專利名稱：呼吸道合胞病毒抗原組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及用于預(yù)防呼吸道合胞病毒感染的組合物和方法，特別是包含抗原表位的多層膜組合物。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是造成全世界嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道疾病的最重要原因，也威脅著老年人和免疫缺陷患者。在美國，RSV感染每年導(dǎo)致多至126，000個(gè)嬰兒住院治療，以及多至60，000個(gè)老年人住院治療。因?yàn)樽匀籖SV感染不誘發(fā)持久的長期免疫，所以患者在一生中均可以被 相同或不同的病毒株再感染。RSV與繼發(fā)感染如中耳炎相關(guān)，其可使得幼兒在之后易于患哮喘相關(guān)疾病。在經(jīng)過40多年的努力以后，依舊沒有安全有效的RSV疫苗。在二十世紀(jì)六十年代最早嘗試開發(fā)出的福爾馬林滅活明帆沉淀RSV (formalin-1nactivatedalum-precipitated RSV,FI_RSV)疫苗實(shí)際上表現(xiàn)出易于使被接種的兒童在隨后的自然感染中患上更加嚴(yán)重的疾病甚至是死亡。尚未全面表征出該應(yīng)答的準(zhǔn)確機(jī)制，但是其似乎依賴于使免疫應(yīng)答向以細(xì)胞因子和趨化因子途徑之不恰當(dāng)活化為特征的炎性Th2優(yōu)勢表型(Th2_dominant phenotype)偏移?？紤]到RSV疾病對經(jīng)濟(jì)的影響(2004年在美國估計(jì)為每年近700百萬美元)以及RSV感染嬰兒、老人和免疫缺陷患者可造成的威脅生命的并發(fā)癥，開發(fā)安全有效的RSV疫苗極為重要。需要適于刺激針對RSV之免疫應(yīng)答的改進(jìn)的抗原組合物。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含來自RSV的第一多肽表位和來自RSV的第二多肽表位，其中第一多肽表位和第二多肽表位與一種或更多種聚電解質(zhì)共價(jià)相連，其中所述一種或更多種聚電解質(zhì)在一個(gè)或更多個(gè)多層膜中，其中所述一個(gè)或更多個(gè)多層膜各包含兩層或更多層聚電解質(zhì)，其中相鄰的層包含帶相反電荷的聚電解質(zhì)，其中聚電解質(zhì)包括分子量大于1，000并且每分子至少帶5個(gè)電荷的聚陽離子材料或聚陰離子材料，其中來自RSV的第一多肽表位和來自RSV的第二多肽表位存在于同一多層膜或不同的多層膜中。在另一實(shí)施方案中，組合物包含來自RSV的第一多肽表位和來自RSV的第二多肽表位，其中第一多肽表位和第二多肽表位為一個(gè)或更多個(gè)多層膜的形式，其中所述一個(gè)或更多個(gè)多層膜各包含兩層或更多層聚電解質(zhì)，其中相鄰的層包含帶相反電荷的聚電解質(zhì)，其中多層膜的至少一種聚電解質(zhì)包含經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽，其中經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽帶有足以與帶相反電荷的表面穩(wěn)定結(jié)合的電荷，其中經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽包含來自RSV的第一多肽表位、來自RSV的第二多肽表位或二者，其中不是經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽的聚電解質(zhì)包括分子量大于1，000并且每分子至少帶5個(gè)電荷的聚陽離子材料或聚陰離子材料，其中來自RSV的第一多肽表位和來自RSV的第二多肽表位存在于同一多層膜或不同的多層膜中。組合物包含與一種或更多種聚電解質(zhì)共價(jià)連接的RSV-G多肽表位，其中所述一種或更多種聚電解質(zhì)在一個(gè)或更多個(gè)多層膜中，其中所述一個(gè)或更多個(gè)多層膜各包含兩層或更多層聚電解質(zhì)，其中相鄰的層包含帶相反電荷的聚電解質(zhì)，其中聚電解質(zhì)包括分子量大于1，000并且每分子至少帶5個(gè)電荷的聚陽離子材料或聚陰離子材料。


圖1 :完整ACT-2044(SEQ ID NO 8)的MH6+6電荷態(tài)的放大FT-1CR質(zhì)譜圖。全氧化肽的預(yù)期單同位素m/z = 1015. 43，實(shí)測值=1015.6008。該結(jié)果與ACT-2044中兩個(gè)分子內(nèi)~硫鍵完全相符。圖2 ACT-2086 (SEQ ID NO : 13)的 FT-1CR 質(zhì)譜圖。MH9+9 單同位素峰的 m/z 為867. 1571，對應(yīng)于7795. 344amu的單同位素質(zhì)量，其非常接近于7795. 33amu的單同位素質(zhì)量計(jì)算值。該結(jié)果完全與ACT-2086中兩個(gè)二硫鍵的存在符合。圖3 :在每一 ELBL成層步驟后測量的納米顆粒的表面(;)電勢。未包被顆粒(EP)具有正4值。包被單層PGA得到負(fù)4值。隨后用經(jīng)設(shè)計(jì)的肽ACT-2031、多肽PGA和PLL、或經(jīng)設(shè)計(jì)的肽ACT-2044進(jìn)行的成層步驟造成;電勢交替正或負(fù)移，表明成功的ELBL步驟。圖4:通過足墊注射用納米顆粒ACT-1042 (SEQ ID NO 8 ； RSV-G164^191)免疫BALB/c小鼠三次；獲取血清并且用ELISA進(jìn)行測定。血清識(shí)別RSV-G CX3C構(gòu)象表位肽ACT-2044(SEQ ID NO 8)。圖5 :通過足墊注射用納米顆粒 ACT-1042(SEQ ID NO 8 ;RSV_G164_191)免疫 BALB/c小鼠三次；獲取血清并且用ELISA進(jìn)行測定。血清不識(shí)別同一肽通過半胱氨酸殘基加帽來線性化的形式(ACT-2054 ；SEQ ID NO 9)。圖6 :通過足墊注射用納米顆粒 ACT-1042(SEQ ID NO 8 ;RSV_G164_191)免疫 BALB/c小鼠三次；獲取血清并且用ELISA進(jìn)行測定。血清也識(shí)別天然RSV-G蛋白。圖7 :通過足墊注射用納米顆粒 ACT-1042(SEQ ID NO 8 ；RSV-G164^191)免疫 BALB/c小鼠三次；獲取血清并且在測量RSV-G與CX3CR1趨化因子受體結(jié)合之抑制的生物化學(xué)結(jié)合測定中進(jìn)行檢測。由ACT-1042引起的抗體應(yīng)答的生物活性通過RSV-G與趨化因子受體結(jié)合的抑制來確定。 圖8 :通過足墊注射用納米顆粒 ACT-1042(SEQ ID NO :8 ;RSV_G164_191)免疫 BALB/c小鼠三次；獲取血清并且在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行測定。由ACT-1042引起的抗體應(yīng)答的生物活性通過人PBMC向經(jīng)純化RSV-G遷移的抑制來確定。圖9 :通過 s. c.、1. p.、1. n.和足墊施用用 ACT_1023(SEQ ID NO :12 ；RSV-M281_98)免疫后的RSV-M2特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在免疫后14天從小鼠體內(nèi)獲取脾細(xì)胞，在IL-4或正^^￡115 01'板中用1 ￥-]\12肽4(1'-2019(5￡0 ID NO 7)再刺激。結(jié)果顯示在單個(gè)未處理或免疫動(dòng)物中每IO6細(xì)胞抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量。
圖10 :多價(jià)RSV納米顆?；旌弦呙绲拿庖咴?。在第0天和第21天免疫BALB/c小鼠(5只/組，5至6周齡)。針對RSV-G的抗體應(yīng)答在第28天采集血清，用ELISA測量RSV-G特異性IgG抗體效價(jià)。數(shù)據(jù)為每組5只小鼠的平均值土SD。圖11 :多價(jià)RSV納米顆?；旌弦呙绲拿庖咴?。在第0天和第21天免疫BALB/c小鼠(5只/組，5至6周齡)。針對RSV-M2的T細(xì)胞應(yīng)答在第28天獲取脾細(xì)胞，在IFN y或IL-4ELISP0T板中用RSV-M2(ACT-2031 ；SEQ ID NO :12)再刺激。數(shù)據(jù)為每組5只小鼠的平均值土 SD。圖12 :通過RSV納米顆粒免疫誘導(dǎo)體內(nèi)CTL活性。如所示免疫BALB/c小鼠，在7天后通過1.v.注射用ACT-2031 (RSV-M2 ;SEQ ID NO :12)脈沖(pulse)并且標(biāo)記有高劑量熒光示蹤劑CFSE的同基因脾細(xì)胞(藍(lán)色峰)與標(biāo)記有低劑量CFSE并且無靶標(biāo)肽的同基因脾細(xì)胞(紅色峰)的混合物來進(jìn)行攻擊。次日，利用流式細(xì)胞術(shù)分析免疫小鼠的脾，以檢測具有不同標(biāo)記的供體靶細(xì)胞的存活。各柱圖示出來自處理組中單個(gè)免疫小鼠的結(jié)果。圖13 :通過RSV納米顆粒免疫誘導(dǎo)體內(nèi)CTL活性。結(jié)果示出圖12中被特異性殺死的RSV-M2標(biāo)記靶細(xì)胞的百分比，其通過比較柱狀圖中每個(gè)峰的相對細(xì)胞數(shù)來計(jì)算。圖14和15示出在利用單表位和多表位構(gòu)建物的RSV顆粒免疫后的初始后(14)和加強(qiáng)后(15)的抗體應(yīng)答。圖16是圖14和15所示結(jié)果的柱狀圖。圖17示出了用活RSV攻擊被含有RSV-G、RSV_M2或其組合之RSV納米顆粒免疫的小鼠的結(jié)果。數(shù)據(jù)以噬斑測定和qPCR測定示出。圖18 :通過RSV納米顆粒免疫誘導(dǎo)體內(nèi)CTL活性。如所示免疫BALB/c小鼠，在7天后通過1. V.注射用ACT-2031 (RSV-M2 ；SEQ ID NO :12)脈沖且標(biāo)記有高劑量熒光示蹤劑CFSE的同基因脾細(xì)胞(藍(lán)色峰)與標(biāo)記有低劑量熒光示蹤劑CFSE且無靶標(biāo)肽的同基因脾細(xì)胞(紅色峰)的混合物來進(jìn)行攻擊。次日，利用流式細(xì)胞術(shù)分析免疫小鼠的脾臟，來檢測具有不同標(biāo)記的供體靶細(xì)胞的存活。各柱圖示出來自處理組中單個(gè)免疫小鼠的結(jié)果。圖19 :通過RSV納米顆粒免疫誘導(dǎo)體內(nèi)CTL活性。結(jié)果示出圖18中被特異性殺死的RSV-M2標(biāo)記靶細(xì)胞的百分比，其通過比較柱狀圖各峰中細(xì)胞的相對數(shù)來計(jì)算。圖20和21 =RSV-G特異性抗體應(yīng)答。在第0天和第21天免疫BALB/c小鼠。利用ELISA測量加強(qiáng)后血清中RSV-G特異性IgG抗體的效價(jià)。(20) OD值，I 50稀釋的各血清?；旌衔?cocktail) = ACT-1023+1042。水平條代表組中各值的平均數(shù)。(21)在連續(xù)滴定中每組5種血清的平均。通過以下具體實(shí)施方式
、附圖和所附權(quán)利要求，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解并領(lǐng)會(huì)上述及其他特征。詳述本文公開的是包含來自RSV的多肽表位的多層膜，其中多層膜在給宿主施用后能夠引起宿主體內(nèi)的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，多層膜包含兩種來自RSV的多肽表位，特別是引發(fā)特異性T細(xì)胞應(yīng)答(如細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答)的表位和引發(fā)特異性抗體應(yīng)答的表位。在該實(shí)施方案中，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)與僅施用一種成分相比，將引發(fā)特異性T細(xì)胞應(yīng)答的表位與引發(fā)特異性抗體應(yīng)答的表位進(jìn)行組合使得以T細(xì)胞應(yīng)答測量的免疫效力出乎意料地增強(qiáng)。特別地，與僅含RSV-M2表位的多層膜相比，采用一個(gè)或更多個(gè)多層膜形式的RSV-G (特異性抗體應(yīng)答)和RSV-M2 (特異性T細(xì)胞應(yīng)答)表位的組合引起顯著增強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答。特別地，多層膜包含帶相反電荷的聚電解質(zhì)的交替層，其中一個(gè)聚電解質(zhì)層包含共價(jià)連接有至少一種來自RSV之多肽表位的聚電解質(zhì)。第一和第二 RSV多肽表位可以連接在相同或不同的聚電解質(zhì)上，和/或可以存在于同一多層膜或不同的多層膜中。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二 RSV多肽表位共價(jià)連接在相同聚電解質(zhì)上，因此位于相同多層膜中。在另一實(shí)施方案中，第一和第二 RSV多肽表位共價(jià)連接在不同的聚電解質(zhì)上,但成層于同一多層膜內(nèi)。而在另一實(shí)施方案中，第一和第二 RSV多肽共價(jià)連接在不同的聚電解質(zhì)上,但是成層于不同的多層膜內(nèi)(其隨后在施用前混合)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多層膜包含帶相反電荷的聚電解質(zhì)的交替層，其中一個(gè)聚電解質(zhì)層為包含至少一種來自RSV之多肽表位的經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽。第一和第二 RSV多肽表位可以存在于相同或不同的經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽中，和/或可以存在于同一多層膜或不同的多層膜中。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二 RSV多肽表位存在于相同的經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽中，因此位于相同多層膜中。在另一實(shí)施方案中，第一和第二 RSV多肽表位存在于不同的經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽中，但成層于同一多層膜內(nèi)。而在另一實(shí)施方案中，第一和第二 RSV多肽表位存在于不同的經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽中，但是成層于不同的多層膜內(nèi)(其隨后在施用前混合)。在一個(gè)實(shí)施方案中，RSV多肽表位來自RSV-G蛋白。RSV-G(粘附)蛋白與很多失常相關(guān)，包括CC和CXC趨化因子mRNA表達(dá)的改變以及Th2細(xì)胞因子應(yīng)答的改變，其似乎幫助產(chǎn)生不恰當(dāng)?shù)拿庖呓Y(jié)果和增強(qiáng)的疾病。RSV-G蛋白的富含半胱氨酸的中央保守區(qū)在氨基酸182至186位包含CX3C趨化因子基序，其與CXXXC趨化分子(fractalkine) (CX3CL1)受體CX3CR1結(jié)合。RSV-G對CX3CL1的模擬促進(jìn)RSV感染并干擾針對病毒的正常適應(yīng)性免疫應(yīng)答。利用跨RSV-G CX3C基序的肽進(jìn)行主動(dòng)免疫保護(hù)小鼠免受RSV感染和肺部炎癥。迄今，還未將這些RSV-G肽開發(fā)成安全有效的疫苗。

在另一實(shí)施方案中，RSV多肽表位來自RSV-F或RSV-M2蛋白。除了 RSV-G蛋白外，RSV-F(融合)蛋白和RSV-M2(基質(zhì))蛋白也是可行的疫苗候選物。開發(fā)僅含一種主要抗原決定簇的單價(jià)RSV疫苗的嘗試因不能完全形成針對感染和炎性疾病的保護(hù)而受到阻礙，提示多價(jià)方法可能更成功。實(shí)際上，利用引起抗體和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答二者的多價(jià)疫苗免疫小鼠導(dǎo)致Th2的降低和Thl/CD8應(yīng)答的提高，其與針對病毒感染的更強(qiáng)保護(hù)和更少的炎性肺病相關(guān)。這些結(jié)果提示理想的RSV疫苗設(shè)計(jì)應(yīng)包含來自兩種或更多種病毒蛋白質(zhì)的表位，并且能引發(fā)抗體和分泌IFNy的⑶8+T細(xì)胞二者。在另一實(shí)施方案中，多層膜包含來自RSV的多肽表位，其中多肽表位來自RSV-G蛋白(特異性抗體應(yīng)答)。出乎意料地發(fā)現(xiàn)用包含RSV-GCX3C表位的納米顆粒免疫小鼠保護(hù)其免受活RSV的攻擊。有趣的是，RSV-M2表位不提供針對活RSV攻擊的保護(hù)，與單獨(dú)的RSV-G相比，RSV-G和RSV-M2組合疫苗不提供增強(qiáng)的保護(hù)。不受理論的約束，認(rèn)為在這些實(shí)驗(yàn)中所使用的高濃度納米顆?？赡苎谏w了組合納米顆粒的潛在益處。在一個(gè)實(shí)施方案中，多層膜沉積(deposit)在核心顆粒上,例如CaCO3納米顆粒、膠乳顆?；蜩F顆粒。具有直徑為5納米(nm)至50微米(y m)左右的大小的顆粒尤其有用。也可以使用由其他材料制作的顆粒作為核心，前提是它們是生物相容的，具有可控制的大小分布，并且具有足以結(jié)合聚電解質(zhì)肽的表面電荷(無論正或負(fù))。實(shí)例包括由例如以下的材料制作的納米顆粒和微顆粒聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、殼聚糖、透明質(zhì)酸、明膠或其組合。核心顆粒還可以由被認(rèn)為不適于在人類使用的材料制作，前提是它們可在膜制作后被溶解并且與多層膜分離。模板核心物質(zhì)的例子包括有機(jī)聚合物如膠乳或無機(jī)材料如硅石。聚電解質(zhì)多層膜是由帶相反電荷的聚電解質(zhì)的交替層構(gòu)成的薄膜(例如，幾納米至微米厚)。這些膜可以通過在合適底物上通過層層組裝(layer-by-layer assembly)形成。在靜電層層自組裝(“ELBL”)中，聚電解質(zhì)結(jié)合的物理基礎(chǔ)是靜電引力。因?yàn)樵谶B續(xù)膜沉積時(shí)膜表面電荷密度的符號轉(zhuǎn)變，所以膜的構(gòu)建是可行的。ELBL膜方法的通用性和相對簡便性允許很多不同類型的聚電解質(zhì)沉積在很多不同類型的表面上。多肽多層膜是聚電解質(zhì)多層膜的亞類型，其包含至少一層這樣的層，所述層包含帶電多肽(在本文稱作經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽)。與由其他聚合物制作的膜相比，多肽多層膜的主要優(yōu)點(diǎn)是其生物相容性。ELBL膜也可以用于封裝(encapsulation)。多肽膜和微囊的應(yīng)用包括,例如納米反應(yīng)器、生物傳感器、人造細(xì)胞和藥物遞送運(yùn)載體。術(shù)語“聚電解質(zhì)”包括分子量大于1，000并且每分子至少帶5個(gè)電荷的聚陽離子和聚陰離子材料。合適的聚陽離子材料包括例如多肽和聚胺。聚胺包括例如多肽如聚L-賴氨酸(PLL)或聚L-鳥氨酸、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N- 二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N- 二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亞胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯氯)(poly (N,N,N-trimethylaminoa crylate chloride))、聚(甲基丙烯酸胺基丙基三甲基氯化銨)、殼聚糖以及包含一種或更多種上述聚陽離子材料的組合。合適的聚陰離子材料包括例如多肽如聚L-谷氨酸(PGA)和聚L-天冬氨酸、核酸如DNA和RNA、藻酸鹽、角叉菜膠(carrageenan)、帚叉藻膠(furcellaran)、果膠、黃原膠、透明質(zhì)酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纖維素、羧甲基纖維素、酸性多糖和交聯(lián)羧甲纖維素(croscarmelose),包含懸垂(pendant)羧基的共聚物和合成聚合物，以及包含一種或更多種上述聚陰離子材料的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，RSV表位和聚電解質(zhì)具有相同的電荷符號。在一個(gè)實(shí)施方案中，膜的一個(gè)或更多個(gè)聚電解質(zhì)層(任選地包括包含RSV表位的聚電解質(zhì))為經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，適于靜電層層沉積的多肽的設(shè)計(jì)原理在美國專利公開No. 2005/0069950中說明，其關(guān)于多肽多層膜的教導(dǎo)通過引用并入本文。簡單來說，主要設(shè)計(jì)考慮為多肽的長度和電荷。靜電是最重要的設(shè)計(jì)考慮，因?yàn)樗荅LBL的基礎(chǔ)。沒有合適的電荷性質(zhì)，多肽可能無法基本溶解在PH4至10的水溶液中，也無法容易地用于通過ELBL制造多層膜。其他設(shè)計(jì)考慮包括多肽的物理結(jié)構(gòu)、由多肽形成的膜的物理穩(wěn)定性，以及膜和組分多肽的生物相容性和生物活性。經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽是指帶有的電荷足以與帶相反電荷的表面穩(wěn)定結(jié)合的多肽，S卩，可以沉積成多層膜的層的多肽，其中形成膜的驅(qū)動(dòng)力是靜電作用。短期穩(wěn)定膜是指形成后在PBS中于37°C孵育24小時(shí)后保留其一半以上成分的膜。在一些具體實(shí)施方案中，經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽的長度為至少15個(gè)氨基酸，在pH 7. 0多肽每殘基的靜電荷的大小大于或等于0.1、0. 2、0. 3、0. 4或0. 5。在pH 7.0下帶正電荷(堿性)的天然氨基酸為精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、鳥氨酸(Orn)和賴氨酸(Lys)。在pH 7.0下帶負(fù)電荷(酸性)的天然氨基酸為谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)。也可以使用帶相反電荷的氨基酸殘基的混合，只要電荷的總的凈比率滿足特定標(biāo)準(zhǔn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽不是同聚物。在另一實(shí)施方案中，經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽無支鏈。一個(gè)設(shè)計(jì)考慮是多肽ELBL膜穩(wěn)定性的控制。離子鍵、氫鍵、范德華相互作用和疏水相互作用促進(jìn)多層膜的穩(wěn)定。此外，在同一層或相鄰層內(nèi)多肽含巰基氨基酸之間形成的共價(jià)二硫鍵可以增加結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。含巰基氨基酸包括半胱氨酸和高半胱氨酸，這些殘基可以容易地整合入合成的經(jīng)設(shè)計(jì)多肽中。此外，可以利用文獻(xiàn)中充分描述的方法將巰基整合進(jìn)聚電解質(zhì)同聚物如聚L-賴氨酸或聚L-谷氨酸中。通過改變氧化電勢，含巰基氨基酸可被用于“鎖”(結(jié)合在一起)和“解鎖”多層多肽膜的層。此外，在經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽中整合含巰基氨基酸使得通過在分子間形成二硫鍵來在薄膜制造中使用相對短的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，在還原劑的存在下通過ELBL組裝經(jīng)設(shè)計(jì)的含巰基多肽(無論是化學(xué)合成的還是在宿主生物中產(chǎn)生的)以防止過早形成二硫鍵。在膜組裝之后，去除還原劑并且加入氧化劑。在氧化劑的存在下巰基間形成二硫鍵，由此在硫醇基存在處將層內(nèi)和層間的多肽“鎖”在一起。合適的還原劑包括二硫蘇糖醇(DTT)、2_巰基乙醇(BME)、還原型谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)以及多于一種這些化學(xué)物的組合。合適的氧化劑包括氧化型谷胱甘肽、叔丁基過氧化氫(卜8即)、硫柳汞、二酰胺、5，5' -二硫代-雙(2-硝基-苯甲酸)(DTNB)、4，4' - 二硫代二吡啶、溴酸鈉、過氧化氫、連四硫酸鈉、porphyrindin、sodiumorthoiodosobenzoate以及多于一種這些化學(xué)物的組合。作為二硫鍵的代替物，也可以使用產(chǎn)生其他共價(jià)鍵的化學(xué)成分來穩(wěn)定ELBL膜。對于由多肽構(gòu)成的膜，產(chǎn)生酰胺鍵的化學(xué)成分尤其有用。在合適偶聯(lián)劑的存在下，酸性氨基酸(側(cè)鏈包含羧酸基團(tuán)的氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸)將與側(cè)鏈包含胺基的氨基酸(例如賴氨酸和鳥氨酸)反應(yīng)形成酰胺鍵。在生物條件下酰胺鍵比二硫鍵更穩(wěn)定，并且酰胺鍵不進(jìn)行交換反應(yīng)(exchange reaction)?？梢允褂煤芏嘣噭﹣砘罨嚯膫?cè)鏈以進(jìn)行酰胺結(jié)合。碳二亞胺試劑(如水溶性1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC))在弱酸性pH下與天冬氨酸或谷氨酸反應(yīng)形成中間產(chǎn)物，所述中間產(chǎn)物與胺基不可逆反應(yīng)形成酰胺鍵。經(jīng)常向反應(yīng)中加入添加劑如N-羥基琥珀酰亞胺以加快形成酰胺的速率和效率。反應(yīng)之后，通過離心和抽吸從納米顆?；蛭㈩w粒中除去可溶性試劑。其他偶聯(lián)劑的例子包括二異丙基碳二亞胺、HBTU, HATU, HCTU, TBTU和PyBOP。其他添加劑的例子包括磺基-N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑和1-羥基-7-氮雜-苯并三唑?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)偶聯(lián)劑的化學(xué)計(jì)量、反應(yīng)時(shí)間或反應(yīng)溫度來控制酰胺交聯(lián)的程度，并且可以通過例如傅里葉變換紅外光譜(FT-1R)對其進(jìn)行監(jiān)測。共價(jià)交聯(lián)的ELBL膜具有期望的性質(zhì)，例如增加的穩(wěn)定性。較高的穩(wěn)定性允許在納米顆粒、微顆粒、納米囊、或微囊的制造中使用更加嚴(yán)酷的條件。嚴(yán)酷條件的例子包括高溫、低溫、制冷溫度、高離心速度、高鹽緩沖液、高pH緩沖液、低pH緩沖液、過濾和長期儲(chǔ)存。制作聚電解質(zhì)多層膜的一種方法包括在基底上沉積帶相反電荷的化學(xué)物質(zhì)的多個(gè)層。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)層包含經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽。連續(xù)沉積的聚電解質(zhì)具有相反的靜電荷。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚電解質(zhì)的沉積包括將基底暴露于包含聚電解質(zhì)的水溶液，其pH使聚電解質(zhì)帶有適于ELBL的靜電荷。在另一些實(shí)施方案中，聚電解質(zhì)在基底上的沉積通過連續(xù)噴灑帶相反電荷的多肽的溶液來實(shí)現(xiàn)。而在另一些實(shí)施方案中，在基底上的沉積通過同時(shí)噴灑帶相反電荷的聚電解質(zhì)的溶液來實(shí)現(xiàn)。在形成多層膜的ELBL方法中，相鄰層的相反電荷為組裝提供驅(qū)動(dòng)力。相對層中聚電解質(zhì)是否帶有相同的凈線性電荷密度并不關(guān)鍵，只要相對層帶有相反電荷即可。一種通過沉積作用進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)模組裝程序包括在聚離子電離的PH(即，pH4-10)下形成聚離子的水溶液，提供具有表面電荷的基底，將基底交替浸沒在帶電的聚電解質(zhì)溶液中。任選地，在交替層的沉積之間洗滌基底。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以容易確定適于聚電解質(zhì)沉積的聚電解質(zhì)濃度。一個(gè)示例性濃度為0.1至10mg/mL。對于典型的非多肽聚電解質(zhì)如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺鹽酸
鹽)，典型的層厚度為約3至約
權(quán)利要求
1.組合物，其包含來自RSV的第一多肽表位和來自RSV的第二多肽表位，其中所述第一和第二多肽表位與一種或更多種聚電解質(zhì)共價(jià)連接，其中所述一種或更多種聚電解質(zhì)在一個(gè)或更多個(gè)多層膜中，其中所述一個(gè)或更多個(gè)多層膜各包含兩層或更多層聚電解質(zhì)，其中相鄰的層包含帶相反電荷的聚電解質(zhì)，以及其中所述聚電解質(zhì)包括分子量大于1，000并且每分子至少帶5個(gè)電荷的聚陽離子材料或聚陰離子材料，以及其中所述來自RSV的第一多肽表位和所述來自RSV的第二多肽表位存在于同一多層膜或不同的多層膜中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述多層膜的至少一種聚電解質(zhì)包含經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽，其中所述經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽具有足以與帶相反電荷之表面穩(wěn)定結(jié)合的電荷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽的長度為至少15個(gè)氨基酸，并且在中性PH下每殘基的靜電荷大于或等于O. 1，并且其中所述經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽包含所述來自RSV的第一多肽表位、所述來自RSV的第二多肽表位或二者。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位與所述來自RSV的第二多肽表位存在于單一聚電解質(zhì)中并且在同一多層膜中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位與所述來自RSV的第二多肽表位存在于不同的聚電解質(zhì)中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中包含所述來自RSV的第一多肽表位的第一聚電解質(zhì)與包含所述來自RSV的第二多肽表位的第二聚電解質(zhì)存在于同一多層膜中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中包含所述來自RSV的第一多肽表位的第一聚電解質(zhì)存在于第一多層膜中，以及包含所述來自RSV的第二多肽表位的聚電解質(zhì)存在于第二多層膜中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位引起特異性細(xì)胞毒性或輔助T細(xì)胞應(yīng)答，以及所述來自RSV的第二多肽表位引起特異性抗體應(yīng)答。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位為RSV-M2蛋白表位，以及所述來自RSV的第二多肽表位為RSV-G蛋白表位。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位包含SEQID NO:7,以及所述來自RSV的第二多肽表位包含SEQ IDNO :4。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位為RSV-F蛋白表位，以及所述來自RSV的第二多肽表位為RSV-G蛋白表位。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述膜沉積在核心顆粒上。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述多層膜為中空囊的形式。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述多層膜的兩層或更多層共價(jià)交聯(lián)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述多層膜的兩層或更多層通過酰胺鍵共價(jià)交聯(lián)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述多層膜的兩層或更多層通過二硫鍵共價(jià)交聯(lián)。
17.組合物，其包含來自RSV的第一多肽表位和來自RSV的第二多肽表位，其中所述第一多肽表位和第二多肽表位為一個(gè)或更多個(gè)多層膜的形式，其中所述一個(gè)或更多個(gè)多層膜各包含兩層或更多層聚電解質(zhì)，其中相鄰的層包含帶相反電荷的聚電解質(zhì)，并且其中所述多層膜的至少一種聚電解質(zhì)包含經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽，其中所述經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽帶有足以與帶相反電荷之表面穩(wěn)定結(jié)合的電荷，以及其中所述經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽包含所述來自RSV的第一多肽表位、所述來自RSV的第二多肽表位或二者，其中不是經(jīng)設(shè)計(jì)之多肽的聚電解質(zhì)包括分子量大于1，000并且每分子至少帶5個(gè)電荷的聚陽離子材料或聚陰離子材料，以及其中所述來自RSV的第一多肽表位和所述來自RSV的第二多肽表位存在于同一多層膜或不同的多層膜中。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽的長度至少為15個(gè)氨基酸，并且在中性pH下每殘基的靜電荷大于或等于O.1。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位與所述來自RSV的第二多肽表位存在于單一經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽中并且在同一多層膜中。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位與所述來自RSV的第二多肽表位存在于不同的經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽中。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中包含所述來自RSV的第一多肽表位的第一經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽與包含所述來自RSV的第二多肽表位的第二經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽存在于同一多層膜中。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中包含所述來自RSV的第一多肽表位的第一經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽存在于第一多層膜中，以及包含所述來自RSV的第二多肽表位的第二經(jīng)設(shè)計(jì)的多肽存在于第二多層膜中。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位引起特異性細(xì)胞毒性或輔助T細(xì)胞應(yīng)答，以及所述來自RSV的第二多肽表位引起特異性抗體應(yīng)答。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位為RSV-M2蛋白表位，以及所述來自RSV的第二多肽表位為RSV-G蛋白表位。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位包含SEQIDNO :7，以及所述來自RSV的第二多肽表位包含SEQ IDNO :4。
26.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述來自RSV的第一多肽表位為RSV-F蛋白表位，以及所述來自RSV的第二多肽表位為RSV-G蛋白表位。
27.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述膜沉積在核心顆粒上。
28.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述多層膜為中空囊的形式。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述多層膜的兩層或更多層共價(jià)交聯(lián)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述多層膜的兩層或更多層通過酰胺鍵共價(jià) 交聯(lián)。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述多層膜的兩層或更多層通過二硫鍵共價(jià)交聯(lián)。
32.組合物，其包含與一種或更多種聚電解質(zhì)共價(jià)連接的RSV-G多肽表位，其中所述一種或更多種聚電解質(zhì)在一個(gè)或更多個(gè)多層膜內(nèi)，其中所述一個(gè)或更多個(gè)多層膜各包含兩層或更多層聚電解質(zhì)，其中相鄰的層包含帶相反電荷的聚電解質(zhì)，以及其中所述聚電解質(zhì)包括分子量大于1，000并且每分子至少帶5個(gè)電荷的聚陽離子材料或聚陰離子材料。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述RSV-G多肽表位包含SEQID NO :4。
34.向需要針對RSV進(jìn)行免疫的個(gè)體施用權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述組合物的方法。
全文摘要
包含來自RSV之多肽表位的多層膜。所述多層膜在向宿主施用后能夠在宿主體內(nèi)引起免疫應(yīng)答。所述多層膜包含至少一種經(jīng)設(shè)計(jì)的肽，所述經(jīng)設(shè)計(jì)的肽包含一種或更多種來自RSV的多肽表位。特別地，所述多層膜包含兩種來自RSV的多肽表位，例如引起特異性T細(xì)胞應(yīng)答如細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的表位，以及引起特異性抗體應(yīng)答的表位。
文檔編號A61K39/155GK103037898SQ201180033742
公開日2013年4月10日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者托馬斯·J·鮑威爾, 詹姆斯·戈勒姆·博伊德 申請人:人工細(xì)胞科技公司