專利名稱：通過抑制沉默調(diào)節(jié)蛋白(sirt)的天然反義轉(zhuǎn)錄物而治療沉默調(diào)節(jié)蛋白(sirt)相關(guān)疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求2010年5月03日提交的美國臨時專利申請No. 61/330，427、2010年11月2日提交的美國臨時專利申請No. 61/409，136、2010年11月10日提交的美國臨時專利申請No. 61/412,066和2010年11月22日提交的美國臨時專利申請No. 61/415，891的優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明的實施方案包括調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)和相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA雜交對于核酸功能的許多方面是重要的，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄 和翻譯。雜交對于檢測特定核酸或改變其表達(dá)的多種技術(shù)也是關(guān)鍵的。反義核苷酸，例如通過與靶RNA雜交從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制來破壞基因表達(dá)。反義DNA具有額外的特性，即DNA-RNA雜交物作被核糖核酸酶H消化的底物，這是在大多數(shù)細(xì)胞類型中存在的活性。反義分子可被遞送到細(xì)胞中，如寡脫氧核苷酸(ODN)的情形，或反義分子可從內(nèi)源基因表達(dá)為RNA分子。FDA最近批準(zhǔn)了一種反義藥物VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，反映了反義藥物具有治療效用。概述在一個實施方案中，本發(fā)明提供通過利用靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物任何區(qū)域的反義寡核苷酸而導(dǎo)致相應(yīng)有義基因的上調(diào)來抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物作用的方法。本文還預(yù)期，天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可由siRNA、核酶和小分子實現(xiàn)，認(rèn)為這些在本發(fā)明的范圍中?！獋€實施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與包括SEQ ID NO: 9的核苷酸I至1028或SEQ ID NO: 10的核苷酸I至429、或SEQ ID NO: 11的核苷酸I至508或SEQ ID NO: 12的核苷酸I至593、SEQ ID NO: 13 的 I 至 373、SEQ ID NO: 14 的 I 至 1713、SEQ ID NO: 15 的 I 至 660、SEQ IDNO: 16 的 I 至 589、SEQ ID NO: 17 的 I 至 726、SEQ ID NO: 18 的 I 至 320、SEQ ID NO: 19 的
I至 616、SEQ ID NO: 20 的 I 至 492、SEQ ID NO: 21 的 I 至 428、SEQ ID NO: 22 的 I 至 4041或 SEQ ID NO: 23 的 I 至 705 或 SEQ ID NO: 141 的 I 至 2714 或 SEQ ID NO: 142 的 I 至 1757或SEQ ID NO: 143的I至3647中的5至30個連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一性，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在另一個實施方案中，寡核苷酸靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的天然反義序列，例如，SEQ ID N0:9至23、141至143所列的核苷酸及其任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。用于實施本發(fā)明的方法的反義寡核苷酸的實例如SEQID NO:24 至 127 所列。另一實施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。另一實施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在一個實施方案中，組合物包括一種或多種結(jié)合有義和/或反義沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義寡核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸包括一種或多種修飾或取代的核苷酸。在另一個實施方案中，寡核苷酸包括一種或多種修飾的鍵。在又一實施方案中，修飾的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、2’ -O-甲基、氟-或碳、亞甲基或其它鎖核酸(LNA)分子的修飾的堿基。優(yōu)選地，修飾的核苷酸是鎖核酸分子，包括a-L-LNA。在另一個實施方案中，將寡核苷酸皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用給患者。在另一個實施方案中，寡核苷酸以藥物組合物施用。治療方案包括向患者施用反義化合物至少一次；然而，可修改該治療以包括經(jīng)一段時間的多個劑量。該治療可與一種或多種其它類型的治療聯(lián)合。
在另一個實施方案中，將寡核苷酸封裝在脂質(zhì)體中或連接于載體分子(例如，膽固醇、TAT肽)。其它方面在以下描述。附圖簡述圖I和圖2是實驗的實時PCR結(jié)果，其中H印G2細(xì)胞用針對靶SIRT反義CV396200設(shè)計的寡核苷酸處理。該結(jié)果顯示用針對sirtas (sirtas_5,P=0. 01)設(shè)計的siRNA之一處理后48h，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加。在相同的樣品中，用sirtas_5處理后，sirtas RNA的水平顯著下降，但是用sirtas_6和sirtas_7 (它們也對SIRTl mRNA水平?jīng)]有影響)處理后，其水平并未變化(圖2)。sirtas_5、sirtas_6和sirtas_7分別對應(yīng)于 SEQ ID N0:47、48 和 49。圖3顯示跨SIRT反義的寡核苷酸通道。實時PCR結(jié)果顯示用針對sirtas的反義寡核苷酸中的三個(CUR-0292、CUR-0307和CUR-0308)處理后48h，HepG2細(xì)胞中SIRTlmRNA的水平顯著增加。CUR-0292至CUR-0309分別對應(yīng)于SEQ ID N0:24至41。圖4和5顯示!fepG2 (圖4)和Vero76 (圖5)細(xì)胞中的PS、LNA和2’0Me修飾的寡核苷酸的結(jié)果。實時PCR結(jié)果顯示用針對SIRTl反義設(shè)計的PS、LNA、2’ O Me和2’ O Me混合物反義寡核苷酸處理后48h，H印G2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加。用針對SIRTl反義的PS和LNA修飾的反義寡核苷酸處理后48h，Vero細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平也增加。標(biāo)為 CUR-0245、CUR-0736、CUR 0688、CUR_0740 和 CUR-0664 的條柱分別對應(yīng)于 SEQ ID NO:42至46。
圖6顯示猴脂肪或組織檢查(Monkey Fat Biopsies)的PCR結(jié)果。實時PCR結(jié)果顯示來自用⑶R-963 ( 一種針對SIRTl反義CV396200. I設(shè)計的寡核苷酸)給藥的猴的脂肪活組織檢查中SIRTl mRNA水平的增加。CUR-963對應(yīng)于SEQ ID N0:43。圖7顯示原代猴肝細(xì)胞的PCR結(jié)果。實時PCR結(jié)果顯示用抗SIRTl反義的寡核苷酸處理后，SIRTl mRNA水平的增加。標(biāo)為CUR-0245的條柱對應(yīng)于SEQ ID N0:42。圖8顯示針對SIRT反義CV396200設(shè)計的寡核苷酸的結(jié)果。實時PCR結(jié)果顯示用針對SIRTl反義CV396200設(shè)計的寡核苷酸之一處理后，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加。標(biāo)為CUR-1230至CUR-1233的條柱對應(yīng)于SEQ ID NO:50至53。圖9顯示針對SIRT反義CV428275設(shè)計的寡核苷酸的結(jié)果。實時PCR結(jié)果顯示用針對SIRTl反義CV428275設(shè)計的寡核苷酸中的兩個處理后，!fepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加。標(biāo)為 CUR-1302、CUR-1304、CUR-1303 和 CUR-1305 的條柱對應(yīng)于 SEQ ID NO: 54至57。

圖10顯示實時PCR結(jié)果。結(jié)果顯示用針對SIRT反義BE717453設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48小時，!fepG2細(xì)胞中的SIRTl mRNA水平顯著增加。標(biāo)為CUR-1264至CUR-1266的條柱分別對應(yīng)于SEQ IDN0:58至60。圖11顯示實時PCR結(jié)果。結(jié)果顯示用針對SIRT反義AV718812設(shè)計的寡核苷酸中的三個處理后48小時，HepG2細(xì)胞中的SIRTlmRNA水平顯著增加。標(biāo)為⑶R-1294、CUR-1297、CUR-1295、CUR-1296 和 CUR-1298 的條柱分別對應(yīng)于 SEQ ID NO:61 至 65。圖12是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理ifepG2細(xì)胞后與對照相比SIRTl mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl反義AW169958設(shè)計的寡核苷酸中的兩個處理后48h，!fepG2細(xì)胞中SIRTlmRNA的水平顯著增加。標(biāo)為CUR-1381、CUR-1382、CUR-1383和CUR-1384的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID NO:66至69處理的樣品。圖13是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理3T3細(xì)胞后與對照相比SIRTl mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl小鼠反義AK044604設(shè)計的寡核苷酸中的三個處理后48h，3T3細(xì)胞中SIRTlmRNA的水平顯著增加。標(biāo)為CUR-0949、CUR-0842、CUR-1098和CUR-1099的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID N0:76、70、80 和 81 處理的樣品。圖14是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理3T3細(xì)胞后與對照相比SIRTl mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl小鼠反義AK044604設(shè)計的寡核苷酸中的五個處理后48h，3T3細(xì)胞中SIRTlmRNA的水平顯著增加。標(biāo)為CUR-0948至CUR-0951、CUR-0846和CUR-0844的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID N0:75至78、74和72處理的樣品。圖15是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理3T3細(xì)胞后與對照相比SIRTl mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl小鼠反義AK044604設(shè)計的寡核苷酸中的兩個處理后48h，!fepG2細(xì)胞中SIRTlmRNA的水平顯著增加。標(biāo)為CUR-0842、CUR-0844和CUR-0845的條柱分別對應(yīng)于用SEQ IDNO:70、72和73處理的樣品。圖16是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理3T3細(xì)胞后與對照相比SIRTl mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl小鼠反義AK044604設(shè)計的寡核苷酸中的兩個處理后48h，!fepG2細(xì)胞中SIRTlmRNA的水平顯著增加。標(biāo)為CUR-0843和CUR-0846的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID NO:71和74處理的樣品。圖17是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后與對照相比沉默調(diào)節(jié)蛋白3mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。RT PCR結(jié)果顯示，用針對sirt3反義Hs. 683117設(shè)計的寡核苷酸處理后48h，HepG2細(xì)胞中的sirt3水平增加。標(biāo)為 CUR-0551、CUR-1552、CUR-1555、CUR-1556、CUR-1553、CUR-1554、CUR-1545、CUR-1546、CUR-1548、CUR-1549、CUR-1550 和 CUR-1547 的條柱分別對應(yīng)于用 SEQ ID NO:82至93處理的樣品。圖18是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后與對照相比沉默調(diào)節(jié)蛋白3mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。RT PCR結(jié)果顯示，用針對sirt3反義BQ024738和BE164357設(shè)計的寡核苷酸處理后48h，HepG2細(xì)胞中的sirt3水平增加。標(biāo)為CUR-1869、CUR-1871和CUR-1873至CUR-1878的條柱分別對應(yīng) 于用 SEQ ID N0:94、95、96 和 98、99、100、101 和 102 處理的樣品。圖19是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯和siRNA寡核苷酸處理Hek293細(xì)胞后與對照相比沉默調(diào)節(jié)蛋白3mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為CUR-1883和CUR-1884的條柱對應(yīng)于用SEQ ID NO: 126和127處理的樣品。圖20是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯和siRNA寡核苷酸處理Vero76細(xì)胞后與對照相比SIRT3mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為CUR-1883 CUR-1884 CUR-1873、CUR-1875、CUR-1878 和 CUR-1546 的條柱分別對應(yīng)于用 SEQID N0:126、127、96、98、100 和 92 處理的樣品。圖21是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理HUVEC細(xì)胞后與對照相比SIRT4 mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-1832和CUR-1835的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID NO: 105和107處理的樣品。圖22是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后與對照相比SIRT4 mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-1833和CUR-1835的條柱對應(yīng)于用SEQ ID NO: 104至107處理的樣品。圖23是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后與對照相比SIRT5 mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-1828、CUR-1829、CUR-1831 和 CUR-1830 的條柱分別對應(yīng)于用 SEQ ID NO: 108、109、111 和 110 處
理的樣品。圖24是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理ifepG2細(xì)胞后與對照相比SIRT6 mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT6反義序列(登錄號NM_133475)設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48h，HepG2細(xì)胞中 SIRT6 mRNA 的水平顯著增加。標(biāo)為 CUR-0873、CUR-0869 至 CUR-0871、CUR-0874 和CUR-0872的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID NO: 116、112、113、114、117和115處理的樣品。圖25是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理ifepG2細(xì)胞后與對照相比SIRT6 mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT6反義bf772662設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48h，H印G2細(xì)胞中SIRT6 mRNA的水平顯著增加。標(biāo)為CUR-0878、CUR-0876、CUR-0877和CUR-0875的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID N0:121、119、120 和 118 處理的樣品。圖26是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理DBS-FCL-I細(xì)胞后與對照相比SIRT6mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT6反義bf772662設(shè)計的寡核苷酸中的兩個和針對登錄號NM_133475的序列設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48h，DBS-FCL-I細(xì)胞中SIRT6 mRNA的水平顯著增加。標(biāo)為CUR-0876、CUR-0878、CUR-0875 和 CUR-0874 的條柱分別對應(yīng)于用 SEQ ID NO: 119、121、118和117處理的樣品。圖27是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡 核苷酸處理Vero76細(xì)胞后與對照相比SIRT7 mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-1824和CUR-1825的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID NO: 122和123處理的樣品。圖28是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理SK-N-AS細(xì)胞后與對照相比SIRT7mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-1824和CUR-1825的條柱分別對應(yīng)于用SEQ ID NO: 124和125處理的樣品。圖29是實時PCR結(jié)果的圖，顯示利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后與對照相比SIRT7 mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)為⑶R-1824和CUR-1825的條柱對應(yīng)于用SEQ ID NO: 122和123處理的樣品。序列表描述-SEQ ID NO: I:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白(沉默交配型信息調(diào)控2同系物)I (釀酒酵母)(SIRTl)，mRNA (NCBI 登錄號ΝΜ_012238· 4)SEQ ID NO: 133:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白I (SIRTl)，轉(zhuǎn)錄變體2，mRNA (NCBI登錄號ΝΜ_001142498. I)SEQ ID N0:2:小家鼠沉默調(diào)節(jié)蛋白I (沉默交配型信息調(diào)控2同系物)I (釀酒酵母)(SIRTl) mRNA (NCBI 登錄號ΝΜ_001159589)SEQ ID NO:3:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白2(SIRT2)，轉(zhuǎn)錄變體1，mRNA(NCBI登錄號ΝΜ_012237· 3).SEQ ID NO: 134:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白2 (SIRT2)，轉(zhuǎn)錄變體2，mRNA(NCBI登錄號NM_030593. 2)SEQ ID NO: 135:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白2 (SIRT2)，轉(zhuǎn)錄變體3，mRNA (NCBI登錄號ΝΜ_001193286. I)SEQ ID NO: 136:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白2 (SIRT2)，轉(zhuǎn)錄變體4，非編碼RNA(NCBI登錄號NR_034146. I)SEQ ID NO: 4:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白(沉默交配型信息調(diào)控2同系物)3 (釀酒酵母)(SIRT3)，轉(zhuǎn)錄變體 1，mRNA (NCBI 登錄號ΝΜ_012239· 5).SEQ ID NO: 137:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白3 (SIRT3)，轉(zhuǎn)錄變體2，mRNA (NCBI登錄號ΝΜ_001017524· 2)SEQ ID NO:5:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白 4(SIRT4)，mRNA(NCBI 登錄號NM_012240).SEQ ID NO: 138:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白5 (SIRT5)，轉(zhuǎn)錄變體2，mRNA (NCBI登錄號NM_031244. 2)SEQ ID NO: 139:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白5 (SIRT5)，轉(zhuǎn)錄變體3，mRNA (NCBI登錄號ΝΜ_001193267. I)SEQ ID N0:6:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白5 (SIRT5)，轉(zhuǎn)錄變體1，mRNA(NCBI登錄號NM_012241).SEQ ID NO:7:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白6(SIRT6)，轉(zhuǎn)錄變體1，mRNA(NCBI登錄號ΝΜ_016539).SEQ ID NO: 140:智人沉默調(diào)節(jié)蛋白6 (SIRT6)，轉(zhuǎn)錄變體2，mRNA (NCBI登錄號ΝΜ_001193285. I)SEQ ID NO: 8 :智人沉默調(diào)節(jié)蛋白 7(SIRT7)，mRNA (NCBI 登錄號ΝΜ_016538).
天然反義序列-SEQ ID NO:9 :擴(kuò)展型天然反義序列(CV396200-擴(kuò)展型)；SEQ IDNO: 10:天然反義序列(CV428275) ；SEQ ID NO: 11 :天然反義序列(BE717453)SEQ ID NO: 12:天然反義序列(AV718812) ；SEQ ID NO: 13 :天然 SIRTl 反義序列(AW169958) ；SEQ ID NO: 14 :小鼠天然 SIRTl 小鼠反義序列(AK044604) ；SEQ ID NO: 15:天然 SIRT3 反義序列(Hs. 683117) ；SEQ ID NO: 16 :天然 SIRT3 反義序列(DA645474)SEQ ID NO: 17 :天然 SIRT3 反義序列(BQ024738) ;SEQ ID NO: 18 :天然 SIRT3 反義序列(BE164357);天然SIRT3反義序列(RIC8A) SEQ ID NO: 141、天然SIRT3反義序列(PMSD13)SEQ ID NO: 142、天然 SIRT3 反義序列(DA246502) SEQ ID NO: 143，SEQ ID NO: 19 天然SIRT4反義序列(AA156947) ；SEQ ID NO:20 :天然SIRT5反義序列(Hs. 671550) ；SEQ IDN0:21 :天然 SIRT6 反義序列(BF772662) ；SEQ ID NO:22 :天然 SIRT6 反義序列(ANKRD24)；SEQ ID NO:23 :天然 SIRT7 反義序列(Hs. 671550)反義寡核苷酸-SEQ ID NO: 24至127. *指示硫代磷酸酯鍵，+指示LNA且m指示2’ O Me，r 指示 RNASEQ ID NO: 128 至 130-SEQ ID NO: 128 對應(yīng)于 SIRTl 天然反義 CV396200 的外顯子4，SEQ ID NO: 129、130和131分別對應(yīng)于正向引物序列、反向引物序列和報告序列。SEQID NO: 132對應(yīng)于⑶R962，*指示硫代磷酸酯鍵且+指示LNA。SEQ ID NO: 144和145分別對應(yīng)于反義寡核苷酸SEQ ID NO: 126和127的反向互補序列。詳述下面參考用于示例的實例應(yīng)用來描述本發(fā)明的多個方面。應(yīng)理解的是，列出許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)聯(lián)和方法以提供對本發(fā)明的完全理解。然而，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識到，可沒有一種或多種具體細(xì)節(jié)地實踐本發(fā)明或以其它方法實踐本發(fā)明。本發(fā)明不限于行為或事件的順序，因為一些行為可以不同順序進(jìn)行和/或與其它行為或事件同時進(jìn)行。而且，并非所有列舉的行為或事件都是實施根據(jù)本發(fā)明的方法所需的。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物預(yù)期對應(yīng)來自本文公開的組合物和方法可適用的任何物種的同系物。因此，這些術(shù)語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)理解的是，當(dāng)公開來自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時，這一公開僅旨在示例，不應(yīng)解釋為限制，除非在其存在的上下文清楚地指明。因此，例如，對于本文公開的基因，其在一些實施方案中涉及哺乳動物核酸和氨基酸序列，預(yù)期涵蓋來自其它動物的同源和/或直系同源基因和基因產(chǎn)物，所述其它動物包括但不限于其它哺乳動物、魚、兩棲類、爬行動物和鳥類。在實施方案中，基因或核酸序列是人的。除非另有指出，否則本文命名的登錄號識別美國國立衛(wèi)生研究院數(shù)據(jù)庫，GenBank (參見 Nucleic Acids Research, 2008 年 I 月 36 日 Database issue :D25_30)中公眾可得的序列。由登錄號提及的所有序列通過弓I用并入本文。定義本文所用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方案的目的，并不旨在限制本發(fā)明。除非上下文另外清楚地指明，否則本文所用的單數(shù)形式〃一個/ 一種(a)〃、〃一個/ 一種(an)〃和〃該(the)"預(yù)期包括復(fù)數(shù)形式。而且，就詳述和/或權(quán)利要求書中使用術(shù)語〃包括(including) 〃、〃 包括(includes) 〃、〃 具有(having) 〃、〃 具有(has)"、〃帶有(with) 〃或其變化形式來說，這些術(shù)語預(yù)期以類似于術(shù)語〃包含(comprising)"的方式被包括。術(shù)語〃約〃或〃大約〃是指在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的特定數(shù)值的可接受誤 差范圍內(nèi)，其將部分地取決于如何測量或確定該數(shù)值，即，測量系統(tǒng)的限度。例如，按照本領(lǐng)域中的實踐，〃約〃可表示在I個或多于I個標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)?？蛇x地，〃約〃可表示給定數(shù)值的達(dá)20%、優(yōu)選地達(dá)10%、更優(yōu)選地達(dá)5%、仍更優(yōu)選地達(dá)1%的范圍?？蛇x地，尤其是有關(guān)生物系統(tǒng)或方法，術(shù)語可表示在數(shù)值的數(shù)量級內(nèi)，優(yōu)選地在5倍內(nèi)，更優(yōu)選地在2倍內(nèi)。當(dāng)在本申請和權(quán)利要求書中描述特定數(shù)值時，除非另外指明，否則應(yīng)假設(shè)術(shù)語"約"表示在特定數(shù)值可接受的誤差范圍內(nèi)。本文所用的術(shù)語"mRNA"是指靶基因的目前已知的mRNA轉(zhuǎn)錄物和可能說明的任何進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄物?！ǚ戳x寡核苷酸〃或〃反義化合物〃是指結(jié)合另一 RNA或DNA (靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，其借助于RNA-RNA相互作用結(jié)合另一 RNA靶并且改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意為包括從治療、診斷或其它觀點來說有用的任何外來RNA或DNA分子。這種分子包括，例如，反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療性編輯RNA和激動劑與拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可選剪接體、引物、探針以及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的范疇中，術(shù)語〃寡核苷酸〃是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語"寡核苷酸"還包括天然和/或修飾的單體或鍵合的線性或環(huán)狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代形式和其α -異頭形式、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯和類似物。寡核苷酸能夠經(jīng)由規(guī)則方式的單體與單體間的相互作用，例如Watson-Crick型堿基配對、Ho0gsteen或逆Ho(3gsteeii型堿基配對或類似物特異性結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是〃嵌合的"，即，包括不同區(qū)域。在本發(fā)明的范疇中，"嵌合〃化合物是寡核苷酸，其包含兩個或更多個化學(xué)區(qū)域，例如，DNA區(qū)域、RNA區(qū)域、PNA區(qū)域等等。每個化學(xué)區(qū)域由至少一個單體單位構(gòu)成，在寡核苷酸化合物的情形中所述單體單位即為核苷酸。這些寡核苷酸通常包括至少一個區(qū)域，其中寡核苷酸經(jīng)修飾以表現(xiàn)一種或多種期望特性。寡核苷酸的期望特性包括但不限于，例如，對核酸酶降解增加的耐受性、增加的細(xì)胞攝取和/或?qū)Π泻怂嵩黾拥慕Y(jié)合親和力。因此，寡核苷酸的不同區(qū)域可具有不同特性。如上所述，本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種寡核苷酸的混合結(jié)構(gòu)、修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類似物。寡核苷酸可由可被〃成行〃地連接(即當(dāng)單體被連續(xù)地連接時，如在天然DNA中)的區(qū)域或經(jīng)由間隔物連接的區(qū)域構(gòu)成。預(yù)期間隔物構(gòu)成區(qū)域之間的共價"橋"，在情形中具有不超過約100個碳原子的長度。間隔物可攜帶不同功能性，例如，具有正電荷或負(fù)電荷，攜帶特殊的核酸結(jié)合特性(嵌入劑、槽溝結(jié)合物、毒素、熒光團(tuán)等等)，為親脂性的，誘導(dǎo)特殊的二級結(jié)構(gòu)，如例如，誘導(dǎo)α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的〃沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)"包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等等。 本文所用的詞語沉默調(diào)節(jié)蛋白1、SIRT1、沉默調(diào)節(jié)蛋白、沉默交配型信息調(diào)控2同系物l、hSIR2、hSIRTl、NAD-依賴性脫乙?；赋聊{(diào)節(jié)蛋白I、SIR2L1、SIR2樣蛋白I被認(rèn)為在文獻(xiàn)中是相同的，且在本申請中可交換地使用。本文所用的詞語沉默調(diào)節(jié)蛋白2、沉默調(diào)節(jié)蛋白-2、SIRT2、SIR2L和SIR2L2被認(rèn)為在文獻(xiàn)中是相同的，且在本申請中可交換地使用。本文所用的詞語’沉默調(diào)節(jié)蛋白3’、沉默調(diào)節(jié)蛋白3、沉默調(diào)節(jié)蛋白-3、SIRT3、SIRT-3、hSIRT3、NAD-依賴性脫乙酰化酶沉默調(diào)節(jié)蛋白_3、線粒體、SIR2L3、SIR2樣蛋白3被認(rèn)為在文獻(xiàn)中是相同的，且在本申請中可交換地使用。本文所用的詞語沉默調(diào)節(jié)蛋白4、SIRT4、MGC130046、MGC130047、MGC57437、NAD-依賴性ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶沉默調(diào)節(jié)蛋白-4、SIR2L4、SIR2-樣蛋白4被認(rèn)為在文獻(xiàn)中是相同的，且在本申請中可交換地使用。本文所用的詞語沉默調(diào)節(jié)蛋白5、SIRT5、FLJ36950、NAD-依賴性脫乙酰化酶沉默調(diào)節(jié)蛋白_5、SIR2L5、SIR2-樣蛋白5被認(rèn)為在文獻(xiàn)中是相同的，且在本申請中可交換地使用。本文所用的詞語‘沉默調(diào)節(jié)蛋白6’、沉默調(diào)節(jié)蛋白6、沉默調(diào)節(jié)蛋白-6、SIRT6、SIRT-6、NAD-依賴性脫乙?；赋聊{(diào)節(jié)蛋白-6、SIR2L6、SIR2-樣蛋白6被認(rèn)為在文獻(xiàn)中是相同的，且在本申請中可交換地使用。本文所用的詞語沉默調(diào)節(jié)蛋白7、SIRT7、MGC126840、MGC126842、NAD-依賴性脫乙?；赋聊{(diào)節(jié)蛋白-7、SIR2L7、SIR2-樣蛋白7被認(rèn)為在文獻(xiàn)中是相同的，且在本申請中可交換地使用。本文所用的術(shù)語〃對…有特異性的寡核苷酸〃或〃靶向…的寡核苷酸〃是指具有(i)能夠與靶基因的一部分形成穩(wěn)定復(fù)合體，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體的序列的寡核苷酸。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計算和/或體外測定來確定。用于確定雜交復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測定在以下實施例中描述。
本文所用的術(shù)語〃靶核酸〃涵蓋DNA、從這種DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前體mRNA和mRNA)、還有從這種RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。特異性地與靶核酸雜交的化合物對靶核酸功能的這一調(diào)節(jié)通常稱為〃反義〃。待干擾的DNA功能包括，例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重要功能，例如，RNA向蛋白翻譯位置的移位，從RNA翻譯為蛋白，剪接RNA以產(chǎn)生一種或多種mRNA種類以及可能由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總效果是調(diào)節(jié)編碼的產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)。RNA干擾"RNAi "由對其〃靶〃核酸序列具有序列特異性的同源性的雙鏈RNA(dsRNA)分子介導(dǎo)。在本發(fā)明的某些實施方案中，介導(dǎo)物是5-25個核苷酸的〃小干擾"RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA來源于稱為Dicer的RNA酶對dsRNA的加工。siRNA雙鏈體產(chǎn)物被募集到稱為RISC (RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。不希望受任何特定理論束縛，認(rèn)為隨后RISC被引導(dǎo)至靶核酸(適當(dāng)?shù)貫閙RNA)，在那里siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用來以催化方式介導(dǎo)裂解。根據(jù)本發(fā)明可使用的小干擾RNA可根據(jù)本領(lǐng)域公知并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方案合成和使用。用于本發(fā)明方法的小干擾RNA適當(dāng)?shù)匕sI至約50個核苷酸(nt)。在非限制性實施方案的實例中，siRNA可包括約5至約40nt、約5至約30nt、約10至約30nt、約15至約25nt或約20-25個核苷酸。 通過利用自動比對核酸序列并指明同一性或同源性的區(qū)域的計算機(jī)程序來便于選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账帷＿@種程序用來比較獲得的核酸序列，例如通過搜尋數(shù)據(jù)庫例如GenBank或通過對PCR產(chǎn)物測序。比較來自一系列物種的核酸序列允許選擇在物種之間展示適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄?。在未被測序的基因的情形中，進(jìn)行DNA印跡(Southernblots)以允許確定靶物種與其它物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域所熟知的，通過以不同的嚴(yán)格性程度進(jìn)行DNA印跡，可能獲得近似的同一性測量。這些方案允許選擇展現(xiàn)與待控制的受治療者中的靶核酸序列的高程度互補性和與其它物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補性的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在選擇用于本發(fā)明的基因的適當(dāng)區(qū)域方面存在相當(dāng)大的自由。〃酶促RNA"是指具有酶促活性的RNA分子。酶促核酸(核酶)通過首先結(jié)合靶RNA來作用。這種結(jié)合經(jīng)由被保持在鄰近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分處的酶促核酸的靶結(jié)合部分來進(jìn)行。因此，酶促核酸首先識別靶RNA然后經(jīng)由堿基配對結(jié)合靶RNA，結(jié)合到正確位置時，酶促地作用以切割靶RNA?！ㄕT餌RNA〃是指模擬配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。因此，誘餌RNA與天然結(jié)合靶競爭結(jié)合特定配體。例如，已經(jīng)顯示HIV反式激活響應(yīng)(TAR)RNA的過表達(dá)可作為〃誘餌〃起作用并有效地結(jié)合HIV tat蛋白，從而阻止其結(jié)合HIV RNA中編碼的TAR序列。這表示一個特定的實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這僅是一個實例，利用本領(lǐng)域通常已知的技術(shù)可容易地產(chǎn)生其它實施方案。本文所用的術(shù)語〃單體〃通常是指由磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小從數(shù)個單體單位例如約3-4個至約數(shù)百個單體單位范圍的寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵合的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯和類似物，如以下更充分地描述。術(shù)語“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，此前被認(rèn)為是"非天然存在的"各種核苷酸后來已在自然界中發(fā)現(xiàn)。因此，"核苷酸"不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其它類型的核苷酸的示例性實例是含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶、郵，郵-橋亞乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷的分子以及美國專利No. 5，432，272中描述的〃非天然存在的〃核苷酸。術(shù)語〃核苷酸〃預(yù)期涵蓋這些實例的每一種和所有以及其類似物和互變異構(gòu)體。尤其關(guān)注的核苷酸是包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，它們被認(rèn)為是與在人的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2’ -脫氧糖和2’ -羥基糖，例如在 Kornberg 和 Baker, DNA Replication,第 2版· (Freeman, San Francisco, 1992)中描述的，以及它們的類似物。提及核苷酸的"類似物"包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成的核苷酸。這種類似物包括經(jīng)設(shè)計以增強結(jié)合特性，例如，雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性或類似特性的合成的核苷酸。本文所用的〃雜交〃是指寡聚化合物的大致互補鏈的配對。配對的一種機(jī)制包括寡聚化合物的鏈的互補核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可以是 Watson-Crick、Ho6gsteen或逆Ho0gsteeii氫鍵合。例如,腺嘌呤和胸腺嘧啶是經(jīng)由氫鍵形成而配對的互補核苷酸。雜交可在不同情況下發(fā)生。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)時，該化合物是"可特異性雜交的"，且在期望特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理條件下和在體外測定的情形中進(jìn)行測定的條件下)存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。本文所用的短語"嚴(yán)格雜交條件"或"嚴(yán)格條件"是指本發(fā)明化合物將與其靶序列雜交，但與最小數(shù)目的其它序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同情況中將是不同的，并且在本發(fā)明范疇中，寡聚化合物與靶序列雜交的"嚴(yán)格條件"由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及研究它們的測定決定。通常，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(〈O. 15M)的帶有無機(jī)陽離子例如Na++或K++的鹽(即，低離子強度)、高于20°C _25°C低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體的Tm的溫度、和存在變性劑例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亞砜或去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，對于每種1%甲酰胺，雜交率降低I. 1%。高嚴(yán)格雜交條件的實例是在60°C下O. I X氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC) /0. l%(w/v) SDS進(jìn)行30分鐘。本文所用的〃互補〃是指一條或兩條寡聚鏈上的兩個核苷酸之間準(zhǔn)確配對的能力。例如，如果在反義化合物某一位置的核堿基能夠與在靶核酸某一位置的核堿基氫鍵結(jié)合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認(rèn)為寡核苷酸與靶核酸之間的氫鍵結(jié)合位置是互補位置。當(dāng)每個分子的足夠數(shù)目的互補位置由可彼此成氫鍵的核苷酸占據(jù)時，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子是彼此互補的。因此，〃可特異性雜交〃和〃互補"是用來表示經(jīng)足夠數(shù)目的核苷酸足夠程度的準(zhǔn)確配對或互補性，從而在寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定和特異性結(jié)合的術(shù)語。本領(lǐng)域應(yīng)理解的是，寡聚化合物的序列不必與待可特異性雜交的其靶核酸的序列100%互補。而且，寡核苷酸可經(jīng)一個或多個區(qū)段雜交，從而其間的或相鄰區(qū)段不牽涉在雜交事件中(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包括與其所靶向的靶核酸序列中靶區(qū)域具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%序列互補性。例如,其中反義化合物的20個核苷酸中的18個與靶區(qū)域互補從而將特異性雜交的反義化合物將表示90%互補性。在這一實例中，其余非互補核苷酸可成串或散布于互補核苷酸，不必彼此連續(xù)或與互補核苷酸連續(xù)。因此，具有側(cè)翼為與靶核酸具有完全互補性的兩個區(qū)域的4 (四)個非互補核苷酸的長度為18個核苷酸的反義化合物將與靶核酸具有77. 8%總互補性，因此屬于本發(fā)明的范圍中。反義化合物與靶核酸的區(qū)域的互補性百分比可常規(guī)地利用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序來確定。同源性、序列同一性或互補性的百分比可通過(例如)Gap程序確定。本文所用的術(shù)語"熱熔點(Tm)"是指在指定的離子強度、pH和核酸濃度下，與靶序列互補的寡核苷酸的50%平衡地與靶序列雜交的溫度。通常，嚴(yán)格條件將是其中鹽濃度為至少約O. 01至I. OM Na離子濃度(或其它鹽)、pH 7. O至8. 3，且對于短寡核苷酸(例如，10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C的條件。嚴(yán)格條件還可通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實現(xiàn)。本文所用的〃調(diào)節(jié)〃是指基因表達(dá)的增加(刺激)或減少(抑制)。
術(shù)語〃變體〃當(dāng)在多核苷酸序列的上下文中使用時，可涵蓋與野生型基因相關(guān)的多核苷酸序列。這一定義還可包括，例如，〃等位〃、〃剪接〃、〃物種〃或〃多態(tài)〃變體。剪接變體可與參考分子具有顯著的同一性，但由于在mRNA加工期間外顯子的可選剪接通常將具有更大數(shù)目或更小數(shù)目的多核苷酸。相應(yīng)的多肽可具有另外的功能結(jié)構(gòu)域或缺少結(jié)構(gòu)域。物種變體是在物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中特別有用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可來源于核酸序列中至少一種突變，并可產(chǎn)生改變的mRNA或產(chǎn)生結(jié)構(gòu)或功能可能改變或可能不改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可具有O種、一種或多種等位基因形式。產(chǎn)生變體的常見突變改變通常歸因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。在給定序列中，這些類型改變的每一種可單獨發(fā)生，或組合其它類型改變發(fā)生一次或多次。所得的多肽通常將具有相對于彼此顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體還可涵蓋"單核苷酸多態(tài)性"(SNP)或其中多核苷酸序列差異為一個堿基的單堿基突變。SNP的存在可指示，例如，具有疾病狀態(tài)的傾向的某一群體，所述傾向相比于耐受性為易感性。衍生的多核苷酸包括經(jīng)受化學(xué)修飾(例如以烷基、?；虬被鏆?的核酸。衍生物例如，衍生物寡核苷酸，可包括非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵合。其中示例的有硫代磷酸酯和本領(lǐng)域已知的其它含硫物質(zhì)。衍生的核酸還可包含標(biāo)記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性粒子和類似物?！ㄑ苌铩ǘ嚯幕螂氖抢缤ㄟ^糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、?；?、化學(xué)偶合或適度福爾馬林處理修飾的多肽或肽。還可修飾衍生物以直接或間接包含可檢測的標(biāo)記，包括但不限于，放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。本文所用的術(shù)語〃動物〃或〃患者〃意為包括，例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、貂、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、犬、貓、大鼠、小鼠、鳥類、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蛛形綱動物?！ú溉閯游铩êw通常處于醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動物(例如，人和馴養(yǎng)的動物)。實例包括貓科動物、犬科動物、馬科動物、牛科動物和人，以及僅僅人?！ㄖ委?Treating) 〃或〃治療(treatment) 〃涵蓋治療哺乳動物的疾病狀態(tài),并包括(a)防止疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當(dāng)所述哺乳動物傾向于疾病狀態(tài)但還未被診斷為患有其的時候；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如阻止其發(fā)展；和/或(C)緩解疾病狀態(tài)，例如導(dǎo)致疾病狀態(tài)消退，直到達(dá)到期望端點。治療還包括疾病癥狀的改善(例如，減輕疼痛或不適)，其中所述改善可或不可直接影響疾病(例如起因、傳染、表達(dá)等等)。本文所用的"癌癥"是指在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥或贅生物或惡性腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥本身表現(xiàn)為〃腫瘤〃或包括癌癥惡性細(xì)胞的組織。腫瘤的實例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、腎母細(xì)胞瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤?？捎酶鶕?jù)本發(fā)明公開的組合物治療的其它癌癥包括但不限于，例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細(xì)胞肺腫瘤、原發(fā)性腦瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰島腫瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、惡變前皮膚損傷、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血癥、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺癌?！ㄉ窠?jīng)病學(xué)疾病或病癥〃是指神經(jīng)系統(tǒng)和/或視覺系統(tǒng)的任何疾病或病癥?！ㄉ窠?jīng)病學(xué)疾病或病癥"包括牽涉中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦、腦干和小腦)、外周神經(jīng)系統(tǒng)(包括顱神經(jīng))和自主神經(jīng)系統(tǒng)(其部分位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)兩者中)的疾病或病癥。神經(jīng)病學(xué)病癥的實例包括但不限于，頭痛、麻痹和昏迷、癡呆、癲癇、睡眠障礙、外傷、感染、贅生物、神經(jīng)眼科學(xué)、運動障礙、脫髓鞘疾病、脊髓病癥以及外周神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉接頭的病癥。成癮和精神疾病，包括但不限于雙相性精神障礙和精神分裂癥，也包括在神經(jīng)病學(xué)病癥的定義中。以下是可利用根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法治療的多種神經(jīng)病學(xué)病癥、癥·狀、跡象和綜合征的列表獲得性癲癇樣失語癥；急性播散性腦脊髓炎；腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥；年齡相關(guān)的黃斑變性；胼胝體發(fā)育不全；失認(rèn)癥；艾卡迪綜合征；亞力山大??；阿爾佩斯??；交替性偏癱；血管性癡呆；肌萎縮性側(cè)索硬化；無腦；Angelman綜合征；血管瘤?。蝗毖醢Y；失語癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；阿-基氏腦畸形；動靜脈畸形；阿斯佩各綜合征；共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張；注意力缺乏過動癥；孤獨癥；自主神經(jīng)失調(diào)；背痛；巴藤?。话兹?；貝耳麻痹；良性自發(fā)性瞼痙攣；良性局灶性肌萎縮；良性顱內(nèi)高壓；賓斯旺格氏?。徊€疫攣；Bloch Sulzberger綜合征；臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)；脊髓腫瘤；布朗-塞卡爾綜合征；卡納萬病；腕管綜合癥；灼痛；中樞性疼痛綜合癥；腦橋中部髓鞘溶解；頭部障礙；腦動脈瘤；腦動脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性麻痹；夏_馬-圖三氏?。换熞鸬纳窠?jīng)病和神經(jīng)性疼痛；基氏腦畸形；舞蹈癥；慢性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)?。宦酝?；慢性局部疼痛綜合征；科-勒二氏綜合征；昏迷，包括持續(xù)性植物人狀態(tài)；先天性面癱；皮質(zhì)基底節(jié)變性；顱動脈炎；顱縫早閉；克雅氏?。环e累性損傷錯亂；柯興綜合征；巨細(xì)胞包涵體??；巨細(xì)胞病毒感染；眼舞蹈-足舞蹈綜合征；丹-沃二氏綜合征；DaWSon??；德摩西埃氏綜合征；下臂叢麻痹；癡呆；皮肌炎；糖尿病性神經(jīng)??；彌漫性硬化癥；家族性自主神經(jīng)異常；書寫困難；閱讀困難；張力障礙；早期幼兒癲癇性腦?。豢盏熬C合征；腦炎；腦膨出；腦三叉神經(jīng)血管瘤??；癲癇；歐勃氏麻痹；特發(fā)性震顫；法布里氏?。环柺暇C合征；昏厥；家族性痙攣麻痹癥；熱性癲癇發(fā)作；菲希爾綜合征；弗里德賴希氏共濟(jì)失調(diào)；額顳癡呆和其它"tau病變〃；高歇??；格斯特曼氏綜合征；巨細(xì)胞性動脈炎；巨細(xì)胞性包涵體??；球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；格_巴二氏綜合征；HTLV-1相關(guān)的骨髓?。还?斯二氏?。活^部損傷；頭痛；半面痙攣；遺傳性痙攣性截癱；多神經(jīng)炎型遺傳性共濟(jì)失調(diào)；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；Hirayama綜合征；HIV相關(guān)的癡呆和神經(jīng)病(也是AIDS的神經(jīng)病學(xué)表現(xiàn))；前腦無裂畸形；亨延頓氏舞蹈病和其它多谷氨酰胺重復(fù)序列病；積水性無腦畸形；腦積水；皮質(zhì)醇過多癥；低氧；免疫介導(dǎo)的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調(diào)癥；嬰兒植烷酸貯積病；嬰兒雷夫 敘姆病；嬰兒痙攣；炎性肌??；顱內(nèi)囊腫；顱內(nèi)高壓Joubert綜合征；卡恩斯-塞爾綜合征；Kennedy?。唤鹚共剂旨{綜合征；克-費二氏綜合征；克拉貝?。粠靇韋二氏??；庫魯??；拉福拉??；Lambert-Eaton肌無力綜合征；Landau-Kleffner綜合征；側(cè)髓(瓦倫伯格氏)綜合征；學(xué)習(xí)障礙；利氏??；Lenn0X-GUStaUt綜合征；萊-萘二氏綜合征；腦白質(zhì)病變；路易體癡呆；無腦回癥；閉鎖綜合征；Lou Gehrig病(即，運動神經(jīng)元病或肌萎縮性側(cè)索硬化)；椎間盤退變；萊姆病-神經(jīng)病學(xué)后遺癥；Machado-Jos印h病；巨頭；巨腦；梅_羅二氏綜合征；美尼爾癥；腦膜炎；門克斯??；異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；頭小畸形；偏頭痛；Miller Fisher綜合征；小中風(fēng)；線粒體肌??；默比厄斯氏綜合征；單肢肌萎縮；運動神經(jīng)元??；Moyamoya??；粘多糖忙積癥；多發(fā)梗塞性癡呆；多灶性運動神經(jīng)病；多發(fā)性硬化和其它脫髓鞘病癥；伴有體位性低血壓的多系統(tǒng)萎縮癥；肌肉萎縮癥；重癥肌無力；腦脫髓鞘彌散性硬化；嬰兒肌陣攣性腦??；肌陣攣；肌病；先天性肌強直；嗜睡??；神經(jīng)纖維瘤??；抗精神病藥的惡性綜合征；AIDS的神經(jīng)病學(xué)表現(xiàn)；狼瘡的神經(jīng)病學(xué)后遺癥；神經(jīng)性肌強直；神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥；神經(jīng)元移行異常；尼-皮二氏?。籓’ Sullivan-McLeod綜合征；枕神經(jīng)痛；隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征；大田原綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；眼陣攣-肌陣攣；視神經(jīng)炎；直立性低血壓；過度使用綜合征；感覺異常；神經(jīng)變性疾病或病癥(帕金森病、亨延頓氏舞蹈病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、癡呆、多發(fā)性硬化和與神經(jīng)元細(xì)胞死亡相關(guān)的其它疾病和病癥)；先天性肌強直?。桓蹦[瘤性疾??；突發(fā)性癲癇；帕-羅二氏綜合征；佩-梅氏?。恢芷谛月楸?；外周神經(jīng)病；痛性神經(jīng)病和神經(jīng)性疼痛；持續(xù)性植物人狀態(tài)；全身性發(fā)育遲緩；光噴嚏反射；植烷酸貯積??；皮克氏病；神經(jīng)挾捏；垂體腫瘤；多肌炎；孔洞腦；小兒麻痹癥后期綜合癥；帶狀皰疹后神經(jīng)痛；感染后腦脊髓炎；體位性低血壓；帕-魏二氏綜合征；原發(fā)性脊髓側(cè)索硬化；朊病毒?。贿M(jìn)行性面偏側(cè)萎縮癥；進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病；進(jìn)行性硬化性灰質(zhì)萎縮；進(jìn)行性核上性麻痹；假性腦瘤；Ramsay-Hunt綜合征(I型和II型)；Rasmussen腦炎；反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良綜合征；雷夫敘姆病；重復(fù)性運動損傷；重復(fù)性壓力損傷；多動腿綜合征；逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的脊髓?。籖ett綜合征；雷依氏綜合征；圣維特斯舞蹈?。簧５禄舴虿?；謝耳德氏?。荒X裂；視隔發(fā)育不全；搖晃嬰兒綜合癥；帶狀皰疹 ’希-德二氏綜合征；斯耶格倫氏綜合征；睡眠窒息；Soto綜合征；僵直；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓腫瘤；脊髓性肌萎縮；僵人綜合征；中風(fēng)；斯特奇-韋伯綜合征；亞急性硬化全腦炎；動脈硬化性皮層下腦?。晃鞯录{姆舞蹈；暈厥；脊髓空洞癥；遲發(fā)性運動障礙；泰-薩二氏??；顳動脈炎；脊髓拴系綜合征；肌強直性白內(nèi)障；胸部出口綜合征；三叉神經(jīng)痛；托德氏麻痹；圖雷特綜合癥；暫時性缺血性發(fā)作；傳染性海綿狀腦??；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經(jīng)痛；熱帶痙攣性輕截癱；結(jié)節(jié)性腦硬化；血管性癡呆(多發(fā)梗塞性癡呆)；血管炎(包括顳動脈炎)；希-林二氏??；瓦倫伯格氏綜合征；韋-霍二氏?。豁f斯特綜合征；鞭抽式損傷(whiplash)；威廉斯綜合征；Wildon病和澤韋格綜合征?！x疾病或病癥〃是指內(nèi)分泌系統(tǒng)的各種疾病和病癥，包括例如胰島素抗性、糖尿病、肥胖癥、葡萄糖耐量受損、高血膽固醇、高血糖癥、高胰島素血癥、血脂障礙和高脂血癥。"炎癥"是指系統(tǒng)性炎癥病狀和局部地伴有單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和/或中性白細(xì)胞的遷移和吸引的病狀。炎癥的實例包括但不限于，病原生物體(包括革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲諸如原生動物和蠕蟲)感染引起的炎癥、移植排斥(包括排斥實體器官諸如腎臟、肝臟、心臟、肺或角膜、以及排斥骨髓移植物包括移植物抗宿主病(GVHD))、或局部的慢性或急性自身免疫或變應(yīng)性反應(yīng)引起的炎癥。自身免疫疾病包括急性腎小球性腎炎；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎；慢性腎小球性腎炎；炎性腸病諸如克 羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎和壞死性小腸結(jié)腸炎；粒細(xì)胞輸血相關(guān)的綜合征；炎癥性皮膚病諸如接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、銀屑?。蝗硇约t斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、和一些形式的糖尿病、或其中受治療者自身免疫系統(tǒng)的攻擊導(dǎo)致病理學(xué)組織破壞的任何其它自身免疫狀態(tài)。變應(yīng)性反應(yīng)包括變應(yīng)性哮喘、慢性支氣管炎、急性和延遲的過敏癥。系統(tǒng)性炎癥疾病狀態(tài)包括外傷、燒傷、缺血事件后再灌注(如，心臟、腦、腸或外周脈管系統(tǒng)中的血栓形成事件，包括心肌梗塞和中風(fēng))相關(guān)的炎癥、敗血癥、ARDS或多器官功能障礙綜合征。炎性細(xì)胞募集也發(fā)生在動脈粥樣硬化斑塊中。炎癥包括但不限于，非霍奇金淋巴瘤、韋格納氏肉芽腫、橋本氏甲狀腺炎、肝細(xì)胞癌、胸腺萎縮、慢性胰腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性淋巴樣增生、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、乳頭狀癌、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、急性膽囊炎、慢性膽囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、內(nèi)在性子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜異位癥、急性宮頸炎、慢性宮頸炎、淋巴樣增生、多發(fā)性硬化、特發(fā)性血小板減少性紫癜繼發(fā)性的肥大、原發(fā)性IgA腎病、全身性紅斑狼瘡、銀屑病、肺氣腫、慢性腎盂腎炎和慢性膀胱炎。心血管疾病或病癥包括可導(dǎo)致缺血或由心臟再灌注引起的那些病癥。實例包括但不限于，動脈硬化、冠狀動脈病、巨細(xì)胞性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽腫性)、原發(fā)性肥大型心肌病、外周動脈病(PAD)、中風(fēng)、心絞痛、心肌梗塞、心搏停止造成的心血管組織損傷、心臟旁路造成的心血管組織損傷、心源性休克、和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相關(guān)病狀或包括心臟或脈管系統(tǒng)的功能障礙或組織損傷的相關(guān)病狀，尤其是但不限于，沉默調(diào)節(jié)基因3激活相關(guān)的組織損傷。CVS疾病包括但不限于，動脈硬化、肉芽腫性心肌炎、心肌梗塞、瓣膜性心臟病繼發(fā)性心肌纖維化、無梗塞的心肌纖維化、原發(fā)性肥大性心肌病和慢性心肌炎(非肉芽腫性)。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶在一個實施方案中，靶包括沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的核酸序列，包括但不限于沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。在一個實施方案中，靶包括SIRTl的核酸序列，包括但不限于與SIRTl基因相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。
在一個實施方案中，靶包括SIRT2的核酸序列，包括但不限于與SIRT2基因相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。在一個實施方案中，靶包括SIRT3的核酸序列，包括但不限于與SIRT3基因相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。在一個實施方案中，靶包括SIRT4的核酸序列，包括但不限于與SIRT4基因相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。在一個實施方案中，靶包括SIRT5的核酸序列，包括但不限于與SIRT5基因相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。在一個實施方案中，靶包括SIRT6的核酸序列，包括但不限于與SIRT6基因相關(guān)的有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。在一個實施方案中，靶包括SIRT7的核酸序列，包括但不限于與SIRT7基因相關(guān)的 有義和/或反義的非編碼和/或編碼序列。"SIRT1蛋白〃是指沉默調(diào)節(jié)蛋白脫乙?；傅膕ir2家族的成員。在一個實施方案中，SIRTl蛋白包括酵母Sir2(GenBank登錄號P53685)、秀麗隱桿線蟲(C. elegans)Sir-2. I (GenBank 登錄號 NP. sub. —501912)、人 SIRTl (GenBank 登錄號 NM. sub. 一012238和 NP. sub. —036370 (或 AF083106))。SIRTl "沉默調(diào)節(jié)蛋白〃是包括SIR2結(jié)構(gòu)域(一個如在Pfam家族"SIR2"-PR)2146(附于附錄的)中被評分為命中的氨基酸序列定義的結(jié)構(gòu)域)的蛋白質(zhì)。該家族在INTERPR0數(shù)據(jù)庫中被引用為INTERPR0說明(條目IPR003000)。為了鑒定〃SIR2〃結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)序列中的存在和作出目標(biāo)多肽或蛋白質(zhì)具有特定特征譜的決定，可使用缺省參數(shù)(http://www. sanger. ac. uk/Software/Pfam/HMM_search)針對 HMM 的 Pfam 數(shù)據(jù)庫(例如，Pfam數(shù)據(jù)庫，釋放9)搜索蛋白質(zhì)的氨基酸序列。SIR2結(jié)構(gòu)域在Pfam中被索引為PF02146以及在INTERPR0中被索引為INTERPR0說明(條目IPR003000)。Pfam數(shù)據(jù)庫的說明可見于"The Pfam Protein Families Database^Bateman A 等人(2002)NucleicAcids Research 30(I):276-280 和 Sonhammer 等人(1997)Proteins 28(3):405-420,并且HMM的詳細(xì)描述可見于例如Gribskov等人(1990) Meth. Enzymol. 183:146-159 ；Gribskov 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358 ;Krogh 等人(1994) J. Mol.Biol. 235:1501-1531 ;和 Stultz 等人(1993)Protein Sci. 2:305-314。在線粒體沉默調(diào)節(jié)蛋白當(dāng)中，SIRT3具有最強勁的脫乙?；富钚?。事實上，與SIRT4或SIRT5敲除動物的肝中的線粒體蛋白質(zhì)乙酰化水平相比較，在SIRT3為空值的小鼠的肝中檢測到的顯著更高的線粒體蛋白質(zhì)乙?；?。然而，關(guān)于SIRT3的生理作用知之甚少，盡管已鑒定了許多SIRT3底物和共沉淀蛋白質(zhì)乙?；o酶A合成酶2、Ku70、F0X03a、線粒體復(fù)合物I的亞基9 (NDUFA9)、谷氨酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶2。SIRT3為主要的線粒體脫乙?；?。線粒體蛋白質(zhì)在SIRT3敲除小鼠中顯示超乙?；?，但在SIRT4或SIRT5敲除小鼠中未顯示超乙酰化。乙?；o酶A合成酶2 (AceCS2)(一種將乙酰鹽轉(zhuǎn)化成乙酰基輔酶A的線粒體酶)是第一個鑒定的SIRT3的線粒體底物。SIRT3在賴氨酸642上對AceCS2的脫乙?；饔眉せ钜阴；o酶A合成酶的活性，從而提供了增加的乙?；o酶A供給三羧酸循環(huán)。谷氨酸脫氫酶(GDH)(另一種參與能量產(chǎn)生的線粒體蛋白質(zhì))被SIRT3脫乙酰化。⑶H也可被SIRT4 ADP-核糖基化，反過來降低其酶活性。這指示SIRT3可在細(xì)胞代謝中起重要作用。也已顯示SIRT3參與選擇性細(xì)胞凋亡途徑和細(xì)胞生長控制。SIRT3和SIRT4，但非SIRT5，已牽涉與細(xì)胞存活相關(guān)的調(diào)控NAD+水平的補救途徑。此外，已將hSIRT3基因的變異性與人長壽相聯(lián)系。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白-2基因(Sir2)編碼NAD-依賴性組蛋白脫乙?；?，該酶與釀酒酵母的染色質(zhì)、基因組穩(wěn)定性和壽命的調(diào)節(jié)相關(guān)。Sir2抑制數(shù)個基因座上的轉(zhuǎn)錄并且抑制核糖體DNA(rDNA)重復(fù)上的重組。在Sir2上具有突變的酵母在rDNA重組的背景中具有增強的基因組不穩(wěn)定性，這反過來縮短復(fù)制的壽命-一種該生物體繁殖老化的標(biāo)志。相反地,抑制rDNA重組的Sir2的額外拷貝增加復(fù)制的壽命。Sir2的此類作用促成其中通過染色質(zhì)調(diào)節(jié)促進(jìn)基因組穩(wěn)定化的基因可以是調(diào)節(jié)生物體的壽命、衰老和年齡相關(guān)性病理學(xué)的重要貢獻(xiàn)者的范例。與Sir2因子在壽命調(diào)節(jié)中的保守作用一致，Sir2蛋白在多細(xì)胞生物秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅中的增加的活性也增加壽命。然而，此類Sir2因子可通過不依賴于基因組穩(wěn)定化的機(jī)制來起作用，并且它們的生理分子底物仍然不清楚。在哺乳動物中，存在7個Sir2 家族成員SIRT1-SIRT7。SIRT—直以來作為哺乳動物壽命和年齡相關(guān)過程的候選調(diào)節(jié)劑而極具吸引力。在本說明書中，幾種哺乳動物SIRT具有影響年齡相關(guān)分子途徑和疾病的功能。然而，哺乳動物SIRT的初步研究使此類酶與與釀酒酵母Sir2的生物化學(xué)靶和細(xì)胞功能不同的生物化學(xué)靶和細(xì)胞功能聯(lián)系起來。沉默調(diào)節(jié)蛋白是酵母轉(zhuǎn)錄抑制因子Sir2p的同系物并且從細(xì)菌至人都是保守的。人SIRT4被定位在線粒體。SIRT4為基質(zhì)蛋白質(zhì)并且在輸入線粒體后在氨基酸28上被切割。與SIRT4共沉淀的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析鑒定了胰島素降解酶和ADP/ATP載體蛋白、ANT2和ANT3。SIRT4未顯示組蛋白脫乙?；富钚裕米鹘M蛋白和牛血清白蛋白的高效ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶。SIRT4在胰島中表達(dá)并且與表達(dá)胰島素的β細(xì)胞共定位。從產(chǎn)生胰島素的INS-IE細(xì)胞耗盡SIRT4導(dǎo)致響應(yīng)葡萄糖的增加的胰島素分泌。沉默調(diào)節(jié)蛋白(沉默交配型信息調(diào)控2同系物)5 (釀酒酵母)，也稱為SIRT5，是在人中由SIRT5基因和在其它物種中由Sirt5基因編碼的蛋白質(zhì)。該基因編碼與酵母Sir2蛋白同源的許多蛋白質(zhì)的沉默調(diào)節(jié)蛋白家族。沉默調(diào)節(jié)蛋白家族的成員的特征在于沉默調(diào)節(jié)蛋白核心結(jié)構(gòu)域并且所述成員被分成4類?，F(xiàn)在仍然未確定人沉默調(diào)節(jié)蛋白的功能；然而，已知酵母沉默調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控表觀遺傳基因沉默和抑制rDNA的重組。研究表明人沉默調(diào)節(jié)蛋白可用作具有單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。由該基因編碼的蛋白質(zhì)包括在沉默調(diào)節(jié)蛋白家族的種類III中。該基因的選擇性剪接導(dǎo)致兩種轉(zhuǎn)錄變體。哺乳動物SIRT6基因缺陷型小鼠的產(chǎn)生顯示SIRT6在聯(lián)系壽命、染色質(zhì)和基因組穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)中的潛在作用。在本說明書中，小鼠的SIRT6缺乏導(dǎo)致顯著縮短的壽命和與過早衰老的病理學(xué)重疊的急性變性表型。此外，SIRT6敲除小鼠細(xì)胞具有基因組不穩(wěn)定性和DNA損傷超敏感性。在生物化學(xué)分級分離測定中，SIRT6蛋白優(yōu)先與富含染色質(zhì)的細(xì)胞級分締合。綜合起來，這些觀察表明SIRT6可能將染色質(zhì)調(diào)控與DNA修復(fù)相偶聯(lián)。然而，迄今仍未證明SIRT6在這樣的過程中的生理學(xué)作用。最近已提出哺乳動物沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT1-7)(酵母Sir2的同系物)參與關(guān)鍵代謝途徑以及細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期、基因組穩(wěn)定性和基因表達(dá)的控制。沉默調(diào)節(jié)蛋白(也稱為III類組蛋白脫乙?；?為蛋白質(zhì)脫乙酰基酶/ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶。此類酶從原核生物至真核生物高度保守。它們?nèi)脊灿斜Ｊ氐腘AD-依賴性催化核心結(jié)構(gòu)域，并且顯示促成它們的獨特亞細(xì)胞定位的可變N末端和C末端延伸，并且還可調(diào)控它們的催化活性。沉默調(diào)節(jié)蛋白的亞細(xì)胞分布、底物特異性和細(xì)胞功能是相當(dāng)多樣的。SIRT2是主要的細(xì)胞質(zhì)蛋白，SIRT3-5是線粒體蛋白質(zhì)，SIRT7、-6和-7定位在細(xì)胞核中。SIRT7與酵母Sir2最密切相關(guān)并且為最詳盡表征的沉默調(diào)節(jié)蛋白，具有許多底物(包括p53、Ku70、NF-kB和叉頭轉(zhuǎn)錄因子)，所述底物調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化和遺傳毒性應(yīng)激。SIRT6牽涉在防止細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性和類早老表型中的重要功能。此外，SIRT6為唯一的顯示強勁的自身-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的沉默調(diào)節(jié)蛋白。SIRT7為唯一的定位在核仁中的沉默調(diào)節(jié)蛋白。已顯示當(dāng)對乙?；M蛋白和RNA Pol I機(jī)器的各種乙酰化組分進(jìn)行測試時，其顯示無脫乙?；富駻DP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。關(guān)于SIRT7的核仁功能，F(xiàn)ord等人提出SIRT7可以是通過其與RNA Pol I的締合進(jìn)行的rDNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)劑。其過表面增加rDNA轉(zhuǎn)錄，然而其的抑制減少rDNA轉(zhuǎn)錄。有趣地，SIRT7的表達(dá)與細(xì)胞生長正相關(guān)SIRT7在代謝活性組織諸如肝臟、脾臟和睪丸中非常豐富。迄今為止，沒有關(guān)于SIRT7的細(xì)胞周期調(diào)控和其在有絲分裂過程中(此時rDNA轉(zhuǎn)錄被抑制)的命運的數(shù)據(jù)。
在一些實施方案中，反義寡核苷酸用來預(yù)防或治療沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)家族成員相關(guān)的疾病或病癥?？捎脧睦梅戳x化合物獲得的干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的示例性沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)介導(dǎo)的疾病和病癥包括與沉默調(diào)節(jié)蛋白的異常功能和/或表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥、癌癥(例如，乳腺癌、結(jié)直腸癌、CCL、CML、前列腺癌)、神經(jīng)變性疾病或病癥(例如，阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓氏病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、多發(fā)性硬化和由聚谷氨酰胺聚集引起的病癥)、淀粉樣蛋白疾病或病癥(例如，以淀粉樣蛋白積聚為特征的病癥諸如阿爾茨海默病)、骨骼肌疾病(例如，杜興肌營養(yǎng)不良、骨骼肌萎縮癥、貝克氏肌營養(yǎng)不良、或肌強直性營養(yǎng)不良)；代謝性疾病或病癥(例如，胰島素抗性、糖尿病、2型糖尿病、肥胖癥、葡萄糖耐量受損、代謝性綜合征、成人發(fā)病型糖尿病、糖尿病性腎病、高血糖癥、糖尿病性腎病、高膽固醇血癥、血脂異常高脂血癥和年齡相關(guān)代謝性疾病等)、與胰島素調(diào)節(jié)受損相關(guān)的疾病或病癥、神經(jīng)病變(例如，感覺性神經(jīng)病變、自發(fā)性神經(jīng)病變、運動性神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變)、與酮體生成性病狀相關(guān)的疾病或病癥、與能量體內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的疾病或病癥、與乙?；o酶A合成酶2活性受損相關(guān)的疾病或病癥、與代謝性體內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的疾病或病癥、脂質(zhì)代謝疾病或病癥、與產(chǎn)熱受損相關(guān)的疾病或病癥、與細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)受損相關(guān)的疾病或病癥、與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病或病癥、神經(jīng)病變(例如，感覺性神經(jīng)病變、自發(fā)性神經(jīng)病變、運動性神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變)、纖維變性、炎癥性心肌病變、心臟肥大、慢性炎癥、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、癡呆、骨質(zhì)疏松癥和心血管疾病或病癥、肝疾病或病癥(例如，由于酒精濫用或肝炎、脂肪肝疾病等)、年齡相關(guān)性黃斑變性、骨疾病(例如，骨質(zhì)疏松癥)、血液疾病(例如，白血病)、骨質(zhì)吸收、年齡相關(guān)性黃斑變性、AIDS相關(guān)性癡呆、ALS、貝爾氏麻痹、動脈粥樣硬化、心臟疾病或病癥(例如，心臟節(jié)律紊舌L、慢性充血性心力衰竭、缺血性中風(fēng)、冠狀動脈疾病和心肌病)、慢性退行性疾病(例如，心肌疾病)、慢性腎衰竭、2型糖尿病、潰瘍、白內(nèi)障、遠(yuǎn)視、腎小球腎炎、吉蘭-巴雷綜合征(Guillan-Barre syndrome)、出血性中風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病疾病、SLE、克羅恩氏病、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、皮膚老化、皮膚疾病或病癥、尿失禁、與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病或病癥(例如，線粒體肌病變、腦病、利伯(Leber)疾病、利(Leigh)腦病、皮爾森氏病(Pearson’s disease)、乳酸性酸中毒、‘線粒體腦病、乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣癥狀’(MELAS)等)、肝變性、骨骼肌變性、肌肉疾病或病癥、炎癥、與異位脂質(zhì)沉積相關(guān)的疾病或病癥、與氧化性應(yīng)激相關(guān)的疾病或病癥、與細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的疾病或病癥、與神經(jīng)元細(xì)胞死亡相關(guān)的疾病或病癥、老化或以不必要細(xì)胞損耗為特征的其它病狀、退行性綜合征、與氨解毒相關(guān)的病或病癥、衰老、與端粒功能障礙相關(guān)的疾病或病癥、與染色質(zhì)調(diào)節(jié)受損相關(guān)的疾病或病癥、與早熟細(xì)胞衰老相關(guān)的疾病或病癥、與SIRT介導(dǎo)的DNA修復(fù)受損相關(guān)的疾病或病癥和以不必要細(xì)胞損耗為特征的病狀。已報道沉默調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)TNF-α活性，如描述于例如美國專利申請公布No. 2010/0137345, “Prophylactic and therapeutic use of sirtuininhibitors inTNF-alpha mediated pathologies”,其通過引用整體并入本文。在實施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸用于調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白，例如SIRT 6，以治療TNF-α-介導(dǎo)的病癥或疾病。TNF-α-介導(dǎo)病癥或疾病包括，例如強直性脊柱炎、動脈粥樣硬化、炎性腸疾病(IBD)(包括克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡病質(zhì)、革蘭陰性膿毒癥、內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克、膿毒性休克綜合征、全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)或多器官功能紊亂綜合征(MODS);和/或移植物抗宿主病理學(xué)(包括反應(yīng)移植物抗宿主病 (GVHD)和移植的異種或同種異體組織或器官的排斥)；和/或急性或慢性感染性或寄生性過程(包括病毒、細(xì)菌或真菌感染和原生動物或后生動物寄生蟲感染，優(yōu)選腦瘧疾或腦膜炎球菌性腦膜炎)；和/或變應(yīng)性病癥(包括變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、哮喘、濕疹、蕁麻疹、接觸性皮炎、全身性變應(yīng)性應(yīng)答(過敏性反應(yīng))和過敏性休克、變應(yīng)性鼻炎或哮喘、急性播散性腦脊髓炎(ADEM)) ;AddiSon’S疾?。粡娭毙约怪?；抗磷脂抗體綜合征(APS);再生障礙性貧血；動脈粥樣硬化；自身免疫性胃炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性血小板減少癥；BehCet’ s疾??；腹腔疾??；皮肌炎；1型糖尿??；11型糖尿?。患易逍缘刂泻?；家族性冷誘導(dǎo)自身炎癥綜合征；古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’s syndrome);痛風(fēng)；假痛風(fēng)；格雷夫斯氏??；吉蘭-巴雷巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome) (GBS);橋本氏疾病；遺傳性周期性發(fā)熱；特發(fā)性血小板減少性紫癜；炎性腸病(IBD)(包括克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)；缺血-再灌注損傷；Kawasaki’ s疾?。换旌辖Y(jié)締組織疾?。荒?韋二氏綜合征(Muckle-Wells syndrome);多發(fā)性硬化(MS);重癥肌無力；夜間肌陣攣綜合征(OMS)；視神經(jīng)炎；奧德氏甲狀腺炎；骨關(guān)節(jié)炎；天皰瘡；惡性貧血；結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎；多肌炎；術(shù)后或創(chuàng)傷性炎癥；原發(fā)性膽汁性肝硬變；primary myoxedema ;銀屑?。汇y屑病性關(guān)節(jié)炎；風(fēng)濕熱；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；萊特爾綜合征；硬皮病；干燥綜合征(Sjogren’s syndrome);中風(fēng)-缺血(stroke-ischemia);系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎；高安氏動脈炎；顳動脈炎；白癲風(fēng)；溫?zé)嶙陨砻庖咝匀苎载氀缓晚f格納氏肉芽腫。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸調(diào)節(jié)遭受與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)相關(guān)的疾病或病癥或處于形成所述疾病或病癥的危險的患者中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的正常表達(dá)和/或正常功能。在本發(fā)明的實施方案中，給需要皮膚治療或存在他們?yōu)榇诵枰つw治療的發(fā)展中病狀的風(fēng)險的受治療者提供治療和/或美容方法和相關(guān)的特定治療?？衫缁谑苤委熣逽IRT狀態(tài)進(jìn)行診斷。患者給定組織例如皮膚中的SIRT表達(dá)水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和本文別處所述的方法來確定，例如通過使用PCR或基于抗體的檢測方法來分析組織。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案提供一種用于皮膚治療和/或美容應(yīng)用的組合物，所述組合物包含SIRT反義寡核苷酸例如以上調(diào)SIRT在皮膚中的表達(dá)。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID N0S:24至127所列。通過引用并入本文的美國專利No. 7，544，497“Compositionsformanipulating the lifespan and stress response of cells and organisms，，描述了通過降低沉默調(diào)節(jié)蛋白對其底物的Km而調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白活性的試劑的潛在美容用途。在實施方案中，通過本發(fā)明的寡核苷酸體內(nèi)處理細(xì)胞來增加細(xì)胞壽命、預(yù)防細(xì)胞凋亡。例如，如本文所述，通過處理皮膚(例如上皮細(xì)胞)可以保護(hù)皮膚避免衰老，例如起皺紋。在一個示例性實施方案中，使皮膚與包含本文所述的SIRT反義化合物的藥物組合物或美容組合物相接觸。示例性皮膚折磨或皮膚狀況包括與炎癥、曬傷或自然衰老有關(guān)的病癥或疾病或者由炎癥、曬傷或自然衰老所導(dǎo)致的病癥或疾病。例如，所述組合物在預(yù)防和治療接觸性皮炎(包括刺激性接觸性皮炎和過敏性接觸性皮炎)、遺傳過敏性皮炎(也稱作過敏性濕疹)、光化性角化病、角質(zhì)化病癥(包括濕疹)、大皰性表皮松解癥(包括天皰瘡)、剝脫性皮
炎、脂溢性皮炎、紅斑(包括多形性紅斑和結(jié)節(jié)性紅斑)、由于太陽或其他光源所導(dǎo)致的損傷、盤狀紅斑狼瘡、皮肌炎、皮膚癌以及自然衰老效應(yīng)中有效。已報道沉默調(diào)節(jié)蛋白干擾雙氫睪酮誘導(dǎo)的雄激素受體信號傳導(dǎo)。(參見，例如，F(xiàn)u 等人，2006， “Hormonal Control of Androgen ReceptorFunction throughSIRT1, ^Molecular and Cellular Biology 26 (21) :8122 - 8135，其通過引用并入本文)。在本發(fā)明的實施方案中，包含SIRT反義寡核苷酸的組合物例如上調(diào)SIRT在頭皮中的表達(dá)并且抑制雄激素受體發(fā)信號，由此防止雄激素性脫發(fā)(頭發(fā)脫落)。在實施方案中，以局部制劑或全身制劑施用給患有脫發(fā)的患者。在實施方案中，將本文所述的反義寡核苷酸摻合至包含通常適于局部藥物施用的局部載體以及包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何此類物質(zhì)的局部制劑中。所述局部載體可以如此選擇以便以所需形式(例如以軟膏劑、洗劑、乳膏劑、微乳齊U、凝膠劑、油劑、溶液等形式)提供組合物，并且可以由天然存在或合成來源的物質(zhì)組成。優(yōu)選的是所選載體不會對局部制劑中的有效劑或其他組份造成不利影響。適于本文使用的局部載體的例子包括水、醇、其他的無毒有機(jī)溶劑、甘油、礦物油、硅酮、石油膏、羊毛脂、月旨肪酸、植物油、尼泊金類、蠟類等。制劑可以是無色無味的軟膏劑、洗劑、乳膏劑、微乳劑和凝膠劑。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以摻入到軟膏劑中，所述軟膏劑通常為代表性地基于凡士林和其他凡士林衍生物的半固體制劑。如那些本領(lǐng)域技術(shù)人員所領(lǐng)會到的，所使用的特定的軟膏劑基質(zhì)用于提供最適宜的藥物遞送，優(yōu)選是提供其他所需要的特性(例如柔潤性等)。如同其他載體或媒介物那樣，軟膏劑基質(zhì)應(yīng)該是惰性的、穩(wěn)定的、無刺激性的和非致敏性的。如 Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.)中解釋的那樣，軟膏劑基質(zhì)可分為四類油性基質(zhì)；可乳化基質(zhì)；乳劑基質(zhì)；和水溶性基質(zhì)。油性軟骨劑基質(zhì)包括例如植物油、源自動物的脂肪和源自石油的半固體烴類。可乳化軟膏劑基質(zhì)也稱作可吸收的軟膏劑基質(zhì)，包含很少的水或者不含水，并且包括例如硫酸羥基硬脂精、無水羊毛脂和吸水性凡士林。乳劑軟膏劑基質(zhì)是油包水(W/0)乳劑或水包油(0/W)乳劑中的任一種，并且包括例如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。示例性水溶性軟膏劑基質(zhì)由不同分子量(例如參見Remington’s,同上)的聚乙二醇(PEG)制備。
本發(fā)明的反義寡核苷酸可以摻合到洗劑中，所述洗劑通常是沒有摩擦地應(yīng)用于皮膚表面的制劑，并且典型地為液體或半液體制劑，其中包括活性劑的固體顆粒存在于水或醇基質(zhì)中。洗劑經(jīng)常是固體的混懸劑，可以包括水包油型的液體-油狀乳劑。由于易于應(yīng)用更多液體的組合物，因而洗劑優(yōu)選是用于治療大身體面積的制劑。通常需要洗劑中的不溶物質(zhì)被很好地分開。洗劑典型地包含用于產(chǎn)生良好分散的助懸劑以及對于局部化活性劑并保持其與皮膚接觸有用的化合物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等。與目前方法結(jié)合使用的示例性洗劑制劑包含混合有吸水性凡士林的丙二醇，其可以以商標(biāo)AquaphorRTM由拜爾斯道夫公司(Beiersdorf, Inc.) (Norwalk, Conn.)獲得。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以摻合到乳膏劑中，所述乳膏劑通常為粘性的液體或者半固體乳劑，可以是水包油或油包水乳劑的任一種。乳膏劑基質(zhì)是可水洗的，并且包含油相、乳化劑和水相。該油相通常由凡士林和脂肪醇如鯨蠟醇或硬脂醇構(gòu)成；該水相經(jīng)常但并非必須在體積上超過油相，并且通常包含潤濕劑。如Remington’s,同上所解釋的那樣，乳膏劑制劑中的乳化劑通常是非離子型、陰離子型、陽離子型或兩性表面活性劑。 本發(fā)明的反義寡核苷酸可以摻合到微乳劑中，所述微乳劑通常是熱力學(xué)上穩(wěn)定的、兩種不混溶液體(如油和水)的各向同性地透明的分散體，通過表面活性劑分子的界面膜得以穩(wěn)定(Encyclopedia ofPharmaceutical Technology (New York:Marcel Dekker,1992)，卷9)。對于微乳劑的制備，需要表面活性劑(乳化劑)、共表面活性劑(共乳化劑)、油相和水相。適合的表面活性劑包括任何在制備乳劑中有用的表面活性劑，例如典型地用于制備乳膏劑的乳化劑。所述共表面活性劑(或"共乳化劑")通常選自聚甘油衍生物、丙三醇衍生物和脂肪醇。優(yōu)選的乳化劑/共乳化劑組合通常但并非必須選自單硬脂酸甘油酯和聚氧乙烯硬脂酸酯；聚乙二醇和硬脂酸棕櫚酸乙二醇酯；辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯以及油酰基聚乙二醇甘油酯。水相不僅包括水，還典型地包括緩沖液、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇，優(yōu)選低分子量聚乙二醇(例如PEG 300和PEG 400)和/或丙三醇等，而油相通常包括如脂肪酸酯、改性植物油、硅酮油、甘油單酯和甘油二酯和甘油三酯的混合物、PEG的單酯和二酯(例如油?；垡叶几视王?等。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以摻合到凝膠制劑中，所述凝膠制劑通常是包含由小的無機(jī)顆粒構(gòu)成的懸浮液(雙相系統(tǒng))或基本上均勻地分布在載體溶液中的大的有機(jī)分子(單相凝膠)的半固體系統(tǒng)。單相凝膠可如下制作例如通過將所述活性劑、載體液體、適合的膠凝劑，如黃蓍膠(2-5%)、藻酸鈉(2-10%)、明膠(2-15%)、甲基纖維素(3-5%)、羧甲基纖維素鈉(2-5%)、卡波姆(O. 3-5%)或聚乙烯醇(10-20%)組合在一起并且混合直至產(chǎn)生特征性半固體產(chǎn)物。其他適合的膠凝劑包括羥甲基纖維素、聚氧乙烯-聚氧丙烯、羥乙基纖維素和明膠。盡管凝膠通常采用水性載體液體，但醇和油也可用作載體液體。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種添加劑也可包括在制劑中，例如局部制劑。添加劑的例子包括但不限于增溶劑、透皮促滲劑、遮光劑、防腐劑(例如抗氧化劑)、膠凝劑、緩沖齊U、表面活性劑(特別是非離子型和兩性表面活性劑)、乳化劑、軟化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、著色劑、芳香劑(fragrance)等。特別優(yōu)選與乳化劑、軟化劑和防腐劑一起,含有增溶劑和/或透皮促滲劑。最佳的局部制劑主要包括約2wt. 9T60wt. %、優(yōu)選2wt. 9T50wt. %的增溶劑和/或透皮促滲劑；2wt. % 50wt· %、優(yōu)選2wt. % 20wt· %的乳化劑；2wt. % 20wt· %的軟化劑；和0. 0Γ0. 2wt. %防腐劑，以及制備所述制劑剩余部分的活性劑和載體(例如水)。
透皮促滲劑對促進(jìn)治療水平的活性劑通過合理大小面積的完整皮膚有用。適合的促進(jìn)劑在本領(lǐng)域是熟知的，包括例如鏈烷醇(如甲醇、乙醇和2-丙醇)；烷基甲基亞砜(如二甲基亞砜(DMSO)、癸基甲基亞砜(CltlMSO)和十四烷基甲基亞砜)；吡咯烷酮(如2-吡咯烷酮，N-甲基-2-吡咯烷酮和N-(-羥基乙基)吡咯烷酮)；脲；隊^二乙基-間甲苯酰胺；C2-C6鏈烷二醇；混溶性溶劑(如二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)和四氫呋喃甲醇)；1_取代的氮雜環(huán)庚烷-2-酮，特別是I-正十二烷基環(huán)氮雜環(huán)庚烷-2-酮(月桂氣麗)；以商標(biāo)AzoneRTM可由Whitby Research股份有限公司(Richmond, Va)獲得。增溶劑的例子包括但不限于以下物質(zhì)親水性醚，如二乙二醇單乙醚(乙氧基二甘醇，可以TranscutolRTM市售可得)和二乙二醇單乙醚油酸酯(可以SoficutolRTM市售可得)；聚乙烯蓖麻油衍生物，如聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油等 ’聚乙二醇，特別是低分子量聚乙二醇，如PEG 300和PEG 400，以及聚乙二醇衍生物，如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯(可以LabrasolRTM市售可得)；烷基甲基亞砜，如DMSO ;吡咯烷酮，如2-批咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮；和DMA。很多增溶劑還可作為吸收促進(jìn)劑發(fā)揮作用。可將單獨的增溶劑摻合至制劑中，或者可以將增溶劑的混合物摻合至制劑中。 合適的乳化劑和共乳化劑包括但不限于那些關(guān)于微乳劑制劑所描述的乳化劑和共乳化劑。軟化劑包括例如丙二醇、丙三醇、肉豆蘧酸異丙酯、聚丙二醇-2 (PPG-2)肉豆蘧基釀丙酸酷等。其他的活性劑也可包含在制劑中，例如其它抗炎藥、止痛藥、抗菌劑、抗真菌劑、抗生素、維生素、抗氧化劑、以及通常在防曬制劑中發(fā)現(xiàn)的防曬劑，所述防曬劑包括但不限于鄰氨基苯甲酸鹽、二苯甲酮(特別是二苯甲酮_3)、樟腦衍生物、肉桂酸酯(例如甲氧基肉桂酸辛酯)、二苯甲酰甲烷(例如丁基甲氧基二苯甲酰甲烷)、對氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物、以及水楊酸鹽(例如水楊酸辛酯)。在實施方案中，寡核苷酸是對沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)多核苷酸有特異性，該多核苷酸包括但不限于非編碼區(qū)。沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)靶包括沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)的變體；沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)的突變體，包括SNP ;沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)的非編碼序列；等位基因、片段和類似物。優(yōu)選地寡核苷酸是反義RNA分子。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不限于僅沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)多核苷酸，還延伸到沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)的任何同種型、受體、同系物、非編碼區(qū)和類似物。在另一個實施方案中，寡核苷酸靶向沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)靶的天然反義序列(與編碼區(qū)和非編碼區(qū)天然反義)，包括但不限于，其變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括變體，其中在化合物中一個或多個核苷酸位置存在不同堿基。例如，如果第一個核苷酸是腺嘌呤，可產(chǎn)生在這一位置包含胸苷、鳥苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的變體。這可在反義化合物的任何位置進(jìn)行。在一些實施方案中，反義化合物與靶之間的同源性、序列同一性或互補性是從約50%至約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約60%至約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約70%至約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約80%至約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。
當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以導(dǎo)致活性的喪失時，該化合物是可特異性雜交的，且在期望特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。這種條件包括，即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理條件以及在體外測定的情形中進(jìn)行測定的條件。當(dāng)反義化合物(無論是DNA、RNA、嵌合、取代的等等)與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能以導(dǎo)致效用的喪失時，該化合物是可特異性雜交的，且在期望特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理條件下以及在體外測定的情形中進(jìn)行測定的條件下)存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合。在另一個實施方案中，沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)的靶向包括但不限于，利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)展的反義序列、一種或多種如SEQ ID N0:9至23、141至143所列的序列和調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)基因(SIRT)表達(dá)或功能的類似物。在一個實施方案中，與對照相比表達(dá)或功能被上調(diào)。在另一個實施方案中，與對照相比表達(dá)或功能被下調(diào)。
在另一個實施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID N0:24至127所列的核酸序列，包括利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)展的反義序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長的片段、修飾的鍵和類似物。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或類似物。在另一個實施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？筛郊佑诒景l(fā)明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團(tuán))可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烴酯、硫代磷酸酯和類似物。上述磷酸酯類似物的制備和將其向核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。反義的特異性和靈敏性還由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用以用于治療用途。反義寡核苷酸已在動物和人的疾病狀態(tài)的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸已經(jīng)安全且有效地施用于人，目前正在進(jìn)行許多臨床試驗。因此已經(jīng)確定，寡核苷酸可以是有用的治療形態(tài)，可被配置以用于治療細(xì)胞、組織和動物(尤其是人)的治療方案。在本發(fā)明的實施方案中，寡聚反義化合物，尤其是寡核苷酸，結(jié)合靶核酸分子并調(diào)節(jié)靶基因編碼的分子的表達(dá)和/或功能。待干擾的DNA的功能包括，例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重要功能，例如RNA向蛋白翻譯位置的移位，從RNA翻譯為蛋白，剪接RNA以產(chǎn)生一種或多種mRNA種類以及可由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。取決于期望的功能，功能可被上調(diào)或抑制。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可選剪接體、引物、探針以及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明范疇中，將反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步驟的過程。該過程通常開始于鑒定待調(diào)節(jié)其功能的靶核酸。這一靶核酸可以是，例如，其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)或來自感染物的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼性激素集合球蛋白沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)。靶向過程通常還包括確定靶核酸中發(fā)生反義相互作用從而產(chǎn)生期望作用例如調(diào)節(jié)表達(dá)的至少一個靶區(qū)域、區(qū)段或位置。在本發(fā)明范疇中，術(shù)語〃區(qū)域〃定義為具有至少一種可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區(qū)域中是區(qū)段。"區(qū)段"定義為靶核酸中較小區(qū)域或區(qū)域的亞部分。本發(fā)明中使用的"位置"定義為靶核酸中的位置。在一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的天然反義序列并調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT) (SEQ ID NO: I至23和133至143)的表達(dá)和/或功能。反義序列的實例包括SEQ ID N0:24至127。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的一個或多個區(qū)并調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的表達(dá)和/或功能。區(qū)段包括沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的有義或反義多核苷酸的至少五個連續(xù)核苷酸。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸是對沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的天然反義序列有特異性，其中寡核苷酸對沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的表達(dá)和/或功能。在另一個實施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID N0:24至127所列的序列、利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)展的反義序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長的片段、修飾的鍵和類似物。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或類似物。在另一個實施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？筛郊佑诒景l(fā)明的修飾的寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基團(tuán))可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸烷烴酯、硫代磷酸酯和類似物。上述磷酸酯類似物的制備和將其向核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸的并入本身是已知的，不必在此描述。如本領(lǐng)域已知的，因為翻譯起始密碼子通常是5’ -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在·相應(yīng)DNA分子中是5’ -ATG)，翻譯起始密碼子也稱為"AUG密碼子〃、〃起始密碼子〃或"AUG起始密碼子"。少數(shù)基因具有具有RNA序列5’ -GUG、5’ -UUG或5’ -CUG的翻譯起始密碼子；且5’ -AUA、5’ -ACG和5’ -CUG已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語〃翻譯起始密碼子〃和〃起始密碼子"可涵蓋許多密碼子序列，盡管每種情形中的起始氨基酸通常是甲硫氨酸(真核細(xì)胞中)或甲酰甲硫氨酸(原核細(xì)胞中)。真核基因和原核基因可具有兩個或更多個替代性起始密碼子，其中的任何一個可在特定細(xì)胞類型或組織中或在特定條件設(shè)置下優(yōu)先地用于翻譯起始。在本發(fā)明范疇中，"起始密碼子"和"翻譯起始密碼子"是指體內(nèi)用于起始從編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯的一種或多種密碼子，而不論這種密碼子的序列?；虻姆g終止密碼子(或"終止密碼子〃)可具有三種序列即5’ -UAA、5’ -UAG 和 5’ -UGA 之一(相應(yīng)的 DNA 序列分別是 5’ _TAA、5’ -TAG 和 5’ -TGA)。術(shù)語〃起始密碼子區(qū)〃和〃翻譯起始密碼子區(qū)〃是指這種mRNA或基因的一部分，涵蓋以任一方向(即，5’或3’)從翻譯起始密碼子的約25至約50個連續(xù)核苷酸。類似地，術(shù)語〃終止密碼子區(qū)〃和〃翻譯終止密碼子區(qū)〃是指這種mRNA或基因的一部分，涵蓋以任一方向(即，5’或3’)從翻譯終止密碼子的約25至約50個連續(xù)核苷酸。因此，〃起始密碼子區(qū)〃(或"翻譯起始密碼子區(qū)〃)和"終止密碼子區(qū)〃(或"翻譯終止密碼子區(qū)〃)都是可用本發(fā)明的反義化合物有效地靶向的區(qū)域。本領(lǐng)域已知開放讀碼框(ORF)或〃編碼區(qū)〃是指翻譯起始密碼子與翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，也是可被有效地靶向的區(qū)域。在本發(fā)明范疇中，靶向的區(qū)域是涵蓋基因開放讀碼框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)域。
另一靶區(qū)域包括5'非翻譯區(qū)(5’ UTR)，本領(lǐng)域已知是指mRNA以5’方向從翻譯起始密碼子的部分，因此包括mRNA的5’帽位置與翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。又一靶區(qū)域包括3'非翻譯區(qū)(3’UTR)，本領(lǐng)域已知是指mRNA以3’方向從翻譯終止密碼子的部分，因此包括mRNA的翻譯終止密碼子與3’端之間的核苷酸(或基因上相應(yīng)的核苷酸)。mRNA的5’帽位置包括經(jīng)由5’ -5’三磷酸酯鍵合與mRNA的最5’殘基連接的N7-甲基化鳥苷殘基。認(rèn)為mRNA的5’帽區(qū)域包括5’帽結(jié)構(gòu)本身以及與帽位置相鄰的前50個核苷酸。本發(fā)明的另一靶區(qū)域是5’帽區(qū)域。SIRTl的其它靶區(qū)域包括反義轉(zhuǎn)錄物CV396200的核苷酸65至85，和221至253。在實施方案中，調(diào)節(jié)SIRTl多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法包括將細(xì)胞或組織與靶向這些區(qū)域中的一個或多個的至少一種反義寡核苷酸，部分或整體地接觸。在某些實施方案中，使用靶向這些區(qū)域中的一個或多個的反義寡核苷酸和靶向其它沉默調(diào)節(jié)蛋白的一個或多個反義轉(zhuǎn)錄物的組合。在實施方案中，組合使用靶向SIRT不同區(qū)域的多種反義寡核苷酸，或組合施用靶向一個或多個不同SIRT區(qū)域的多種反義寡核苷酸。 盡管一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物被直接翻譯，但是許多包含一個或多個稱為〃內(nèi)含子〃的區(qū)域，在翻譯前從轉(zhuǎn)錄物切除。其余(因此被翻譯的)區(qū)域稱為"外顯子"，被剪接在一起以形成連續(xù)的mRNA序列。在一個實施方案中，靶向剪接位置，即，內(nèi)含子-外顯子結(jié)點或外顯子-內(nèi)含子結(jié)點在其中疾病中牽涉異常剪接的情形或其中疾病中牽涉特定剪接產(chǎn)物的過度產(chǎn)生的情形尤其有用。由于重排或缺失的異常融合結(jié)點是靶位置的另一形式。由剪接來自不同基因來源的兩個(或更多個)mRNA的過程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為"融合轉(zhuǎn)錄物"。利用靶向例如DNA或前體mRNA的反義化合物可有效地靶向內(nèi)含子。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合靶多核苷酸的編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合天然反義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合有義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。可從DNA的相同基因組區(qū)域產(chǎn)生可選RNA轉(zhuǎn)錄物。這些可選轉(zhuǎn)錄物通常稱為〃變體"。更具體地，〃前體mRNA變體〃是從相同基因組DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，在其起始或終止位置與從相同基因組DNA產(chǎn)生的其它轉(zhuǎn)錄物不同，并包含內(nèi)含子序列和外顯子序列兩者。在剪接期間切除一個或多個外顯子或內(nèi)含子區(qū)域或其部分后，前體mRNA變體產(chǎn)生更小的"mRNA變體〃。因此，mRNA變體是加工的前體mRNA變體，且每個獨特的前體mRNA變體必定因為剪接而產(chǎn)生獨特的mRNA變體。這些mRNA變體還稱為〃可選剪接變體〃。如果不進(jìn)行前體mRNA變體的剪接，則前體mRNA變體與mRNA變體相同。變體可經(jīng)由使用可選信號產(chǎn)生以起始或終止轉(zhuǎn)錄。前體mRNA和mRNA可具有多于一個起始密碼子或終止密碼子。來源于使用可選起始密碼子的前體mRNA或mRNA的變體稱為該前體mRNA或mRNA的"可選起始變體"。使用可選終止密碼子的那些轉(zhuǎn)錄物稱為該前體mRNA或mRNA的〃可選終止變體"。一種特定類型的可選終止變體是〃聚腺苷酸變體"，其中產(chǎn)生的多個轉(zhuǎn)錄物由"聚腺苷酸終止信號"之一被轉(zhuǎn)錄機(jī)制可選選擇所致，從而產(chǎn)生在獨特聚腺苷酸位點終止的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明范疇中，本文所述的變體類型也是靶核酸的實施方案。靶核酸上與反義化合物雜交的位置定義為活性反義化合物靶向的靶區(qū)域的至少5-核苷酸長的部分。盡管本文列出了某些示例性靶區(qū)段的具體序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些用于闡釋和描述于本發(fā)明范圍中的具體實施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮到本公開內(nèi)容可容易地鑒定另外的靶區(qū)段。認(rèn)為包括選自示例性優(yōu)選的靶區(qū)段中的至少五(5)個連續(xù)核苷酸的段的長度為5-100個核苷酸的靶區(qū)段也適合于靶向。靶區(qū)段可包括包括從示例性的靶區(qū)段之一的5’ -末端的至少5個連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列(其余核苷酸為從靶區(qū)段5’ -末端的緊鄰上游開始的相同DNA或RNA的連續(xù)段并延伸直到DNA或RNA包含約5至約100個核苷酸)。類似地，靶區(qū)段由包括從示例性 的靶區(qū)段之一的3’ -末端的至少5個連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列代表(其余核苷酸為從靶區(qū)段3’ -末端的緊鄰下游開始的相同DNA或RNA的連續(xù)段并延伸直到DNA或RNA包含約5至約100個核苷酸)。借助本文所示例的靶區(qū)段的本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定另外的靶區(qū)段而不需過度試驗。已經(jīng)鑒定出一種或多種靶區(qū)域、區(qū)段或位置后，選擇與靶足夠地互補，S卩，充分良好并以足夠特異性雜交的反義化合物以獲得期望作用。在本發(fā)明的實施方案中，寡核苷酸結(jié)合特定靶的反義鏈。寡核苷酸長度為至少5個核苷酸并可合成以使每個寡核苷酸靶向重疊序列，從而寡核苷酸被合成以覆蓋靶多核苷酸的整個長度。靶還包括編碼區(qū)以及非編碼區(qū)。在一個實施方案中，反義寡核苷酸靶向特定核酸。將反義化合物靶向特定核酸是多步驟的過程。該過程通常開始于鑒定待調(diào)節(jié)其功能的核酸序列。這一核酸序列可以是，例如，其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)、或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA(ncRNA)。RNA可分為(I)信使RNA (mRNA)，其被翻譯為蛋白，和⑵非蛋白編碼RNA (ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度終止密碼子和缺少任何廣泛的〃開放讀碼框〃的其它轉(zhuǎn)錄單位(TU)。許多ncRNA表現(xiàn)為從蛋白-編碼基因座的3'非翻譯區(qū)(3’UTR)中的起始位點開始。ncRNA通常是罕見的，已被FANTOM財團(tuán)測序的ncRNA的至少一半似乎不是多腺苷酸化的。出于明顯的原因，大多數(shù)研究者集中于被加工并輸出到細(xì)胞質(zhì)的多腺苷酸化mRNA。最近，顯示非多腺苷酸化的核RNA的組可能是非常大的，且許多這樣的轉(zhuǎn)錄物來源于所謂的基因間區(qū)。ncRNA可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制是通過與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對。通過堿基配對起作用的RNA可分為(I)順式編碼的RNA，其在它們所作用的RNA的相同遺傳位置但在相對鏈上被編碼，因此與其靶展示極佳的互補性，和(2)反式編碼的RNA，其在不同于它們所作用的RNA的染色體位置被編碼，通常不與其靶展示極佳的堿基-配對可能。不希望受限于理論，反義多核苷酸被本文所述的反義寡核苷酸的擾動可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達(dá)。然而，這一調(diào)節(jié)可以是不一致的(反義敲低導(dǎo)致信使RNA升高)或一致的(反義敲低導(dǎo)致相伴的信使RNA減少)。在這些情形中，反義寡核苷酸可靶向于反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，導(dǎo)致其敲低或隔離。編碼以及非編碼反義可以相同方式靶向，任一種類能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)的有義轉(zhuǎn)錄物-以一致的或不一致的方式。鑒定針對靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可基于反義RNA轉(zhuǎn)錄物被反義寡核苷酸的敲低或調(diào)節(jié)期望靶的任何其它手段。策略I :在不一致調(diào)節(jié)的情形下，敲低反義轉(zhuǎn)錄物升高常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。如果后者基因編碼已知或推測的藥物靶，則其反義對應(yīng)物的敲低能夠可設(shè)想地模擬受體激動劑或酶刺激劑的作用。策略2 :在一致調(diào)節(jié)的情形下，人們可以協(xié)同地敲低反義轉(zhuǎn)錄物和有義轉(zhuǎn)錄物兩者，從而實現(xiàn)常規(guī)(有義)基因表達(dá)的協(xié)同減少。例如，如果反義寡核苷酸用來實現(xiàn)敲低，則這一策略可用來施加靶向有義轉(zhuǎn)錄物的一種反義寡核苷酸和靶向相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的另一反義寡核苷酸，或同時靶向重疊的有義轉(zhuǎn)錄物和反義轉(zhuǎn)錄物的單個有力地對稱的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物以及雜交于靶核 酸的至少一部分并調(diào)節(jié)其功能的其它寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、DNA-樣、RNA-樣或其混合物，或可以是一種或多種這些的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部凸出或末端凸出、錯配或環(huán)。常規(guī)線性地制備反義化合物，但可被連接或以其它方式制備為環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如，兩條鏈雜交以形成完全或部分雙鏈的化合物或者具有足夠自互補性的單鏈以允許雜交和形成完全或部分雙鏈的化合物。兩條鏈可在內(nèi)部被連接，留下游離的3’或5’末端，或可被連接以形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含在5’或3’末端的突出，產(chǎn)生單鏈特征的延伸段。雙鏈化合物任選地可包括在末端的突出。進(jìn)一步的修飾可包括附加于末端之一、所選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一的綴合物基團(tuán)?？蛇x地，兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或接頭基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時，dsRNA可采取自互補發(fā)夾型分子的形式，其與自身對折以形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來實現(xiàn),然而,在一些實施方案中，基因表達(dá)或功能被上調(diào)。當(dāng)由兩條鏈或采取與自身對折以形成雙鏈體的自互補發(fā)夾型分子形式的單鏈形成時，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式堿基配對的互補RNA鏈。被引入系統(tǒng)中后，本發(fā)明的化合物可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實現(xiàn)靶核酸的裂解或其它修飾，或可經(jīng)由基于占位性的機(jī)制作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可描述為"DNA-樣〃(S卩，通常具有一個或多個2’ -脫氧糖，且通常具有T而不是U堿基)或〃RNA-樣〃(即，通常具有一個或多個2’ -羥基或2’ -修飾的糖，且通常具有U而不是T堿基)。核酸螺旋可采用多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常是A-和B-形式。通常認(rèn)為，具有B-形式-樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"DNA-樣〃，且具有A-形式樣結(jié)構(gòu)的是"RNA-樣〃。在一些(嵌合)實施方案中，反義化合物可包含A-形式區(qū)域和B-形式區(qū)域兩者。在另一個實施方案中，期望寡核苷酸或反義化合物包括以下至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包括修飾的鍵合的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA (siRNA)、微干擾 RNA (miRNA)、時序調(diào)節(jié)小 RNA (stRNA)或短發(fā)夾 RNA (shRNA)、小 RNA-誘導(dǎo)的基因活化(RNAa)、小活化RNA(saRNA)或其組合。dsRNA還可活化基因表達(dá)，這是已被稱為"小RNA-誘導(dǎo)的基因活化〃或RNAa的機(jī)制。dsRNA靶向基因啟動子誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效的轉(zhuǎn)錄活化。RNAa在人細(xì)胞中利用合成的dsRNA證實，稱為"小活化RNA〃 (saRNA)。已發(fā)現(xiàn)小雙鏈RNA (dsRNA)，例如小干擾RNA (siRNA)和微RNA (miRNA)是稱為RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的觸發(fā)物。RNAi不變性導(dǎo)致基因沉默。然而在以下實施例部分詳細(xì)描述的情況中，寡核苷酸顯示增加沉默 調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸和其編碼的產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNA還可作為小活化RNA(saRNA)作用。不希望受理論束縛，通過靶向基因啟動子中的序列，saRNA將以稱為dsRNA-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化(RNAa)的現(xiàn)象誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在進(jìn)一步的實施方案中，本文鑒定的"靶區(qū)段"可用于篩選調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸表達(dá)的另外的化合物。〃調(diào)節(jié)劑〃是減少或增加編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的核酸分子表達(dá)的那些化合物，且包括與靶區(qū)段互補的至少5-核苷酸部分。篩選方法包括以下步驟將編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，并選擇減少或增加編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的核酸分子(例如SEQ ID N0:24至127)的表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑。顯示一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如，減少或增加)編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的核酸分子的表達(dá)后，隨后調(diào)節(jié)劑可用于沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸功能的進(jìn)一步研究性研究，或用作根據(jù)本發(fā)明的研究劑、診斷劑或治療劑。靶向天然反義序列調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)(例如登錄號 Μ_012238· 4、ΝΜ_001159589、ΝΜ_012237. 3、ΝΜ_012239、ΝΜ_012240、ΝΜ_012241、ΝΜ_016539、ΝΜ_016538、ΝΜ_001142498. I、ΝΜ_030593. 2、ΝΜ_001193286. 1，NR_034146. I、ΝΜ_001017524. 2、ΝΜ_031244. 2、ΝΜ_001193267. I、ΝΜ_001193285. I)。在實施方案中，靶是沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的反義多核苷酸。在實施方案中，反義寡核苷酸靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸(例如，登錄號 ΝΜ_012238· 4、ΝΜ_001159589, ΝΜ_012237. 3、ΝΜ_012239、ΝΜ_012240、ΝΜ_012241、ΝΜ_016539、ΝΜ_016538、ΝΜ_001142498. 1、ΝΜ_030593. 2、ΝΜ_001193286. I, NR_034146. I、ΝΜ_001017524. 2、匪_031244. 2、ΝΜ_001193267. I、ΝΜ_001193285. I)的有義和/或天然反義序列、變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子且靶包括反義和/或有義沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。本發(fā)明的靶區(qū)段還可與本發(fā)明的其各自的互補反義化合物組合以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。在本領(lǐng)域中，這種雙鏈寡核苷酸部分已顯示經(jīng)由反義機(jī)制調(diào)節(jié)靶表達(dá)和調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。而且，可對雙鏈部分進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，這種雙鏈部分已經(jīng)顯示通過雙鏈體的反義鏈與靶經(jīng)典雜交，從而觸發(fā)靶的酶促降解來抑制靶。在實施方案中，反義寡核苷酸靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸(例如，登錄號 ΝΜ_012238· 4、ΝΜ_001159589、ΝΜ_012237. 3、ΝΜ_012239、ΝΜ_012240、ΝΜ_012241、ΝΜ_016539、ΝΜ_016538、ΝΜ_001142498. I、ΝΜ_030593. 2、ΝΜ_001193286. I, NR_034146. I、ΝΜ_001017524. 2、ΝΜ_031244. 2、ΝΜ_001193267. I、ΝΜ_001193285. I)、變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不限于僅沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)，還延伸到沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)分子的同種型、受體、同系物和類似物的任一種。在另一個實施方案中，寡核苷酸靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的天然反義序列，例如，如SEQ ID NO: 9至23、141至143所列的多核苷酸，和任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段及其互補序列。反義寡核苷酸的實例列在SEQ ID N0:24至127。在一個實施方案中，寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)反義的核酸序列互補或結(jié)合，包括但不限于沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸相關(guān)的非編碼有義和/或反義序列，并調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)分子的表達(dá)和/或功能。在另一個實施方案中，寡核苷酸與如SEQ ID N0:9至23、141至143所列的沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)天然反義的核酸序列互補或結(jié)合，并調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)分子的表達(dá) 和/或功能。在另一個實施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NO: 24至127的至少5個連續(xù)核苷酸的序列，并調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶包括沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)，包括其家族成員、沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的變體；沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的突變體，包括SNP ;沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的非編碼序列；沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的等位基因；物種變體、片段和類似物。優(yōu)選地寡核苷酸是反義分子。在另一個實施方案中，靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、干擾 RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA);微干擾 RNA (miRNA);時序調(diào)節(jié)小 RNA (stRNA);或短發(fā)夾RNA(shRNA);小RNA誘導(dǎo)的基因活化(RNAa);或小活化RNA(saRNA)。在另一個實施方案中，靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸(例如SEQ ID N0:9至23、141至143)調(diào)節(jié)這些靶的表達(dá)或功能。在一個實施方案中，與對照相比表達(dá)或功能被上調(diào)。在另一個實施方案中，與對照相比表達(dá)或功能被下調(diào)。在另一個實施方案中，反義化合物包括如SEQ ID N0:24至127所列的序列。這些寡核苷酸可包括一種或多種修飾的核苷酸、更短或更長片段、修飾的鍵和類似物。在另一個實施方案中，SEQ ID NO:24至127包括一種或多種LNA核苷酸。期望靶核酸的調(diào)節(jié)可以本領(lǐng)域已知的多種方式進(jìn)行。例如，反義寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子(例如，核酶)是能夠催化多種反應(yīng)的一種或多種的核酸分子，包括以核苷酸堿基序列特異性方式重復(fù)地裂解其它單獨核酸分子的能力。這種酶促核酸分子可用于例如靶向幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄物。由于其序列特異性，反式裂解酶促核酸分子顯示用作人疾病的治療劑的希望?？稍O(shè)計酶促核酸分子以裂解細(xì)胞RNA背景中的特定RNA靶。這種裂解事件使得mRNA無功能并消除從該RNA的蛋白表達(dá)。以這種方式，可選擇性地抑制疾病狀態(tài)相關(guān)的蛋白的合成。通常，具有RNA裂解活性的酶促核酸通過首先結(jié)合靶RNA來作用。這種結(jié)合經(jīng)由被保持在鄰近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分的酶促核酸的靶結(jié)合部分來進(jìn)行。因此，酶促核酸首先識別靶RNA然后經(jīng)由互補堿基配對結(jié)合靶RNA，結(jié)合到正確位置時，酶促地作用以切割靶RNA。對這種靶RNA的關(guān)鍵裂解將破壞其指導(dǎo)編碼蛋白合成的能力。在酶促核酸已結(jié)合和裂解其RNA靶后，其從該RNA釋放以搜尋另一靶并可重復(fù)地結(jié)合和裂解新的靶。多種方法例如體外選擇(進(jìn)化)策略已經(jīng)用于進(jìn)化能夠催化多種反應(yīng)(例如磷酸二酯鍵合和酰胺鍵合的裂解和連接)的新核酸催化劑。催化活性最佳的核酶的開發(fā)將顯著有助于為了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的采用RNA-裂解核酶的任何策略。例如，錘頭狀核酶在飽和(IOmM)濃度的Mg2+輔因子存在下以約Imin-I的催化速率(kcat)作用。人工的〃RNA連接酶〃核酶已經(jīng)顯示以約IOOmin-I的速率催化相應(yīng)的自修飾反應(yīng)。此外，已知具有DNA制成的底物結(jié)合臂的某些修飾的錘頭狀核酶以接近IOOmin-I的多倍周轉(zhuǎn)率催化RNA裂解。最后，用某些核苷酸類似物代替錘頭的催化核心中的特定殘基獲得顯示催化速率改進(jìn)多達(dá)10倍的修飾的核酶。這些發(fā)現(xiàn)證明，核酶可促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)化，伴隨催化速率顯著大于大多數(shù)天然自裂解核酶體外展示的催化速率。那么可能可優(yōu)化某些自裂解核酶的結(jié)構(gòu)以獲得最大催化活性，或可能可制備對于RNA磷酸二酯裂解展示顯著更快速率的完全新的RNA基序。符合〃錘頭〃模型的RNA催化劑對RNA底物的分子間裂解首次在1987年顯示。回收RNA催化劑并與多種RNA分子反應(yīng)，證實其真正是催化性的。通過在催化性RNA中進(jìn)行適當(dāng)?shù)膲A基改變以保持與靶序列必需的堿基配對，基于〃錘頭〃基序設(shè)計的催化性RNA已用于裂解特定靶序列。這已經(jīng)允許使用催化性RNA來裂解特定靶序列并指示，按照"錘頭"模型設(shè)計的催化性RNA可能可體內(nèi)裂解特定底物RNA。
RNA干擾(RNAi)已經(jīng)變成在哺乳動物和哺乳動物細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的強有力工具。這一方法要求利用表達(dá)質(zhì)?；虿《竞捅患庸閟iRNA的小發(fā)夾RNA的編碼序列遞送作為RNA本身或作為DNA的小干擾RNA(siRNA)。這一系統(tǒng)使得能夠有效地運輸前體siRNA到細(xì)胞質(zhì)，在那里它們是活性的，并允許使用用于基因表達(dá)的受控型啟動子和組織特異性啟動子。在一個實施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物或其模擬物、嵌合體、類似物或同系物。這一術(shù)語包括包括天然存在的核苷酸、糖和共價核苷間(主鏈)鍵的寡核苷酸以及具有類似地起作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。因為期望的特性，例如對增加的細(xì)胞攝取、對靶核酸增加的親和力和在核酸酶存在下增加的穩(wěn)定性，這種修飾的或取代的寡核苷酸通常相比于天然形式是期望的。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或〃反義化合物〃包括反義寡核苷酸(例如，RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同系物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA和與靶核酸的至少一部分雜交并調(diào)節(jié)其功能的其它寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、DNA-樣、RNA-樣或其混合物，或可以是一種或多種這些的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部凸出或末端凸出、錯配或環(huán)。常規(guī)線性地制備反義化合物，但可被連接或以其它方式制備為環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如，兩條鏈雜交以形成完全或部分雙鏈的化合物，或具有足夠自互補性的單鏈以允許雜交和形成完全或部分雙鏈的化合物。兩條鏈可在內(nèi)部被連接，留下游離的3’或5’末端，或可被連接以形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含在5’或3’末端的突出，產(chǎn)生單鏈特征的延伸段。雙鏈化合物任選地可包括在末端的突出。進(jìn)一步的修飾可包括附加于末端之一、所選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一的綴合物基團(tuán)?？蛇x地，兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或接頭基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時，dsRNA可采取自互補發(fā)夾型分子的形式，其與自身對折以形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的。基因表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來實現(xiàn)。當(dāng)由兩條鏈或采取與自身對折以形成雙鏈體的自互補發(fā)夾型分子形式的單鏈形成時，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式喊基配對的互補RNA鏈。被引入系統(tǒng)中后，本發(fā)明的化合物可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實現(xiàn)靶核酸的裂解或其它修飾，或可經(jīng)由基于占位性的機(jī)制作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可描述為"DNA-樣〃(S卩，通常具有一個或多個2’ -脫氧糖，且通常具有T而不是U堿基)或〃RNA-樣〃(即，通常具有一個或多個2’ -羥基或2’ -修飾的糖，且通常具有U而不是T堿基)。核酸螺旋可采用多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常是A-和B-形式。通常認(rèn)為，具有B-形式-樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是"DNA-樣〃，且具有A-形式樣結(jié)構(gòu)的是"RNA-樣〃。在一些(嵌合)實施方案中，反義化合物可包含A-形式區(qū)域和B-形式區(qū)域兩者。根據(jù)本發(fā)明的反義化合物可包括長度為從約5至約80個核苷酸(即，從約5至約80個連接的核苷)的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包括從5至約80個核苷酸，且本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如dsRNA)包括長度為5至約80個核苷酸的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括長度為 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、2·8、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個核苷酸或其中的任何范圍的反義部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有長度為10至50個核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括具有長度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸或其中的任何范圍的反義部分的寡核苷酸。在一些實施方案中，寡核苷酸長度為15個核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有長度為12或13至30個核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括具有長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸或其中的任何范圍的反義部分的反義化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括變體，其中在化合物中一個或多個核苷酸位置存在不同堿基。例如，如果第一個核苷酸是腺嘌呤，可產(chǎn)生在這一位置包含胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可在反義或dsRNA化合物的任何位置進(jìn)行。隨后利用本文所述的方法測定這些化合物以確定它們抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實施方案中，反義化合物與靶之間的同源性、序列同一性或互補性是從約40%至約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約60%至約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約70%至約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是從約80%至約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性是約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸，例如SEQ ID NO:24至127所列的核酸分子，包括一種或多種取代或修飾。在一個實施方案中，核苷酸是用鎖核酸(LNA)取代的。在另一個實施方案中，寡核苷酸靶向與SIRT和如SEQ ID NO: I至23和133至143所列的序列相關(guān)的編碼和/或非編碼序列的有義和/或反義的核酸分子的一個或多個區(qū)域。寡核苷酸還靶向于SEQ IDNO: I至23和133至143的重疊區(qū)域。本發(fā)明某些寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本發(fā)明范疇中，〃嵌合寡核苷酸〃或〃嵌合體〃是包含兩個或更多個化學(xué)不同區(qū)域的寡核苷酸，每個區(qū)域由至少一個核苷酸組成。這些寡核苷酸通常包含賦予一種或多種有益特性(例如，增加的核酸酶耐受性、增加的攝取入細(xì)胞、增加的對靶的結(jié)合親和力)的修飾的核苷酸的至少一個區(qū)域和為能夠裂解RNA = DNA或RNA = RNA雜交物的酶的底物的區(qū)域。例如，RNA酶H是裂解RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞核酸內(nèi)切酶。因此，RNA酶H的活化導(dǎo)致RNA靶的裂解，從而大大增強基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)的效力。因此，與雜交于相同靶區(qū)域的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時以較短寡核苷酸通?？色@得可比較的結(jié)果。RNA靶的裂解可常規(guī)地通過凝膠電泳來檢測，如果需要，通過本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)來檢測。在一個實施方案中，嵌合寡核苷酸包括經(jīng)修飾以增加靶結(jié)合親和性的至少一個區(qū)域和通常作為RNA酶H底物作用的區(qū)域。寡核苷酸對其靶(在這一情形中是編碼ras的核酸)的親和性常規(guī)地通過測量寡核苷酸/靶配對的Tm來確定，Tm是寡核苷酸與靶解離的溫度；分光光度地檢測解離。Tm越高，寡核苷酸對靶的親和性越大。 本發(fā)明的嵌合反義化合物可形成為兩種或更多種寡核苷酸、如上所述的修飾的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)。這種化合物在本領(lǐng)域中也已稱為雜交物或間隙體(gapmer)。教導(dǎo)這種雜交物結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利 No. 5，013，830,5, 149，797,5, 220，007,5, 256，775,5, 366，878,5, 403，711,5, 491，133、5，565，350,5, 623，065,5, 652，355,5, 652，356 和 5，700，922，其每一個通過引用并入本文。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的寡核苷酸的區(qū)域包括在糖的2’位置修飾的至少一個核苷酸，最優(yōu)選地2’ -O烷基、2’ -O-烷基-O-烷基或2’ -氟代-修飾的核苷酸。在其它實施方案中，RNA修飾包括在RNA3’端的嘧啶、脫堿基殘基或反向堿基的核糖上的2’ -氟代、2’ -氨基和2’ O-甲基修飾。這種修飾常規(guī)地并入寡核苷酸，且這些寡核苷酸已經(jīng)顯示對給定靶具有比2’ -脫氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的靶結(jié)合親和性)。這種增加的親和性的作用是大大增強基因表達(dá)的RNAi寡核苷酸抑制。RNA酶H是裂解RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞核酸內(nèi)切酶；因此該酶的活化導(dǎo)致RNA靶的裂解，從而可大大增強RNAi抑制的效力。RNA靶的裂解可常規(guī)地通過凝膠電泳來證實。在另一個實施方案中，還修飾嵌合寡核苷酸以增強核酸酶的耐受性。細(xì)胞包含多種可降解核酸的核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。多種核苷酸和核苷修飾已經(jīng)顯示使得它們并入的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對核酸酶消化更耐受。核酸酶耐受性常規(guī)地通過如下測量培養(yǎng)寡核苷酸與細(xì)胞提取物或分離的核酸酶溶液，并隨著時間測量剩余的完整寡核苷酸的程度，通常通過凝膠電泳測量。經(jīng)修飾以增強其核酸酶耐受性的寡核苷酸比未修飾的寡核苷酸保持完整更長時間。多種寡核苷酸修飾已證實增強或賦予核酸酶耐受性。包含至少一種硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸目前是更優(yōu)選的。在一些情形中，增強靶結(jié)合親和性的寡核苷酸修飾也獨立地能夠增強核酸酶耐受性。一些期望的修飾可在 DeMesmaeker 等人(1995)Acc. Chem. Res. , 28:366-374 中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明預(yù)期的一些寡核苷酸的具體實例包括包括修飾的主鏈的那些，例如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲基酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵合或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵合。大多數(shù)是具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的那些，尤其是CH2—NH—0—CH2、CH、一N (CH3)—0—CH2 [稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI主鏈]、CH2--0—N(CH3)—CH2、CH2-N(CH3)—N(CH3)—CH2 和 0—N (CH3)—CH2—CH2 主鏈，其中天然磷酸二酯主鏈表示為O—P—O—CH。由De Mesmaeker等(1995)Acc. Chem.Res. 28:366-374公開的酰胺主鏈也是優(yōu)選的。還有具有嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和Weller,美國專利No. 5，034, 506)。在其它實施方案中，例如肽核酸(PNA)主鏈，寡核苷酸的磷酸二酯主鏈被聚酰胺主鏈代替，核苷酸被直接或間接地結(jié)合于聚酰胺主鏈的氮雜氮原子。寡核苷酸還可包括一種或多種取代的糖部分。寡核苷酸在2’位置包括以下之一 0H、SH、SCH3、F、0CN、0CH3 0CH3、0CH30(CH2)n CH3、0(CH2)n NH2 或 0(CH2)n CH3,其中η是I至約10 ；C1至ClO低級烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基；Cl ；Br ；CN ；CF3 ；0CF3 ;0—、S—或 N-烷基；0—、S—或N-烯基；S0CH3 ；S02 CH3 ；0N02 ；N02 ；N3 ；NH2 ;雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解基團(tuán)；報告基團(tuán)；嵌入劑；用于改善寡核苷酸藥代動力學(xué)特性的基團(tuán)；或用于改善寡核苷酸藥效學(xué)特性的基團(tuán)和具有類似特性的其它取代基。修飾包括2’ -甲氧基乙氧基[2’ -0-CH2 CH20CH3,還稱為’-O-(2_甲氧基乙基)]。其它修飾包括2’_甲氧基(2’-O—CH3)、2’-丙氧基(2’ -0CH2 CH2CH3)和2’ -氟代(2’ -F)。還可在寡核苷酸上的其它位置進(jìn)行類似修飾，尤其是3’末端核苷酸上糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物例如環(huán)丁基來代替戊呋喃糖基。 另外或可選地，寡核苷酸還可包括核堿基(本領(lǐng)域中通常簡稱為〃堿基〃)修飾或取代。本文所用的"未修飾"或"天然"核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核苷酸包括天然核酸中僅僅罕見或短暫出現(xiàn)的核苷酸，例如，次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、尤其是5-甲基胞嘧啶(也稱為5-甲基-2’脫氧胞嘧啶，本領(lǐng)域中通常稱為5-Me-C)、5_羥基甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基HMC以及合成的核苷酸，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2，6- 二氨基嘌呤?？砂ū绢I(lǐng)域中已知的〃通用〃堿基，例如肌苷。5-Me-C取代已顯示增加核酸雙鏈體的穩(wěn)定性0.6-1. 2°C，是目前優(yōu)選的堿基取代。(Sanghvi，Y.S·，參見 Crooke, S. Τ·和 Lebleu, B.編輯，Antisense Research and Applications, CRCPress, BocaRaton, 1993,第 276-278 頁)本發(fā)明寡核苷酸的另一修飾包括與該寡核苷酸化學(xué)連接增強寡核苷酸的活性或細(xì)胞攝取的一個或多個部分或綴合物。這種部分包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽固醇基部分、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代膽固醇、脂肪族鏈如十二烷二醇或i^一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基_rac-甘油或1，2- 二 -O-十六烷基_rac_甘油基-3-H-磷酸三乙基銨、聚胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸。包括親脂部分的寡核苷酸和制備這種寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，美國專利No. 5，138，045,5, 218，105和5，459，255。給定的寡核苷酸中的所有位置不必一致地被修飾，事實上多于一個上述修飾可并入單個寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸中的單個核苷中。本發(fā)明還包括為上文定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸分子綴合于另一部分，該另一部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或聚烴化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這些分子可在糖、堿基或磷酸酯基團(tuán)上的多個位置連接于一種或多種任何核苷酸(包括核酸分子)。根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸可方便和常規(guī)地通過公知的固相合成技術(shù)制備。用于這種合成的設(shè)備由包括Applied Biosystems的多個供應(yīng)商出售。還可采用用于這種合成的任何其它手段；寡核苷酸的實際合成完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的才能范圍內(nèi)。還公知的是使用類似技術(shù)來制備其它寡核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。還公知的是使用類似技術(shù)和市售可獲得的修飾的亞酰胺化物(amidite)和可控孔度玻璃(CPG)產(chǎn)物例如生物素、突光素、B丫唳或補骨脂素-修飾的亞酰胺化物和/或CPG(可從Glen Research, SterlingVA獲得)來合成熒光標(biāo)記的、生物素化的或其它修飾的寡核苷酸，例如膽固醇-修飾的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，使用修飾例如使用LNA單體來增強包括本發(fā)明化學(xué)性質(zhì)例如Μ0Ε、ANA、FANA、PS等的寡核苷酸的效力、特異性和作用持續(xù)時間并增寬所述寡核苷酸施用途徑。
這可通過以LNA單體取代本發(fā)明寡核苷酸中的一些單體來實現(xiàn)。LNA修飾的寡核苷酸可具有與親本化合物相似的大小或可更大或優(yōu)選地更小。這種LNA-修飾的寡核苷酸包含少于約70%、更優(yōu)選地少于約60%、最優(yōu)選地少于約50%的LNA單體，且其大小為約5至25個核苷酸，更優(yōu)選地約12至20個核苷酸。修飾的寡核苷酸主鏈包括但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、膦酸甲基酯和其它膦酸烷基酯(包括膦酸3’亞烷基酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰磷酸烷基酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3’ -5’鍵合的硼磷酸酯、這些的2’ -5’連接的類似物和具有倒轉(zhuǎn)極性的那些，其中相鄰的核苷單元對是3’ -5’至5’ -3’或2’-5’至5’-2’連接的。還包括多種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)以上含磷鍵合的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 3，687，808,4, 469，863,4, 476，301,5, 023，243,5, 177，196,5, 188，897,5, 264，423、5，276，019、5，278，302、5，286，717、5，321，131、5，399，676、5，405, 939、5，453，496、5，455，233,5, 466，677,5, 476，925,5, 519，126,5, 536，821,5, 541，306,5, 550, 111、5，563，253,5, 571，799,5, 587，361 和 5，625，050，其每一個通過引用并入本文。其中不包含磷原子的修飾的寡核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合或者一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合形成的主鏈。這些包括具有嗎啉代鍵合(部分地從核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰基(formacetyl)和硫代甲?；麈湥粊喖谆柞；土虼柞；麈?；含鏈烯的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和磺胺主鏈；酰胺主鏈；和具有混合的N、O、S和CH2組成部分的其它主鏈。教導(dǎo)以上寡核苷的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 5，034，506,5, 166，315,5, 185，444,5, 214，134,5, 216，141,5, 235，033,5, 264，562、5，264，564,5,405，938,5,434，257,5, 466，677,5, 470，967,5, 489，677,5, 541，307、5，561，225,5, 596，086,5, 602, 240,5, 610, 289,5, 602, 240,5, 608, 046,5, 610, 289、5，618，704,5, 623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439，其每一個通過引用并入本文。在其它寡核苷酸模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵合兩者即主鏈被新的基團(tuán)代替。堿基單元被保留用于與適當(dāng)?shù)暮怂岚谢衔镫s交。一種這樣的寡聚化合物，即已顯示具有極佳的雜交特性的寡核苷酸模擬物稱為肽核酸(PM)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-主鏈被包含酰胺的主鏈，特別是氨基乙基甘氨酸主鏈代替。核堿基被保留，并直接或間接與主鏈的酰胺部分的氮雜氮原子結(jié)合。教導(dǎo)PNA化合物的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 5，539，082,5, 714，331和5，719，262，其每一個通過引用并入本文。PNA 化合物的進(jìn)一步教導(dǎo)可見于 Nielsen 等(1991) Science 254，1497-1500。在本發(fā)明的另一個實施方案中，具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的寡核苷，尤其是-CH2-NH-0-CH2、稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI主鏈的-CH2_N(CH3)-0-CH2-、-CH2-0-N (CH3) -CH2、_CH2N (CH3) -N (CH3) CH2 和-O-N (CH3) -CH2-CH2，其中天然磷酸二酯主鏈表示為以上引用的美國專利No. 5，489，677的-0-P-0-CH2-和以上引用的美國專利No. 5，602, 240的酰胺主鏈。還有具有以上引用的美國專利No. 5，034, 506的嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾的寡核苷酸還可包含一種或多種取代的糖部分。寡核苷酸在2’位置包括以下之一 0H ；F ;0_、S-或N-烷基；0_、S-或N-烯基；0_、S-或N-炔基；或O烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C至CO烷基或C2至CO烯基和炔基。尤其是O (CH2) n 0mCH3、O (CH2) η、0CH3、O (CH2) ηΝΗ2、O (CH2) nCH3、O (CH2) η0ΝΗ2 和 O (CH2n0N (CH2)nCH3)2，其中n和m可以為I至約10。其它寡核苷酸包括在2’位置包括以下之一C至CO低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基團(tuán)、報告基團(tuán)、嵌入劑、用于改善寡核苷酸藥代動力學(xué)特性的基團(tuán)或用于改善寡核苷酸藥效學(xué)特性的基團(tuán)和具有類似特性的其它取代基。修飾包括2’ -甲氧基乙氧基(2’ -0-CH2CH20CH3，還稱為2’ -0-(2-甲氧基乙基)或2’ -Μ0Ε)即，烷氧基烷氧基基團(tuán)。另外修飾包括如在本文以下實施例中描述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即0(CH2)20N(CH3)2基團(tuán)，還稱為2’_DMA0E，和2’- 二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域還稱為2’ _0_ _■甲基氣基乙氧基乙基或2’ _DMAE0E)，即，2’ _0_CH2_0_CH2_N (CH2) 2。其它修飾包括2’ -甲氧基(2’ -O—CH3)、2’ -氨基丙氧基(2’ -0CH2CH2CH2NH2)和2’_氟代(2’-F)。還可在寡核苷酸上的其它位置進(jìn)行類似修飾，尤其是3’末端核苷酸或2’_5’連接的寡核苷酸上糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分來代替戊呋喃糖基糖。教導(dǎo)這種修飾的糖結(jié)構(gòu)的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利 No. 4，981，957,5, 118，800,5, 319，080,5, 359，044,5, 393，878、5，446，137,5, 466，786,5, 514，785,5, 519，134,5, 567，811,5, 576，427,5, 591，722、5，597，909,5, 610，300,5, 627，053,5, 639，873,5, 646，265,5, 658，873,5, 670，633 和5，700, 920，其每一個通過引用并入本文。寡核苷酸還可包括核堿基(本領(lǐng)域中通常簡稱為"堿基")修飾或取代。本文所用的"未修飾"或"天然"核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)、和嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾的核苷酸包括其它合成的和天然核苷酸例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假-尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫氫基、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤和3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。此夕卜，核苷酸包括美國專利No. 3，687，808中公開的那些、’ TheConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering’,第 858-859 頁,Kroschwitz, J.I.編著.John Wiley & Sons, 1990 中公開的那些、Englisch 等，’AngewandleChemie, International Edition’, 1991, 30,第 613 頁中公開的那些以及 Sanghvi, Y.S.,第 15 章，，Antisense Researchand Applications',第 289-302 頁，Crooke, S. T.和Lebleu, B.編著，CRCPress, 1993中公開的那些。這些核苷酸的某些尤其有用于增加本發(fā)明寡聚化合物的結(jié)合親和性。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶、N-2、N-6和0-6取代
的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯不增加核酸雙鏈體穩(wěn)定性O(shè). 6-1. 2°C (Sanghvi, Y. S. , Crooke, S. T.和Lebleu, B.編著，’AntisenseResearch and Applications’，CRC Press, Boca Raton, 1993，pp. 276-278),并且目前是堿基取代，甚至更尤其是當(dāng)與2’-O甲氧基乙基糖修飾組合時。教導(dǎo)上述修飾的核苷酸以及其它修飾的核苷酸的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利 No. 3，687，808 以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273、5，367，066、5，432，272、5，457，187、5，459，255、5，484，908、5，502，177、5，525，711、5，552，540,5, 587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941，其每一個通過引用并入本文。本發(fā)明寡核苷酸的另一修飾包括將寡核苷酸化學(xué)連接于增強寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的一個或多個部分或綴合物。這種部分包括但不限于，脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫膽固醇、脂肪族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基-rac-甘油或1，2- 二 -O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚?；糠?、或十八胺或己基氨基-羰基_t羥膽固醇部分。教導(dǎo)這種寡核苷酸綴合物的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、5，578，717,5,580,731,5,580,731,5,591，584,5, 109, 124,5, 118，802,5, 138，045、5，414，077,5, 486，603,5, 512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、4，667，025,4, 762，779,4, 789，737,4, 824，941,4, 835，263,4, 876，335,4, 904，582、4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481,5, 587，371,5, 595，726、5，597，696、5，599，923,5, 599，928和5，688，941，其每一個通過引用并入本文。藥物發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物還可應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)和靶確認(rèn)的領(lǐng)域。本發(fā)明涵蓋本文鑒定的化合物和靶區(qū)段在藥物發(fā)現(xiàn)嘗試中使用以闡明沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸與疾病狀態(tài)、表型或病狀之間存在的關(guān)聯(lián)。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸，包括將樣品、組織、細(xì)胞或生物體與本發(fā)明化合物接觸，在處理后某一時間測量沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)的表型或化學(xué)端點，和任選地將測量值與未處理樣品或用本發(fā)明另外化合物處理的樣品比較。這些方法還可與其它試驗平行或組合進(jìn)行，以為靶確認(rèn)方法確定未知基因的功能，或確定特定基因產(chǎn)物作為治療或預(yù)防特定疾病、病狀或表型的靶的有效性。評價基因表達(dá)的上調(diào)或抑制外源核酸向宿主細(xì)胞或生物體中的轉(zhuǎn)移可通過直接檢測細(xì)胞或生物體中該核酸的存在來評價。這種檢測可通過本領(lǐng)域公知的多種方法來實現(xiàn)。例如，外源核酸的存在可通過DNA印跡或利用特異性地擴(kuò)增與該核酸相關(guān)的核苷酸序列的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來檢測。外源核酸的表達(dá)還可利用包括基因表達(dá)分析的常規(guī)方法測量。例如，從外源核酸產(chǎn)生的mRNA可利用RNA印跡(Northern blot)和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)來檢測和定量。 RNA從外源核酸的表達(dá)還可通過測量酶促活性或報告蛋白活性來檢測。例如，反義調(diào)節(jié)活性可間接地作為靶核酸表達(dá)的減少或增加來測量，靶核酸表達(dá)的減少或增加作為外源核酸在產(chǎn)生效應(yīng)RNA的指示。基于序列保守性，可設(shè)計引物并用于擴(kuò)增靶基因的編碼區(qū)域。最初，來自每個基因的最高度表達(dá)的編碼區(qū)域可用于構(gòu)建模式對照基因，盡管可使用任何編碼或非編碼區(qū)域。通過在報告基因編碼區(qū)域和其poly (A)信號之間插入每個編碼區(qū)域來組裝每個對照基因。這些質(zhì)粒將產(chǎn)生報告基因在基因的上游部分且可能的RNAi靶在3'非編碼區(qū)域的mRNA。單獨反義寡核苷酸的效果將通過報告基因的調(diào)節(jié)來測定?？捎糜诒景l(fā)明方法的報告基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、熒光素酶(Luc)、胭脂堿合酶(NOS)、章魚堿合酶(OCS)及其衍生物。賦予對氨芐西林、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素和四環(huán)素抗性的多種選擇標(biāo)記是可得的。確定報告基因的調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，熒光方法(例如，熒光光譜學(xué)、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、熒光顯微鏡檢術(shù))、抗生素抗性確定。SIRTU SIRT3和SIRT6蛋白和mRNA表達(dá)可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和在本文別處描述的方法來測定。例如，免疫測定例如ELISA可用于測量蛋白水平。ELISA的沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)抗體是市售可獲得的，如，得自R&D Systems (Minneapolis, MN), Abeam,Cambridge，MA0在實施方案中，利用本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品(例如，體內(nèi)或體外的細(xì)胞或組織)中的SIRT1、SIRT3和SIRT6表達(dá)(例如，mRNA或蛋白)通過與對照樣品中的沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)表達(dá)比較來評價。例如，蛋白或核酸的表達(dá)可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法與模擬處理或未處理樣品中的比較?？蛇x地，取決于期望的信息，可與以對照反義寡核苷酸(例如，具有改變的或不同序列的反義寡核苷酸)處理的樣品進(jìn)行比較。在另一實施方案中，處理樣品與未處理樣品中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)蛋白或核酸的表達(dá)差異可與處理樣品與未處理樣品中不同核酸(包括研究者認(rèn)為適當(dāng)?shù)娜魏螛?biāo)準(zhǔn)，例如，看家基因)的表達(dá)差異比較。觀察到的差異可如期望地表示，例如，以比率或分?jǐn)?shù)的形式，用于與對照比較。在實施方案中，以本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)mRNA或蛋白的水平相對于未處理樣品或以對照核酸處理的樣品增加或減少約I. 25倍至約10倍或更多。在實施方案中，沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)mRNA或蛋白的水平增加或減少至少約I. 25倍、至少約
I.3倍、至少約I. 4倍、至少約I. 5倍、至少約I. 6倍、至少約I. 7倍、至少約I. 8倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約3. 5倍、至少約4倍、至少約4. 5倍、至少約5倍、至少約5. 5倍、至少約6倍、至少約6. 5倍、至少約7倍、至少約7. 5倍、至少約8倍、至少約8. 5倍、至少約9倍、至少約9. 5倍、或至少約10倍或更多。試劑盒、研究試劑、診斷和治療本發(fā)明的化合物可用于診斷、治療和預(yù)防，及作為研究試劑和試劑盒的成分。而 且，能夠以強烈特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸通常被本領(lǐng)域技術(shù)人員用來闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑的不同成員的功能。對于在試劑盒和診斷和不同生物系統(tǒng)中使用，本發(fā)明的化合物，單獨地或與其它化合物或治療組合地用作差異和/或組合分析中的工具來闡明細(xì)胞和組織中表達(dá)的基因的一部分或完全互補序列的表達(dá)模式。本文所用的術(shù)語〃生物系統(tǒng)〃或〃系統(tǒng)〃定義為表達(dá)或使成為感受態(tài)以表達(dá)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)基因產(chǎn)物的任何生物體、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織。這些包括但不限于，人、轉(zhuǎn)基因動物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植物及其組合。作為一個非限制性實例，將以一種或多種反義化合物處理的細(xì)胞或組織中的表達(dá)模式與未被反義化合物處理的對照細(xì)胞或組織比較，并按照其屬于所檢查的基因的例如疾病關(guān)聯(lián)、信號傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能分析所產(chǎn)生的模式的基因表達(dá)差異水平。這些分析可對刺激或未刺激的細(xì)胞進(jìn)行，并在影響表達(dá)模式的其它化合物存在或不存在下。本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析方法的實例包括DNA陣列或微陣列、SAGE(基因表達(dá)系列分析)、READS(消化的cDNA的限制性酶擴(kuò)增)、T0GA(總基因表達(dá)分析)、蛋白陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)、表達(dá)的序列標(biāo)簽(EST)測序、消減RNA指紋技術(shù)(SuRF)、消減克隆、差異展示(DD)、比較基因組雜交、FISH (熒光原位雜交)技術(shù)和質(zhì)譜方法。本發(fā)明的化合物可用于研究和診斷，因為這些化合物雜交于編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的核酸。例如，在本文公開的這種條件下以這種效力雜交的為有效的沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸，在有利基因擴(kuò)增或檢測的條件下分別是有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要特異性檢測編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的核酸分子的方法和可用于擴(kuò)增用于檢測或用于進(jìn)一步研究沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的所述核酸分子。本發(fā)明的反義寡核苷酸，尤其是引物和探針與編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的核酸的雜交可通過本領(lǐng)域已知的手段檢測。這種手段可包括將酶綴合于寡核苷酸、放射性標(biāo)記寡核苷酸或任何其它適當(dāng)?shù)臋z測手段。還可制備利用這種檢測手段來檢測樣品中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)水平的試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員還利用反義的特異性和靈敏性用于治療用途。反義化合物已經(jīng)在動物(包括人)的疾病狀態(tài)的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已經(jīng)安全且有效地施用于人，目前正在進(jìn)行許多臨床試驗。因此已經(jīng)確定，反義化合物可以是有用的治療形態(tài)，可被配置以用于治療細(xì)胞、組織和動物(尤其是人)的治療方案。對于治療，通過施用根據(jù)本 發(fā)明的反義化合物來治療懷疑患有可通過調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的表達(dá)來治療的疾病或病癥的動物，優(yōu)選地人。例如，在一個非限制性實施方案中，方法包括向需要治療的動物施用治療有效量的沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)調(diào)節(jié)劑的步驟。本發(fā)明的沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)調(diào)節(jié)劑有效地調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的活性或調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)蛋白的表達(dá)。在一個實施方案中，與對照相比，動物中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的活性或表達(dá)被抑制約10%。優(yōu)選地，動物中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的活性或表達(dá)被抑制約30%。更優(yōu)選地，動物中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的活性或表達(dá)被抑制50%或更多。因此，與對照相比，寡聚化合物調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)mRNA的表達(dá)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一個實施方案中，與對照相比，動物中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的活性或表達(dá)增加約10%。優(yōu)選地，動物中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的活性或表達(dá)增加約30%。更優(yōu)選地，動物中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的活性或表達(dá)增加50%或更多。因此，與對照相比，寡聚化合物調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT) mRNA的表達(dá)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或
100% ο在實施方案中，通過測量生物樣品中的沉默調(diào)節(jié)蛋白mRNA、反義RNA、蛋白質(zhì)、沉默調(diào)節(jié)蛋白生物標(biāo)記物或其組合的水平觀察到沉默調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)。沉默調(diào)節(jié)蛋白生物標(biāo)記物包括例如MCP-I、BMP受體1A、Smpdl3a、CD14、ApoE, FAS、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、FABPl、?；o酶A硫酯酶I、?；o酶A硫酯酶2、水通道蛋白4、Rrad, CXCL9、CCL8、Ppplr3g、ApoA-I、ApoA-II和ΑροΒ。沉默調(diào)節(jié)蛋白的生物標(biāo)記物和其在監(jiān)控沉默調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)中的用途已描述于例如美國專利申請公布 No. 2010/0215632，“Biomarkers of Sirtuin Activity andMethods ofUse Thereof ”中，其通過引用整體并入本文。沉默調(diào)節(jié)蛋白活性的測定包括乙?；D(zhuǎn)移酶/脫乙酰化酶活性的測定。此類測定已描述于文獻(xiàn)例如美國專利申請公布No. 2009/0221020,“Mass Spectrometry Assays forAcetyItransferase/DeacetyIase Activity”中，其通過引用整體并入本文。設(shè)想本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的沉默調(diào)節(jié)蛋白活性的任何測定與本發(fā)明的方法結(jié)合，用于測量沉默調(diào)節(jié)蛋白活性。在某些實施方案中，通過與對照例如未處理的或模擬物處理的樣品相比，增加(上調(diào))或減少(下調(diào))沉默調(diào)節(jié)蛋白mRNA拷貝數(shù)、mRNA濃度或生物標(biāo)記物mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)或活性至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約125%、至少約150%、至少約200%、至少約250%、至少約300%、至少約3500%、至少約400%、至少約450%、或至少約500%、至少約600%、至少約700%、至少約800%、至少約900%、或至少約1000%，而鑒定沉默調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。在實施方案中，沉默調(diào)節(jié)蛋白mRNA拷貝數(shù)、mRNA濃度或生物標(biāo)記物mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)或活性增加或減少約10%至約500%。在實施方案中，沉默調(diào)節(jié)蛋白mRNA拷貝數(shù)、mRNA濃度或生物標(biāo)記物mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)或活性增加或減少約10%至約50%、約10%至約100%、約10%至約150%、約10%至約200%、約10%至約250%、約10%至約300%、約10%至約350%、約10%至約400%、約10%至約450%、約10%至約500%、約10%至約600%、約10%至約700%、約10%至約800%、約10%至約900%、約10%至約1000%、約50%至約100%、約50%至約150%、約50%至約200%、約50%至約250%、約50%至約300%、約50%至約350%、約50%至約400%、約50%至約450%、約50%至約500%、約50%至約600%、約50%至約700%、約50%至約800%、約50%至約900%、約50%至約1000%、約100%至約150%、約100%至約200%、約100%至約250%、約100%至約300%、約100%至約350%、約100%至約400%、約 100% 至約 450%、約 100% 至約 500%、約 100% 至約 600%、約 100% 至約 700%、約 100%至約800%、約100%至約900%、約100%至約1000%、約150%至約200%、約150%至約250%、約150%至約300%、約150%至約350%、約150%至約400%、約150%至約450%、約150%至約500%、約 150% 至約 600%、約 150% 至約 700%、約 150% 至約 800%、約 150% 至約 900%、約 150%至約1000%、約200%至約250%、約200%至約300%、約200%至約350%、約200%至約400%、約200%至約450%、約200%至約500%、約200%至約600%、約200%至約700%、約200%至約800%、約 200% 至約 900%、或約 200% 至約 1000%。
例如，可測量動物的血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其它體液、組織或器官中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)表達(dá)的減少。優(yōu)選地，待分析的所述體液、組織或器官中包含的細(xì)胞包含編碼沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)肽和/或沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)蛋白本身的核酸分子。本發(fā)明的化合物可用于藥物組合物，通過向適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的稀釋劑或載體加入有效量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明的化合物和方法的用途還可以是預(yù)防上有用的。綴合物本發(fā)明寡核苷酸的另一修飾包括將該寡核苷酸化學(xué)連接至增強寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的一個或多個部分或綴合物。這些部分或綴合物可包括共價結(jié)合官能團(tuán)例如伯羥基或仲羥基基團(tuán)的綴合物基團(tuán)。本發(fā)明的綴合物基團(tuán)包括嵌入劑、報告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強寡聚物藥代動力學(xué)特性的基團(tuán)、增強寡聚物藥效學(xué)特性的基團(tuán)。典型綴合物基團(tuán)包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。在本發(fā)明范疇中，增強藥效學(xué)特性的基團(tuán)包括改進(jìn)攝取、增強對降解的耐受性和/或加強與靶核酸序列特異性雜交的基團(tuán)。在本發(fā)明范疇中，增強藥代動力學(xué)特性的基團(tuán)包括改進(jìn)本發(fā)明化合物的攝取、分布、代謝或排泄的基團(tuán)。代表性綴合物基團(tuán)公開在1992年10月23日提交的國際專利申請NO.PCT/US92/09196和美國專利No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。綴合物部分包括但不限于，脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醇、硫膽固醇、脂肪族鏈例如十二烷二醇或i^一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基-rac-甘油或1，2- 二 -O-十六烷基-rac-甘油-3-H膦酸三乙基銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚?；糠只蚴税坊蚣夯被?羰基-羥膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸還可綴合于活性藥物物質(zhì)，例如，阿斯匹林、華法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)_(+)_普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟滅酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜環(huán)庚三烯、吲哚美辛、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺藥物、抗糖尿病藥、抗菌藥或抗生素。教導(dǎo)這種寡核苷酸綴合物的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利No. 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、5，578，717、5，580, 731、5，580, 731,5, 591，584、5，109, 124、5，118，802、5，138，045、5，414，077,5,486，603,5,512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、4，667，025,4, 762，779,4, 789，737,4, 824，941,4, 835，263,4, 876，335,4, 904，582、4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5,254，469,5,258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、5，371，241,5, 391，723,5, 416，203,5, 451，463,5, 510，475,5, 512，667,5, 514，785、5，565，552,5, 567，810,5, 574，142,5, 585，481,5, 587，371,5, 595，726,5, 597，696、5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941。制劑為了輔助攝取、分布和/或吸收，本發(fā)明的化合物還可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、包封、綴合或以其它方式關(guān)聯(lián)，例如脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服、直腸、局部或其它制劑。教導(dǎo)這種攝取、分布和/或吸收輔助制劑的制備的代表性美國專利包括但不限于，美國專利 No. 5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127,5, 521，291、·5，543，165、5，547，932、5，583，020、5，591, 721,4, 426，330,4, 534，899、5，013，556、5，108，921、5，213，804、5，227，170、5，264，221,5, 356，633、5，395，619、5，416，016、5，417，978,5,462，854,5,469，854,5,512，295,5, 527，528,5, 534，259,5, 543，152、5，556，948,5, 580，575和5，595，756，其每一個通過引用并入本文。盡管反義寡核苷酸不必以載體的背景施用以便調(diào)節(jié)靶表達(dá)和/或功能，但是本發(fā)明的實施方案涉及用于表達(dá)反義寡核苷酸的表達(dá)載體構(gòu)建體，包括啟動子、雜合體啟動子基因序列，并具備強的組成型啟動子活性或在期望情形中可被誘導(dǎo)的啟動子活性。在實施方案中，發(fā)明實踐包括以適當(dāng)?shù)暮怂徇f送系統(tǒng)施用至少一種上述反義寡核苷酸。在一個實施方案中，該系統(tǒng)包括可操作地連接于多核苷酸的非病毒載體。這種非病毒載體的實例包括單獨寡核苷酸(例如，SEQ ID NO: 24至127的任何一種或多種)或寡核苷酸與適當(dāng)?shù)牡鞍?、多糖或脂質(zhì)制劑的組合。另外適當(dāng)?shù)暮怂徇f送系統(tǒng)包括病毒載體，通常序列來自以下的至少一種腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、輔助病毒依賴型腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或日本血凝病毒-脂質(zhì)體(HVJ)復(fù)合體。優(yōu)選地，病毒載體包括可操作地連接于多核苷酸的強的真核啟動子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子。另外優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼氏鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種基于HIV的病毒載體包括至少兩種載體,其中g(shù)ag和pol基因來自HIV基因組且env基因來自另一病毒。DNA病毒載體是優(yōu)選的。這些載體包括痘病毒載體例如正痘病毒或禽痘病毒載體、皰疹病毒載體例如I型單純皰疹病毒(HSV)載體、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。本發(fā)明的反義化合物涵蓋任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯或這種酯的鹽、或當(dāng)施用于動物(包括人)時能夠提供(直接或間接)生物活性代謝物的任何其它化合物或其殘留物。術(shù)語〃藥學(xué)上可接受的鹽〃是指本發(fā)明化合物的生理上和藥學(xué)上可接受的鹽即，保留親本化合物的期望生物活性且不對其賦予不期望的毒物學(xué)作用的鹽。對于寡核苷酸，藥學(xué)上可接受的鹽及其用途的實例進(jìn)一步描述于美國專利No. 6，287，860，其通過引用并入本文。
本發(fā)明還包括包含本發(fā)明反義化合物的藥物組合物和制劑。取決于期望局部還是系統(tǒng)治療和待治療的區(qū)域，本發(fā)明的藥物組合物可以多種方式施用。施用可以是局部的(包括眼睛和向粘膜，包括陰道和直腸遞送)、肺部，例如通過吸入或噴入粉末或氣霧劑，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和經(jīng)皮)、口服或腸胃外。腸胃外施用包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)的施用。對于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的組織，施用可通過例如注射或輸注到腦脊液中來進(jìn)行。反義RNA向腦脊液的施用描述于例如美國專利申請公布No. 2007/0117772 “Methodsfor slowing familial ALS diseaseprogression” 中，通過引用整體并入本文。當(dāng)預(yù)期本發(fā)明的反義寡核苷酸被施用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞時，可以能夠促進(jìn)本發(fā)明反義寡核苷酸跨越血腦屏障的滲透的一種或多種試劑施用。注射可在例如內(nèi)嗅皮質(zhì)或海馬中進(jìn)行。通過向肌肉組織中的運動神經(jīng)元施用腺病毒載體來遞送神經(jīng)營養(yǎng)因子描述于例如美國專利 No. 6, 632, 427 ^Adenoviral-vector-mediated gene transfer intomedullary motor neurons”中，其通過引用并入本文。向腦例如紋狀體、丘腦、海馬或黑質(zhì)直接遞送載體是本領(lǐng)域已知的，描述于例如美國專利No. 6，756，523 “Adenovirusvectors for the transfer of foreign genesinto cells of the central nervoussystem particularly in brain”中，其通過引用并入本文。施用可以是快速的,如通過注射，或經(jīng)一段時間進(jìn)行，如通過緩慢輸注或施用緩釋制劑。本發(fā)明反義寡核苷酸可還連接或綴合于提供期望的藥物或藥效學(xué)特性的試劑。例如，反義寡核苷酸可偶聯(lián)于本領(lǐng)域已知的促進(jìn)跨血腦屏障滲透或運輸?shù)娜魏挝镔|(zhì)，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體，并通過靜脈內(nèi)注射施用。反義化合物可連接于病毒載體，例如，使得反義化合物更有效和/或增加反義化合物跨血腦屏障的運輸?shù)牟《据d體。滲透血腦屏障破壞還可通過例如輸注以下物質(zhì)來實現(xiàn)糖包括但不限于，赤蘚糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(_)阿拉伯糖、纖維二糖、D⑴麥芽糖、D⑴棉子糖、L(+)鼠李糖、D(+)蜜二糖、D(-)核糖、側(cè)金盞花醇、D (+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)巖藻糖、L(-)巖藻糖、D(-)來蘇糖、L(+)來蘇糖和L(-)來蘇糖，或氨基酸包括但不限于，谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和?；撬?。用于增強血腦屏障滲透的方法和材料描述于，例如，美國專利 No. 4，866，042 “Methodfor the delivery of genetic material acrossthe blood brain barier”,美國專利 No. 6，294，520“Material for passage through theblood-brain barrier，，和美國專利 No. 6，936，589 “Parenteral delivery systems，，，其每一個通過弓I用整體并入本文。為了幫助攝取、分布和/或吸收，本發(fā)明反義化合物可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物混合物，例如，脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服、直腸、局部或其它制劑混合、包封、綴合或以其它方式關(guān)聯(lián)。例如，陽離子脂質(zhì)可被包括在制劑中以促進(jìn)寡核苷酸攝取。顯示促進(jìn)攝取的一種這樣的組合物是LIP0FECTIN (可從GIBC0-BRL，Bethesda, MD獲得)。認(rèn)為具有至少一種2’-O-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸尤其可用于口服施用。用于局部施用的藥物組合物和制劑可包括經(jīng)皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧齊U、液體和粉末。常規(guī)藥物載體、水性、粉狀或油性基質(zhì)、增稠劑和類似物可以是必需或期望的。涂覆的避孕套、手套和類似物也是可用的。可方便地以單位劑型呈現(xiàn)的本發(fā)明的藥物制劑可按照制藥工業(yè)中公知的常規(guī)技術(shù)制備。這種技術(shù)包括將活性成分與藥物載體或賦形劑關(guān)聯(lián)的步驟。通常，制劑通過以下制備均勻且密切地將活性成分與液態(tài)載體或磨碎的固態(tài)載體或兩者關(guān)聯(lián)，然后，如果需要，將產(chǎn)品成型。本發(fā)明的組合物可配制為任何的許多可能劑型，例如但不限于，片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿劑、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可配制為在含水、不含水或混合介質(zhì)中的懸浮劑。含水懸浮劑可進(jìn)一步包含增加懸浮劑粘度的物質(zhì)，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。懸浮劑還可包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于，溶液、乳液、泡沫劑和含脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可包括一種或多種滲透促進(jìn)劑、載體、賦形劑或其它活性或無活性配料。
乳劑通常是一種液體以直徑通常超過O. I μ m的液滴形式分散在另一液體中的異質(zhì)系統(tǒng)。除了分散相和可作為以水相、油相或本身作為單獨相的溶液存在的活性藥物以外，乳劑可包含另外的成分。包括微乳劑作為本發(fā)明的實施方案。乳劑及其用途是本領(lǐng)域公知的，進(jìn)一步描述于美國專利No. 6，287，860。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明所用的術(shù)語〃脂質(zhì)體〃是指包括以一個或多個球形雙層排列的兩親性脂質(zhì)的囊泡。脂質(zhì)體是單層或多層囊泡，具有從親脂性材料形成的膜和包含待遞送的組合物的含水內(nèi)部。陽離子脂質(zhì)體是帶正電荷的脂質(zhì)體，認(rèn)為其與帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定復(fù)合體。認(rèn)為pH-敏感或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體捕獲DNA而不是與其復(fù)合。陽離子和非陽離子脂質(zhì)體兩者已經(jīng)用于向細(xì)胞遞送DNA。脂質(zhì)體還包括〃空間上穩(wěn)定的〃脂質(zhì)體，本文所用的該術(shù)語是指包括一種或多種特化的脂質(zhì)的脂質(zhì)體。當(dāng)被并入脂質(zhì)體時，這些特化的脂質(zhì)產(chǎn)生相對于松散這種特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體具有增強的循環(huán)生命周期的脂質(zhì)體?？臻g上穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實例是其中脂質(zhì)體的形成囊泡的脂質(zhì)部分的部分包括一種或多種糖脂或以一種或多種親水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)部分衍生化的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體及其用途進(jìn)一步描述于美國專利No. 6，287，860中。本發(fā)明的藥物制劑和組合物還可包括表面活性劑。表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中的使用是本領(lǐng)域公知的。表面活性劑及其用途進(jìn)一步描述于美國專利No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。在一個實施方案中，本發(fā)明采用多種滲透促進(jìn)劑來實現(xiàn)核酸尤其是寡核苷酸的有效遞送。除了幫助非親脂性藥物跨細(xì)胞膜的擴(kuò)散，滲透促進(jìn)劑還增強親脂性藥物的滲透性。滲透促進(jìn)劑可分為屬于五個大類之一，即，表面活性劑、脂肪酸、膽酸、螯合劑和非螯合非表面活性劑。滲透促進(jìn)劑及其用途進(jìn)一步描述于美國專利No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，制劑常規(guī)地根據(jù)其預(yù)期用途即施用途徑來設(shè)計。用于局部施用的制劑包括其中本發(fā)明的寡核苷酸與局部遞送劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑混合的制劑。脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性(例如，二油?；?磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性(例如，二肉豆蘧酰磷脂酰甘油DMPG)和陽離子(例如，二油?；募谆被鵇OTAP和二油?；?磷脂酰乙醇胺D0TMA)。對于局部或其它施用，可將本發(fā)明的寡核苷酸封裝于脂質(zhì)體中或可與其形成復(fù)合體，尤其是陽離子脂質(zhì)體?？蛇x地，寡核苷酸可與脂質(zhì)，尤其是陽離子脂質(zhì)復(fù)合。脂肪酸和酯、其藥學(xué)上可接受的鹽及其用途進(jìn)一步描述于美國專利No. 6，287，860中。用于口服施用的組合物和制劑包括粉末劑或顆粒劑、微顆粒、納米顆粒、水或非水介質(zhì)中的懸浮劑或溶液、膠囊、凝膠膠囊、囊劑、片劑或小片劑。增稠劑、芳香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可以是期望的。口服制劑是其中本發(fā)明的寡核苷酸連同一種或多種滲透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑一起施用的那些。表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽酸和/或其鹽。膽酸/鹽和脂肪酸及其用途進(jìn)一步描述于美國專利No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。還有滲透促進(jìn)劑的組合，例如，脂肪酸/鹽與膽酸/鹽的組合。尤其是月桂酸、癸酸和UDCA的鈉鹽。進(jìn)一步的滲透促進(jìn)劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本發(fā)明的寡核苷酸可口服遞送，以包括噴霧干燥顆粒的粒狀形式或復(fù)合以形成微顆?；蚣{米顆粒。寡核苷酸絡(luò)合劑及其用途進(jìn)一步描述于美國專利 No. 6，287，860中，其通過引用并入本文。用于腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可包括還可包含緩沖劑、稀釋劑和其它適當(dāng)?shù)奶砑觿?例如但不限于滲透促進(jìn)劑、載體化合物和其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑)的無菌水溶液。本發(fā)明的某些實施方案提供包含與一種或多種其它試劑組合的一種或多種寡聚化合物的藥物組合物。其它試劑可通過非反義機(jī)制起作用。第二試劑是例如目前用于治療沉默調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)疾病或病癥的試劑。第二試劑可選擇性地是非-沉默調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)劑，例如化療劑。例如，在治療癌癥中，一種或多種用于治療特定癌癥的化療劑可與本發(fā)明的至少一種反義寡核苷酸組合施用。組合治療方案包括這樣的治療方案，其中在用第二試劑治療之前、期間或之后引發(fā)SIRT反義寡核苷酸的施用，并且繼續(xù)這種施用直到用第二試劑的治療期間的任何時間或用第二試劑的治療終止后。這也包括這樣的治療，其中在治療期過程中，同時或在不同時間和/或以遞減或遞增的間隔施用組合使用的試劑。組合治療包括在不同時間開始并停止以協(xié)助患者的臨床管理的周期性治療。例如，組合的試劑可在治療開始時每周施用一次，遞減至每兩周施用一次，并且酌情進(jìn)一步遞減?？膳c本發(fā)明的反義寡核苷酸組合向患者施用的其它調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白的試劑已描述于文獻(xiàn)例如美國專利申請公布No. 2009/0163476, ^N-Phenyl Benzamide Derivativesas Sirtuin Modulators”中，其通過引用整體并入本文。該公布報道了某些沉默調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)化合物用于治療神經(jīng)變性疾病、和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、脊髓或周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的創(chuàng)傷性或機(jī)械性損傷的用途。其還列出了可與沉默調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)劑組合使用的其它治療劑。設(shè)想與本發(fā)明的反義寡核苷酸組合向患者施用的其它沉默調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)劑描述于美國專利No. 7, 855, 289, “Sirtuinmodulating compounds”和美國專利No. 7, 829, 556, “Sirtuin modulatingcompounds” ；美國專利申請公布 No. 2009/0143376,“Fused HeterocyclicCompounds and Their Use as Sirtuin Modulators，，;美國專利申請公布No. 2009/0069301,“Acridine and Quinoline Derivatives as SirtuinModulators，，；美國專利申請公布No. 2007/0037865, “Sirtuin modulatingcompounds” ；美國專利申請公布 No. 2007/0149466,“Methods andrelated compositions for treating or preventingobesity, insulin resistancedisorders, and mitochondrial-associated disorders，，,其每一個通過弓I用整體并入本文。這種化療劑的實例包括但不限于，癌癥化療藥物例如柔紅霉素、道諾霉素、放線菌素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、雙氯乙亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧柯福霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素、長春新堿、長春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時，這種化療劑可單獨地使用(例如，5-FU和寡核苷酸)，順序地使用(例如，5-FU和寡核苷酸持續(xù)一段時間，隨后是MTX和寡核苷酸)或與一種或多種其它這種化療劑組合使用(例如，
5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放療和寡核苷酸)。包括但不限于非類固醇抗炎藥物和皮質(zhì)激素的抗炎藥物及包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷和更昔洛韋的抗病毒藥物也可組合在本發(fā)明的組合物中。反義化合物與其它非反義藥物的組合也在本發(fā)明的范圍中。兩種或更多種組合的化合物可一起或順序地使用。在另一相關(guān)實施方案中，本發(fā)明的組合物可包含靶向第一核酸的一種或多種反義化合物，尤其是寡核苷酸，和靶向第二核酸靶的一種或多種另外的反義化合物。例如，第一靶可以是沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的特定反義序列，第二靶可以是來自另一核苷酸序列的區(qū)域?？蛇x地，本發(fā)明的組合物可包含靶向同一沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)核酸靶的不同區(qū)域的兩種或更多種反義化合物。本文闡述了反義化合物的許多實例，其它的可選自本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)幕衔?。兩種或更多種組合的化合物可一起或順序地使用。給藥認(rèn)為治療性組合物的配制及其隨后的施用(給藥)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。給藥依賴于待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和響應(yīng)性，治療的時期持續(xù)數(shù)天到數(shù)月，或直到實現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕。最佳給藥計劃可從患者體內(nèi)藥物積累的測量來計算。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。最佳劑量可根據(jù)單獨寡核苷酸的相對效力而變化，通?？苫谠谟行У捏w外和體內(nèi)動物模型中有效的EC50來估算。通常，劑量是每kg體重從0. 01 μ g至IOOg,可每天、每周、每月或每年一次或多次,或甚至每2至20年一次地提供。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于測量的藥物在體液或組織中的停留時間和濃度容易地估算重復(fù)率。在成功治療之后，可能期望對患者進(jìn)行維持療法以阻止疾病狀態(tài)復(fù)發(fā)，其中寡核苷酸以維持劑量施用，范圍從每kg體重0. 01μ g至100g，每天一次或多次，至每20年一次。在實施方案中，患者以至少約I、至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90或至少約100mg/kg體重的藥物劑量治療。反義寡核苷酸的某些注射劑量描述于，例如，美國專利No. 7，563，884“Antisense modulation ofPTPlB expression”,其通過引用整體并入本文。
盡管以上已經(jīng)描述了本發(fā)明多種實施方案，應(yīng)理解的是，它們僅以示例而非限制的方式呈現(xiàn)?？筛鶕?jù)本公開內(nèi)容對公開的實施方案進(jìn)行多種改變而不偏離本發(fā)明的主旨或范圍。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)限于任何上述的實施方案。本文提及的所有文件通過引用并入本文。本申請中提及的所有出版物和專利文件為了所有目的通過引用并入本文，其程度如同每個單獨出版物或?qū)＠募粏为毜靥峒啊Ｍㄟ^在本文件中提及多個參考文獻(xiàn)，申請人不承認(rèn)任何特定參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的"現(xiàn)有技術(shù)"。本發(fā)明組合物和方法的實施方案在以下實施例中闡述。
實施例以下非限制性實施例用于闡述本發(fā)明的選定實施方案。應(yīng)理解的是，所示組分的成分的比例和其它選擇方面的改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，并且在本發(fā)明實施方案范圍中。實施例I :對與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)反義的核酸分子和/或沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT) 多核苷酸的有義鏈有特異性的反義寡核苷酸的設(shè)計如上所述，術(shù)語〃對…有特異性的寡核苷酸〃或〃寡核苷酸靶〃是指具有⑴能夠與祀向基因的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體，或(ii)能夠與祀基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體的序列的寡核苷酸。進(jìn)一步通過利用自動比對核酸序列并指明同一性或同源性的區(qū)域的計算機(jī)程序來便于選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账?。這種程序用來比較獲得的核酸序列，例如通過搜尋數(shù)據(jù)庫例如GenBank或通過對PCR產(chǎn)物測序。比較來自一系列物種的核酸序列允許選擇在物種之間展示適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄?。在未被測序的基因的情形中，進(jìn)行DNA印跡以允許確定靶物種與其它物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域所熟知的，通過以不同的嚴(yán)格性程度進(jìn)行DNA印跡，可能獲得近似的同一性測量。這些方案允許選擇展現(xiàn)與待控制的受治療者中靶核酸序列的高程度互補性和與其它物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補性的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在選擇用于本發(fā)明的基因的適當(dāng)區(qū)域方面存在相當(dāng)大的自由。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)時，該化合物是"可特異性雜交的"，且在期望特異性結(jié)合的條件下(即，在體內(nèi)測定或治療性治療的情形中的生理條件下，和在體外測定的情形中進(jìn)行測定的條件下)存在足夠程度的互補性以避免反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。本文所述寡核苷酸的雜交特性可通過本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測定來確定。例如，本文所述寡核苷酸的特性可利用解鏈曲線測定確定靶天然反義與可能的藥物分子之間的結(jié)合強度來獲得。靶天然反義與可能的藥物分子(分子)之間的結(jié)合強度可利用測量分子間相互作用強度的任何已建立的方法例如解鏈曲線測定來估算。對于天然反義/分子復(fù)合體，解鏈曲線測定確定雙鏈向單鏈構(gòu)象的快速轉(zhuǎn)變發(fā)生時的溫度。這一溫度被廣泛接受作為兩種分子之間相互作用強度的可靠量度。解鏈曲線測定可利用對應(yīng)分子結(jié)合位置的實際天然反義RNA分子或合成的DNA或RNA核苷酸的cDNA拷貝進(jìn)行。多種包含所有進(jìn)行這一測定所必需的試劑的試劑盒是可獲得的(例如，AppliedBiosystems Inc. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包括包含雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料之一(例如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO等等)的適當(dāng)?shù)木彌_溶液。dsDNA染料的特性是使得它們在游離形式幾乎不發(fā)出熒光，但當(dāng)結(jié)合dsDNA時是高度熒光的。為了進(jìn)行測定，將cDNA或相應(yīng)的寡核苷酸與由具體制造商的方案規(guī)定的濃度的分子混合。將混合物加熱到95°C以使所有預(yù)形成的dsDNA復(fù)合體解離，然后緩慢冷卻到室溫或試劑盒制造商規(guī)定的其它較低溫度以允許DNA分子退火。然后將新形成的復(fù)合體緩慢加熱到95°C，同時連續(xù)收集反應(yīng)產(chǎn)生 的熒光的量的數(shù)據(jù)。熒光強度與反應(yīng)中存在的dsDNA的量成反比。數(shù)據(jù)可利用與試劑盒相容的實時PCR儀器(例如ABI’ s StepOne Plus實時PCR 系統(tǒng)或 LightTyperinstrument, Roche Diagnostics, Lewes, UK)來收集。利用適當(dāng)?shù)能浖?例如LightTyper (Roche)或 SDS DissociationCurve, ABI)將熒光相對于溫度的負(fù)導(dǎo)函數(shù)(y軸上的-d(熒光)/dT))對溫度(X軸)繪圖來構(gòu)建熔融峰。分析數(shù)據(jù)以鑒定dsDNA復(fù)合體向單鏈分子快速轉(zhuǎn)變的溫度。這一溫度稱為Tm，與兩種分子之間相互作用的強度成正比。通常，Tm將超過40°C。實施例2 =SIRT多核苷酸的調(diào)節(jié)以反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞在37 V和5%C02下將來自ATCC的!fepG2細(xì)胞(cat#HB_8065)生長在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone cat#SH30024 或 Mediatechcat#MT-10-010_CV)+10%FBS(Mediatechcat#MT35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech cat#MT30-002-CI))中。實驗前一天，將細(xì)胞以I. 5XlOVml的密度重新鋪板到6孔板中并且在37°C和5%C02下孵育。在實驗當(dāng)天將6孔板中培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 μ M的濃度。將此溶液的 2 μ I 與 400 μ I Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco cat#31985-070)和 4μ I Lipofectamine2000 (Invitrogen cat#11668019)在室溫一起孵育20min，然后施加到帶有H印G2細(xì)胞的6孔板的每一孔。代替寡核苷酸溶液的包括2μ I水的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5%C02培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48h后，去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)或來自Qiagen的RNeasy總RNA分離試劑盒(cat#74181)按照制造商的說明書從細(xì)胞提取RNA。將600ng RNA加入到利用來自Thermo Scientific的VersocDNA試劑盒(cat#AB1453B)或高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(cat#4368813)如制造商的方案所述地進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA 用于利用 ABI Taqman 基因表達(dá)混合物(cat#4369510)和由 ABI (Applied BiosystemsTaqman 基因表達(dá)測定Hs00202021_mU Hs00202030_mU Hs00953479_ml、Hs00202033_ml, Hs00978329_ml、Hs00213036_ml 和Hs00213029_ml，由 AppliedBiosystems Inc. , FosterCity CA)設(shè)計的引物/探針通過實時PCR監(jiān)測基因表達(dá)。利用St印One Plus Real TimePCR Machine (AppliedBiosystems)使用以下PCR 循環(huán)50°C 持續(xù) 2min、95°C 持續(xù) 10min、40個循環(huán)的(95°C持續(xù)15秒、60°C持續(xù)Imin)。以反義寡核苷酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的差異來計算。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl反義CV396200的一些反義寡核苷酸處理后48h，H印G2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖3，4)。
實時PCR結(jié)果顯示，利用針對SIRTl反義CV396200設(shè)計的寡核苷酸之一，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖8)。實時PCR結(jié)果顯示，利用針對SIRTl反義CV428275設(shè)計的寡核苷酸中的兩個，H印G2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖9)。結(jié)果顯示，分別用針對SIRT反義BE717453設(shè)計的寡核苷酸中的三個處理后48h，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖10)。結(jié)果顯示，用針對SIRT反義AV718812設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48h，HepG2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖11)。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl反義AW169958設(shè)計的寡核苷酸中的兩個處理后48h, H印G2細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖12)。RT PCR結(jié)果顯示，用針對sirt3反義Hs. 683117設(shè)計的硫代磷酸酯反義寡核苷酸 (CUR-1545-1550)處理后48h, H印G2細(xì)胞中sirt3的水平增加(圖17)。RT PCR結(jié)果顯示，用針對sirt3反義BQ024738和BE164357設(shè)計的硫代磷酸酯反義寡核苷酸處理后48h，HepG2細(xì)胞中sirt3的水平增加(圖18)。RT PCR結(jié)果顯示，用針對sirt3反義RIC8A和PMSD13設(shè)計的SiRNA寡核苷酸處理后48h，H印G2細(xì)胞中sirt3的水平增加(圖19)實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT4反義設(shè)計的反義寡核苷酸之一處理后48h，H印G2細(xì)胞中SIRT4 mRNA的水平顯著增加(圖22)。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT5反義Hs. 671550設(shè)計的反義寡核苷酸之一處理后48h，H印G2細(xì)胞中SIRT5 mRNA的水平顯著增加(圖23)。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT6反義NM_133475設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48h, H印G2細(xì)胞中SIRT6 mRNA的水平顯著增加(圖24)。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT6反義bf772662設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48h，HepG2細(xì)胞中SIRT6 mRNA的水平顯著增加(圖25)。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT7反義設(shè)計的寡核苷酸之一處理后48h，HepG2細(xì)胞中SIRT7 mRNA的水平顯著增加(圖29)。以反義寡核苷酸處理3T3細(xì)胞在37°C和5%C02下將來自ATCC的3T3細(xì)胞(cat#CRL_1658)生長在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone cat#SH30024 或 Mediatechcat#MT-10-010_CV)+10%FBS(Mediatechcat#MT35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech cat#MT30-002-CI))中。實驗前一天，將細(xì)胞以I. 5XlOVml的密度重新鋪板到6孔板中并且在37°C和5%C02下孵育。在實驗當(dāng)天將6孔板中培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 μ M的濃度。將此溶液的 2 μ I 與 400 μ I Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco cat#31985-070)和 4μ I Lipofectamine2000 (Invitrogen cat#l 1668019)在室溫一起孵育20min，然后施加到帶有3T3細(xì)胞的6孔板的每一孔。代替寡核苷酸溶液的包括2 μ I水的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5%C02培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48h后，去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)或來自Qiagen的RNeasy總RNA分離試劑盒(cat#74181)按照制造商的說明書從細(xì)胞提取RNA。將600ng RNA加入到利用來自Thermo Scientific的VersocDNA試劑盒(cat#AB1453B)或高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(cat#4368813)如制造商的方案所述地進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于利用ABI Taqman基因表達(dá)混合物(cat#4369510)和由ABI (AppliedBiosystems Taqman 基因表達(dá)測定Hs00202021_ml,由 Applied Biosystems Inc. , FosterCity CA)設(shè)計的引物/探針通過實時PCR監(jiān)測基因表達(dá)。利用St印One Plus Real TimePCRMachine (Applied Biosystems)使用以下PCR 循環(huán)50°C 持續(xù) 2min、95°C 持續(xù) 10min、40個循環(huán)的(95°C持續(xù)15秒、60°C持續(xù)Imin)。以反義寡核苷酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的差異來計算。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl小鼠反義AK044604設(shè)計的寡核苷酸中的三個處理后48h，3T3細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖13)。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl小鼠反義AK044604設(shè)計的寡核苷酸中的五個處理后48h，3T3細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖14)。
實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl小鼠反義AK044604設(shè)計的寡核苷酸中的兩個處理后48h，3T3細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖15)。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl小鼠反義AK044604設(shè)計的寡核苷酸中的兩個處理后48h，3T3細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖16)。以反義寡核苷酸處理Vero76細(xì)胞在37°C和5%C02下將來自ATCC的Vero76細(xì)胞(cat#CRL_1587)生長在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone cat#SH30024 或 Mediatechcat#MT-10-010_CV)+10%FBS (Mediate。h cat#MT35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech cat#MT30-002-CI))中。實驗前一天，將細(xì)胞以I. 5XlOVml的密度重新鋪板到6孔板中并且在37°C和5%C02下孵育。在實驗當(dāng)天將6孔板中培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸在水中稀釋到20 μ M的濃度。將此溶液的 2μ I 與 400μ IOpti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco cat#31985-070)和 4μ ILipofectamine2000 (Invitrogen cat#l 1668019)在室溫一起孵育 20min,然后施加到帶有Vero76細(xì)胞的6孔板的每一孔。代替寡核苷酸溶液的包括2 μ I水的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5%C02培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48h后，去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)或來自Qiagen的RNeasy總RNA分離試劑盒(cat#74181)按照制造商的說明書從細(xì)胞提取RNA。將600ng RNA 加入到利用來自 ThermoScientific 的 Verso cDNA 試劑盒(cat#AB1453B)如制造商的方案所述地進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于利用ABITaqman基因表達(dá)混合物(cat#4369510)和由ABI (Applied BiosystemsTaqman基因表達(dá)測定:Hs00202021_ml,由 Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計的引物/ 探針通過實時 PCR監(jiān)測基因表達(dá)。利用 StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)使用以下PCR循環(huán)50°C持續(xù)2min、95°C持續(xù)10min、40個循環(huán)的(95°C持續(xù)15秒、60°C持續(xù)Imin)。以反義寡核苷酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dC^t值的差異來計算。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRTl反義CV396200的反義寡核苷酸處理后48h，Vero細(xì)胞中SIRTl mRNA的水平顯著增加(圖5)。
實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT3反義PSMD13的反義寡核苷酸之一處理后48h，Vero細(xì)胞中SIRT3 mRNA的水平顯著增加(圖20)。實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT7反義CV308253設(shè)計的反義寡核苷酸之一處理后48h, Vero76細(xì)胞中SIRT7 mRNA的水平顯著增加(圖27)。以反義寡核苷酸處理HUVEC細(xì)胞在37 0C 和 5%C02 下將來自 ATCC 的 HUVEC 細(xì)胞(Promo Cellcat#C_12253)生長在上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(Promo Cell cat#C-22010)中。實驗前一天，使用Promo CellDetach Kit(cat#C-41200)將細(xì)胞以I. 5X 105/ml的密度重新鋪板到6孔板中并且在37°C和5%C02下孵育。在實驗當(dāng)天將6孔板中培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 μ M的濃度。將此溶液的2 μ I與400 μ IOpti-MEM培養(yǎng)基(Gibcocat#31985_070)和 4 μ I Lipofectamine2000 (Invitrogen cat#11668019)在室溫一起孵育20min，然后施加到帶有HUVEC細(xì)胞的6孔板的每一孔。代替寡核苷酸溶液的包括2 μ I水的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5%C02培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48h后,去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)或來自Qiagen的RNeasy總RNA分離試劑盒(cat#74181)按照制造商的說明書從細(xì)胞提取RNA。將600ng RNA加入到利用來自ThermoScientific的Verso cDNA試劑盒(cat#AB1453B)如制造商的方案所述地進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于利用 ABITaqman基因表達(dá)混合物(cat#4369510)和由 ABI (Applied BiosystemsTaqman基因表達(dá)測定Hs00202033_ml,由 Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計的引物/探針通過實時PCR監(jiān)測基因表達(dá)。利用St印One Plus Real Time PCR Machine (AppliedBiosystems Inc.)或 Mx4000 熱循環(huán)儀(Stratagene)使用以下 PCR 循環(huán)50°C持續(xù) 2min、95°C持續(xù)10min、40個循環(huán)的(95°C持續(xù)15秒、60°C持續(xù)Imin)。以反義寡核苷酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的差異來計算。
結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT4反義AA156947設(shè)計的反義寡核苷酸之一處理后48h, HUVEC細(xì)胞中SIRT4 mRNA的水平顯著增加(圖21)。以反義寡核苷酸處理DBS細(xì)胞在37°C和5%C02下將來自ATCC的DBS細(xì)胞(cat#CCL_161)生長在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone cat#SH30024 或 Mediatech cat#MT-10-010-CV)+10%FBS(Mediatechcat#MT35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech cat#MT30-002-CI))中。實驗前一天，將細(xì)胞以I. 5XlOVml的密度重新鋪板到6孔板中并且在37°C和5%C02下孵育。在實驗當(dāng)天將6孔板中培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 μ M的濃度。將此溶液的 2 μ I 與 400 μ I Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco cat#31985-070)和 4μ I Lipofectamine2000 (Invitrogen cat#l 1668019)在室溫一起孵育20min，然后施加到帶有3T3細(xì)胞的6孔板的每一孔。代替寡核苷酸溶液的包括2 μ I水的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5%C02培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48h后，去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)或來自Qiagen的RNeasy總RNA分離試劑盒(cat#74181)按照制造商的說明書從細(xì)胞提取RNA。將600ng RNA加入到利用來自Thermo Scientif ic的VersocDNA試劑盒(cat#AB1453B)或高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(cat#4368813)如制造商的方案所述地進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA 用于利用 ABI Taqman 基因表達(dá)混合物(cat#4369510)和由 ABI (Applied BiosystemsTaqman 基因表達(dá)測定Hs00202021_ml、Hs00202030_mU Hs00202033_mU Hs00978329_ml、Hs00213036_ml 和Hs00213029_ml,由 Applied Biosystems Inc. , FosterCity CA)設(shè)計的引物/探針通過實時PCR監(jiān)測基因表達(dá)。利用StepOnePlus Real Time PCR Machine (AppliedBiosystems)使用以下PCR循環(huán)50°C持續(xù)2min、95°C持續(xù)10min、40個循環(huán)的(95°C持續(xù)15秒、60°C持續(xù)Imin)。以反義寡核苷酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的差異來計算。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT6反義bf772662設(shè)計的寡核苷酸中的兩個和針對NM_133475設(shè)計的一個寡核苷酸處理后48h，DBS細(xì)胞中SIRT6 mRNA的水平顯著增加(圖26)。以反義寡核苷酸處理SK-N-AS細(xì)脆 在37 V和5%C02下將SK-N-AS細(xì)胞(成神經(jīng)細(xì)胞瘤ATCC#CRL_2137)生長在DMEM(Mediatech cat#10-013-CV) +10%FBS (Mediatech cat#MT35-011_CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech cat#MT30-002_CI))中。實驗前一天，將細(xì)胞以約3X IO5/孔的密度重新鋪板到6孔板中并且在37°C和5%C02下孵育過夜。在給藥時，細(xì)胞為約75%匯合。為了給藥，將6孔板中培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈rDMEM+10%FBS+青霉素+鏈霉素(I. 5ml/孔)。將所有反義寡核苷酸在不含DNA酶/RNA酶的無菌水(工作儲備液)中稀釋到20 μ M的濃度。為了向一個孔給藥，將此溶液的2 μ I與400 μ I Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco cat#31985-070)和4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat#11668019)在室溫一起孵育 20min,然后滴加到帶有SK-N-AS細(xì)胞的6孔板的一個孔(最終寡核苷酸濃度=20nM)。相同濃度的失活寡核苷酸用作控制。另外向每個板上的一個孔給藥400ul Opti-MEM培養(yǎng)基的混合物，4ulLipofectamine 2000和2ul不含DNA酶/RNA酶的無菌水用于模擬轉(zhuǎn)染的控制。在37°C和5%C02培養(yǎng)約18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈rDMEM+10%FBS+青霉素+鏈霉素。加入反義寡核苷酸約48h后,去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)按照制造商的說明書從細(xì)胞提取RNA。將600ng RNA加入到利用來自Applied Biosystems的高容量cDNA試劑盒(cat#4368813)如制造商的方案所述地進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于利用ABI Taqman基因表達(dá)混合物(cat#4369510)和由ABI (對于SIRT7，測定ID#Hs00213029_ml)設(shè)計的引物/探針通過實時PCR監(jiān)測基因表達(dá)。利用St印OnePlus Real Time PCR 系統(tǒng)(AppliedBiosystems)使用以下 PCR 循環(huán)50°C持續(xù) 2min、95°C持續(xù) IOmin,40 個循環(huán)的(95°C持續(xù) 15 秒、60°C持續(xù) Imin)。用 ABI (cat#4319413E)制造18S的測定。以反義寡核苷酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dC^t值的差異來計算。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，用針對SIRT7反義設(shè)計的寡核苷酸處理后48h，SK-N-AS細(xì)胞中SIRT7 mRNA的水平顯著增加(圖28)。實施例3 =SIRT基因表達(dá)的調(diào)節(jié)材料和方法以反義寡核苷酸處理裸露的!fepG2細(xì)胞
在37°C和5%C02下將來自ATCC的!fepG2細(xì)胞(cat#HB_8065)生長在生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone cat#SH30024 或 Mediatechcat#MT-10-010_CV)+10%FBS(Mediatechcat#MT35-011-CV)+青霉素 / 鏈霉素(Mediatech cat#MT30-002-CI))中。實驗前一天，將細(xì)胞以O(shè). 5XlOVml的密度重新鋪板到6孔板中并且在37°C和5%C02下孵育。在實驗當(dāng)天將6孔板中培養(yǎng)基替換為I. 5ml/孔的新鮮生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸在水中稀釋到 20 μ M 的濃度。將此溶液的 2 μ I 與 400 μ I Opti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco cat#31985-070)和 4 μ ILipofectamine 2000 (Invitrogen cat#11668019)在室溫一起孵育 20min,然后施加到帶有HepG2細(xì)胞的6孔板的每一孔。代替寡核苷酸溶液的包括2 μ I水的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5%C02培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸72h后，如上所述地重新給藥細(xì)胞。第二次給藥反義寡核苷酸48h后，去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)或來自Qiagen的RNeasy總RNA分離試劑盒(cat#74181)按照制造商的說明書從細(xì)胞提取RNA。將600ng RNA加入到利用來自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(cat#AB1453B)如制造商的方案所述地進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于利用ABI Taqman基因表達(dá) 混合物(cat#4369510)和由 ABI (AppliedBiosystems Taqman 基因表達(dá)測定Hs00202021_ml、Hs00202030_ml、Hs00202033_ml、Hs00978329_ml、Hs00213036_ml 和 Hs00213029_ml，由Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計的引物/探針通過實時PCR監(jiān)測基因表達(dá)。利用 StepOne Plus Real Time PCR Machine (AppliedBiosystems)使用以下PCR循環(huán)50°C持續(xù)2min、95°C持續(xù)IOmin,40個循環(huán)的(95°C持續(xù)15秒、60°C持續(xù)Imin)。以反義寡核苷酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的差異來計算。對于定制設(shè)計的Taqman測定的外顯子4的引物和探針AACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCA(SEQ ID NO: 128)和 SIRTl 天然反義 CV396200。正向引物序列CCATCAGACGACATCCCTTAACAAA (SEQ IDNO: 129)反向引物序列ACATTATATCATAGCTCCTAAAGGAGATGCA (SEQ ID NO: 130)報告序列CAGAGTTTCAATTCCC(SEQ ID NO: 131)結(jié)果結(jié)果顯示，用針對sirtas (sirtas_5, P=O. 01)設(shè)計的siRNA之一處理后48h，HepG2細(xì)胞中SIRT mRNA的水平顯著增加。在相同的樣品中，用sirtas_5處理后，sirtas RNA的水平顯著下降，但是用sirtas_6和sirtas_7 (它們也對SIRTl mRNA水平?jīng)]有影響)處理后，其水平并未變化(圖2)。sirtas_5、sirtas_6和sirtas_7分別對應(yīng)于SEQ IDNO:47、48 和 49。處理原代猴肝細(xì)胞原代猴肝細(xì)胞由RxGen Inc.引入到培養(yǎng)物中并在6孔板中鋪板。它們用寡核苷酸如下處理。6孔板中的培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基，所述新鮮生長培養(yǎng)基由補充有5%FBS、50U/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素、4ug/ml胰島素、IuM地塞米松、10ug/ml菌纖維素(InVivogen, San Diego CA)的 William’ s Medium E(Sigma cat#W4128)組成。將所有反義寡核苷酸稀釋至20μΜ的濃度。在室溫下用400μ1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibcocat#31985_070)和 4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat#11668019)孵育 2 μ I 該溶液20min,然后施加到帶有該細(xì)胞的6孔板的每一孔。代替寡核苷酸溶液的包括2 μ I水的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5%C02培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基改變?yōu)樾迈r生長培養(yǎng)基。加入反義寡核苷酸48h后,去除培養(yǎng)基且利用來自Promega的SV總RNA分離系統(tǒng)(cat#Z3105)或來自Qiagen的RNeasy總RNA分離試劑盒(cat#74181)按照制造商的說明書從細(xì)胞提取RNA。將600ng RNA加入到利用來自Thermo Scientific^tJVersocDNAS劑盒(cat#AB1453B)如制造商的方案所述地進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。來自這一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA 用于利用 ABI Taqman 基因表達(dá)混合物(cat#4369510)和由 ABI (Applied BiosystemsTaqman 基因表達(dá)測定Hs00202021_ml、Hs00202030_mU Hs00202033_mU Hs00978329_ml、Hs00213036_ml和Hs00213029_ml,由 AppliedBiosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計的引物/探針通過實時PCR監(jiān)測基因表達(dá)。利用Mx4000熱循環(huán)儀(Stratagene)使用以下PCR循環(huán):50°C持續(xù)2min、95°C持續(xù)IOmin,40個循環(huán)的(95°C持續(xù)15秒、60°C持續(xù)Imin)。以反義寡核苷酸處理后的基因表達(dá)倍數(shù)變化基于處理樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間18S-標(biāo)準(zhǔn)化的dCt值的差異來計算。結(jié)果結(jié)果示于圖7。實時PCR結(jié)果顯示用針對SIRTl反義的寡核苷酸處理后，SIRTl mRNA水平的增加。
實施例4 =CUR 963在非洲綠猴中的作用功效和持續(xù)時間的研究本研究的目的是在非人靈長類動物模型中評估和比較在靜脈內(nèi)施用后調(diào)控SIRTl基因的不協(xié)調(diào)的非編碼反義序列的反義敲低的作用。被設(shè)計來抑制SIRTl調(diào)控序列的反義寡核苷酸測試品稱為CUR963。CUR 963:+G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A(SEQ ID NO:43).CUR 962 (對照):+G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*+G (SEQ IDNO: 132).管理測試指導(dǎo)方針本研究按照可接受的毒理學(xué)原理和遵從國際協(xié)調(diào)會議(ICH)統(tǒng)一的三方指導(dǎo)方針(藥物ICH M3 (m)的用于實施人臨床試驗的非臨床安全研究)，2000年11月9日)來進(jìn)行設(shè)計，并且通常接受用于測試治療劑的方法。測試品和對照品測試品身份和制備測試品CUR-963為化學(xué)上穩(wěn)定的反義寡核苷酸。用于靜脈內(nèi)遞送的媒介物為磷酸緩沖鹽水(PBS)。媒介物的表征對于PBS媒介物，組成、批號、藥品有效期和貯存條件(溫度和光/暗)從提供商獲得。測試品貯存和處理相應(yīng)地按照由資助者和制造商提供的接受的貯存條件貯存測試物質(zhì)和媒介物。測試品制劑的分析冷凍保存測試品制劑的樣品以用于分析測試物質(zhì)制劑的濃度、穩(wěn)定性和均勻性。測試系統(tǒng)原理靈長類動物是監(jiān)管機(jī)構(gòu)可接受為潛在危害的指示者并且關(guān)于其的詳盡背景資料是可獲得的適當(dāng)?shù)姆菄X類動物物種。非洲綠猴特別地為多種人生理和疾病狀態(tài)的高度臨床相關(guān)模型。
靜脈內(nèi)施用途徑對應(yīng)于可能的人治療途徑。測試品的劑量基于先前在非洲綠猴中進(jìn)行的類似化合物的劑量調(diào)查研究的結(jié)果。非洲綠猴被選擇作為選擇的靈長類動物，因為測試物質(zhì)的靶序列在物種間是保守的，在靈長類動物中具有100%的同源性。此外，測試物質(zhì)為合成寡核苷酸。因此，靈長類動物的給藥允許進(jìn)行此類化合物的功效的優(yōu)良評估，與在任何其它物種中相比，所述評估更能反映可能在人中看到的攝取。動物物種Chlorocebus sabaeus,非人靈長類動物品種St. Kitts 土生土長的非洲綠猴來源RxGen,Lower Bourryeau, St. Kitts, West Indies.預(yù)期年齡測試動物為成年。 預(yù)期生物體重猴體重約3_4kg。實際范圍可變化但記錄在資料中。性別測試動物為成年雌性。動物的數(shù)目篩選10只動物以確保鑒定8只動物適合于本研究的招募。關(guān)于研究的數(shù)目雌性8只關(guān)于研究的數(shù)目的論證本研究被設(shè)計來盡可能使用最少數(shù)目的動物，與目的在于評價測試品在非洲綠猴中的治療功效和該類型的寡核苷酸在該物種中的全身性施用的先前研究的靈長類動物一致。動物說明將體重在3至4kg范圍內(nèi)的10只成年非洲綠猴用于研究。猴為從棲息在島上的野生群體人道地捕獲的首次接觸藥物的成年動物。利用驅(qū)腸蟲劑處理捕獲的猴以消除任何可能的腸寄生蟲負(fù)荷，在研究招募篩選之前隔離觀察其最少4周。通過大小和齒狀突起估計捕獲的猴的年齡，將較老的動物從研究排除。在研究招募之前，對每一只猴進(jìn)行臨床檢查，包括運動和靈巧的估計。采集血液樣品，將其送至AntechDiagnostics (Memphis, TN)以獲得全面的臨床化學(xué)和完全血細(xì)胞計數(shù)以及脂質(zhì)特征譜(關(guān)于說明參見部分9. 2和319567928)。將具有異常實驗值(如通過與St. Kitts聚居地的猴的確定的正常范圍相比較測定的)的猴從研究排除。為了鑒定滿足該標(biāo)準(zhǔn)的8只猴，對10只猴進(jìn)行篩選，必要時篩選額外的動物。在研究開始前，將選擇的猴轉(zhuǎn)移至單個籠子中以使其適應(yīng)個別關(guān)養(yǎng)，進(jìn)行I周的時期。僅將被認(rèn)為適合于實驗的動物招募用于研究。研究開始時的實際(或估計的)年齡和體重范圍將被詳細(xì)記錄在原始數(shù)據(jù)和最終的報告中。動物健康與福利使動物福利的最高標(biāo)準(zhǔn)遵照和堅持由圣基茨島農(nóng)業(yè)部(St.Kitts Department of Agriculture)和美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部(U. S. Department ofHealth and Human Services)規(guī)定的指導(dǎo)方針。所有研究將按照這些要求和所有可適用的實驗室動物的護(hù)理和居住的實施規(guī)程來進(jìn)行。獸醫(yī)護(hù)理、操作和檢查的所有可適用標(biāo)準(zhǔn)如動物的護(hù)理和使用的NIH指南中包括的。St. Kitts設(shè)施維持檢查方案和考察如指南所要求的設(shè)施的動物研究委員會?；饡哂杏蓪嶒瀯游锔＠k公室(Office of LaboratoryAnimal Welfare)提交的批準(zhǔn)的保險，如 Guide, #A4384_01 (Axion Research Foundation/St. Kitts Biomedical Foundation)所要求的。不存在由本研究中指定的研究產(chǎn)生的特定非人靈長類動物獸醫(yī)護(hù)理問題和生物危害問題。居住和環(huán)境為了使得能夠檢測任何處理相關(guān)臨床癥狀，在手術(shù)之前和手術(shù)后直至處死將動物單獨地關(guān)養(yǎng)。其中放置個體籠子的靈長類動物建筑物完全按照處于北緯17度接近U. S. D. H. H. S指導(dǎo)方針中推薦的12hr: 12hr光-暗周期的環(huán)境光照明。RxGen靈長類動物建筑物完全對外通風(fēng)。通過吊扇確保另外的空氣流動以維持23-35° C的恒定目標(biāo)溫度，這是St. Kitts 一年中的典型氣候條件。每天測量24小時的溫度和相對濕度的極限值(這也不受控制)。在研究過程中，定期清潔籠子。欽食和水每天給每只動物提供約90克的標(biāo)準(zhǔn)猴飼料(chowdiet)(TekLad, Madison, WI)。記錄飲食的具體營養(yǎng)組成。定期分析水的微生物學(xué)純度。常規(guī)飼料(stock diet)和水供給的污染物的可接受水平的標(biāo)準(zhǔn)分別在由食物制造商和定期設(shè)施水評價建立的分析規(guī)范內(nèi)。水滿足證明為對于人消費可接受的所必需的所有標(biāo)準(zhǔn)。 實驗設(shè)計動物鑒定和隨機(jī)化通過基于體重和血漿膽固醇特性的分層隨機(jī)化程序進(jìn)行分配。在分配至組之前和之后，通過腹部上的紋身鑒定每一只動物。將紋身置于所有聚居動物上作為常規(guī)健康檢查過程中的鑒定的工具。籠計劃(cage plan)被制定來鑒定關(guān)養(yǎng)在籠內(nèi)的個體，還可通過系在它們各自籠上的標(biāo)記標(biāo)簽來鑒定個別猴。組大小、劑量和標(biāo)識號將動物分配至2個處理組，每組由4只猴組成。按照設(shè)施編號系統(tǒng)給每一只猴提供特定的動物標(biāo)識號。該系統(tǒng)通過一個字母后跟3個數(shù)字的號碼例如Y032來唯一地標(biāo)識每一只猴。施用的途徑和頻率在第1、3和5天通過持續(xù)約10分鐘的手工輸注進(jìn)行的靜脈內(nèi)遞送每天給動物給藥一次。輸注速率將為24mL/kg/h。在給藥過程之前和期間利用氯胺酮和賽拉嗪使動物鎮(zhèn)靜。將靜脈導(dǎo)管(Terumo迷你靜脈輸液裝置，20號針或類似的適當(dāng)?shù)妮斠貉b置)插入隱靜脈。每一只猴的給藥在早上8:00至10:00點之間在動物醒來后不久并且在喂食之前進(jìn)行。在即將進(jìn)行每一次輸注之前收集血液樣品以估量血漿膽固醇和其它脂質(zhì)水平，如下面血液化學(xué)部分中所描述的。在兩次取樣間隔在喂食之前收集血液以使對膽固醇測量的飲食影響降至最低。臨床觀察在給藥的每一天記錄對處理的反應(yīng)的所有可見癥狀。此外，每周檢查動物的身體屬性諸如外表和一般狀況至少一次。體重在處理期間和處理后時期以每周一次的間隔記錄體重。食物消耗不定量個體的食物消耗。然而監(jiān)控喂食模式并且記錄任何較大的變化。死亡率和發(fā)病率記錄死亡率和發(fā)病率。如果可能的話，在與實驗負(fù)責(zé)人和資助者的監(jiān)測科學(xué)家商量之后作出關(guān)于過早處死(premature sacrifice)的任何決定。將被發(fā)現(xiàn)過早死亡或殺死的動物經(jīng)歷尸體剖檢以收集肝、腎、心和脾肺組織以進(jìn)行組織病理學(xué)。倘若過早處死，也可獲取血液樣品(如果可能的話)，測定參數(shù)。將被發(fā)現(xiàn)在正常工作時間后死亡的動物冷藏過夜，在接下來的工作日開始時進(jìn)行尸體剖檢。如果動物的狀況需要過早處死，則通過戊巴比妥鈉的靜脈內(nèi)過量給藥來將其無痛致死。所有研究遵照動物使用原則(Principlesfor Use of Animals)。RxGen按法律規(guī)定遵從關(guān)于靈長類動物設(shè)施的美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部(U. S. Department of Health and Human Services)標(biāo)準(zhǔn)，所述標(biāo)準(zhǔn)表不指定為溫和的本研究內(nèi)的過程必須遵守的嚴(yán)重性的水平。臨床實驗室研究脂肪活組織檢查在第26個研究日通過經(jīng)臍下Icm正中切口提取組織對所有研究猴(除Y775外)進(jìn)行皮下脂肪活組織檢查。立即將活檢組織浸沒在裝有2mlRNAlater(Qiagen)的標(biāo)記冷凍管中，于4°C下溫育過夜，之后吸出RNAlater，將樣品管快速冷凍在液氮中。在于氮中運輸后，分離總RNA以進(jìn)行靶基因的實時qPCR。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示與用CUR-962(SEQ ID NO. :132)( 一種對SIRTl的體外表達(dá)沒有影響的寡核苷酸(針對ApoAl反義DA327409設(shè)計的，數(shù)據(jù)未顯示))給藥的猴相比較來自用⑶R-963 ( 一種針對SIRTl反義CV396200. I設(shè)計的寡核苷酸)給藥的猴的脂肪活組織檢查中SIRTl mRNA水平的增加。通過實時PCR測量mRNA水平(圖6)。實施例5 :反義DNA寡核苷酸對沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的體內(nèi)調(diào)節(jié)利用反義DNA寡核苷酸(ASO)的處理給被喂食高脂肪飲食12周以誘導(dǎo)肥胖癥和糖尿病的C57B1/6J小鼠施用對于SIRTl AS是特異性的反義寡核苷酸(ASO)。利用ASO對小鼠的處理始于執(zhí)行高脂肪飲食時。每周一次用濃度為5mg/kg的在生理鹽水中制備的ASO對小鼠進(jìn)行IP注射。體重和食物攝入的測量在IP注射ASO之前，每周兩次測量小鼠的體重和食物攝入。血糖測量通過從尾靜脈采集血液樣品每周測量進(jìn)食和空腹血糖濃度。葡萄糖耐量測試(GTT):每只小鼠總共進(jìn)行2次GTT，在高脂肪飲食進(jìn)行至一半時(在第4周)和高脂肪飲食快結(jié)束時(在第10周)。GTT將告訴我們關(guān)于小鼠的作為從血液快速清除葡萄糖推注(glucosebolus)的能力的葡萄糖耐量。這為糖尿病的量度。將小鼠禁食過夜，進(jìn)行16小時。給小鼠IP注射葡萄糖2g/kg。對于30g重的小鼠，這轉(zhuǎn)化為終體積O. 2ml的30%(w/v)葡萄糖溶液。在葡萄糖注射前和在注射后5、15、30、60、90和120分鐘測量葡萄糖。在IP葡萄糖注射前，通過在異氟烷麻醉下從尾巴末端切取1_的尾尖來測量葡萄糖。將血滴抽吸至測試條(strip)，并利用血糖測計儀測量葡萄糖濃度。每只小鼠總共進(jìn)行2次GTT，在高脂肪飲食進(jìn)行至一半時(在第4周)和高脂肪飲食快結(jié)束時(在第10周)。GTT將告訴我們關(guān)于小鼠的作為從血液快速清除葡萄糖推注的能力的葡萄糖耐量。這為糖尿病的量度。胰島素耐量測試(ITT):將小鼠從早上9點至下午3點禁食6小時。隨后給小鼠IP注射0.5-1U胰島素/kg。調(diào)整胰島素濃度以便終注射體積為O. 1-0. 15ml。在注射之前和在注射后5、15、30、45和60分鐘進(jìn)行血糖測量。完全如GTT下所述收集血液。除了監(jiān)控葡萄水平外，還在ITT期間不斷觀察小鼠的行為。低血糖癥可表現(xiàn)為動物變得非常安靜并且顯示不適的行為的改變。為了預(yù)防低血糖癥，血糖濃度一降至低于50mg/ml或觀察到不適的癥狀就立即IP注射終體積為O. 1-0. 15ml的葡萄糖(lg/kg)。通過面靜脈穿刺進(jìn)行血液收集通過頸背和尾基部控制小鼠，通過緊握頸部皮膚上的夾子輕度壓緊頸部血管。取樣位置在下頜角稍前方的頜上。利用18G針或柳葉刀以90°的角度刺穿取樣位置上的皮膚直至針/柳葉刀的尖端剛好通過皮膚。使用微量血細(xì)胞比容管收集血液樣品。在已收集血液后，松開頸上的夾子，用紗布海綿壓住插入位置以確保止血。通過該方法收集O. 05-0. 2ml血液。該方法在高脂肪飲食的第5周中僅進(jìn)行一次，如果心內(nèi)穿刺效果不好(參見下文)最終在第12周進(jìn)行該方法。使用商購可得的ELISA試劑盒(例如，R&DSystems, Minneapolis, MN, Assay Pro St. Charles, MO, Mabtech, Mariemont,OH)測量調(diào)節(jié)葡萄和脂質(zhì)代謝的血液激素(諸如胰島素、脂連素(adiponectin)和瘦素)。
心內(nèi)穿刺在12周的高脂肪飲食結(jié)束時，通過連續(xù)異氟烷吸入麻醉小鼠。通過將小鼠置于提供有異氟烷和氧氣的吸氣盒(inductionbox)中來誘導(dǎo)麻醉。將小鼠仰臥控制。利用27G針對心臟進(jìn)行穿刺。在放血后，切斷頭以確保死亡。收集組織(肝、胰、白色和棕色脂肪組織以及骨骼肌)以進(jìn)一步調(diào)查(RNA和蛋白質(zhì)測量以及組織學(xué))。獲取約O. 5-Iml血液，將其用于測定葡萄糖和脂質(zhì)代謝的幾個臨床參數(shù)(葡萄糖、胰島素、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、瘦素、脂肪因子、皮質(zhì)類固醇、甲狀腺激素)。如果該方法存在困難，我們就改由在異氟烷麻醉下通過面靜脈穿刺收集血液(參見上文)。盡管已經(jīng)參照一種或多種實現(xiàn)來說明和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀和理解說明書和附圖后將進(jìn)行等價的改變和修飾。此外，盡管僅關(guān)于多種實現(xiàn)之一公開了本發(fā)明的特定特征，這種特征可如所需地與其它實現(xiàn)的一種或多種其它特征組合，如對于任何給定或特定應(yīng)用可能是期望和有利的。
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權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與包括SEQ ID NO:9的核苷酸I至1028或SEQID NO: 10的核苷酸I至429、或SEQ ID NO: 11的核苷酸I至508或SEQ ID NO: 12的核苷酸 I 至 593、SEQ ID NO: 13 的 I 至 373、SEQ IDNO: 14 的 I 至 1713、SEQ ID NO: 15 的 I 至660、SEQ ID NO: 16 的 I 至 589、SEQ ID NO: 17 的 I 至 726、SEQ ID NO: 18 的 I 至 320、SEQIDNO: 19 的 I 至 616、SEQ ID NO:20 的 I 至 492、SEQ ID NO:21 的 I 至 428、SEQ ID NO:22的 I 至 4041 或 SEQ ID NO: 23 的 I 至 705 或 SEQ ID NO: 141 的 I 至 2714 或 SEQ ID NO: 142的I至1757或SEQ IDNO: 143的I至3647中的5至30個連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
2.—種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的天然反義的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
3.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
4.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與靶向所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)域的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的功能和/或表達(dá)相對于對照體內(nèi)或體外增加。
6.如權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的天然反義序列。
7.如權(quán)利要求4、5或6所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向包括沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的編碼核酸序列和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述細(xì)胞或組織被多于一種的反義寡核苷酸靶向，所述反義寡核苷酸靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的重疊序列和/或非重疊序列。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包括選自以下的一種或多種修飾至少一種修飾的糖部分、至少一種修飾的核苷間鍵合、至少一種修飾的核苷酸及其組合。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的核苷間鍵合硫代磷酸酯、2’ -O甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟代、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組合。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾的核苷酸肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、類似物、衍生物及其組口 ο
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包括如SEQID NO: 24至127中任一個所列的序列。
14.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5至30個核苷酸的至少一種短干擾RNA(SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義核酸分子和/或有義核酸分子的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少50%序列同一性；以及體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的功能和/或表達(dá)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述寡核苷酸與所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義核酸分子和/或有義核酸分子互補的至少約五個連續(xù)核酸的序列具有至少80%序列同一性。
16.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞或組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長度為約5至30個核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，所述至少一種反義寡核苷酸對沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼序列和/或編碼序列有特異性，其中所述至少一種反義寡核苷酸與如SEQ ID NO: I至23和133至143所列的至少一種核酸序列具有至少50%序列同一性；以及體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞或組織中所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的功能和/或表達(dá)。
17.一種合成的、修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種修飾的糖部分；至少一種修飾的核苷酸間鍵合；至少一種修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸是與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)基因雜交并與正常對照相比體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其功能和/或表達(dá)的反義化合物。
18.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下組成的組的核苷酸間鍵合硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組合。
19.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。
20.如權(quán)利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵合的主鏈。
21.如權(quán)利要求17-20中任一項所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括至少一種修飾的核苷酸，所述修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
22.如權(quán)利要求17-21中任一項所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括多種修飾,其中所述修飾包括選自以下的修飾的核苷酸硫代磷酸酯、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其組合。
23.如權(quán)利要求17-22中任一項所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾的核苷酸肽核酸、鎖核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組入口 ο
24.如權(quán)利要求17-23中任一項所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括選自以下的至少一種修飾的糖部分2’-0_甲氧基乙基修飾的糖部分、2’-甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
25.如權(quán)利要求17-24中任一項所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包括多種修飾,其中所述修飾包括選自以下的修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、二環(huán)的糖部分及其組合。
26.如權(quán)利要求17-25中任一項所述的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸長度為至少約5至30個核苷酸并與沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約20%序列同一性。
27.如權(quán)利要求17-26中任一項所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與所述沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約80%序列同一性。
28.如權(quán)利要求17-27中任一項所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸雜交并與正常對照相比體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能。
29.如權(quán)利要求17-28中任一項所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQIDNO:24至127所列的序列。
30.一種組合物，所述組合物包括對一種或多種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸有特異性的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補序列、等位基因、同系物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQIDNO:24至127所列的任一種核苷酸序列相比具有至少約40%序列同一性。
32.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQIDNO:24至127所列的核苷酸序列。
33.如權(quán)利要求31或權(quán)利要求32所述的組合物，其中如SEQIDNO: 24至127所列的寡核苷酸包括一種或多種修飾或取代。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、膦酸甲酯、肽核酸、鎖核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預(yù)防或治療與至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸和/或至少一種其編碼的產(chǎn)物相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括向患者施用治療有效劑量的結(jié)合所述至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的天然反義序列并調(diào)節(jié)所述至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的表達(dá)的至少一種反義寡核苷酸；從而預(yù)防或治療與所述至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸和/或至少一種其編碼的產(chǎn)物相關(guān)的疾病。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中與所述至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸相關(guān)的疾病選自與與沉默調(diào)節(jié)蛋白的異常功能和/或表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥、癌癥(例如，乳腺癌、結(jié)直腸癌、CCL、CML、前列腺癌)、神經(jīng)變性疾病或病癥(例如，阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓氏病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、多發(fā)性硬化和由聚谷氨酰胺聚集引起的病癥)、β-淀粉樣蛋白疾病或病癥(例如，以β-淀粉樣蛋白積聚為特征的病癥諸如阿爾茨海默病)、骨骼肌疾病(例如，杜興肌營養(yǎng)不良、骨骼肌萎縮癥、貝克氏肌營養(yǎng)不良、或肌強直性營養(yǎng)不良)；代謝性疾病或病癥(例如，胰島素抗性、糖尿病、2型糖尿病、肥胖癥、葡萄糖耐量受損、代謝性綜合征、成人發(fā)病型糖尿病、糖尿病性腎病、高血糖癥、糖尿病性腎病、高膽固醇血癥、血脂異常高脂血癥和年齡相關(guān)代謝性疾病等)、與胰島素調(diào)節(jié)受損相關(guān)的疾病或病癥、神經(jīng)病變(例如，感覺性神經(jīng)病變、自發(fā)性神經(jīng)病變、運動性神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變)、與酮體生成性病狀相關(guān)的疾病或病癥、與能量體內(nèi)穩(wěn)態(tài)受損相關(guān)的疾病或病癥、與乙酰基輔酶A合成酶2活性受損相關(guān)的疾病或病癥、與代謝性體內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的疾病或病癥、脂質(zhì)代謝疾病或病癥、與產(chǎn)熱受損相關(guān)的疾病或病癥、與細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)受損相關(guān)的疾病或病癥、與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病或病癥、神經(jīng)病變(例如，感覺性神經(jīng)病變、自發(fā)性神經(jīng)病變、運動性神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變)、纖維變性、炎癥性心肌病變、心臟肥大、慢性炎癥、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、癡呆、骨質(zhì)疏松癥和心血管疾病或病癥、肝疾病或病癥(例如，由于酒精濫用或肝炎、脂肪肝疾病等)、年齡相關(guān)性黃斑變性、骨疾病(例如，骨質(zhì)疏松癥)、血液疾病(例如，白血病)、骨質(zhì)吸收、年齡相關(guān)性黃斑變性、AIDS相關(guān)性癡呆、ALS、貝爾氏麻痹、動脈粥樣硬化、心臟疾病或病癥(例如,心臟節(jié)律紊亂、慢性充血性心力衰竭、缺血性中風(fēng)、冠狀動脈疾病和心肌病)、慢性退行性疾病(例如,心肌疾病)、慢性腎衰竭、2型糖尿病、潰瘍、白內(nèi)障、遠(yuǎn)視、腎小球腎炎、吉蘭-巴雷綜合征、出血性中風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病疾病、SLE、克羅恩氏病、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺炎、皮膚老化、皮膚疾病或病癥、尿失禁、與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病或病癥(例如，線粒體肌病變、腦病、利伯疾病、利腦病、皮爾森氏病、乳酸性酸中毒、‘線粒體腦病、乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣癥狀’(MELAS)等)、肝變性、骨骼肌變性、肌肉疾病或病癥、炎癥、與異位脂質(zhì)沉積相關(guān)的疾病或病癥、與氧化性應(yīng)激相關(guān)的疾病或病癥、與細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)的疾病或病癥、與神經(jīng)元細(xì)胞死亡相關(guān)的疾病或病癥、老化或以不必要細(xì)胞損耗為特征的其它病狀、退行性綜合征、與氨解毒相關(guān)的病或病癥、衰老、與端粒功能障礙相關(guān)的疾病或病癥、與染色質(zhì)調(diào)節(jié)受損相關(guān)的疾病或病癥、與早熟細(xì)胞衰老相關(guān)的疾病或病癥、與SIRT介導(dǎo)的DNA修復(fù)受損相關(guān)的疾病或病癥和以不必要細(xì)胞損耗為特征的病狀。
37.一種預(yù)防或治療與至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的皮膚病狀的方法，所述方法包括向具有皮膚病狀或有發(fā)展成皮膚病狀的風(fēng)險的患者施用治療有效劑量的至少一種結(jié)合于所述至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的天然反義序列并調(diào)節(jié)所述至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸的表達(dá)的反義寡核苷酸；從而預(yù)防或治療與所述至少一種沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病皮膚病狀。
38.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述皮膚病狀是由炎癥、光損傷和衰老導(dǎo)致的。
39.如權(quán)利要求38或權(quán)利要求39所述的方法，其中所述皮膚病狀為起皺紋、接觸性皮炎、遺傳過敏性皮炎、光化性角化病、角質(zhì)化病癥、大皰性表皮松解癥、剝脫性皮炎、脂溢性皮炎、紅斑、盤狀紅斑狼瘡、皮肌炎、皮膚癌或自然衰老效應(yīng)。如權(quán)利要求1-16或35-39中任一項所述的方法，其中通過測定所述沉默調(diào)節(jié)蛋白或沉默調(diào)節(jié)蛋白生物標(biāo)記物而確定沉默調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中測定沉默調(diào)節(jié)蛋白生物標(biāo)記物，所述沉默調(diào)節(jié)蛋白生物標(biāo)記物選自由MCP-1、BMP受體1A、Smpdl3a、⑶14、ApoE, FAS、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、FABPl、?；o酶A硫酯酶I、?；o酶A硫酯酶2、水通道蛋白4、Rrad, CXCL9、CCL8、Ppplr3g、ApoA-I、ApoA-II 和 ApoB 組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的表達(dá)和/或功能的反義寡核苷酸，尤其是通過靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)的天然反義多核苷酸。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定和它們在治療沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)表達(dá)相關(guān)的疾病和病癥中的用途。
文檔編號A61P17/00GK102933711SQ201180027983
公開日2013年2月13日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月3日
發(fā)明者J·克拉德, O·霍克瓦舍曼, C·科伊托, B·德里昂 申請人:庫爾納公司