專利名稱：疫苗制劑的制作方法
疫苗制劑
背景技術(shù)：
由細(xì)菌肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(也被稱為肺炎球菌(pneumococcus))導(dǎo)致的肺炎球菌疾病是全球較重要的細(xì)菌病原體之一。該疾病負(fù)擔(dān)在沒有疫苗的發(fā)展中國家的5歲以下兒童中是高的。肺炎球菌疾病是復(fù)合的病群，包括侵襲性感染諸如菌血癥/膿毒癥、腦膜炎、肺炎和中耳炎，其既侵襲兒童又侵襲成人。Prevnar13(也稱為“Prevenar 13”，以及在本文被稱為“Prev (e) nar 13”)是來自13種肺炎球菌血清型(1,3,4, 5,6k, 6B, 7F，9V，14，18C, 19A, 19F 和 23F)、分別與 CRM19 (來自白喉棒狀桿菌(Corynebacterim diphtheriae)突變株的交叉反應(yīng)物質(zhì))綴合的多糖制劑。Prev(e)nar13被推薦用于嬰兒和幼兒的主動免疫以提供對任何肺炎球菌綴合疫苗的寬廣血清型覆蓋。尤其是，Prev(e)nar 13中的血清型19A在世界的許多地區(qū)流行，并經(jīng)常與抗生素抗性有關(guān)。參見，例如 W02006/110381; W02008/079653; W02008/079732; W02008/143709 以及其中引用的參考文獻(xiàn)。 硫柳萊(Thimerosal)(也稱為鄰乙萊硫基苯酸鈉(Thiomersal)、硫柳萊(merthiolate))是含乙基汞的防腐劑，其從20世紀(jì)30年代早期已被添加至許多多劑量可注射制劑和局部溶液以保護(hù)它們在暴露期以及當(dāng)給予多重個體時免受潛在的污染。在美國和世界的其他國家，硫柳汞作為強(qiáng)制免疫的部分以及在其他藥物產(chǎn)品中繼續(xù)被施用。據(jù)稱它在疫苗領(lǐng)域的產(chǎn)品多次使用期間是用于消除潛在的污染菌的有效防腐劑，與疫苗的抗原結(jié)構(gòu)和特性有最小限度的相互作用。由于關(guān)于乙基汞對嬰兒和青年人的腦發(fā)育的潛在安全問題和副作用逐漸增加的爭論，一些機(jī)構(gòu)開始建議鑒定具有較低或可以忽略的安全風(fēng)險的可替代防腐劑。在1999年，由美國國會托管的美國食品藥品監(jiān)督管理局的審查發(fā)現(xiàn)，與依據(jù)一些國立指南被認(rèn)為可接受的汞相比，一些嬰兒可能從疫苗中接受更多的汞。美國兒科學(xué)會(AAP)和美國公共衛(wèi)生署(USPHS)關(guān)于疫苗中的硫柳汞簽署了一份聯(lián)合聲明，然后AAP向臨床醫(yī)生發(fā)布了一份臨時報告，建議盡快從疫苗中去除硫柳汞，同時保持努力以確保高水平的疫苗接種繼續(xù)在全球?qū)嵤?，而不影響安全性。通過制備和使用僅單劑量的疫苗制劑可以降低或消除將防腐劑添加至疫苗的需要。然而，使用單劑量、無防腐劑的制劑增加了疫苗接種的總費(fèi)用，并且危及發(fā)展中國家免疫規(guī)劃的效果。此外，從多劑量瓶完全去除防腐劑不被認(rèn)為是優(yōu)先的選擇，特別是在冷藏條件有限以及健康保健標(biāo)準(zhǔn)不理想的國家(Drain et al. , Bull World Health Organ81 (10) : 726 - 731 (2003)。在1928年，接種過受污染的白喉疫苗的21名兒童中有12名死于多發(fā)性葡萄球菌胺腫和毒血癥(Wilson, The Hazards of Tmmuni z at ion, AthlonePress, London, pp. 75 - 78(1967)。因此，盡管多劑量瓶看起來是最適合用于生產(chǎn)較廉價的疫苗，但理想的是配制具有至少一種防腐劑的多劑量疫苗以便保護(hù)個體免于感染在多次使用期間或者一個或多個非無菌事件后無意引入疫苗的微生物。然而，防腐劑在抵制細(xì)菌和其他微生物污染方面的功效必須與特定防腐劑對所選免疫原性組合物的免疫原性以及對每一不同抗原決定簇長期穩(wěn)定性的影響相平衡。Prev(e)nar 13制劑與防腐劑間的相容性之前沒有討論過。制備包含至少一種保護(hù)和/或穩(wěn)定Prev(e)nar 13中存在的肺炎球菌抗原血清型的抗原決定簇的防腐劑的優(yōu)化制劑是理想的。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明提供了多價免疫原性組合物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型的多種莢膜多糖和2-苯氧乙醇(2-PE)。在某些實施方案中，莢膜多糖來自選自1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C, 19A, 19F和23F的一種或多種肺炎鏈球菌血清型。在某些實施方案中，莢膜多糖來自七種或更多種選自1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C, 19A, 19F和23F的肺炎鏈球菌血清型。在某些實施方案中，莢膜多糖來自肺炎鏈球菌血清型
I,3，4，5，6A, 6B, 7F,9V, 14，18C, 19A, 19F 和 23F 的每一種。在發(fā)明的某些實施方案中，組合物包含濃度為7mg/mL-15mg/mL、約10mg/mL、不低于7mg/mL、不低于10mg/mL、或者不低于15mg/mL的2-PE。在某些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物還可以包含佐劑、緩沖劑、冷凍保護(hù) 齊U、鹽、二價陽離子、非離子去垢劑、和自由基氧化抑制劑的一種或多種。在某些實施方案中，佐劑是磷酸鋁。本發(fā)明優(yōu)選的多價免疫原性組合物是分別綴合至CRM19的來自血清型1，3，4，5，6A, 6B, 7F，9V，14，18C, 19A, 19F和23F的肺炎球菌莢膜多糖的制劑，其中多價免疫原性組合物配制在無菌液體中以包含約4. 4 μ g/mL的每種多糖,除外約8. 8 μ g/mL的6B ；約58 μ g/mL CRM197載體蛋白；約O. 25mg/mL的磷酸鋁形式的元素鋁；約O. 85%氯化鈉；約O. 02%聚山梨醇酯80 ；pH為5. 8的約5mM琥珀酸鈉緩沖劑；以及約10mg/mL的2-苯氧乙醇。在本發(fā)明的某些實施方案中，免疫原性組合物的抗原性在2-8°C、20_25°C或37°C溫度下穩(wěn)定不少于I年、I. 5年、2年或2. 5年。在本發(fā)明的某些實施方案中，免疫原性組合物接種一種或多種微生物后，所述微生物的濃度隨著時間降低。在某些實施方案中，用一種或多種細(xì)菌菌株接種后，組合物在24小時呈現(xiàn)從初次微生物計數(shù)的至少I. O的對數(shù)下降(log reduction),在7天時呈現(xiàn)從先前測量的值的至少3. O的對數(shù)下降，以及28天后，呈現(xiàn)從先前測量的值的不超過0. 5的對數(shù)增加(log increase).在某些實施方案中，用一種或多種細(xì)菌菌株接種后，組合物在6小時呈現(xiàn)從初次計算的計數(shù)的至少2. O的對數(shù)下降，在24小時呈現(xiàn)從先前測量的值的至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天沒有恢復(fù)。微生物菌株包括一種或多種選自銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、大腸桿菌(E. coli)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的菌株。在某些實施方案中，免疫原性組合物被接種多次。某些實施方案中，第二次接種發(fā)生在初次接種后6小時，第三次接種發(fā)生在初次接種后24小時，第三次接種發(fā)生在初次接種后7天，以及第四次接種發(fā)生在初次接種后14天。在第二方面，本發(fā)明還提供了含本發(fā)明的多價免疫原性組合物的小瓶。小瓶可以包含單劑量或多次劑量的免疫原性組合物。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的多價免疫原性組合物的預(yù)填充疫苗遞送裝置。在某些實施方案中，預(yù)填充疫苗遞送裝置是注射器或包含注射器。本發(fā)明的疫苗遞送裝置可以包含雙室或多室注射器或小瓶或其組合。在某些實施方案中，預(yù)填充疫苗遞送裝置包含配制用于肌內(nèi)或皮下注射的多價免疫原性組合物。在第三方面，本發(fā)明還提供了用于制備本發(fā)明的免疫原性組合物的試劑盒，其中該試劑盒包含⑴在凍干形式的組合物中的多種莢膜多糖，以及(ii)用于重建(reconstitute)組分(i)的水性物質(zhì)，以便提供水性組合物。在第四方面，本發(fā)明提供了在小瓶中包含四次劑量疫苗的多劑量疫苗，每一劑量包含4-20mg/mL、優(yōu)選10mg/mL的2-苯氧乙醇,其中一劑 量是O. 5mL的疫苗。在第五方面，本發(fā)明還提供了在疫苗組合物的一些或全部免疫原性和非免疫原性組分存在的情況下，測量包含一種或多種選擇的防腐劑的疫苗制劑功效的方法，其中測試包括至少以下兩步用選擇的微生物群接種測試組合物，以及將接種的微生物或微生物們隨著時間和在特定環(huán)境條件下(例如溫度)的對數(shù)下降與在缺乏測試防腐劑的對照組合物中的對數(shù)下降相比較。附圖簡述圖I-硫柳汞作為疫苗防腐劑在多種制劑中的效力。圖2-2-苯氧乙醇(2-PE)作為疫苗防腐劑在多種制劑中以及在不同濃度時的效力和穩(wěn)定性。圖3-單次微生物攻擊后，在20-25 °C下，不含防腐劑的Prev (e) nar 13疫苗制劑中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均Iogltl變化)。圖4-單次微生物攻擊后，在20_25°C下，含O. 01%硫柳汞的Prev (e) nar 13疫苗制劑中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均Iogltl變化)。圖5-單次微生物攻擊后，在20_25°C下，含O. 02%硫柳汞的Prev (e) nar 13疫苗制劑中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均Iogltl變化)。圖6-單次微生物攻擊后，在20_25°C下，含O. 02%硫柳汞的鹽水中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均
Iog10 變化)。圖7_單次微生物攻擊后,在20_25°C下,含5mg/0. 5mL 2_苯氧乙醇的Prev (e) nar13疫苗制劑中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均Iogltl變化)。圖8-多次微生物攻擊后，在⑷22 - 24°C或在(B) 2 - 8°C下，在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時不含防腐劑的Prev (e)nar 13疫苗制劑中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均Iogltl變化)。圖9-多次微生物攻擊后，在(A) 22 - 24°C或在(B) 2 - 8°C下，在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時含O. 01%硫柳萊的Prev (e) nar 13疫苗制劑中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均Iogui變化)。

圖10-多次微生物攻擊后，在⑷22 - 24°C或在(B) 2 - 8°C下，在t=0、6小時、24小時、7天和14天時含O. 02%硫柳萊的Prev (e)nar 13疫苗制劑中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均Iogltl變化)。
圖11-多次微生物攻擊后，在⑷22 - 24°C或在⑶2 - 8°C下，在t=0、6小時、24小時、7天和14天時含O. 02%硫柳汞的鹽水中微生物菌落計數(shù)減少的時程(表示為在t=0、6小時、24小時、7天、14天和28天時與攻擊時間相比的平均Iogltl變化)。圖12-金黃色葡萄球菌在多種攻擊研究中消減的非線性回歸分析。圖13-2-PE和硫柳汞作為疫苗防腐劑抵抗單次或多次微生物攻擊的比較通過或未通過EP 5. I. 3標(biāo)準(zhǔn)B。圖14-來自每種血清型的肺炎鏈球菌多糖制劑的抗原性在配制有5mg2_PE的Prev (e) nar 13中的長期穩(wěn)定性。圖15-2-PE在Prev (e) nar 13疫苗制劑中的長期穩(wěn)定性。發(fā)明詳述
如本申請所用的百分比濃度是質(zhì)量與體積比(w/v)或質(zhì)量與質(zhì)量比(w/w)。除非另外規(guī)定，“劑量”指O. 5mL的疫苗劑量。術(shù)語“多劑量”指包含超過一次劑量的疫苗的組合物，其可以以不同的給藥步驟或隨著時間給予一個個體或多個個體。本發(fā)明提供了包含來自肺炎鏈球菌(也稱為肺炎球菌)血清型的多種莢膜多糖和防腐劑的多價免疫原性組合物。該組合物還可以被稱為疫苗，以及用于誘導(dǎo)抗肺炎球菌的免疫反應(yīng)并保護(hù)個體例如人類個體、優(yōu)選為人類兒童或嬰兒免受感染。多種任何肺炎鏈球菌莢膜多糖適用于本發(fā)明的組合物。在本發(fā)明的某些實施方案中，多價免疫原性組合物包含從肺炎鏈球菌血清型4，6B, 9V，14，18C, 19F和23F制備的莢膜多糖。在某些實施方案中，莢膜多糖從血清型4，6B，9V，14，18C, 19F，23F以及至少一種另外的肺炎鏈球菌血清型制備。在某些實施方案中，莢膜多糖從至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種或至少9種選自肺炎鏈球菌血清型I, 4，5，6B, 7F，9V，14，18C, 19F和23F的血清型制備。在某些實施方案中，莢膜多糖從肺炎鏈球菌血清型1，3，4，5，6A, 6B, 7F，9V,14, 18C, 19A, 19F和23F制備。利用已知的技術(shù)從肺炎鏈球菌血清型制備本發(fā)明的莢膜多糖。參見，例如國際專利申請W02006/110381;W02008/079653;W02008/079732和W02008/143709，其每一篇都通過引用并入本文。在本發(fā)明的某些實施方案中，莢膜多糖與載體蛋白綴合。這些肺炎球菌綴合物可以分別制備。例如，在一個實施方案中，每種肺炎球菌多糖血清型生長在大豆培養(yǎng)基中。然后通過離心、沉淀、超濾和柱色譜法純化單獨(dú)的多糖。用化學(xué)方法活化純化過的多糖，從而使得糖類能夠與所選載體蛋白反應(yīng)以形成肺炎球菌綴合物。一旦被活化，每種莢膜多糖分別與載體蛋白綴合以形成糖綴合物。在某些實施方案中，每種不同的莢膜多糖與相同的載體蛋白綴合。在這類實施方案中，可以通過例如還原胺化法實現(xiàn)綴合。多糖的化學(xué)活化以及隨后與載體蛋白的綴合通過常規(guī)的方法完成。參見，例如美國專利號4，673，574和4，902，506，其通過引用并入本文。載體蛋白優(yōu)選是無毒和無反應(yīng)原性以及可以足夠的量和純度獲得的蛋白。載體蛋白應(yīng)順從標(biāo)準(zhǔn)的綴合程序。在本發(fā)明的某些實施方案中，CRM197用作載體蛋白。CRM197 (Pfizer, Sanford, NC)是從生長在酪蛋白氨基酸和酵母膏培養(yǎng)基中的白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7 (CRM197)培養(yǎng)物分離的白喉毒素的無毒變體(即類毒素)。CRM197通過超濾、硫酸銨沉淀和離子交換色譜法純化?？蛇x地，按照例如通過引用并入本文的美國專利號5，614，382重組制備CRM197。其他的白喉類毒素也適用于作為載體蛋白。其他合適的載體蛋白包括滅活的細(xì)菌毒素，諸如破傷風(fēng)類毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如，如在國際專利申請W02004/083251中描述的)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST和來自銅綠假單胞菌的外毒素A。還可以利用細(xì)菌外膜蛋白諸如外膜復(fù)合物c(OMPC)、孔蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、來自A組或B組鏈球菌的C5a肽酶、或者流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)蛋白D。其他蛋白諸如卵清蛋白、鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或純化的結(jié)核菌素的蛋白衍生物(PPD)也可以用作載體蛋白。莢膜多糖與載體蛋白綴合后，該多糖-蛋白綴合物通過多種技術(shù)來純化(即在多糖-蛋白綴合物量方面進(jìn)行富集)。這些技術(shù)包括濃縮/透析過濾操作、沉淀/洗脫、柱色譜法和深層過濾。
如下文更詳細(xì)討論的，本發(fā)明的免疫原性組合物包含用于制備多劑量疫苗制劑的至少一種防腐劑，其在多價肺炎球菌莢膜多糖-蛋白綴合物的一種或多種抗原決定簇的長期穩(wěn)定性方面具有有利特性，并且通過在給予有需要的個體前賦予對一種或多種微生物的抗性有利地保護(hù)組合物免受污染?？梢岳帽绢I(lǐng)域公認(rèn)的方法取得本發(fā)明包含防腐劑的免疫原性組合物另外的制齊U。例如，可以將十三種單獨(dú)的肺炎球菌綴合物與生理學(xué)上可接受的載體配制以制備組合物。這種載體的實例包括但不限于水、緩沖鹽、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)和右旋糖溶液，如下文更詳細(xì)描述的。本發(fā)明的免疫原性組合物除多種肺炎球菌莢膜多糖-蛋白綴合物外還包含一種或多種防腐劑。FDA要求多重劑量(多劑量)瓶的生物產(chǎn)品包含防腐劑，僅有少數(shù)例外情況。含防腐劑的疫苗產(chǎn)品包括含以下物質(zhì)的疫苗芐索氯銨(炭疽疫苗)、2_苯氧乙醇(無細(xì)胞百白破疫苗(DTaP)、甲肝疫苗、萊姆病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗(腸胃外的))、苯酚(肺炎疫苗、傷寒疫苗(腸胃外的)、牛痘疫苗)和硫柳汞(無細(xì)胞百白破疫苗、白破疫苗(DT)、破傷風(fēng)-白喉疫苗(Td)、乙肝疫苗、b型流感嗜血桿菌疫苗(Hib)、流感疫苗、乙型腦炎疫苗(JE)、流腦疫苗、肺炎疫苗、狂犬病疫苗)的疫苗。批準(zhǔn)用于可注射藥物的防腐劑包括，例如氯丁醇、間甲酚、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、2-苯氧乙醇、芐索氯銨、苯扎氯銨、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞和硝酸苯汞。測試了多種包含用于增強(qiáng)Prev(e)nar 13免疫原性組合物效力和穩(wěn)定性的防腐劑的潛在合適的制劑后，本文公開的本發(fā)明提供了包含濃度為約2. 5-10mg/劑量(O. 5 -2%)的2-苯氧乙醇(2-PE)的這種肺炎球菌免疫原性組合物。在某些實施方案中，2-PE的濃度為約3. 5 - 7. 5mg/劑量(O. 7 - I. 5%)。在某些實施方案中，2-PE的濃度為約5mg/劑量(1%)。在某些實施方案中，2-PE的濃度不低于3. 5mg/劑量(O. 7%)，不低于4. Omg/劑量(O. 8%)，不低于4. 5mg/劑量(O. 9%)，不低于5. Omg/劑量(1%)，不低于5. 5mg/劑量(I. 1%)，不低于6. Omg/劑量(I. 2%)，不低于6. 5mg/劑量(I. 3%)，不低于7. Omg/劑量，不低于7. 5mg/劑量(I. 5%)，不低于8. Omg/劑量(I. 6%)，不低于9. Omg/劑量(I. 8%)或者不低于IOmg/劑量(2%)。
在本發(fā)明的某些實施方案中，肺炎球菌免疫原性組合物包含一種或多種另外的防腐劑，包括但不限于硫柳萊和福爾馬林。在某些實施方案中，免疫原性組合物可以包含一種或多種佐劑。如本文定義的，“佐劑”是用于增強(qiáng)本發(fā)明的免疫原性組合物免疫原性的物質(zhì)。因此，佐劑常被用于加強(qiáng)免疫反應(yīng)，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。增強(qiáng)組合物效力的合適佐劑包括，但不限于(I)鋁鹽(礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳化制劑(含有或不含有其他特異性免疫刺激劑諸如胞壁肽(如下文定義的)或細(xì)菌細(xì)胞壁組分)，諸如例如，(a)MF59 (PCT申請WO 90/14837)，其包含利用微流化儀諸如型號IlOY的微流化儀(Microf luidics, Newton, MA)配制在亞微米顆粒中的5%角藍(lán)烯、O. 5%吐溫80和O. 5%司盤 (Span) 85 (任選地包含不同量的MTP-PE (參見下文,盡管不是必需的)),(b) SAF,其包含10%角鯊烯、O. 4%吐溫80、5%普朗尼克嵌段共聚物L(fēng)121和thr-MDP(見下文)，被微流化在亞微米顆粒乳劑或被渦旋以生成更大粒度的乳劑，以及(C)Ribi 佐劑系統(tǒng)(RAS), (Corixa，Hamilton, MT)，其包含 2% 角鯊烯、O. 2% 吐溫80和一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，所述細(xì)胞壁組分來自由美國專利號4，912，094描述的3-0-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A (MPL) (Corixa)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)組成的組，優(yōu)選為MPL+CWS (Detox)；(d)聚山梨醇酯80 (吐溫80);(3)皂素佐劑，諸如 Quil A 或 SHMULON QS-21 (Antigenics, Framingham, MA)(美國專利號5，057，540)可以利用或者從其產(chǎn)生的顆粒諸如ISCOMs (免疫刺激復(fù)合物)；(4)細(xì)菌脂多糖；合成的脂質(zhì)A類似物諸如氨烷基葡萄糖胺磷酸化合物(AGP)、或其衍生物或類似物，其可以從Corixa購買到，并且在美國專利號6，113,918中描述過，一種這樣的AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脫氧-4-0-磷?；?3-0- [ (R) -3-十四酰氧基十四酰基]-2- [ (R) -3-十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其還被稱為529 (以前被稱為RC529)，其被配制為水性形式或配制為穩(wěn)定的乳劑；合成的多核苷酸諸如包含CpG基序的寡核苷酸(美國專利號6，207, 646)；(5)細(xì)胞因子，諸如白介素(例如 IL-1，IL-2, IL-4，IL-5，IL-6，IL-T, IL-12，IL-15，IL-18等)、干擾素(例如Y干擾素)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、共刺激分子B7-1和B7-2等；(6)細(xì)菌ADP-核糖基化毒素的去毒突變體，所述細(xì)菌ADP-核糖基化毒素諸如野生型或突變形式的霍亂毒素(CT)，例如按照公布的國際專利申請?zhí)朩O 00/18434(還參見WO 02/098368和WO 02/098369)其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一氨基酸取代，優(yōu)選被組氨酸取代；百日咳毒素(PT);或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)，特別是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129(參見例如 WO 93/13302 和 WO 92/19265);以及(7)作為免疫刺激劑增強(qiáng)組合物效力的其他物質(zhì)，諸如鈣鹽、鐵、鋅、?；野彼釕乙骸Ⅴ；?、衍生化糖/糖類、聚磷腈、生物可降解的微球、單磷酰基脂質(zhì)A(MPL)、脂質(zhì)A衍生物(例如具有降低的毒性)、3-0_脫酰基MPL、quil A、皂素、QS21、母育酚、弗氏不完全佐劑(Difco Laboratories, Detroit, MI)、Merck 佐劑 65 (Merck and Company, Inc. , Rahway,NJ)、AS-2 (Smith-Kline Beecham, Philadelphia, PA)、CpG 寡核苷酸(優(yōu)選未甲基化的)、生物粘附劑和粘膜粘附劑、微粒、脂質(zhì)體、聚氧乙烯醚制劑、聚氧乙烯酯制劑和胞壁肽或咪唑并喹諾酮化合物。胞壁肽包括但不限于N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酸_2_(1’ -2’ 二棕櫚?；?sn_甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。在某些實施方案中，佐劑組合物是相對H2-型細(xì)胞因子有利于更大程度誘導(dǎo)THl-型細(xì)胞因子(例如，IFN-Y，TNF a，IL-2和IL-12)的佐劑組合物，這可以有利于誘導(dǎo)針對給予的抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。主要促進(jìn)THl反應(yīng)的特定佐劑系統(tǒng)包括但不限于脂質(zhì)A衍生物，諸如單磷酰脂質(zhì)A (MPL)或其衍生物，例如3-脫-O-?；疢PL (3D-MPL)；MPL和/或3D-MPL與鋁鹽和/或皂素衍生物的組合(例如在WO 94/00153公開的與3D-MPL組合的QS21，或者如在WO 96/33739中公開的QS21和膽固醇)；三萜系化合物以及水包油型乳劑諸如包含生育酚的乳劑(如在WO 95/17210中公開的)。佐劑可以任選地被本發(fā)明的防腐疫苗制劑的一種或多種免疫原性組分吸附或者 與其組合。如本文所用的，術(shù)語“吸附的抗原”指其中大于20%，30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%或90%的抗原吸附至佐劑的混合物。在某些實施方案中，佐劑是吸附的磷酸鋁(Al+)或羥基磷酸鋁。通常，總的鋁含量是每O. 5mL劑量有200-1000 μ g,300-900 μ g,400-800 μ g、500-700yg或大約630ygAl+，其可以全部是氫氧化鋁或全部是磷酸鋁?？蛇x地，Al+含量可以來自多種比例的氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物，例如磷酸鋁氫氧化鋁為1:8-8:1, 1:4-4:1, 3:8-8:3, 1:2-2:1或1:1。盡管在混合前通過預(yù)吸附的抗原提供了大多數(shù)鋁以形成組合疫苗，一些鋁可以在本發(fā)明的組合疫苗配制期間以游離形式加入，例如在本文所述的pH調(diào)整步驟前加入。通常，每O. 5mL劑量游離的鋁含量可以是0-300 μ g，50-250μ g, 75-200 μ g，100-150 μ g 或大約 120 μ g 的 Α13+。游離的 Α13+可以全部是 Al (OH) 3 或全部是A1P04、或者為多種比例的Al (OH) 3和A1P04的混合物。疫苗抗原組分可以在混合前分別預(yù)先吸附到鋁鹽上。在另一實施方案中，抗原混合物可以在與另外的佐劑混合前預(yù)先吸附?？蛇x地，本發(fā)明的疫苗的某些組分可以配制為非有意吸附至佐劑上。本發(fā)明的制劑還可以包含緩沖劑、鹽、二價陽離子、非離子去污劑、冷凍保護(hù)劑諸如糖、以及抗氧化劑諸如自由基清除劑或螯合劑，或者其任一多個組合的一種或多種。任何一種組分例如螯合劑的選擇可以確定是否需要另一種組分(例如，清除劑)。配制用于給藥的最終組合物應(yīng)是無菌的和/或無熱原的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于經(jīng)驗確定這些和其他組分的哪些組合用于包括在本發(fā)明的含防腐劑疫苗組合物中是最優(yōu)的，這取決于諸如所需的特定儲存和給藥條件的多種因素。在某些實施方案中，與腸胃外給藥相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種生理學(xué)上可接受的緩沖劑，其選自但不限于三羥甲基氨基甲烷(三甲胺)、磷酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、組氨酸和琥珀酸鹽。在某些實施方案中，制劑被緩沖至約6. O至約9. O的pH范圍，優(yōu)選從約6. 4至約7. 4。在某些實施方案中，需要調(diào)整本發(fā)明的免疫原性組合物或制劑的pH?？梢岳帽绢I(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)調(diào)整本發(fā)明的制劑的pH。制劑的pH可以調(diào)整至3. 0-8. O。在某些實施方案中，制劑的PH可以是或者可以調(diào)整為3. 0-6. 0,4. 0-6. O、或5. 0-8. O。在其他實施方案中，制劑的PH可以是或者可以調(diào)整為約3. O、約3. 5、約4. O、約4. 5、約5. O、約5. 5、約5.8、約6. O、約6. 5、約7. O、約7. 5、或約8. O。在某些實施方案中，pH可以是或者可以調(diào)整為 4. 5-7. 5、或 4. 5-6. 5,5. 0-5. 4,5. 4-5. 5,5. 5-5. 6,5. 6-5. 7,5. 7-5. 8,5. 8-5. 9,5. 9-6. O、
6.0-6. 1,6. 1-6. 2,6. 2-6. 3,6. 3-6. 5,6. 5-7. 0,7. 0-7. 5 或 7. 5-8. O 的范圍。在特定實施方案中，制劑的pH是約5. 8。在某些實施方案中，與腸胃外給藥相容的本發(fā)明的制劑包含濃度為約O. ImM至約10mM、優(yōu)選高達(dá)約5mM的一種或多種二價陽離子，包括但不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2。在某些實施方案中，與腸胃外給藥相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種鹽，包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉和硫酸鉀，所述鹽存在的離子強(qiáng)度在腸胃外給藥時對個體而言是生理學(xué)上可接受的，并包括在最終濃度以在終制劑中產(chǎn)生所選的離子強(qiáng)度或同滲容摩。制劑的最終離子強(qiáng)度或同滲重摩通過多種組分(例如來自緩沖化合物和其他非緩沖鹽的離子)來確定。優(yōu)選的鹽NaCl存在的范圍高達(dá)約250mM，選擇的鹽濃度補(bǔ)充其他組分 (例如糖)從而使得制劑的最終總同滲容摩與腸胃外給藥(例如，肌內(nèi)或皮下注射)相容，并且會促進(jìn)疫苗制劑的免疫原性組分在多種溫度范圍的長期穩(wěn)定性。無鹽制劑會容許一種或多種選擇的冷凍保護(hù)劑的范圍增加以維持所需的最終同滲容摩水平。 在某些實施方案中，與腸胃外給藥相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種選自但不限于雙糖類(例如，乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖)和多羥烴類(例如半乳糖醇、甘油、甘露醇和山梨醇)的冷凍保護(hù)劑。在某些實施方案中，制劑的同滲容摩的范圍為約200m0s/L至約800m0s/L，優(yōu)選的范圍為約250m0s/L至約500m0s/L、或者約300m0s/L -約400m0s/L。無鹽制劑可以包含例如約5%至約25%的蔗糖，優(yōu)選地約7%至約15%、或者約10%至約12%的蔗糖。可選地，無鹽制劑可以包含例如約3%至約12%的山梨醇，優(yōu)選地約4%至7%、或者約5%至約6%的山梨醇。如果添加諸如氯化鈉的鹽，那么蔗糖或山梨醇的有效范圍相對減小。這些和其他這種同滲重摩和同滲容摩注意事項完全在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。在某些實施方案中，與腸胃外給藥相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種自由基氧化抑制劑和/或螯合劑。多種自由基清除劑和螯合劑是本領(lǐng)域已知的，并適用于本文描述的所用的制劑和方法。實例包括但不限于乙醇、EDTA、EDTA/乙醇組合、三乙醇胺、甘露醇、組氨酸、甘油、檸檬酸鈉、肌醇六磷酸鹽、三聚磷酸鹽、抗壞血酸/抗壞血酸鹽、琥珀酸/琥珀酸鹽、蘋果酸/馬來酸鹽、甲磺酸去鐵胺、EDDHA和DTPA、以及以上兩種或更多種的多種組合。在某些實施方案中，可以以有效地增強(qiáng)制劑長期穩(wěn)定性的濃度添加至少一種非還原性自由基清除劑。一種或多種自由基氧化抑制劑/螯合劑還可以以多種組合添加，諸如清除劑和二價陽離子。螯合劑的選擇會決定是否需要添加清除劑。在某些實施方案中，與腸胃外給藥相容的本發(fā)明的制劑包含一種或多種非離子型表面活性劑，包括但不限于聚氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類聚山梨醇酯_80(吐溫80)、聚山梨醇酯_60(吐溫60)、聚山梨醇酯_40(吐溫40)和聚山梨醇酯_20(吐溫20),聚氧乙烯烷基醚類包括但不限于Brij58、Brij35、以及其他諸如曲拉通(Triton)X-IOO;曲拉通X-114，NP40，司盤85和非離子型表面活性劑的普朗尼克系列(例如，普朗尼克121)，其中優(yōu)選的組分為濃度約O. 001%至約2%(高達(dá)約O. 25%是優(yōu)選的)的聚山梨醇酯-80，或者濃度為約O. 001%至1%(高達(dá)約O. 5%是優(yōu)選的)的聚山梨醇酯-40。在某些實施方案中，本發(fā)明的制劑包含一種或多種適于腸胃外給藥的另外穩(wěn)定齊U，例如包含至少一個硫醇(-SH)基團(tuán)(例如，半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、硫代乙醇酸鈉、硫代硫酸鹽、硫代甘油或其混合物)的還原劑?？蛇x地或任選地，可以通過從儲存容器去除氧、保護(hù)制劑避光(例如，通過利用琥珀色玻璃容器)來進(jìn)一步穩(wěn)定本發(fā)明包含防腐劑的疫苗制劑。本發(fā)明含防腐劑的疫苗制劑可以包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其包括本身不誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的任何賦形劑。合適的賦形劑包括但不限于大分子諸如蛋白、糖類、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖(Paoletti etal, 2001, Vaccine, 19:2118)、海藻糖、乳糖和脂質(zhì)聚合物(諸如油滴或脂質(zhì)體)。這種載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。藥學(xué)上可接受的賦形劑例如在Gennaro, 2000，RemingtoniTheScience and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN:0683306472 中被討論。本發(fā)明的組合物可以被凍干或為水性形式，例如溶液或懸液。液體制劑可以方便地從它們的包裝形式直接給藥，以及由此對于注射是理想的，不需要否則如本發(fā)明的凍干組合物那樣需要在水性介質(zhì)中重溶解。 在本發(fā)明的特定實施方案中，疫苗是多價免疫原性組合物，其包含一種或多種選自血清型1，3，4，5，6A, 6B, 7F，9V，14，18C, 19A, 19F和23F的肺炎球菌莢膜多糖，分別與CRM197綴合。疫苗被配制為包含1至5μ g、優(yōu)選約4. 4 μ g/mL的每種多糖，但優(yōu)選約8. 8 μ g/mL 的 6B ；20-100 μ g/mL、優(yōu)選約 58 μ g/mL 的 CRM197 載體蛋白；0. 02_2mg/mL、優(yōu)選
O.25mg/mL的磷酸鋁形式的元素鋁；0. 5-1. 25%、優(yōu)選約O. 85%的氯化鈉；0. 002-0. 2%、優(yōu)選約O. 02%聚山梨醇酯80 ;1-10禮、優(yōu)選約5mM的琥珀酸鈉緩沖劑，pH為4_7、優(yōu)選pH為5. 8 ;以及4-20mg/mL、優(yōu)選約10mg/mL的2-苯氧乙醇。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，疫苗是多價免疫原性組合物，其包含選自血清型I, 3，4，5，6A, 6B, 7F，9V，14，18C, 19A, 19F和23F的肺炎球菌莢膜多糖，分別與CRM197綴合。疫苗被配制為包含約4. 4 μ g/mL的每種糖，除6B為約8. 8 μ g/mL外；約58 μ g/mL的CRM197載體蛋白；約O. 25mg/mL的磷酸鋁形式的元素鋁；約O. 85%的氯化鈉；約O. 02%的聚山梨醇酯80 ；pH為5. 8的約5mM琥珀酸鈉緩沖劑；以及約10mg/mL的2-苯氧乙醇。本發(fā)明的組合物可以包含的許多物質(zhì)的量可以表示為重量/劑量、重量/體積或百分比濃度(如重量/體積或重量/重量)。所有這些值可以相互轉(zhuǎn)換。為了轉(zhuǎn)換為重量/劑量單位或從重量/劑量單位轉(zhuǎn)換，規(guī)定了劑量的體積。例如，給定O. 5mL的劑量，5. Omg/劑量2-PE相當(dāng)于10mg/mL或I. 0%(g/100mL)的濃度。疫苗制劑還可以表示為多糖2-PE的比例。例如，0.5mL劑量的具有4. 4 μ g/mL每種多糖(除8. 8 μ g/mL的6B外)和10mg/mL 2-PE的優(yōu)選制劑會有30. 8 μ g多糖(2. 2 μ gx12血清型+血清型6B的4. 4 μ g)和5000μ g2-PE。因此，多糖2-PE的重量比為30. 8:5000。在本發(fā)明的某些實施方案中，疫苗的多糖2-PE重量比為5:5000至100:5000。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述多糖2-PE重量比為約30.8:5000。疫苗制劑的遞送還提供了利用公開的包含至少一種防腐劑的藥物組合物和制劑以在哺乳動物個體諸如人類個體、優(yōu)選兒童或嬰兒中誘導(dǎo)抗肺炎球菌的免疫反應(yīng)，并因此保護(hù)避免感染的方法。通過經(jīng)由全身或粘膜途徑給予疫苗，本發(fā)明的疫苗制劑可以用于保護(hù)人類個體不受肺炎球菌感染影響。這些給藥可以包括例如腸胃外給藥或粘膜給藥至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道?？梢酝ㄟ^腸胃外給藥(肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或至組織間隙給藥)，或者通過直腸、口腔、陰道、局部、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼睛、耳朵、肺或其他粘膜給藥實現(xiàn)將本發(fā)明的疫苗制劑直接遞送至個體。在優(yōu)選的實施方案中，腸胃外給藥是通過肌內(nèi)注射例如至個體的大腿或上臂。注射可以經(jīng)由針(例如皮下針)，但可選地，可以利用無針注射。通常的肌內(nèi)劑量是O. 5mL。本發(fā)明的組合物可以制備為多種形式，例如用于注射的液體溶液或懸液。在某些實施方案中，組合物可以制備為用于呼吸道給藥的粉末或噴霧劑，例如在吸入器中。在其他實施方案中，組合物可以制備為栓劑或陰道栓，或者用于鼻、耳或眼睛給藥，例如制備為噴霧劑、滴劑、凝膠或粉末。在一個實施方案中，鼻內(nèi)給藥可以用于預(yù)防肺炎或中耳炎(因為肺炎球菌的鼻咽運(yùn)輸能夠被更有效地預(yù)防，由此在它的初期減輕了感染)。每一疫苗劑量的綴合物的量被選擇為誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng)而沒有明顯副作用的量。取決于肺炎球菌血清型，這種量可以變化。一般地，每一劑量會包含O. I-IOOyg的多糖，特·別是O. 1-10 μ g,以及更特別地是1-5 μ g?？梢酝ㄟ^包括對個體適當(dāng)免疫反應(yīng)的觀測的標(biāo)準(zhǔn)研究來確定特定疫苗的組分的最佳量。初次免疫接種后，個體可以接受一次或幾次充分間隔的加強(qiáng)免疫。用于嬰兒和幼兒抵抗因為包括在Prev(e)nar 13疫苗中的血清型由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的侵襲性疾病的常規(guī)時間表是2，4，6和12-15個月齡。本發(fā)明的組合物還適用于較大的兒童、青春期少年、青少年和成人，其中根據(jù)熟練的專業(yè)人員的決定可以應(yīng)用相同或不同的常規(guī)時間表。包裝和劑型本發(fā)明的疫苗可以包裝在單位劑量或多劑量形式(例如，2次劑量、4次劑量或更多)中。對于多劑量形式，小瓶通常但并不必然優(yōu)于預(yù)填充注射器。合適的多劑量樣式包括但不限于每一容器2-10劑量，每一劑量O. l-2mL。在某些實施方案中，劑量是O. 5mL劑量。參見，例如，國際專利申請W02007/127668，其通過引用并入本文。組合物可以存在于小瓶中或其他合適的儲存容器中，或者可以存在于預(yù)填充的遞送裝置中，例如單或多組件注射器，其可以配備有或不配備針。注射器通常但不必然需要包含單劑量的本發(fā)明的含防腐劑疫苗組合物，盡管多劑量、預(yù)填充的注射器也在考慮中。同樣，小瓶可以包括單次劑量，但可選地可以包括多次劑量?？梢猿Ｒ?guī)地確立有效的劑量體積，但用于注射的組合物的通常劑量具有O. 5mL的體積。在某些實施方案中，配制劑量用于人類個體的給藥。在某些實施方案中，配制劑量用于成人、青少年、青春期少年、幼兒或嬰兒(即不超過I歲)的人類個體給藥，以及在優(yōu)選的實施方案匯總，可以通過注射給藥。本發(fā)明的液體疫苗還適用于重建以凍干形式存在的其他疫苗。如果疫苗要用于這種即時的重建，本發(fā)明提供了以下試劑盒具有兩個或更多個小瓶、兩個或更多個現(xiàn)成填充的注射器、或者每種的一個或多個，其中注射器的內(nèi)容物用于在注射前重建小瓶中的內(nèi)容物，或者反之亦然?？蛇x地，本發(fā)明的疫苗組合物可以凍干和重建,例如利用本領(lǐng)域熟知的用于冷凍干燥的多種方法之一，從而形成干燥的、規(guī)則形狀的(例如球形的)顆粒，諸如微丸或微球，其具有諸如平均直徑大小的顆粒特征，這些特征可以通過改變用于制備顆粒的確切方法來選擇和控制。疫苗組合物還可以包含佐劑，其任選地由單獨(dú)的干燥的、規(guī)則形狀的(例如球形的)顆粒諸如微丸或微球制備或包含在所述顆粒之內(nèi)。在這種實施方案中，本發(fā)明還提供了疫苗試劑盒，其包含包括穩(wěn)定的干燥疫苗組合物、任選地還包含本發(fā)明的一種或多種防腐劑的第一組分，以及包含用于重建第一組分的無菌水性溶液的第二組分。在某些實施方案中，水性溶液包含一種或多種防腐劑，以及可以任選地包含至少一種佐劑(參見，例如W02009/109550 (其通過引用并入本文))。仍在另一實施方案中，多劑量樣式的容器選自以下物體的一種或多種，但不限于以下物體一般實驗室玻璃器皿、長頸瓶、燒杯、量筒、發(fā)酵器、生物反應(yīng)器、管、管道、袋、罐、小瓶、小瓶閉具(例如，橡膠塞、蓋上的螺釘)、安瓶、注射器、雙或多-室注射器、注射器塞、注射器活塞、橡膠閉具、塑料閉具、玻璃閉具、套筒和一次性筆等。本發(fā)明的容器不受加工材料的限制，包括諸如玻璃、金屬(例如，鋼、不銹鋼、鋁等)和聚合物(例如，熱塑性塑料、彈性體、熱塑性彈性體)的材料。在特定實施方案中，該樣式的容器是具有丁基膠塞的5mLSchott I型玻璃瓶。熟練的技術(shù)人員會認(rèn)識到，上述樣式?jīng)Q不是詳盡的列舉，而僅僅作為對 技術(shù)人員關(guān)于本發(fā)明可以利用的多種樣式的指南。預(yù)期用于本發(fā)明的另外樣式可以在來自實驗室設(shè)備供應(yīng)商和生產(chǎn)商諸如United States Plastic Corp. (Lima, OH), VffR.的公開目錄中找到。用于評價疫苗組合物中防腐劑功效的方法本發(fā)明還提供了在疫苗組合物的一些或全部免疫原性和非免疫原性組分的存在的情況下，用于測量包含一種或多種選擇的防腐劑的疫苗制劑功效的新方法。關(guān)于防腐劑功效的WHO協(xié)議利用USP和EP測試，并且包括進(jìn)行某些測試時的開瓶政策(Open VialPolicy)條件。通常的防腐劑功效測試是單次攻擊測試，其中測試的組合物用選擇的微生物群接種一次，以及將接種的微生物隨著時間和在特定環(huán)境條件(例如溫度)下的對數(shù)下降與接種的微生物在缺乏測試防腐劑的對照組合物中的對數(shù)下降比較。參見，例如下文的實施例2和3。然而，還沒有額外的測試被要求用來解決防腐劑對多次污染的功效問題，例如通過多次接種相同的小瓶解決小瓶和塞子的問題。因此，本發(fā)明提供了多次攻擊測試，用于評價免疫原性組合物中一種或多種防腐劑的功效，其中該測試包括至少以下兩步用選擇的微生物群接種測試組合物，以及將接種的微生物隨著時間和在特定環(huán)境條件(例如溫度)下的減少與在缺乏測試防腐劑的對照組合物中的減少比較。參見，下文的實施例4和5。防腐劑效力本發(fā)明含防腐劑的疫苗制劑適用于填充在例如與腸胃外給藥相容的多劑量疫苗小瓶或容器中，并且在2-8°C、室溫或37°C長期保持穩(wěn)定，其中活性的損傷與缺乏防腐劑的相同制劑相比時降低或可以忽略。將制劑中防腐劑的量選擇為滿足疫苗安全性需要的量，如美國(U. S.)、歐洲或世界衛(wèi)生組織(WHO)藥典或者其組合所定義的。為了確定依據(jù)美國和歐洲藥典(分別為USP和EP)的防腐劑的水平，在時間為O時用約105-106CFU/ml (CFU=菌落形成單位)的以下菌接種一次疫苗制劑I.金黃色葡萄球菌(細(xì)菌；ATCC#6538;〃SA〃)
2.銅綠假單胞菌(細(xì)菌；；ATCC#9027;〃PA〃)3.白色念珠菌(Candida albicans)(酵母；ATCC#10231; "CA")4.黑曲霉菌(Aspergillus niger)(霉菌;ATCC#16404; "AN")為了代表實踐中在多劑量制劑重復(fù)使用期間可能發(fā)生的污染的最壞合理情況，WHO要求利用細(xì)菌菌株銅綠假單胞菌("PA")、金黃色葡萄球(〃SA〃)、大腸桿菌("EC")和枯草芽孢桿菌("BA")，有意暴露于多次污染事件的安全性測試。在初次攻擊后的時間0、6小時、24小時、7天和14天時在制劑中加入5xl03CFU/ml的每種生物體，并儲存在2 - 8°C或22 - 240C以模擬實踐中的潛在儲存條件。USP 29NF 24增補(bǔ)版2 (USP)要求，接種細(xì)菌微生物后，在7天時有從初次計算的計數(shù)(即接種的時間)的至少I. O的對數(shù)下降，在14天時有從先前測量的值的至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天時與先前測量的值相比沒有增加。參見表I。對于酵母和真菌，USP的要求是在7、14和28天時，沒有從接種時間的增加。 EP的要求更為嚴(yán)格。EP第5版5. 6(5. 1.3)對腸胃外和眼用制劑的要求有兩部分類目A和類目B。類目A(EP-A)要求，對于細(xì)菌，在接種后6小時有從初次計算的計數(shù)至少
2.O的對數(shù)下降；在24小時有從先前測量的值至少3. O的對數(shù)下降以及在28天沒有恢復(fù)。類目B(EP-B)要求，對于細(xì)菌，在24小時有從初次計算的計數(shù)至少1.0的對數(shù)下降，在7天時有從先前測量的值至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天時有從先前測量的值不超過O. 5對數(shù)增加(即沒有增加)。參見表I。對于酵母和真菌，類目A要求在7天時有從初次計算的計數(shù)的至少2. O的對數(shù)下降，以及在28天時沒有從先前測量的值的增加；以及類目B要求在14天時有從初次計算的計數(shù)至少I. O的對數(shù)下降，以及在28天時沒有從先前測量的值的增加。表I:美國、歐洲和日本藥典間對防腐劑效力測試的驗收標(biāo)準(zhǔn)
生物體 ^對數(shù)CFWmLTff
_feh_24h_7_d_Md_28 d
細(xì)菌EPA* 2I--NR 幡
EPBI3-W 林
I SPI3Ni
.IP3Ni
酵母和
HEPA-2-NI
具圃
EPB--INI
LSP--NININI*A標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)了待實現(xiàn)的推薦的功效。在合理的情形下，如果不能達(dá)到A標(biāo)準(zhǔn)，必須滿足B標(biāo)準(zhǔn)。**NI:沒有增加它被定義為比先前測量的值不超過O. 51og10的升高。***NR:沒有恢復(fù)在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的防腐劑在降低免疫原性制劑中微生物濃度方面是有效的。在本發(fā)明的某些實施方案中，與不含有一種或多種防腐劑的疫苗制劑相比，包含至少一種防腐劑的疫苗制劑在用一種或多種微生物接種后，降低了所述微生物的濃度。在本發(fā)明特定的實施方案中，制劑在24小時呈現(xiàn)從初次微生物計數(shù)的至少I. O的對數(shù)下降，在7天時呈現(xiàn)從先前測量的值至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天時呈現(xiàn)從先前測量的值不超過O. 5的對數(shù)增加。在本發(fā)明的另一特定實施方案中，制劑在6小時呈現(xiàn)從初次計算的計數(shù)的至少2. O的對數(shù)下降，在24小時呈現(xiàn)從先前測量的值的至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天時與初次微生物計數(shù)相比沒有呈現(xiàn)出恢復(fù)。在本發(fā)明另一實施方案中，制劑滿足歐洲藥典(EP)對于腸胃外和眼用制劑的要求，特別是EP第5版5.6(5. 1.3)的類目A(EP-A)和/或類目B的要求。在本發(fā)明的另一實施方案中，制劑滿足美國藥典(USP) 29NF24增補(bǔ)版2對于腸胃外制劑的要求。在本發(fā)明的某些實施方案中，當(dāng)用微生物攻擊時，本發(fā)明的至少一種防腐劑在降低制劑中的微生物濃度方面是有效的，與缺乏一種或多種防腐劑的制劑相比。不受限制，微生物可以是下述的一種或多種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌以及其它。在本發(fā)明的某些實施方案中，微生物可以在不同的間隔引入或接種在疫苗中一次 或多次。接種可以發(fā)生在計劃的實驗性接種情況下或者發(fā)生在污染的皮下針進(jìn)入多劑量疫苗制劑的容器的情況下。接種間的間隔可以在I分鐘和I個月之間。在特定的實施方案中，初次接種后，多次接種發(fā)生在初次接種后6小時、初次接種后24小時，初次接種后7天以及初次接種后14天。疫苗和防腐劑穩(wěn)定性的參數(shù)在本發(fā)明的某些實施方案中，疫苗制劑中至少一種抗原決定簇(即來自肺炎鏈球菌血清型的多糖制劑)的抗原性在儲存時間和溫度范圍內(nèi)是穩(wěn)定的?？乖钥梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法來測量。例如，可以通過利用型-特異性抗血清來確定總抗原性，如在實施例3中所描述的。在本發(fā)明的某些實施方案中，疫苗制劑中的至少一種抗原決定簇的抗原性穩(wěn)定不少于4周、不少于6周、不少于8周、不少于10周、不少于12周、不少于18周、不少于24周、不少于48周、不少于I年、不少于I. 25年、不少于I. 5年、不少于I. 75年、不少于2年、不少于2. 25年或者不少于2. 5年。優(yōu)選地，制劑中疫苗多數(shù)抗原決定簇，例如至少50%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的抗原決定簇的抗原性穩(wěn)定不少于4周、不少于6周、不少于8周、不少于10周、不少于12周、不少于18周、不少于24周、不少于48周、不少于I年、不少于
I.25年、不少于I. 5年、不少于I. 75年、不少于2年、不少于2. 25年或者不少于2. 5年。在本發(fā)明的某些實施方案中，疫苗制劑中至少一種抗原決定簇的抗原性當(dāng)在約-25°C至約37°C、或者-20至-10°C、或2至8°C、或約室溫、或22°C至28°C、或約37°C儲存時是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的特定實施方案中，疫苗制劑中的至少一種抗原決定簇的抗原性在2至8°C溫度下儲存不少于2. 5年是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的防腐劑的濃度在疫苗于上述時間段和儲存溫度下儲存后是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的特定實施方案中，疫苗制劑中的防腐劑的濃度在疫苗于2至8°C溫度下儲存不少于2. 5年是穩(wěn)定的。防腐劑的濃度可以通過本領(lǐng)域已知的方法來測量。例如，硫柳汞可以利用冷蒸氣原子吸收光譜測定法(CVAAS)來測量，如實施例3中描述的?？梢杂梅聪郒PLC測定來測量2-EP的濃度，同樣如在實施例3中描述的?？梢砸韵率龇绞竭M(jìn)行反相HPLC測定將樣品渦旋并以1:10稀釋于5mM在鹽水中的琥珀酸鹽緩沖齊U，然后將樣品離心并再次以1:10稀釋于5mM在鹽水中的琥珀酸鹽緩沖劑(測試樣品的中最終稀釋度為1:100)。然后利用Agilent Eclipse XDB-C18HPLC柱和含三氟乙酸的水和乙腈的線性梯度分析樣品。然后將防腐劑的量與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較。還參見，Sharma et al.，Biologicals36(l):61-63(2008)。以上公開內(nèi)容對本發(fā)明進(jìn)行了一般描述?？梢酝ㄟ^參考下文具體實施例獲得更為透徹的理解。描述這些實施例僅用于示例目的，而不是意欲限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例I -初步的防腐劑篩選研究多劑量Prev(e)nar 13疫苗的配方開發(fā)起始于防腐劑的初步篩選,所述防腐劑包括在Prev (e) nar 13制劑中的苯酌· (O. 25%)、2_苯氧乙醇(5mg/mL)、間甲酌· (O. 3%)、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯(分別為O. 18%和O. 12%)。 為了測試防腐劑的效力，等份的疫苗被接種以下生物體I.金黃色葡萄球(細(xì)菌；ATCC#6538)2.銅綠假單胞菌(細(xì)菌；ATCC#9027)3.白色念珠菌(酵母；ATCC#10231)4.黑曲霉菌(霉菌；ATCC#16404)將有或沒有所示濃度的硫柳汞或2-PE的30毫升(ml)每種疫苗制劑或者含O. 02%硫柳汞的鹽水一式三份接種每種測試的生物體懸液以使接種體的密度在時間為O時達(dá)到約IO5至106CFU/ml (CFU=菌落形成單位)。每種接種體的體積在每次有意攻擊期間不超過產(chǎn)物體積的1%。將樣品混合以確保攻擊的生物體的均勻分布。將一式三份的另外30ml疫苗(含有和不含有防腐劑)用作陰性對照，并加入單獨(dú)的培養(yǎng)基以評價可能存在于樣品或培養(yǎng)基的固有污染。然后將三個系列的疫苗的每種、以及陽性和陰性對照分別在20-25°C孵育。在時間為O時以及在接種后的6小時、24小時、7天、14天和28天的間隔,通過平板計數(shù)法一式兩份地計數(shù)等份(Iml)的攻擊的樣品和對照(或者它們適當(dāng)?shù)倪B續(xù)10倍稀釋液)。USP 29NF 24增補(bǔ)版2 (USP)要求，接種細(xì)菌微生物后，在7天時有從初次計算的計數(shù)(即接種的時間)至少I. O的對數(shù)下降，在14天時有從先前測量的值的至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天時沒有從先前測量的值的增加。參見表I。對于酵母和真菌，USP的要求是從接種時間到7、14和28天時沒有增加。EP的要求更為嚴(yán)格。EP第5版5. 6(5. 1.3)對于腸胃外和眼用制劑的要求有兩部分類目A和類目B。類目A(EP-A)要求，對于細(xì)菌，在接種后6小時有從初次計算的計數(shù)至少2. O的對數(shù)下降，在24小時有從先前測量的值至少3. O的對數(shù)下降以及在28天沒有恢復(fù)。類目B(EP-B)要求，對于細(xì)菌，在24小時有從初次計算的計數(shù)至少I. O的對數(shù)下降，在7天時有從先前測量的值至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天時有從先前測量的值不超過O. 5的對數(shù)增加(即沒有增加)。參見表I。對于酵母和真菌，類目A要求在7天時有至少
2.O的對數(shù)下降，以及在28天時沒有從先前測量的值的增加；以及類目B要求在14天時有至少I. O的對數(shù)下降，以及在28天時沒有從先前測量的值的增加。在計數(shù)時，對于細(xì)菌，使用含〈300CFU的平板，或者對于酵母或霉菌，使用含〈100CFU的平板。對于單次攻擊研究，測量了一式三份并且在二重平板上的所有存活微生物(每一時間點(diǎn)6個值)加上它們稀釋的樣品的算術(shù)平均計數(shù)，并標(biāo)準(zhǔn)化為CFU/ml。結(jié)果表示為平均log1(lCFU/ml下降(與時間為O時相比)。在這種情況下，將時間為O時的存活微生物計數(shù)評價為基線并與6小時、24小時、7天、14天和28天的孵育時間比較。除顯示出降低Prev (e)nar 13結(jié)合的抗原性的尼泊金類(尼泊金甲酯和尼泊金丙酯)外，測試的防腐劑沒有顯示對PreV(e)nar 13穩(wěn)定性的明顯影響。此外，苯酚、間甲酚、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯干擾改進(jìn)型Lowry蛋白測定(疫苗的蛋白濃度通過商購的改進(jìn)型Lowry蛋白測定來確定)。防腐劑效力測試(PET)結(jié)果顯示，所有測試的防腐劑滿足USP的要求，但不滿足EP標(biāo)準(zhǔn)(EP-A或EP-B)。參見表2。2-PE為已知在較高劑量是安全的唯一候選防腐劑。因此，用較高劑量的2-PE對防腐劑效力進(jìn)行了進(jìn)一步的測試。表2:單次微生物攻擊后，潛在的防腐劑在滿足USP和EP*疫苗安全性要求方面的·效力
權(quán)利要求
1.多價免疫原性組合物，其包含多種與載體蛋白綴合的來自肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 和 23F 的莢膜多糖，以及還包含2-苯氧乙醇(2-PE)。
2.權(quán)利要求I的多價免疫原性組合物，其中所述組合物包含七種或更多種來自肺炎鏈球菌血清型 1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 和 23F 的莢膜多糖。
3.權(quán)利要求1-2中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述組合物包含濃度為7mg/mL 至 15mg/mL 的 2-PE。
4.權(quán)利要求3的多價免疫原性組合物，其中所述組合物包含濃度為約10mg/mL的 2-PE。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述組合物包含不少于7mg/mL 的 2-PE。
6.權(quán)利要求1-4中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述組合物包含不少于IOmg/ mL 的 2-PE ο
7.權(quán)利要求1-4中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述組合物包含不少于15mg/ mL 的 2-PE ο
8.權(quán)利要求1-7中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述組合物還包含佐劑，以及其中所述佐劑是磷酸鋁。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物的抗原性在不少于I年、I. 5年、2年或2. 5年是穩(wěn)定的。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的多價免疫原性組合物，其中用一種或多種微生物接種后， 所述微生物的濃度隨著時間下降。
11.權(quán)利要求10的多價免疫原性組合物，其中用一種或多種細(xì)菌菌株接種后，所述組合物在24小時呈現(xiàn)從初始微生物計數(shù)的至少I. O的對數(shù)下降，在7天時呈現(xiàn)從先前測量的值的至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天時呈現(xiàn)從先前測量的值的不超過O. 5的對數(shù)增加。
12.權(quán)利要求10的多價免疫原性組合物，其中用一種或多種細(xì)菌菌株接種后，所述組合物在接種后6小時呈現(xiàn)從初始計算的計數(shù)至少2. O的對數(shù)下降，在24小時呈現(xiàn)從先前測量的值至少3. O的對數(shù)下降，以及在28天時沒有呈現(xiàn)恢復(fù)。
13.權(quán)利要求10-12中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述微生物菌株是選自銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、大腸桿菌(E. coli)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的一種或多種菌株。
14.權(quán)利要求10-13中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述組合物被接種多次。
15.權(quán)利要求13或14的多價免疫原性組合物，其中第二次接種發(fā)生在初始接種后6小時，第三次接種發(fā)生在初始接種后24小時，第三次接種發(fā)生在初始接種后7天，以及第四次接種發(fā)生在初始接種后14天。
16.權(quán)利要求1-15中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述組合物還包含緩沖劑、 冷凍保護(hù)劑、鹽、二價陽離子、非離子去垢劑和自由基氧化抑制劑的一種或多種。
17.肺炎球菌莢膜多糖的多價免疫原性組合物制劑，所述肺炎球菌莢膜多糖來自血清型I、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，分別綴合至CRM197，其中所述多價免疫原性組合物被配制在無菌液體中以包含約4. 4 μ g/mL的每種多糖,除了 6B為約8. 8 μ g/mL ；約58 μ g/mL的CRM197載體蛋白；約O. 25mg/mL的磷酸鋁形式的元素鋁；約O. 85%的氯化鈉； 約O. 02%的聚山梨醇酯80 ；pH為5. 8的約5mM琥珀酸鈉緩沖劑；以及約10mg/mL的2-苯氧乙醇。
18.包含權(quán)利要求1-17中任一項的多價免疫原性組合物的小瓶。
19.權(quán)利要求18的小瓶，其中所述小瓶包含超過一個劑量的所述免疫原性組合物。
20.預(yù)填充的疫苗遞送裝置，其包含權(quán)利要求1-19中任一項所述的多價免疫原性組合物。
21.如權(quán)利要求20所述的預(yù)填充的疫苗遞送裝置，其中所述裝置是注射器或包含注射器。
22.權(quán)利要求19的預(yù)填充的疫苗遞送裝置，其中所述裝置是雙室或多室注射器或小瓶或其組合，或者所述裝置包含雙室或多室注射器或小瓶或其組合。
23.權(quán)利要求20-22的預(yù)填充的疫苗，其中所述多價免疫原性組合物配制為用于肌內(nèi)或皮下注射。
24.用于制備權(quán)利要求1-17中任一項的多價免疫原性組合物的試劑盒，其中所述試劑盒包含(i)上述權(quán)利要求中任一項的組合物的冷凍形式中的所述多種莢膜多糖，以及(ii) 用于重建組分(i)的水性物質(zhì)以便提供水性組合物。
25.在小瓶中包含4個劑量疫苗的多劑量疫苗，每一劑量包含4-20mg/mL、優(yōu)選10mg/mL 的2-苯氧乙醇，其中劑量為O. 5mL的疫苗。
26.容器，其以每劑量O.l_2mL包含兩個劑量或更多的權(quán)利要求1_17中任一項的多價免疫原性組合物。
27.權(quán)利要求26的容器，其中所述劑量是O.5mL劑量。
28.權(quán)利要求26-27的容器，其包含2-10個劑量。
29.在疫苗組合物的一些或全部免疫原性和非免疫原性組分存在的情況下，測量包含一種或多種選擇的防腐劑的疫苗制劑功效的方法，其中測試包括至少以下兩步用選擇的微生物群接種測試組合物，以及將接種的微生物或微生物們隨著時間和在特定環(huán)境條件 (例如，溫度)下的對數(shù)下降與在缺乏測試防腐劑的對照組合物中的對數(shù)下降比較。
全文摘要
免疫原性組合物包含多種與載體蛋白綴合的來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的莢膜多糖，還包含至少一種防腐劑，優(yōu)選為2-苯氧乙醇(2-PE)。本發(fā)明含防腐劑的免疫原性組合物賦予對一種或多種微生物的抗性，并用于生產(chǎn)多劑量疫苗制劑，具有在選擇的免疫原性組合物的不同抗原決定簇的長期穩(wěn)定性方面的有利特性。還提供了用于測量疫苗制劑中一種或多種防腐劑功效的相關(guān)組合物和方法。
文檔編號A61P31/04GK102933229SQ201180027663
公開日2013年2月13日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者L·漢德科, A·拉希德貝基 申請人:惠氏有限責(zé)任公司