其包括 以有效量向?qū)ο笫┯镁哂薪宦?lián)脂質(zhì)雙層且包含試劑的多層脂質(zhì)囊泡。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述多層脂質(zhì)囊泡包含生物可降解脂質(zhì)。
39.權(quán)利要求37或38所述的方法，其中所述多層脂質(zhì)囊泡包含磷脂。
40.權(quán)利要求37、38或39所述的方法，其中所述多層脂質(zhì)囊泡包含磷酸膽堿、磷酸甘油和/或磷酸乙醇胺。
41.權(quán)利要求37至40中任一項所述的方法，其中所述多層脂質(zhì)囊泡包含官能化脂質(zhì)。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述馬來酰亞胺官能化脂質(zhì)是馬來酰亞胺官能化磷酸乙醇胺。
44.權(quán)利要求37至43中任一項所述的方法，其中所述試劑是預(yù)防劑。
45.權(quán)利要求37至43中任一項所述的方法，其中所述試劑是治療劑。
46.權(quán)利要求37至45中任一項所述的方法，其中所述試劑是抗原。
47.權(quán)利要求37至45中任一項所述的方法，其中所述試劑是佐劑。
48.權(quán)利要求37至45中任一項所述的方法，其中所述多層脂質(zhì)囊泡包含多于一種試劑。
49.權(quán)利要求37至45中任一項所述的方法，其中所述多層脂質(zhì)囊泡包含兩種試劑。
50.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述多層脂質(zhì)囊泡包含抗原和佐劑。
51.權(quán)利要求37至50中任一項所述的方法，其中所述多層脂質(zhì)囊泡在其外表面與PEG三雙口 ο
52.方法，其包括 使具有交聯(lián)脂質(zhì)雙層且包含試劑的多層脂質(zhì)囊泡與細(xì)胞在體外接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含穩(wěn)定化多層囊泡的遞送系統(tǒng)，以及其組合物、合成方法和使用方法。所述穩(wěn)定化多層囊泡可包含預(yù)防劑、治療劑和/或診斷劑。
文檔編號A61K39/00GK102917690SQ201180023709
公開日2013年2月6日 申請日期2011年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者達(dá)雷爾·J·歐文, 文宰顯 申請人:麻省理工學(xué)院