專(zhuān)利名稱(chēng)：在用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生的方法中使用的乙?；?肉堿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及烷?；鵏-肉堿用于增加神經(jīng)發(fā)生的用途。具體地，本發(fā)明涉及乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿或其鹽用于增加神經(jīng)發(fā)生的用途。
背景技術(shù)：
認(rèn)為神經(jīng)發(fā)生或新神經(jīng)元細(xì)胞的產(chǎn)生僅發(fā)生在發(fā)育中的生物體中。但是，近期的研究已經(jīng)證實(shí)，在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物生物體中，神經(jīng)發(fā)生實(shí)際上持續(xù)至成年生命 并貫穿其中。神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的新神經(jīng)元的來(lái)源。NSC位于襯在側(cè)腦室里的室管膜區(qū)和/或室下區(qū)(SVZ)內(nèi)(Cell 1999; 97:703-716; Cell1999; 96:25-34)，且位于海馬結(jié)構(gòu)的齒狀回中(J. Neurobiol. 1998; 36:249-266)。研究已經(jīng)揭示了 NSC在成年CNS內(nèi)的幾個(gè)其它位置的潛力(J. Neurosci. 1999;19:8487-8497)。NSC的不對(duì)稱(chēng)分裂會(huì)維持它們的起始數(shù)目，同時(shí)產(chǎn)生一群快速分裂的前體或祖細(xì)胞(Cell1999;96:25-34)。所述祖細(xì)胞對(duì)許多信號(hào)做出響應(yīng)，所述信號(hào)決定它們的增殖程度和它們的命運(yùn)，二者都是以分化和定位的方式。成年人的腦室系統(tǒng)的NSC可能是襯在神經(jīng)管里的胚胎腦室?guī)Ц杉?xì)胞的副本。這些胚胎細(xì)胞的后代遷移離開(kāi)，以形成CNS，成為分化的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)(DevelopmentalNeurobiology. 1991 ;第401-451頁(yè))。NSC存留在成年側(cè)腦室壁(LVW)中，從而產(chǎn)生神經(jīng)元祖細(xì)胞，所述祖細(xì)胞沿著嘴側(cè)遷移流向下遷移至嗅球。在那里，它們分化成顆粒細(xì)胞和球旁神經(jīng)元(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:2074-2077)。大量神經(jīng)元死亡發(fā)生在嗅球中，從而造成對(duì)喪失的神經(jīng)元的持續(xù)替代的需求，從LVW衍生出的遷移祖細(xì)胞滿(mǎn)足了該需求(Neurosci. Lett. 2000;291:17-20)。另外，有人指出，來(lái)自其它腦區(qū)的喪失的神經(jīng)元可以被來(lái)自L(fǎng)VW的祖細(xì)胞替代，后者分化成具有適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元突出物和突觸的喪失的神經(jīng)元的表型，它們具有正確的靶細(xì)胞類(lèi)型(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:11663-11668; Nature2000;405:951-955)o已經(jīng)確立了體外培養(yǎng)技術(shù)，以鑒別在NSC增殖和分化的調(diào)節(jié)中涉及的外部信號(hào)(Cell 1999 ;96:25-34; Exp. Cell Res. 1999; 253:733-736)。促分裂原 EGF 和基礎(chǔ) FGF 允許分離自腦室壁和海馬的神經(jīng)祖細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)繁殖(Science 1997; 276:66-71; Exp.Cell Res. 1999;253:733-736)。這些分裂中的祖細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)，并生長(zhǎng)成稱(chēng)作神經(jīng)球的大細(xì)胞克隆。在撤去促分裂原并加入血清以后，所述祖細(xì)胞會(huì)分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，它們是腦的3個(gè)細(xì)胞譜系(Cell 1999;97:703-716;Cell1999;96:25-34)?？梢约尤胩禺愋缘纳L(zhǎng)因子，以改變形成的每種細(xì)胞類(lèi)型的比例。例如，CNTF的作用是，指導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞具有星形細(xì)胞命運(yùn)(Genes Dev. 1996; 10:3129-3140; J.Neurosci. 1998;18:3620-3629)。甲狀腺激素三碘甲狀腺原氨酸(T3)會(huì)促進(jìn)少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化(Genes Dev. 1996; 10:3129-3140)，而I3DGF會(huì)增強(qiáng)祖細(xì)胞的神經(jīng)元分化(GenesDev. 1996; 10:3129-3140;Neuron 1997;18:553-562)。最近已經(jīng)證實(shí)，成年人再生的神經(jīng)元實(shí)際上整合進(jìn)現(xiàn)存的腦回路中，并繼續(xù)改善神經(jīng)性缺乏(Cell 2002; 110:429441)。令人感興趣地，觀察結(jié)果還已經(jīng)表明，神經(jīng)發(fā)生不僅發(fā)生在嗅球和海馬的水平。在這方面，已經(jīng)提示，該過(guò)程也可以發(fā)生在成年小鼠黑質(zhì)中，這開(kāi)啟了帕金森病治療研究的一片新天地(Proc.Natl. Acad. Sci. USA 2003;100:7925-7930)。繁殖神經(jīng)祖細(xì)胞和操縱它們的細(xì)胞命運(yùn)的能力，對(duì)于神經(jīng)學(xué)疾病(其中喪失特定細(xì)胞類(lèi)型)的移植療法而言具有深遠(yuǎn)影響。例如，帕金森病(PD)的特征在于，黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元的退化。ro患者的先前移植治療已經(jīng)使用取自中腦腹側(cè)的胎兒組織(在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元正發(fā)生終末分化時(shí))(Prog. Neurobiol. 1994;44:1-35)。已經(jīng)將這些細(xì)胞移植到紋狀體上，它們?cè)诖颂幮纬膳c宿主紋狀體神經(jīng)元(它們的通常突觸靶物)的突觸接觸。這會(huì)恢復(fù)多巴胺周轉(zhuǎn)，并釋放至正常水平，對(duì)患者具有顯著的功能益處(Prog.Neurobiol. 1994;44:1-35)。但是，胎兒組織的移植受到倫理考慮和供體組織缺乏的限制。 成年NSC的繁殖和操縱可以潛在地提供許多確定地表征的細(xì)胞，用于諸如H)等神經(jīng)變性疾病的基于移植的策略。為此目的，掌控神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型的增殖和分化的因素和途徑的鑒別，是根本性地重要的。研究已經(jīng)表明，EGF和基礎(chǔ)FGF的心室內(nèi)輸注都會(huì)誘導(dǎo)成年腦室壁細(xì)胞群的增殖。在EGF的情況下，已經(jīng)觀察到祖細(xì)胞向鄰近的紋狀體實(shí)質(zhì)中的廣泛遷移(J. Neurosci1996; 16:2649-2658; J. Neurosci 1997; 17:5820-5829)。EGF 會(huì)增加向神經(jīng)膠質(zhì)譜系的分化，并減少神經(jīng)元的產(chǎn)生(J. Neurosci 1997;17:5820-5829)。另外，BDNF在成年大鼠中的心室內(nèi)輸注會(huì)增加在嗅球和嘴側(cè)遷移流中和在實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)(包括紋狀體、隔膜、丘腦和下丘腦)中新產(chǎn)生的神經(jīng)元的數(shù)目(J. Neurosci. 2001;21:6706-6717)。因而，幾項(xiàng)研究已經(jīng)表明，可以刺激在LVW的SVZ內(nèi)的祖細(xì)胞的增殖，且可以引導(dǎo)它們的譜系成為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)命運(yùn)。然而，已知會(huì)影響體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的因素的數(shù)目較小，且它們的作用是不利的或有限的。如上所述，掌控神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型的增殖和分化的因素和途徑的鑒別，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中是根本性地重要的。乙酰基L-肉堿或丙?；鵏-肉堿在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用是已知的。US 4346107涉及乙?；鵏-肉堿用于治療性處理大腦代謝受損的患者(例如在老年和老年前期精神運(yùn)動(dòng)涉及狀態(tài)，和在老年和老年前期癡呆中)的用途。US 4343816涉及乙?；鵏-肉堿用于治療性處理具有周?chē)芗膊?諸如通常，雷諾病)的患者的用途。WO 9857629涉及乙?；鵏-肉堿用于治療性處理遭受情緒障礙的年輕個(gè)體的用途，基于DMS IV和AXIS II分類(lèi)，所述情緒障礙可分類(lèi)為心境惡劣(DMS IV)和抑郁的、易發(fā)怒的、循環(huán)型情感性人格或性情，包括精神藥品的明確濫用。WO 03066041涉及乙?；鵏-肉堿用于治療性處理具有嚴(yán)重抑郁障礙的非癡呆型老年受試者(NDG-MDD)的抑郁癥的用途。EP 0256999涉及乙酰基L-肉堿用于治療性處理受急性或慢性周?chē)窠?jīng)病影響的患者的用途。
EP 0498144涉及乙酰基L-肉堿用于治療性處理傷損昏憒的用途。在該公開(kāi)中還報(bào)道稱(chēng)，乙酰基L-肉堿能夠增加大腦血流量(CBF)，這借助于SPECT (單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù))測(cè)得。EP 0793962涉及丙?；鵏-肉堿用于治療具有嚴(yán)重失能型間歇性跛行的患者的慢性閉塞性動(dòng)脈硬化的用途。已經(jīng)公認(rèn)，在整個(gè)生命中，由神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞(NSC)在成年海馬中產(chǎn)生新神經(jīng)元。神經(jīng)發(fā)生是對(duì)外界刺激響應(yīng)性的再生過(guò)程，涉及學(xué)習(xí)、記憶和情緒調(diào)節(jié)。因此，認(rèn)為神經(jīng)發(fā)生是神經(jīng)再生的一種重要形式，這使生物體能夠在整個(gè)生命中適應(yīng)環(huán)境變化。海馬神經(jīng)發(fā)生的速率隨生理性或病理性影響(諸如體育活動(dòng)、環(huán)境強(qiáng)化、應(yīng)激、情緒障礙、老化和神經(jīng)變性障礙)顯著地變化。實(shí)際上，在老化過(guò)程中，在成年人神經(jīng)發(fā)生中存在年齡相關(guān)的下降。該下降主要與減少的增殖有關(guān)，與對(duì)老化腦中的增殖的刺激減少有關(guān)。天然的或刺激性的海馬神經(jīng)發(fā)生在抗抑郁藥的臨床效果中起重要作用，且可能減少的神經(jīng)發(fā)生可能涉入與抑郁癥有關(guān)的腦區(qū)(包括海馬)萎縮。在阿爾茨海默氏病(AD)中，也存在減少的神經(jīng)發(fā)生(其伴隨該疾病的神經(jīng)元損失特征)的證據(jù)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，認(rèn)知到具有可獲得的新化合物或已知化合物的新用途的需要，所述化合物可用于刺激神經(jīng)發(fā)生，用于預(yù)防在腦的正?；虿±磉^(guò)程中的神經(jīng)元損失。


圖I表明，ALC對(duì)干細(xì)胞/成年祖細(xì)胞向成熟的和未成熟的神經(jīng)元的分化具有濃度依賴(lài)性的強(qiáng)化作用。實(shí)際上，ALC具有顯著的濃度依賴(lài)性的海馬神經(jīng)發(fā)生活性，正如培養(yǎng)物中MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞(即新神經(jīng)元)的百分比的增加所證實(shí)的。圖2顯示了通過(guò)免疫熒光染色通過(guò)培養(yǎng)的神經(jīng)元中的MAP-2染色評(píng)價(jià)的ALC的海馬神經(jīng)發(fā)生活性(MAP2-陽(yáng)性細(xì)胞)。細(xì)胞核被Draq5染色。圖3和4表明，ALC的神經(jīng)發(fā)生活性與神經(jīng)保護(hù)活性無(wú)關(guān)。實(shí)際上，在誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的濃度，ALC (100μΜ;300μΜ或ImM)沒(méi)有降低凋亡細(xì)胞核的百分比(圖3)或甚至LDH酶的活性(壞死的一項(xiàng)指標(biāo))(圖4)。在圖5中顯示了 ALC對(duì)處于不同分化階段的細(xì)胞的特異性效應(yīng)。為了更好地理解圖5，重要的是澄清，使用“巢蛋白”(主要由神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的一種中間絲蛋白)作為特異性標(biāo)志物。實(shí)際上，當(dāng)置于神經(jīng)干細(xì)胞所用的培養(yǎng)條件中時(shí)，僅巢蛋白陽(yáng)性的(巢蛋白+)細(xì)胞形成球。具體地，成熟的神經(jīng)元是ΜΑΡ2陽(yáng)性的和巢蛋白陰性的，未成熟的神經(jīng)元是ΜΑΡ2和巢蛋白二者陽(yáng)性的，干祖細(xì)胞是ΜΑΡ2陰性的和巢蛋白陽(yáng)性的，祖細(xì)胞是ΜΑΡ2和巢蛋白二者陰性的(參見(jiàn)圖5)。在圖6中表明，PLC和ALC是NPC神經(jīng)元分化的活化劑。實(shí)際上，PLC會(huì)增加成熟的神經(jīng)元和未成熟的神經(jīng)元的數(shù)目，并減少未分化的干/神經(jīng)祖細(xì)胞的亞群的數(shù)目，盡管與ALC相比是在更低的程度上。相反，LC不具有作用。此外，結(jié)果證實(shí)，ALC和PLC對(duì)NPC分化的影響不是由于對(duì)新產(chǎn)生的未成熟的或成熟的神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用?！?同義詞乙?；鵏-肉堿=ALC=ALCAR=L_acet ;丙?；?L-肉堿=PLC=L-Prop ；LC=L-肉喊=L_car )。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生的烷?；鵏-肉堿或其鹽。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是，用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿或其鹽。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是，用作用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙?；鵏-肉堿；其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，用作用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生的藥物或食品添加物 的乙酰基L-肉堿或丙?；鵏-肉堿；其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防由老化或遺傳傾向?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)障礙。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，用作用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂的藥物或食品添加物的乙?；鵏-肉堿或丙酰基L-肉堿，其中所述疾病或紊亂的原因是由老化或遺傳傾向?qū)е碌纳窠?jīng)元損失。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，用作用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂的藥物或食品添加物的乙?；鵏-肉堿或丙酰基L-肉堿，其中所述疾病或紊亂對(duì)增加的神經(jīng)發(fā)生有響應(yīng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，乙?；鵏-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽用于制備藥物或食品添加物的用途，所述藥物或食品添加物用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生；其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿或其鹽用于制備藥物或食品添加物的用途，所述藥物或食品添加物用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生；其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防由老化或遺傳傾向?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)障礙。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，乙酰基L-肉堿或丙?；鵏-肉堿用于制備藥物或食品添加物的用途，所述藥物或食品添加物用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂，其中所述疾病或紊亂的原因是由老化或遺傳傾向?qū)е碌纳窠?jīng)元損失。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，乙酰基L-肉堿或丙?；鵏-肉堿用于制備藥物或食品添加物的用途，所述藥物或食品添加物用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂，其中所述疾病或紊亂對(duì)增加的神經(jīng)發(fā)生有響應(yīng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，一種用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的方法，其中給有此需要的患者施用適用于增加神經(jīng)發(fā)生的量的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，一種用于預(yù)防由老化或遺傳傾向?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)障礙的方法，其中給有此需要的患者施用適用于增加神經(jīng)發(fā)生的量的乙酰基L-肉堿或丙?；鵏-肉喊。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，一種用于增加神經(jīng)發(fā)生的方法，其中給有此需要的患者施用適用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的量的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，一種用于增加神經(jīng)發(fā)生的方法，其中給有此需要的患者施用適用于預(yù)防由老化或遺傳傾向?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)障礙的量的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉喊。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，一種用于增加神經(jīng)發(fā)生的方法，其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙，其中給有此需要的患者長(zhǎng)期施用合適量的乙?；鵏-肉堿或丙酰基L-肉堿。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，一種用于增加神經(jīng)發(fā)生的方法，其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防由老化或遺傳傾向?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)障礙，其中給有此需要的患者長(zhǎng)期施用合適量的乙?；鵏-肉堿或丙酰基L-肉堿。根據(jù)本發(fā)明可以預(yù)防的由遺傳傾向?qū)е碌暮?或與老化相關(guān)的疾病或紊亂選自神經(jīng)變性障礙、帕金森病和帕金森障礙、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化、Shy-Drager綜合征、Lewy體病、脊椎缺血、缺血性中風(fēng)、腦梗死、老年癡呆、其它認(rèn)知損害和抑郁癥。顯然，根據(jù)本發(fā)明，不包括具有神經(jīng)(例如受損神經(jīng))或CNS (例如傷損昏憒)的創(chuàng)傷性紊亂的患者?！吧窠?jīng)發(fā)生”在本文中被定義為，神經(jīng)細(xì)胞在體內(nèi)或在體外的增殖、分化、遷移或存活。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述神經(jīng)細(xì)胞是成年人的、胎兒的或胚胎的神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞。神經(jīng)發(fā)生也表示細(xì)胞數(shù)目的凈增加或細(xì)胞存活的凈增加。本文使用的“NSC”至少包括，所有腦干細(xì)胞、所有腦祖細(xì)胞和所有腦前體細(xì)胞。在本公開(kāi)內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)疾病或障礙應(yīng)當(dāng)具有相同的含義。乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿可以全身性施用，或直接施用進(jìn)患者的CNS中。施用途徑包括口服、皮下的、透皮的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、腦室內(nèi)的、實(shí)質(zhì)內(nèi)的、鞘內(nèi)的、顱內(nèi)的、經(jīng)頰的、粘膜的、鼻的、經(jīng)肺的和直腸的施用，或通過(guò)脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)施用。優(yōu)選地，所述藥物組合物用于通過(guò)刺激神經(jīng)發(fā)生(B卩，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、存活和/或分化)而預(yù)防疾病。就預(yù)防而言，本發(fā)明的方法包括在O. Ig/天至4. OOg/天的劑量范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1-2. OOg/天的劑量范圍內(nèi)，最優(yōu)選地以I. 5g/天,在單次或多次劑量中， 給受試者施用有效量的包括乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿的藥物組合物。本發(fā)明的組合物可以另外包含生理上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明，生理上可接受的載體可以是本領(lǐng)域已知適用于制藥(即，局部的、口服的和腸胃外的)用途的任何載體。合適的藥用載體和制劑描述在，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 19 版)(Genarro 編(1995)Mack PublishingCo. , Easton, Pa.)。本發(fā)明的任意方法可以用于預(yù)防神經(jīng)學(xué)疾病或障礙的征狀，諸如帕金森病(震顫麻痹)，包括原發(fā)性帕金森病、繼發(fā)性帕金森綜合征和腦炎后帕金森綜合征；藥物誘發(fā)的運(yùn)動(dòng)障礙，包括帕金森綜合征、急性張力失常、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)安定藥惡性綜合征；亨廷頓病(亨廷頓舞蹈??；慢性進(jìn)行性舞蹈?。贿z傳性舞蹈病)；譫妄(急性精神混亂狀態(tài))；癡呆；阿爾茨海默氏??；非阿爾茨海默氏癡呆，包括Lewy體癡呆、血管性癡呆、賓斯旺格癡呆(皮層下動(dòng)脈硬化性腦病)、拳擊員癡呆、正常壓力腦積水、全身輕癱、額顳癡呆、多發(fā)梗塞性癡呆和AIDS癡呆；年齡相關(guān)的記憶病損(AAMI);遺忘癥，諸如逆行性遺忘癥、順行性遺忘癥、完全性遺忘癥、情態(tài)特異性的遺忘癥、短暫性遺忘癥、穩(wěn)定性遺忘癥和進(jìn)行性遺忘癥；和科爾薩科夫病。其它疾病和障礙包括特發(fā)性直立性低血壓、Shy-Drager綜合征、進(jìn)行性核上麻痹(Steele-Richardson-Olszewski綜合征)；小腦結(jié)構(gòu)損傷，諸如與梗塞、出血或腫瘤有關(guān)的那些；脊髓小腦退化，諸如與弗里德賴(lài)希共濟(jì)失調(diào)有關(guān)的那些，無(wú)β脂蛋白血癥(例如，Bassen-Kornzweig綜合征,維生素E缺乏)、雷夫蘇姆病(植燒酸忙積病)、小腦性共濟(jì)失調(diào)、多系統(tǒng)萎縮(橄欖體腦橋小腦萎縮)、共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)管擴(kuò)張和線(xiàn)粒體多系統(tǒng)障礙；急性播散性腦脊髓炎(感染后腦脊髓炎)；腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良和腎上腺髓質(zhì)神經(jīng)病；萊貝爾遺傳性視神經(jīng)萎縮；HTLV-相關(guān)的脊髓??；和多發(fā)性硬化；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元障礙，諸如肌萎縮側(cè)索硬化、進(jìn)行性延髓麻痹、進(jìn)行性肌萎縮、原發(fā)性側(cè)索硬化和進(jìn)行性假性延髓麻痹和脊髓性肌萎縮，諸如I型脊髓性肌萎縮(Werdnig-Hoffman病)、II型(中間)脊髓性肌萎縮、III型脊髓性肌萎縮(Wohlfart-Kugelberg-Welander病)和IV型脊髓性肌萎縮。本發(fā)明的方法可以用于治療任意哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)、牛、馬、狗、綿羊和貓。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法被用于治療人類(lèi)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了神經(jīng)障礙的再生性預(yù)防，其中刺激細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)生長(zhǎng)、增殖、遷移、存活和/或分化，以替代已經(jīng)喪失或破壞的神經(jīng)細(xì)胞。通過(guò)在適當(dāng)制劑中給細(xì)胞局部地施用(通過(guò)任意途徑)本發(fā)明的神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)劑，可以實(shí)現(xiàn)這樣的細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)的體內(nèi)刺激。適合用于本發(fā)明中的藥物組合物包括這樣的組合物其中含有實(shí)現(xiàn)它的預(yù)期目的 有效量的活性成分。更具體地，治療有效量是指，最佳地刺激(例如，干細(xì)胞或祖細(xì)胞)增殖的有效量。應(yīng)當(dāng)理解，在每個(gè)劑型的單個(gè)劑量中包含一種或多種活性成分的單位含量不需要自身構(gòu)成有效量，因?yàn)橥ㄟ^(guò)施用多個(gè)劑量單位(諸如膠囊劑或片劑或其組合)可以達(dá)到需要的有效量。另外，應(yīng)當(dāng)理解，在某些劑量水平，有效量可能在使用I周、I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月或I年或更久以后不會(huì)表現(xiàn)出任何可測(cè)量的效應(yīng)(所述可測(cè)量的效應(yīng)可以是衰退的缺少)。有效量的確定屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力。任何特定用戶(hù)的具體劑量水平將取決于多種因素，包括年齡、體育活動(dòng)水平、一般健康和要預(yù)防的障礙的嚴(yán)重性。對(duì)于任意化合物，最初可以在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中或在動(dòng)物模型(通常小鼠或大鼠)中估測(cè)治療有效劑量。所述動(dòng)物模型也可以用于確定適當(dāng)?shù)臐舛确秶徒o藥途徑。這樣的信息然后可以用于確定對(duì)于在人類(lèi)中施用而言有用的劑量和途徑。對(duì)于人受試者而言，精確有效劑量取決于疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性，受試者的一般健康，受試者的年齡、體重和性別，飲食，給藥時(shí)間和頻率，對(duì)治療的反應(yīng)敏感性和耐受性/應(yīng)答。該量可以通過(guò)例行試驗(yàn)來(lái)確定，且由臨床醫(yī)師判斷。乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿的鹽是，與不會(huì)產(chǎn)生毒副作用的酸形成的任意鹽。這樣的鹽的非限制性實(shí)例是氯化物、溴化物、乳清酸鹽、天冬氨酸鹽、酸性天冬氨酸鹽、酸性檸檬酸鹽、檸檬酸鎂、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、富馬酸鹽和酸性富馬酸鹽、富馬酸鎂、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽和酸性馬來(lái)酸鹽、草酸鹽、酸性草酸鹽、撲酸鹽、酸性撲酸鹽、硫酸鹽、酸性硫酸鹽、磷酸葡萄糖、酒石酸鹽和酸性酒石酸鹽、甘油磷酸鹽、粘酸鹽、酒石酸鎂、2-氨基-乙磺酸鹽、2-氨基-乙磺酸鎂、甲磺酸鹽、酒石酸膽堿、三氯乙酸鹽和三氟乙酸鹽。在出版物Int. J. of Pharm. 33 (1986)，201-217中，給出了 FDA批準(zhǔn)的藥學(xué)上可接受的鹽的列表。乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿是已知的化合物，它們的制備方法描述在US4，254，053中。它們的獲得因此是非常容易的，因?yàn)檫@些產(chǎn)品目前已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間面市，且具有適合人類(lèi)施用的等級(jí)。如在下面報(bào)道的實(shí)驗(yàn)部分中所證實(shí)的，根據(jù)本發(fā)明的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿的神經(jīng)發(fā)生活性與它們的神經(jīng)保護(hù)活性無(wú)關(guān)。實(shí)際上，在誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的濃度，乙?；鵏-肉堿和丙?；鵏-肉堿沒(méi)有降低凋亡細(xì)胞核的百分比或LDH酶的活性(壞死的一項(xiàng)指標(biāo))。下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步例證了本發(fā)明。實(shí)施例IALC在體外調(diào)節(jié)取自小鼠海馬的成年神經(jīng)祖細(xì)胞的神經(jīng)元分化。前言甚至在成年期中，發(fā)生與細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活有關(guān)的復(fù)雜的事件集合，所述事件表征從神經(jīng)干細(xì)胞開(kāi)始的成年神經(jīng)發(fā)生。這些事件主要發(fā)生在腦中的2個(gè)分開(kāi)的區(qū) 域中海馬齒狀筋膜的顆粒下區(qū)(顆粒下區(qū)，SGZ)和側(cè)腦室壁中的室下區(qū)(室下區(qū)，SVZ)，認(rèn)為這些區(qū)域是使干細(xì)胞能存活和定期地且不對(duì)稱(chēng)地分裂的有利微環(huán)境(小生境)，從而產(chǎn)生快速分裂的祖細(xì)胞，其中的一些向神經(jīng)元分化前進(jìn)。材料和方法動(dòng)物和培養(yǎng)的海馬神經(jīng)球的制備。如以前在Denis-Donini S.等人J. Neuroscience, 2008中所述,制備來(lái)自小鼠海馬的成年干細(xì)胞，并以神經(jīng)球的形式維持培養(yǎng)。具體地，根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法律，使用3-5個(gè)月齡的雄性CDl小鼠。干細(xì)胞/成年神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖。解離4-12代的神經(jīng)球，以IXlO5細(xì)胞/ml的密度鋪板在96-孔板內(nèi)的不同濃度的ALC (O. l_2mM)或媒介物中。在24、48、72和96小時(shí)以后，使用CellTiter-GlowTM發(fā)光的試劑盒(Promega)處理所述細(xì)胞，以測(cè)量存在的細(xì)胞ATP的量。干細(xì)胞/成年神經(jīng)祖細(xì)胞的分化。為了分化，解離從4-12代的海馬神經(jīng)球衍生出的細(xì)胞，以約40，000細(xì)胞/cm2的密度，鋪板在預(yù)先用小鼠層粘連蛋白(2. 5 μ g/cm2, Sigma)包被的Lab-Tek 8_孔permanox室載玻片(Nunc, Wiesbaden,德國(guó))上。分化培養(yǎng)基的組成是Neurobasal_A、添加物B27、谷氨酰胺2mM、100U/100 μ g/ml青霉素/鏈霉素。將ALC (O. l_2mM)或媒介物加入所述培養(yǎng)基中。在24小時(shí)以后，洗滌細(xì)胞，在4%低聚甲醛中固定20min，隨后使用免疫熒光進(jìn)行分析。使用免疫熒光的分析。在PBS中洗滌在有ALC、媒介物或參照藥物存在下分化以后固定的細(xì)胞3次，通過(guò)與補(bǔ)充了 0.48% (vol/vol) Triton X-100 (Sigma)的 PBS—起在室溫溫育 5min,進(jìn)行滲透化處理。隨后，與下述第一抗體一起溫育細(xì)胞抗-巢蛋白小鼠單克隆抗體，1:1200, Abeam, Cambridge, MA);抗-MAP-2 (兔多克隆抗體，1:600，Chemicon)。在含有8% (vol/vol)山羊血清的溶液中，在第一抗體中在室溫溫育所述細(xì)胞150min。使用的第二抗體是:Alexa Fluor 594-綴合的驢抗-小鼠抗體(1:1400，Molecular Probes)、AlexaFluor 488-綴合的驢抗-兔(1:1600，Molecular Probes),在含有 16% (vol/vol)驢血清的溶液中。然后用在PBS中制備的Draq5 (1:2000, Alexis Biochemicals)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染色。使用突光封固劑(DakoCytomation, Glostrup),裝配載玻片。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，如果用于辨別它們的一種或多種表現(xiàn)型標(biāo)志物是陽(yáng)性的，那么定量至少5個(gè)視野/孔的細(xì)胞(與約150個(gè)細(xì)胞相對(duì)應(yīng)):未分化的干祖細(xì)胞、未成熟的神經(jīng)元、成熟的神經(jīng)元。由操作人員(不知曉細(xì)胞經(jīng)歷的處理的性質(zhì))使用具有60X透鏡的ECLIPSEE600熒光顯微鏡(NIKON，Calenzano，意大利)，計(jì)數(shù)細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)在至少5個(gè)細(xì)胞制品上進(jìn)行，一式三份地制作每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。評(píng)估和細(xì)胞存活。在有ALC、媒介物或參照藥物存在下分化以后，收集培養(yǎng)基，使用細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒LDKRoche Applied Science)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，測(cè)定LDH酶的活性，以定量由壞死導(dǎo)致的死亡。平行地，也為了評(píng)估凋亡性死亡，在固定以后，用在PBS中稀釋的O. 8ng/mlHoechst (Sigma-Aldrich)標(biāo)記細(xì)胞核。由操作人員(不知曉細(xì)胞經(jīng)歷的處理的性質(zhì))使用具有60X透鏡的ECLIPSE E600熒光顯微鏡(NIKON, Calenzano,意大利)，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞核。所有實(shí)驗(yàn)在至少5個(gè)細(xì)胞制品上進(jìn)行，一式三份地制作每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。結(jié)果在該研究中，使用微管相關(guān)蛋白2 (MAP2)作為神經(jīng)元特異性的標(biāo)志物。MAP-2是腦組織的主要微管相關(guān)蛋白。有人指出，MAP2在某些類(lèi)型的神經(jīng)元中的表達(dá)水平高于在其它類(lèi)型的神經(jīng)元中。已知MAP2會(huì)促進(jìn)微管裝配，并在微管上形成側(cè)臂，這是神經(jīng)發(fā)生的一個(gè)必需步驟。它也會(huì)與神經(jīng)絲、肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架的其它元件相互作用。在來(lái)自小鼠海馬的成年神經(jīng)球中，與丙戊酸(VPA，一種陽(yáng)性的神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)劑)相t匕，已經(jīng)證實(shí),ALC對(duì)干細(xì)胞/成年祖細(xì)胞分化成成熟的和未成熟的神經(jīng)元具有劑量依賴(lài)性的強(qiáng)化作用(圖I)。實(shí)際上，ALC具有顯著的濃度依賴(lài)性的海馬神經(jīng)發(fā)生活性，正如培養(yǎng)物中MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞的百分比的增加所證實(shí)的。還通過(guò)免疫熒光染色，通過(guò)培養(yǎng)的神經(jīng)元中的MAP-2染色(綠色)評(píng)價(jià)了 ALC的海馬神經(jīng)發(fā)生活性。細(xì)胞核被Draq5染色(圖2)。ALC的神經(jīng)發(fā)生活性與神經(jīng)保護(hù)活性無(wú)關(guān)。實(shí)際上，在誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生的濃度，ALC(100 μ M; 300 μ M或ImM)沒(méi)有降低凋亡細(xì)胞核的百分比(圖3)或甚至沒(méi)有降低培養(yǎng)基中的LDH酶的活性(壞死的一項(xiàng)指標(biāo))(圖4)。使用巢蛋白(主要由神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的一種中間絲蛋白)作為特異性標(biāo)志物。實(shí)際上，當(dāng)置于神經(jīng)干細(xì)胞所用的培養(yǎng)條件中時(shí)，僅巢蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞形成球。具體地，成熟的神經(jīng)元是ΜΑΡ2陽(yáng)性的和巢蛋白陰性的，未成熟的神經(jīng)元是ΜΑΡ2和巢蛋白二者陽(yáng)性的，干/祖細(xì)胞是ΜΑΡ2陰性的和巢蛋白陽(yáng)性的，祖細(xì)胞是ΜΑΡ2和巢蛋白二者陰性的(圖5)。ALC處理會(huì)增加成熟的神經(jīng)元的數(shù)目(以濃度依賴(lài)性的方式)以及未成熟的神經(jīng)元的數(shù)目；ALC對(duì)干/祖細(xì)胞的數(shù)目沒(méi)有影響，并減少了祖細(xì)胞的數(shù)目。在圖1-6中報(bào)告的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，ALC和PLC能夠促進(jìn)成年小鼠海馬神經(jīng)祖細(xì)胞的神經(jīng)元分化。具體地，ALC會(huì)增加成熟的神經(jīng)元和未成熟的神經(jīng)元的數(shù)目；減少未分化的干/神經(jīng)祖細(xì)胞的亞群的數(shù)目；并實(shí)現(xiàn)不是歸因于它的神經(jīng)保護(hù)作用的活性。實(shí)施例2ALC、PLC和LC對(duì)取自小鼠海馬的成年神經(jīng)祖細(xì)胞的神經(jīng)元分化的調(diào)節(jié)的體外對(duì)t匕在實(shí)施例2中，通過(guò)使用與實(shí)施例I相同的實(shí)驗(yàn)規(guī)程，已經(jīng)在成年神經(jīng)祖細(xì)胞的體外模型中將ALC (ImM)作為成年海馬神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)劑的活性與丙?；?L-肉堿(PLC)(O. 3-lmM)和L-肉堿(LC) (O. 3_lmM)的活性進(jìn)行了對(duì)比。如圖6所示，與ALC相比，PLC似乎是NPC神經(jīng)元分化的效力更低的活化劑。實(shí)際上，PLC會(huì)增加成熟的神經(jīng)元和未成熟的神經(jīng)元的數(shù)目，并減少未分化的干/神經(jīng)祖細(xì)胞的亞群的數(shù)目，盡管與ALC相比是在更低的程度上。相反，LC不具有 作用。此外，結(jié)果證實(shí)，ALC和PLC對(duì)NPC分化的影響不是由于對(duì)新產(chǎn)生的未成熟的或成熟的神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生的乙?；鵏-肉堿或丙酰基L-肉堿或其鹽。
2.用作用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生的藥物或食品添加物的乙酰基L-肉堿或丙?；鵏-肉堿；其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。
3.用作用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生的藥物或食品添加物的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿；其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防由老化或遺傳傾向?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)障礙。
4.用作用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂的藥物或食品添加物的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿，其中所述疾病或紊亂的原因是由老化或遺傳傾向?qū)е碌纳窠?jīng)元損失。
5.用作用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂的藥物或食品添加物的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿，其中所述疾病或紊亂對(duì)增加的神經(jīng)發(fā)生有響應(yīng)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿的鹽選自氯化物、溴化物、乳清酸鹽、天冬氨酸鹽、酸性天冬氨酸鹽、酸性檸檬酸鹽、檸檬酸鎂、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、富馬酸鹽和酸性富馬酸鹽、富馬酸鎂、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽和酸性馬來(lái)酸鹽、草酸鹽、酸性草酸鹽、撲酸鹽、酸性撲酸鹽、硫酸鹽、酸性硫酸鹽、磷酸葡萄糖、酒石酸鹽和酸性酒石酸鹽、甘油磷酸鹽、粘酸鹽、酒石酸鎂、2-氨基-乙磺酸鹽、2-氨基-乙磺酸鎂、甲磺酸鹽、酒石酸膽堿、三氯乙酸鹽或三氟乙酸鹽。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中以O(shè).1-4. OOg/天的劑量，優(yōu)選地以1-2. OOg/天的劑量，最優(yōu)選地以I. 5g/天的劑量，在單次或多次劑量中，施用乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中通過(guò)選自下述的腸內(nèi)途徑或腸胃外途徑，施用乙?；鵏-肉堿或丙酰基L-肉堿口服、皮下的、透皮的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、腦室內(nèi)的、實(shí)質(zhì)內(nèi)的、鞘內(nèi)的、顱內(nèi)的、經(jīng)頰的、粘膜的、鼻的、經(jīng)肺的、直腸的途徑，或脂質(zhì)體給藥。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中根據(jù)本發(fā)明可以預(yù)防的由遺傳傾向?qū)е碌暮?或與老化相關(guān)的疾病或紊亂選自神經(jīng)變性障礙、帕金森病和帕金森障礙、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化、Shy-Drager綜合征、Lewy體病、脊椎缺血、缺血性中風(fēng)、腦梗死、老年癡呆、其它認(rèn)知損害和抑郁癥。
10.用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的方法，其中給有此需要的患者施用適用于增加神經(jīng)發(fā)生的量的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿或其鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙是由于老化或遺傳傾向?qū)е碌摹?br> 12.用于增加神經(jīng)發(fā)生的方法，其中給有此需要的患者施用適用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的量的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿或其鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙是由于老化或遺傳傾向?qū)е碌摹?br> 14.用于增加神經(jīng)發(fā)生的方法，其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙，其中給有此需要的患者長(zhǎng)期施用合適量的乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿或其鹽。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙是由于老化或遺傳傾向?qū)е碌摹?br> 全文摘要
本文描述的發(fā)明涉及乙?；鵏-肉堿或丙?；鵏-肉堿或其鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于增加神經(jīng)組織的神經(jīng)發(fā)生；其中所述增加的神經(jīng)發(fā)生可用于預(yù)防由老化或遺傳傾向?qū)е碌闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)障礙。
文檔編號(hào)A61P25/16GK102939084SQ201180029252
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月16日
發(fā)明者M·戈雷里, P·L·卡諾尼克, A·科沃里奇 申請(qǐng)人:希格馬托制藥工業(yè)公司