專利名稱：流感疫苗的制作方法
流感疫苗本發(fā)明涉及組合物，其包含至少一種ISCOM復(fù)合物以及來自一種或更多種流感病毒的至少一種血凝素(HA)結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域和來自一種或更多種流感病毒的至少一種神經(jīng)氨酸酶(NA)結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域表示與流感病毒分離的胞外結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還涉及藥盒。所述組合物可用作免疫刺激藥、免疫調(diào)節(jié)藥物或疫苗，例如其針對脊椎動物(例如禽類和哺乳動物)的流感。
背景技術(shù)：
近來出現(xiàn)的流行性豬源2009甲型(HlNl)流感病毒突出強(qiáng)調(diào)了流感病毒引起全球范圍人群的發(fā)病和死亡的可能。全世界超過200個國家和地區(qū)或團(tuán)體報道了經(jīng)實驗室確認(rèn)的流行性病毒病例，其中包括超過16,000的死亡病例[I]。接種疫苗是預(yù)防或降低流感疾病負(fù)擔(dān)的主要方法。但是，如2009大流行的再次說明的，在爆發(fā)早期快速反應(yīng)因耗時的疫苗株制備和當(dāng)前使用的疫苗制造方法而受阻。這與流感病毒通過抗原漂移(antigenicdrift)和轉(zhuǎn)變(shift)來逃脫已有免疫的公知能力相結(jié)合強(qiáng)調(diào)了對這樣的疫苗的需要，即可快速生產(chǎn)并且對新出現(xiàn)的抗原性變體靈活應(yīng)答的新型安全并且優(yōu)選廣泛有效的疫苗。當(dāng)前許可的流感病毒疫苗包含病毒包膜糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。通過這兩種大的糖蛋白引發(fā)的抗體在針對流感病毒的免疫中具有不同特性。針對HA的抗體通常通過干擾病毒結(jié)合至靶細(xì)胞上的唾液酸受體，或者隨后通過防止病毒與細(xì)胞膜融合(由此病毒基因組進(jìn)入靶細(xì)胞)而中和病毒的感染性。針對NA的抗體通過抑制破壞NA相關(guān)受體的酶活性使子代病毒不能從被感染細(xì)胞釋放。HA介導(dǎo)的體液免疫已被最詳盡地表征并且被證實預(yù)防病毒感染。NA抗體對于預(yù)防疾病的貢獻(xiàn)研究地較少。它們似乎產(chǎn)生一種許可性免疫(permissive immunity) [2],其特征在于減少從感染的上皮細(xì)胞的頂表面(apicalsurface)釋放感染性病毒[2_8]，降低病毒脫落并且傳播至環(huán)境中的可能性。用HA和NA進(jìn)行組合 免疫提供針對流感的加強(qiáng)保護(hù)[5，9，10]。盡管HA和NA具有相當(dāng)?shù)拿庖咴訹2]，但是針對常規(guī)滅活疫苗或病毒感染的體液免疫應(yīng)答自然地向HA偏移，這是因為HA和NA在病毒表面以約4 I的比例存在[11]。另外，如在小鼠中所示，在B和T細(xì)胞引發(fā)(priming)中在完整的病毒粒中HA在免疫上超過NA[12]。當(dāng)HA和NA分開施用時，在經(jīng)免疫的動物中沒有發(fā)現(xiàn)該抗原性競爭[10，13]。當(dāng)前許可的流行疫苗以及季節(jié)性三價疫苗通常由全病毒制備，從而傾向于包含更多的HA抗原而不是NA抗原。在疫苗制劑中改變HA-NA比率以有利于NA可提供更平衡的體液免疫應(yīng)答，從而引起更高的NA抗體水平并且增加的針對疾病的保護(hù)[3，14]。由于當(dāng)前滅活流感病毒疫苗僅標(biāo)準(zhǔn)化HA的量，NA含量是可變的，因此向NA的血清轉(zhuǎn)化的頻率和水平是可變的，常常非常低[28，29]。通常對于甲型流感病毒，能夠逃避已有的免疫的特定病毒亞型內(nèi)的HA和NA抗原變體在人群中被逐漸選擇。該抗原漂移過程要求幾乎每年調(diào)整季節(jié)性疫苗組合物以響應(yīng)最近出現(xiàn)的變體。鑒于未來流感大流行(例如由禽H5N1病毒引起)的威脅，需要誘導(dǎo)廣泛保護(hù)性免疫的疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及組合物和藥盒，所述組合物包含至少一種ISCOM復(fù)合物以及來自一種或更多種流感病毒的至少一種血凝素(HA)結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域和來自一種或更多種流感病毒的至少一種神經(jīng)氨酸酶(NA)結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域表示與流感病毒分離的胞外結(jié)構(gòu)域。包含ISCOM佐劑以及HA和NA或其片段的組合物通過例如W02008157419和[5，9，10]已知。然而，之前并未公開與ISCOM佐劑一起使用的來自HA和NA 二者的胞外結(jié)構(gòu)域?，F(xiàn)在證實，使用由ISCOM或ISCOM基質(zhì)作為佐劑的來自NA和HA 二者的胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行接種降低病毒復(fù)制(例如通過降低肺滴度)并且降低感染的臨床效果，例如體重降低和肺病理。多聚HA和NA胞外結(jié)構(gòu)域具有巨大的疫苗潛力，因為它們可以大量地容易、快速、靈活和安全地生產(chǎn)。在流感疫苗中包含NA顯著并且特別地有助于HA的保護(hù)。在疫苗中包含NA可能降低所需要的HA劑量并且擴(kuò)大保護(hù)性免疫。


圖1設(shè)計并且表達(dá)2009甲型(HlNl)流感病毒的可溶性多聚HA(sHA)和NA(sNA)蛋白質(zhì)。A)重組表達(dá)的sHA和sNA蛋白質(zhì)構(gòu)建體的示意圖。sHA :表達(dá)的HA胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸17-522)分別具有N端的⑶5信號肽以及C端的三聚(GCN4-pII) GCN4結(jié)構(gòu)域和Str印標(biāo)簽(ST)。sNA :表達(dá)的NA頭部結(jié)構(gòu)域(a. a. 75-469)具有N端的CD5信號肽、OneSTrEP (OS)肽和四聚(GCN4-pLI)GCN4結(jié)構(gòu)域。⑶考馬斯藍(lán)染色的經(jīng)親和純化的sHA和sNA蛋白質(zhì)的還原 SDS-PAGE。

圖2用多聚2009甲型(HlNl)流感病毒HA和NA抗原進(jìn)行接種的抗體應(yīng)答。雪貂在第O天和第20天用以下試劑免疫3· 75 μ gsHA3+3. 75 μ gsNA4 (sHA+sNA);佐劑中的3· 75μ gsHA3(ISC0M 基質(zhì) M[IMM] ;sHA+IMM);佐劑中的 3· 75 μ gsNA4 (sNA+IMM);佐劑中的 3·75 μ gsHA3+3. 75 μ gsNA4 (sHA+sNA+IMM) ;PBS 或者 IMM，如所示。針對 2009 甲型(HlNl)流感病毒的抗體應(yīng)答通過凝血抑制(HI ;上圖)、病毒中和(VN ;上方第二幅圖)以及神經(jīng)氨酸酶抑制(NI)測定(下圖)進(jìn)行評價。每個點表示一只雪貂的結(jié)果。水平線表示平均值。水平灰色條表示測定的檢測限。圖3用2009甲型(HlNl)流感病毒進(jìn)行攻擊接種后的臨床效果。如圖2的圖例所示免疫雪貂，在第52天用IO6TCID5tl的病毒進(jìn)行氣管內(nèi)接種。體重減少表示為感染前體重的百分比(上圖)。肺重量表示為體重的百分比，作為肺實變的指示(中圖)。肉眼觀察肺并且對顯示實變之區(qū)域的肺區(qū)域百分比進(jìn)行評級(底圖)。顯示平均值；誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。水平灰色條表示測定的檢測限。圖4接種后雪貂肺中的組織病理學(xué)結(jié)果的實例。A)在用PBS或僅用佐劑(IMM)模擬接種或者用無佐劑的sHA3+sNA4接種的未保護(hù)雪貂的肺中觀察到炎性浸潤，支氣管壁中上皮細(xì)胞喪失和支氣管內(nèi)腔中細(xì)胞碎片。B)在用PBS或僅用佐劑(IMM)模擬接種或者用無佐劑的8撤3+8嫩4接種的雪貂肺肺泡中炎性細(xì)胞的蛋白質(zhì)流體(水腫)和浸潤。C)用sHA+IMM接種的雪貂支氣管中的支氣管周浸潤和細(xì)胞碎片。D)用sHA+IMM接種的雪貂肺中的肺泡隔中的炎性浸潤以及II型肺細(xì)胞肥大和增生。E)在sNA+IMM組和sHA+sNA+IMM組的雪貂肺中觀察到支氣管周浸潤。F)在sNA+IMM組和sHA+sNA+IMM組的雪貂肺肺泡中無炎性細(xì)胞和II型肺細(xì)胞增生。H&E染色；放大20X (支氣管)和40X (肺泡)。圖5經(jīng)攻擊接種的動物的肺、鼻和咽中的病毒滴度。如圖3的圖例所示免疫和攻擊雪貂，在接種后第4天分析病毒復(fù)制。在肺勻漿(上圖)，鼻拭子(中圖)和咽拭子(下圖)中確定病毒滴度。通過MDCK細(xì)胞中的終點滴定來測定滴度。每個點表示一只雪貂的結(jié)果。水平線表示平均值。水平灰色條表示測定的檢測限。圖6通過用多聚2009甲型(HlNl)流感病毒sHA3和sNA4抗原接種來誘導(dǎo)交叉中和抗體。(A)如圖2中圖例所示用均在佐劑中的SHA3或sHA3+sNA4免疫雪貂兩次，在HI測定中測試血清針對包括 AI/wine/shope/1/56、A/ 意大利 /1443/76、A/NL/386/86、A/衣阿華 /15/30、A/NL/25/80、A/ 新澤西 /8/76、A/PR/8/34 和 IVR/148 流感 HlNl 的不同流感病毒的活性。顯示平均滴度；誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(B)將用均在佐劑中的SNA4或sHA3+sNA4免疫一次或兩次的雪貂的血清合并并且在NI測定中測試針對A/肯塔基/UR06-0258/2007 (HlNl)和 A/ 火雞 / 土耳其 /1/2005 (H5N1)流感病毒的 SNA4 的活性。取 A/加利福尼亞/04/2009 (HlNl)的NA作為陽性對照。特異性針對A/NL/602/09 (HlNl)或A/火雞/ 土耳其/1/2005 (H5N1)流感病毒的陽性對照血清獲自用這些病毒感染的雪貂。顯示兩次重復(fù)的平均滴度；誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。水平灰色條表示測定的檢測限。
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發(fā)明詳述本發(fā)明涉及組合物，其包含至少一種ISCOM復(fù)合物以及來自流感病毒的至少一種HA結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域和來自流感病毒的至少一種NA結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域表示與所述流感病毒分離的胞外結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域是膜蛋白延伸至細(xì)胞外空間的結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域一般是啟動與的表面接觸(這導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo))的蛋白質(zhì)部分。在所述組合物中，它可作為抗原并且所述組合物可作為疫苗。分離意指胞外結(jié)構(gòu)域基本上與流感病毒的其他蛋白質(zhì)以及NA和HA蛋白質(zhì)各自的剩余部分分離?？纱嬖谳^少的剩余氨基酸。胞外結(jié)構(gòu)域可以是全部胞外結(jié)構(gòu)域或者其具有相同酶促活性和/或抗原活性的一部分。根據(jù)一個實施方案，胞外結(jié)構(gòu)域的一部分可以是其頭部結(jié)構(gòu)域。這種為全部胞外結(jié)構(gòu)域或者其具有相同酶促活性和/或抗原活性的一部分的胞外結(jié)構(gòu)域可分離自流感病毒或者合成產(chǎn)生。它們可以彼此分開存在或者連接在一起。根據(jù)一個實施方案，所述胞外結(jié)構(gòu)域為可溶性胞外結(jié)構(gòu)域或可溶性頭部結(jié)構(gòu)域。來自相同或不同流感病毒物種或菌株的至少一種血凝素結(jié)構(gòu)域的一個或更多個胞外結(jié)構(gòu)域和至少一種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的一個或更多個胞外結(jié)構(gòu)域可以作為雜合蛋白存在，其可以是重組的。重組產(chǎn)生的HA和NA抗原使得能夠開發(fā)這樣的疫苗，其中可容易地控制兩種抗原的相對量。鑒于它們更好地保留蛋白質(zhì)的天然抗原結(jié)構(gòu)，真核表達(dá)系統(tǒng)(哺乳動物和昆蟲二者)為生產(chǎn)這種糖蛋白優(yōu)選的平臺?？扇鐚嵤├?所述和根據(jù)Genscripthttp://www.genscript. com/gene_synthesis. html 生產(chǎn)雜合蛋白。流感病毒可選自流感的血清亞型例如HxNy，其中x為I至16并且y為I至9。因而 X 可以是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和 16 并且 y 可以是 1、2、3、4、5、6、7、8、9。流感病毒可來自任何物種，例如人、禽類、牲畜例如?？苿游镂锓N、豬、綿羊、山羊?？墒褂们萘鞲胁《纠鏘V6Nh9或人流感病毒氏_具_(dá)2或者來自其NA和HA的胞外結(jié)構(gòu)域的任何組合。NA胞外結(jié)構(gòu)域和/或HA胞外結(jié)構(gòu)域可來自不同物種的流感病毒，例如人和禽流感病毒。因此，一種或更多種人和禽NA胞外結(jié)構(gòu)域可與一種或更多種人和禽HA胞外結(jié)構(gòu)域組合，由此NA和HA可為不同類型的HxNy。根據(jù)一個實施方案，所述流感病毒是甲型流感病毒例如NlHl病毒，例如選自1918H1N1 流感病毒(A/ 南加利福尼亞 /1/18)和 / 或 2004H5N1 (A/ 越南 /1203/04) HlNlA/加利福尼亞/07/2009病毒和/或A/加利福尼亞/04/2009和/或A/加利福尼亞/09/2009和 / 或 A/ 肯塔基 /UR06-0258/2007 (HlNl)和 / 或 A/ 火雞 / 土耳其 /1/2005 (H5N1)?？墒褂脕碜訬A和來自HA的一個或更多個胞外結(jié)構(gòu)域(多聚體)。組合物可包含來自至少一種血凝素結(jié)構(gòu)域的I至5個胞外結(jié)構(gòu)域和來自至少一種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的I至5個頭部結(jié)構(gòu)域。根據(jù)一個實施方案，所述至少一種血凝素胞外結(jié)構(gòu)域選自A/加利福尼亞/09/2009的三聚HA胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸17-522)。根據(jù)一個實施方案，所述至少一種神經(jīng)氨酸酶頭部結(jié)構(gòu)域選自A/加利福尼亞/09/2009病毒的四聚NA頭部結(jié)構(gòu)域(氨基酸75-469)。A/加利福尼亞/09/2009蛋白質(zhì)的序列為本領(lǐng)域所知，例如通過 http://www. ncb1. nlm. nih. gov/protein/227809830 和http://www. ncb1. nlm. nih. gov/protein/227809834。

可將ISCOM復(fù)合物用作佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。其可為ISCOM和/或ISCOM基質(zhì)復(fù)合物。ISCOM-基質(zhì)復(fù)合物和/或ISCOM復(fù)合物可與旨在引發(fā)針對流感感染的免疫應(yīng)答的一種或更多種抗原一起使用。抗原以及ISCOM-基質(zhì)復(fù)合物和/或ISCOM-復(fù)合物可混合或分開施用。ISCOM基質(zhì)復(fù)合物包含至少一種糖苷和至少一種脂質(zhì)。所述糖苷具有佐劑作用并且優(yōu)選為尤其來自阜皮樹(Quillaja saponaria Molina)的阜苷(Quil A)。所述脂質(zhì)至少為固醇例如膽固醇和任選地還有磷脂。ISCOM基質(zhì)復(fù)合物還可包含一種或更多種其他免疫調(diào)節(jié)(佐劑活性)物質(zhì)(不一定是糖苷)，并且可如EP 0436620B1所描述的產(chǎn)生。ISCOM復(fù)合物包含至少一種糖苷、至少一種脂質(zhì)和至少一種抗原物質(zhì)或表位。這些抗原物質(zhì)可以是不同類型例如蛋白質(zhì)和肽、糖蛋白和糖肽、碳水化合物等。糖苷具有佐劑作用并且優(yōu)選為尤其來自皂皮樹的皂苷(Quil K)。這些復(fù)合物增強(qiáng)所包含的抗原的免疫原性并且還可包含一種或更多種免疫調(diào)節(jié)(佐劑活性)物質(zhì)。ISCOM可如EP0109942B1、EP0242380B1 和 EP 0180546B1 所描述的制備。另外，如 EP 9600647-3 (PCT/SE97/00289)所描述的，可使用轉(zhuǎn)運(yùn)(transport)抗原和/或過客(passenger)抗原。胞外結(jié)構(gòu)域抗原可與ISCOM基質(zhì)復(fù)合物和/或ISCOM復(fù)合物混合，結(jié)合或綴合至ISCOM基質(zhì)復(fù)合物或與ISCOM混合，或者連接至ISCOM復(fù)合物。除了胞外結(jié)構(gòu)域抗原之夕卜，所制備的ISCOM復(fù)合物可包含一種或更多種其他抗原。根據(jù)一個實施方案，可使用一種或更多種胞外結(jié)構(gòu)域抗原整合至ISCOM復(fù)合物中。之后，這種ISCOM復(fù)合物可與一種或更多種胞外結(jié)構(gòu)域抗原混合。可使用一種或更多種抗原并且可使用如EP9600647-3 (PCT/SE97/00289)中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)抗原和過客抗原。為了整合至ISCOM顆粒中，抗原需要具有一些疏水性部分或是附于ISCOM基質(zhì)的靜電。不具有疏水性部分的抗原可連接至這種分子。疏水性分子和連接方法在EP 180564中有所描述。在免疫原性復(fù)合物中包含的脂至少為固醇例如膽固醇以及任選地還有磷脂。所使用的一種或更多種脂質(zhì)尤其為在申請人的專利EP 0109942B1 (尤其第3頁上)和專利EP0436620B1第7頁第7至24行中所描述的那些。使用的尤其是固醇例如膽固醇以及磷脂例如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿?？墒褂媒Y(jié)合至細(xì)胞結(jié)合組分(例如糖脂)的含脂質(zhì)受體(包括霍亂毒素受體(其為神經(jīng)節(jié)苷脂GMl))和巖藻糖化血型抗原。之后細(xì)胞結(jié)合組分可作為粘液靶向分子并且通過將該組分與含有該組分的復(fù)合物簡單混合來結(jié)合至含脂質(zhì)物質(zhì)。包含受體的ISCOM復(fù)合物在例如WO 97/30728中有所描述。在本發(fā)明的一個實施方案中，在用于針對流感的接種的免疫原性復(fù)合物中的糖苷為來自皂皮樹的皂苷級分。也可使用皂皮樹皂苷的任何亞片段。另外，可使用皂皮樹的亞片段的任何組合。因此，兩種或更多種亞片段可各自整合至ISCOM復(fù)合物或ISCOM-基質(zhì)復(fù)合物中。在本說明書和權(quán)利要求全文中使用的術(shù)語“來自皂皮樹的皂苷級分”是皂皮樹半純化的或限定的皂苷級分或者 基本純的級分。重要的是，所述級分不包含這樣多的任何其他級分即對使用基本包含一種級分之ISCOM復(fù)合物或ISCOM基質(zhì)復(fù)合物的混合物時獲得的良好結(jié)果有不利影響。根據(jù)一個實施方案，提供的用于本發(fā)明的免疫原性復(fù)合物，其(作為免疫原性復(fù)合物的一部分或在與其混合)除了來自皂皮樹的皂苷級分之外還包含至少另外的佐劑，或者除了整合至ISCOM基質(zhì)或ISCOM復(fù)合物中的一種或更多種之外還包含至少一種其他的糖苷或皂苷。有用的非皂苷佐劑的實例為不同的油和Al (OH) 3?？煞謩e整合入ISCOM復(fù)合物和ISCOM基質(zhì)復(fù)合物或者與其混合的另外的佐劑的實例為任何天然或合成的具有期望的免疫調(diào)節(jié)作用的佐劑，例如天然、或其衍生物、來源于皂皮樹粗皂苷提取物的合成或半合成皂苷分子；例如來自Quil A的皂苷和皂苷級分，細(xì)胞壁骨架，嵌段聚合物例如親水性嵌段共聚體例如CRL-1005，TDM(海藻糖二霉菌酸酯，threhalose di mucolate),脂肽,LPS和LPS衍生物,來自多種細(xì)菌物種的脂質(zhì)A及其衍生物(例如單磷酰脂質(zhì)A、胞壁酰二或三肽或者胞壁酰二肽)，MDP衍生物(例如脂肪酸衍生物)，取代的MDP，MDP (及其衍生物)的蘇氨酰類似物，CpG變體，CpGODN變體，內(nèi)源性人和動物免疫調(diào)節(jié)劑Hf^BGM-CSF)，IL-2，佐劑活性的細(xì)菌毒素，天然或修飾的毒素(例如霍亂毒素CT及其亞組分CTB和CTA1)，大腸桿菌(E. coli)的熱不穩(wěn)定毒素(LT)，百日咳桿菌(Bordetella pertussis) (BP)毒素和 BP 的纖維狀血凝素(filamentus heamagglutenin),DDA，聚陰離子例如硫酸葡聚糖以及脂多糖例如皂苷(除了 QuilA之外其他的)，參見("Futureprospects for vaccine adjuvants " , Warren, H. S. (1988)CRC Crit. Rev.1mmunol· 8 :2,83-101 ； " Characterisation of a non-toxic monophosphoryllipid k",(1987)Johnson, A. G.等，Rev.1nfect. Dis. 9 :5,5512-5516 ; " Developmental status ofsynthetic immunomodulators" ,Berendt,M. J.等(1985),Year Tmmunol. 193-201 ； " Tmmunopotentiating conjugates " , Stewart-TulI, D. E. , Vaccine, 85, 3 :1，40-44),其全部通過引用并入本文。ISCOM顆?？蔀橛扇魏卧碥罩频玫腎SCOM復(fù)合物或ISCOM基質(zhì)復(fù)合物。佐劑級分A和其他至少一種佐劑也可結(jié)合至不同或相同的ISCOM顆?；騃SCOM基質(zhì)顆粒，或者一種或更多種佐劑可與ISCOM顆?；旌稀榱苏现罥SCOM顆粒中，佐劑需要具有一些疏水性分子。不具有疏水性部分的佐劑可連接至這種分子。疏水性分子和連接方法在EP180564中有所描述。優(yōu)選地，佐劑整合至不同的ISCOM顆粒中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，Quil A的佐劑級分A整合至ISCOM顆粒中，而其他至少一種佐劑沒有整合至ISCOM顆粒中并且以游離形式在組合物中使用。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，Quil A的佐劑級分整合至ISCOM顆?；騃SCOM基質(zhì)顆粒中，而其他佐劑沒有整合至ISCOM顆?；騃SCOM基質(zhì)顆粒中并且以游離形式在組合物中使用。在另一個尤其優(yōu)選的實施方案中，組合物包含整合至ISCOM顆粒或ISCOM基質(zhì)顆粒中的Quil A的級分A和至少一種沒有整合至ISCOM顆?；騃SCOM基質(zhì)顆粒中的其他佐劑。在另一個優(yōu)選的實施方案中,所述至少其他佐劑為MPL或霍亂毒素CT。MPL或霍亂毒素可整合至同一 ISCOM顆?；騃SCOM基質(zhì)顆?；蛘吒髡现敛煌腎SCOM顆粒或ISCOM基質(zhì)顆粒。優(yōu)選地，MPL或霍 亂毒素為游離形式。來自皂皮樹的用于ISCOM基質(zhì)復(fù)合物、ISCOM復(fù)合物和/或至少一種另外的佐劑的皂苷級分可選自皂皮樹的級分A、級分B、級分C，皂皮樹的粗級分，QA 1-21。然而，伴隨現(xiàn)代強(qiáng)大的分離技術(shù)，報道并描述了多于60種不同的結(jié)構(gòu)(Bankefors等，J ChromB Analyt Technol BiomedLife Sci 待印；Bankefors 等，Rapid Commun Mass Spectrom22 :3851 ；Broberg 等，J Mass Spectrom 39 :691 ；Nyberg 等，Anal Chem 75 :268 ；Guo 和Kenne Phytochemistry 55 :419 ；Nord 和 Kene Carbohydr Res 329 :817 ；Guo 和 KennePhytochemistry 54 :615 ；Guo 等，Phytochemistry 53 :861 ；Nyberg 等，Carbohyd. Res323 87 ；Nord 和 Kenne Carbohyd. Res 320 :70 ；Guo 等，Phytochemistry 48 :175)。當(dāng)如文中所描述的制備時，皂皮樹的級分A、B和C各表示化學(xué)上緊密相關(guān)的具有可定義特性的分子的組或家族。獲得它們的色譜條件使得在洗脫譜和生物活性方面各批次之間的重復(fù)性高度一致。在本說明書和權(quán)利要求全文中使用的術(shù)語“一種來自皂皮樹的皂苷級分”是皂皮樹半純化或限定的皂苷級分或者基本純的級分的通用描述。重要的是，所述級分不包含這樣多的任何其他級分，其對使用基本包含一種級分之ISCOM或ISCOM基質(zhì)的混合物時獲得的良好結(jié)果有不利影響。如果期望，皂苷制品可包含少量(例如按重量計多至40%，例如按重量計多至30%、按重量計多至25%、按重量計多至20%、按重量計多至15%、按重量計多至10%、按重量計多至7%、按重量計多至5%、按重量計多至2%、按重量計多至1%、按重量計多至O. 5%、按重量計多至O. 1% )的其他化合物例如其他皂苷或其他佐劑物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的皂苷級分A、B和C為WO 96/11711中所描述的，B3、B4和Mb級分為如EP 0436620中所描述的；級分QA 1-21為如EP 03632279B2所描述。可使用EP03632279B2 中描述的級分 QA-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20和21，尤其是QA-7、17-18。如EP 0362279B2中(尤其是第6頁和第8和9頁上的實施例1)所描述的獲得它們。可使用來自皂皮樹的任何類型的粗制或半純化的皂苷級分。用于本專利目的的一種皂皮樹粗級分為從其他親脂性非皂苷組分中稍純化的任何皂苷組合物。這可以是純化而未分級的皂皮樹制備物的任何皂苷級分?？缮a(chǎn)這種粗級分(其中皂苷沒有彼此分離)和購自例如 Desert King Chile (www. desertkingchiie. cl)、Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich. com)、Berghausen (www. berghausen. com)、Brenntag Biosector (www.brenntaq-biosector. com)。WO 96/11711中所描述的級分A、B和C由親脂性級分制備，該親脂性級分通過色譜分離粗制水性皂皮樹提取物并用水中的70%乙腈洗脫以分離親脂性級分而獲得。之后，該親脂性級分通過半制備型HPLC分離，使用酸性水中的25%至60%乙腈梯度洗脫。這里稱作或“級分A”或“QH-A”的級分是或?qū)?yīng)以大約39%乙腈洗脫的級分。這里稱作或“級分B”或“QH-B”的級分是或?qū)?yīng)以大約47%乙腈洗脫的級分。這里稱作或“級分C”或“QH-C”的級分是或?qū)?yīng)以大約49%乙腈洗脫的級分。根據(jù)一個實施方案，使用皂苷的粗級分。根據(jù)另一個實施方案，皂苷的粗級分可與任何其他純化的皂苷級分(例如上述不同的皂苷級分)一起使用。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，整合至ISCOM基質(zhì)復(fù)合物或ISCOM復(fù)合物的來自皂皮樹的皂苷級分或者也整合至ISCOM或ISCOM基質(zhì)復(fù)合物或與其混合的至少一種另外的佐劑選自皂皮樹的級分A、級分B、級分C，皂皮樹的半純化制品、皂皮樹的純化制品或者任何純化的亞級分例如QA 1-21?？墒褂梅謩e包含至少兩種皂皮樹的皂苷級分的ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物?？墒褂貌煌碥占壏值闹亓堪俜直鹊娜魏谓M合?？墒褂萌魏蝺煞N級分的任何重量百分比組合，例如級分A的任何重量百分比和另一種級分的任何重量百分比(例如分別為皂皮樹的任何粗皂苷級分或級分C)。在ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物中，ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物可包含按重量計0.1至99. 9、按重量計5至95%、按重量計10至90%、按重量計15至85%、按重量計20至80%、按重量計25至75%、按重量計30至70%、按重量計35至65 %、按重量計40至60 %、按重量計45至55 %、按重量計40至60 %，、按重量計50至50 %、按重量計55至45 %、按重量計60至40 %、按重量計65至35 %、按重量計70至30 %、按重量計75至25 %、按重量計80至20 %、按重量計85至15 %、按重量計90至10 %、按重量計95至05 %、按重量計50至99 %、按重量計60至90 %、按重量計70至90 %、按重量計75至85%的一種皂苷級分例如皂皮樹 的級分A，和在每種區(qū)間中剩余直到100%的另一種皂苷例如皂皮樹的任何粗級分或任何其他級分例如皂皮樹的級分C (根據(jù)ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物中皂苷的皂苷級分的重量總和)。
根據(jù)一個實施方案，提供用于本發(fā)明的ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物，其包含按重量計5至99 %的一種級分例如皂皮樹的級分A，和剩余直到按重量計100 %的另一種級分例如皂皮樹的粗皂苷級分或級分C (根據(jù)級分A和級分C的重量)。根據(jù)另一個實施方案，提供用于本發(fā)明的ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物，其包含按重量計40%至99%的一種級分例如皂皮樹的級分A，和按重量計1%至60%的另一種級分例如皂皮樹的粗皂苷級分或級分C (根據(jù)級分A和級分C的重量)。根據(jù)又一個實施方案，提供用于本發(fā)明的ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物，其包含按重量計70%至95%的一種級分例如皂皮樹的級分A，和按重量計30%至5%的另一種級分例如皂皮樹的粗皂苷級分或級分C (根據(jù)級分A和級分C的重量)。
·
在一個實施方案中，提供用于本發(fā)明的ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物，其中來自皂皮樹的皂苷級分選自QA 1-21之一。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供·組合物例如疫苗，其包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的ISCOM基質(zhì)和/或ISCOM復(fù)合物以及一種或更多種胞外結(jié)構(gòu)域抗原和一種或更多種可藥用賦形劑、載體和/或稀釋劑和/或其他佐劑，以用于針對流感的接種。這種組合物可包含一種或更多種不同類型的ISCOM-基質(zhì)復(fù)合物顆粒和/或一種或更多種不同類型的ISCOM復(fù)合物顆粒，每種類型的復(fù)合物顆粒包含一種來自皂皮樹的皂苷級分，其中一種復(fù)合物中的皂苷級分不同于其他復(fù)合物顆粒中的皂苷級分。組合物可包含數(shù)種顆粒。然而，根據(jù)一個實施方案，一種顆?？蓛H包含一種單一類型的皂皮樹級分。因此，一種類型的基本純的皂苷級分或粗皂苷級分可整合至一種ISCOM基質(zhì)復(fù)合物或顆粒中，另一種類型的基本純的皂苷級分或粗皂苷級分可整合至另一種ISCOM基質(zhì)復(fù)合物或顆粒中。組合物或疫苗可包含至少兩種類型復(fù)合物或顆粒，每種類型具有一種類型的整合至物理上不同的顆粒中的皂苷。在組合物中，可使用ISCOM基質(zhì)復(fù)合物顆粒和/或ISCOM復(fù)合物顆粒的混合物，其中一種皂皮樹皂苷級分和另一種皂皮樹皂苷級分分別整合入不同的ISCOM基質(zhì)復(fù)合物顆粒和/或ISCOM復(fù)合物顆粒?；谝环N皂苷級分和任何其他皂苷級分的含量，可使用不同ISCOM復(fù)合物的任何重量百分比組合，例如可分別使用級分A和另一種級分，例如皂皮樹的任何粗皂苷級分或級分C。這些百分比數(shù)字可與以上對一個或同一個ISCOM基質(zhì)復(fù)合物顆粒和/或ISCOM復(fù)合物顆粒中(然而此處是在分開的ISCOM基質(zhì)復(fù)合物顆粒和/或ISCOM復(fù)合物顆粒中)的可能皂苷級分混合物所述的相同。在又一個實施方案中，整合入ISCOM顆粒或ISCOM基質(zhì)顆粒中Quil A級分A與至少一種其他佐劑各整合入不同的ISCOM顆?；騃SCOM基質(zhì)顆粒，或者一種或更多種Quil A的其他級分或者一種或更多種其他佐劑整合入相同的ISCOM或ISCOM基質(zhì)顆粒但是不同于Quil A級分A整合入的顆粒，或者其他至少一種佐劑為游離形式。在組合物中，在相同或不同的ISCOM復(fù)合物和/或ISCOM-基質(zhì)復(fù)合物中，級分A可與來自皂皮樹的級分C和粗皂苷級分(例如級分Q)中的至少一種組合。通過組合包含不同皂皮樹級分的ISCOM-基質(zhì)復(fù)合物，可以產(chǎn)生對動物毒性很小的組合物。因此，在一個實施方案中，用于本發(fā)明的組合物在相同或不同的ISCOM復(fù)合物和/或ISCOM-基質(zhì)復(fù)合物中包含與級分C和Q中的至少一種組合的級分A。組合物還可包含一種或更多種可藥用賦形劑、載體和/或稀釋劑以及其他佐劑。
除了整合至ISCOM復(fù)合物顆粒或ISCOM基質(zhì)顆粒中的皂苷之外，組合物可包含至少一種其他佐劑。該其他佐劑可以是來自皂皮樹的皂苷級分，其可結(jié)合至免疫原性ISCOM基質(zhì)復(fù)合物顆?；騃SCOM復(fù)合物顆?；蛘吲c其混合。它也可以是另一種類型的皂苷，或任何其他類型的可整合至、結(jié)合至免疫原性ISCOM基質(zhì)復(fù)合物顆?；騃SCOM復(fù)合物顆粒或者與其混合的佐劑，。組合物可以是疫苗。文中的術(shù)語“疫苗”指能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可產(chǎn)生針對流感的免疫。組合物可以用于預(yù)防以預(yù)防感染發(fā)生，或者可以用于治療以治療已有的感染，或者可用于生產(chǎn)免疫試劑。除了來自流感病毒的胞外結(jié)構(gòu)域的抗原之外，其他抗原可整合至ISCOM復(fù)合物、連接至ISCOM復(fù)合物或連接至ISCOM基質(zhì)復(fù)合物或者與ISCOM復(fù)合物或ISCOM基質(zhì)復(fù)合物混合。本發(fā)明還涉及組合疫苗或組合獸藥用于治療。根據(jù)本發(fā)明的組合物的制劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。合適的可藥用載體和/或稀釋劑包括任何和全部的常規(guī)溶劑、分散介質(zhì)、填充劑、固體載體、水性溶液、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這種介質(zhì)和試劑在藥物活性物質(zhì)中的用途為本領(lǐng)域所公知，并且例如在Remington' s Pharmaceutical Sciences,第18版，MackPub I i sh ingCompany, Pennsylvania, USA中描述的。除了目前與活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑外，考慮它們在本發(fā)明藥物組合物中的使用。補(bǔ)充的活性成分也可摻入該組合物。根據(jù)另一方面，該組合物可用作免疫刺激藥、免疫調(diào)節(jié)藥物或疫苗，例如其針對脊椎動物(例如禽和哺乳動物)的流感。哺乳動物可以是人，伴侶動物例如貓、狗、馬、禽例如鸚鵡，有經(jīng)濟(jì)價值的物種例如牲畜，例如?？苿游镂锓N、豬、綿羊、山羊或雪貂、水貂。

本發(fā)明還涉及藥盒，其包含至少兩個室，其中一個室包含組合物，所述組合物包含至少一種ISCOM復(fù)合物以及來自一種或更多種流感病毒的至少一種血凝素結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域和至少一種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域，另一個室包含使用說明書。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及藥盒，其包含至少兩個室，其中一個室包含ISCOM復(fù)合物和/或ISCOM基質(zhì)復(fù)合物，另一個室包含來自至少一種血凝素結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域和來自至少一種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域。申請人:尤其討論了重組產(chǎn)生的2009甲型(HlNl)流感病毒的HA和NA亞基作為針對雪貂模型中同型流感病毒的疫苗的功效，并且尤其強(qiáng)調(diào)了 NA抗原的貢獻(xiàn)?？扇苄远嗑垠w形式的大流行HlNl病毒的HA和NA抗原已經(jīng)在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。通過一步親和色譜純化糖蛋白，隨后用一種或兩種抗原在具有或不具有ISCOM基質(zhì)M作為佐劑的情況下免疫雪貂。動物對兩種抗原均有血清上的應(yīng)答，但是僅當(dāng)與佐劑一起施用時如此。有趣的是，在疫苗中包含NA增強(qiáng)了 HA抗體和病毒中和活性的水平。尤其如同顯著(51og1(l單位)降低的病毒肺滴度所判斷的，在用與ISCOM基質(zhì)M組合的含HA疫苗免疫的動物中進(jìn)行同源攻擊后觀察到顯著的保護(hù)。有趣的是，以ISCOM基質(zhì)M為佐劑的含NA制劑明顯降低了感染的臨床效果。
本文提及的全部出版物以法律允許的最大程度通過引用并入本文。現(xiàn)在本發(fā)明將進(jìn)一步通過以下非限制性實施例進(jìn)行描述
實施例實施例1HA和NA抗原的制備材料和方法甲型流感攻擊病毒流感病毒A/荷蘭/602/2009通過接種11日齡的雞胚分離自在荷蘭第一例實驗室確認(rèn)的2009甲型(HlNl)感染[15]。通過感染匯合的Madin-Darby狗腎(MCCK)細(xì)胞制備流感病毒A/荷蘭/602/2009 (HlNl)的病毒儲液。完成細(xì)胞病理學(xué)變化之后，通過低速離心除去培養(yǎng)物上清液并且貯存在_70°C。感染性病毒滴度在MCCK細(xì)胞中如之前所描述地確定。所有使用這些病毒的實驗在生物安全水平(BSL)-3的條件下進(jìn)行。HA和NA杭原的制各合成(GenScript)編碼流感病毒A/加利福尼亞/04/2009 (HlNl)的可溶性血凝素胞外結(jié)構(gòu)域(sHA ;氨基酸17-522)和神經(jīng)氨酸酶頭部結(jié)構(gòu)域(sNA ;氨基酸75-469)的人密碼子優(yōu)化序列，然后克隆至表達(dá)質(zhì)粒PSl-1g的衍生物[17]中用于在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)。在HA基因之前加上編碼N端⑶5信號肽的序列，之后加上編碼C端人工GCN4三聚結(jié)構(gòu)域(GCN4-D11) [18]和最近描述的用于親和純化(IBA GmbH)的Strep標(biāo)簽[19，20]的序列。NA基因之前加上相繼編 碼N端CD5信號肽、雙Str印標(biāo)簽(OneSTrEP;IBA GmbH)和人IGCM四聚結(jié)構(gòu)域(GCN4-pLI) [18]的序列。SHA2和SNA1抗原的產(chǎn)牛如圖1A所示，設(shè)計構(gòu)建體以表達(dá)2009甲型(HlNl)流感病毒的三聚HA胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸17-522)和四聚NA頭部結(jié)構(gòu)域(a. a. 75-469)。sHA3和sNA4蛋白質(zhì)通過以下產(chǎn)生在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)，然后通過親和色譜法從培養(yǎng)物中純化，從而獲得預(yù)期大小的糖蛋白(圖1B)。凝膠過濾分析表明HA和NA亞基各自的三聚和四聚寡聚特性(數(shù)據(jù)未顯示)。如通過它們的唾液酸結(jié)合(SHA3 ;制備手稿)和神經(jīng)氨酸酶活性(SNA4 ;下文)所判斷的，多聚復(fù)合物也具有生物活性，進(jìn)一步確認(rèn)了它們的天然狀態(tài)。實施例2.蛋白質(zhì)表達(dá)和純化利用1: 5比率(UgDNA μ gPEI)的sHA和sNA表達(dá)質(zhì)粒與聚乙烯亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。6小時孵育期后，將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基替換為補(bǔ)充了碳酸氫鈉(3. 7g/升)、葡萄糖(2. Og/ 升)、Primatone RL-UF(3. Og/ 升)、青霉素(100 單位 /ml)、鏈霉素(100 μ q/ml)、glutaMAX(Gibco)和1. 5% DMSO 的 293SFM II 表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染后 5 至6天收集組織培養(yǎng)物上清液，然后利用Str印-Tactin親和色譜(IBA GmbH)從培養(yǎng)基中純化sHA和sNA蛋白質(zhì)。通過使用Str印-Tractin-HRP綴合物(IBA GmbH ;數(shù)據(jù)未給出)的western印跡和SDS-PAGE分析確認(rèn)sHA和sNA蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化。通過凝膠過濾色譜和考馬斯亮藍(lán)非變性PAGE(blue-natiVe-PAGE)分析確定蛋白質(zhì)的寡聚化。使用BSA作為參考進(jìn)行蛋白質(zhì)的量的定量。實施例3.免疫和感染MM
健康年輕成年遠(yuǎn)交雌性雪紹(Mustela putorius furo ;6至12月齡)購自商業(yè)飼養(yǎng)員。通過凝血抑制測定檢查動物是否缺乏針對循環(huán)季節(jié)性A/H1N1和A/H3N2流感病毒和針對豬源流感A/NL/602/09病毒的抗體。在開始實驗之前，獨立的動物倫理委員會批準(zhǔn)該實驗方案。如W02004/004762中所描述的制備ISCOM基質(zhì)M佐劑。將PBS中的包含85%基質(zhì)A和15%基質(zhì)C的75微克組合物添加至抗原中。免瘡和感染將36只血清反應(yīng)陰性的雪貂分成6組，每組6只，用以下制劑接種兩次磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的 3· 75μ gsHA3+3. 75μ gsNA4(組 I) ;ISC0M 基質(zhì) M(IMM、Isconova、Uppsala、Sweden)中的 3. 75 μ gsHA3(組 2) ; IMM 中的 3.75 μ g sNA4(組 3) ; IMM 中的 3.75 μ gSHA3+3.75ygSNA4 (組4) ;PBS (組5) ; IMM (組6)。在氯胺酮麻醉下，在后腿的四頭肌中以總體積Iml間隔20天進(jìn)行接種。雪貂成組飼養(yǎng)并且隨意獲取食物和水。在最后接種后的第32天，動物用氯胺酮/美托咪定麻醉(用阿替美唑逆轉(zhuǎn))，稱重，然后用3ml體積PBS中的I X IO6TCID5tl流感A/NL/602/09 (HlNl)氣管內(nèi)攻擊[21，22]。隨后每天監(jiān)測雪貂三次用于生成臨床指標(biāo)。感染前以及感染后第2天和4天，在用氯胺酮麻醉雪貂時收集每只雪貂的鼻拭子和咽拭子。接種后第4天，稱重動物，然后在用氯胺酮和美托咪定麻醉下通過放血處死動物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行尸檢。由于與實驗無關(guān)的原因，組I的一只雪貂在第一次和第二次接種之間死亡。血清學(xué)在接種前、第二次接種當(dāng)天(第20天)和攻擊當(dāng)天(第52天)采集血清樣品。將血清在-20°C下貯存直到使用。如之前所描述的，用I %火雞紅細(xì)胞利用凝血抑制測定(HI測定)測試血清是否存在抗HA抗體，利用微病毒中和測定(VN測定)測試血清是否存在病毒中和抗體[23，24]。測試血清中是否存在與流感A/NL/602/09 (HlNl)反應(yīng)的抗體。為此，生成了反向遺傳學(xué)病毒 。用這些病毒獲得的滴度與針對野生型菌株的那些相當(dāng)(數(shù)據(jù)未給出)。特異性針對流感A/NL/602/09 (HlNl)的陽性對照血清獲自用該病毒感染的雪貂[15]。其他用于HI測定的HlNl流感病毒為A/荷蘭/386/86 (NL/86)、A/荷蘭/25/80 (NL/80)、A/ 新澤西 /8/76 (NJ/76)、A/ 豬 /shope/1/56 (Sw/56)、A/ 意大利 /1443/76 (It/76)、A/ 衣阿華 /15/30 (lo/30)、A/ 波多黎各 /8/34 (Pr/34)和 A/ 布里斯班 /59/07 (IVR-148 疫苗株；IVR/148)。用這些病毒感染的雪貂的血清樣品用作該測定中的陽性對照[25]。還用之前描述的基于胎球蛋白的測定(fetuin-based assay)測試血清中是否存在神經(jīng)氨酸酶抑制(NI)抗體[26]。簡言之，將96孔NuncMaxiSorp板在4°C下用100 μ I5μ g/ml胎球蛋白包被過夜。將60 μ I體積連續(xù)稀釋的血清樣品在37°C下用等體積含有SNA4的培養(yǎng)物上清液(在PBS-Ca/Mg
中預(yù)稀釋以給出1. 5的半數(shù)最大OD450)中孵育30分鐘，之后將100 μ I混合物添加至胎球蛋白包被的孔中。在37°C孵育I小時后，洗滌板，然后通過以下測量神經(jīng)氨酸酶活性添加過氧化物酶標(biāo)記的花生凝集素(2. 5 μ g/ml ;Sigma)，在室溫下孵育I小時,洗滌板,然后向每孔添加100 μ I過氧化物酶底物(TMB)。5分鐘后，通過添加100 μ I O. 3Μ磷酸來終止反應(yīng)，使用ELISA閱讀器(EL-808 [BioTEK])測量450nm下的OD值。為了測試血清的交叉反應(yīng)性NI抗體，還制作SNA4表達(dá)構(gòu)建體(類似上述用于A/加利福尼亞/04/2009 (HlNl)的那些)用于A/肯塔基/UR06-0258/2007 (HlNl)(氨基酸 75-470)和 A/火雞 / 土耳其/1/2005 (H5N1)流感病毒(氨基酸55-449)的頭部結(jié)構(gòu)域。特異性針對流感A/NL/602/09 (HlNl)和A/火雞/ 土耳其/1/2005 (H5N1)的血清獲自用這些病毒感染的雪貂，并且該血清用作陽性對照。h呼吸道和下呼吸道中的病毒復(fù)制右肺的所有葉和副葉的樣品采集自感染的雪貂，在干冰上與乙醇急速冷凍并且貯存在_70°C直到進(jìn)一步使用。將肺樣品稱重，然后用FastPr印-24(MP Biomedicals,Eindhoven, The Netherlands)在含有 O. 5 % 乳清蛋白、10 % 甘油、200U/ml 青霉素、200 μ g/ml鏈霉素、100U/ml硫酸多粘菌素Β、250 μ g/ml慶大霉素和50U/ml制霉菌素(ICNPharmaceuticals, Zoetermeer, The Netherlands)的 Hank' s 平衡鹽溶液中進(jìn)行勻漿，之后短暫離心。將鼻拭子和咽拭子在_70°C直接貯存于與勻漿肺樣品所用相同的培養(yǎng)基中。如前述[16]，將一式四份10倍連續(xù)稀釋的咽、鼻和肺樣品用于感染MDCK細(xì)胞。將接種后5天采集的培養(yǎng)物上清液的HA活性用作感染的指示。根據(jù)Spearman-Karber方法計算滴度，并且對于肺組織表示為log TCID5tl/克或者對于拭子表示為log TCID5ciAil [27]。鉬織病理學(xué)用流感A/NL/602/09 病毒的個感染后 4 天(day post inoculation, dpi),處死雪貂，肉眼觀察肺并稱重，之后采集來自右肺的樣品用于確定病毒滴度。然后用10%中性緩沖福爾馬林充滿左肺葉。固定后包埋在石蠟中，將肺以4μπι切片，然后通過用蘇木精和伊紅(HE)染色來檢查組織切片。統(tǒng)計分析在動物組中的顯著性通過單因素ANOVA和ANOVA之后的杜凱氏檢驗(Tukey test)進(jìn)行分析。P < 0. 05則認(rèn)為差異顯著。
`
結(jié)果通過用sHA3和sNA4免疫誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答測試了糖蛋白誘導(dǎo)針對同源病毒攻擊的保護(hù)性免疫的能力。在第O天和第20天用沒有佐劑的 sHA3+sNA4 (sHA+sNA)、用 ISCOM基質(zhì)M作為佐劑的 sHA3+sNA4 (IMM ;sHA+sNA+IMM)或者用類似的作為佐劑的SHA3(sHA+IMM)或sNA4(sNA+IMM)免疫雪貂。在第二次免疫當(dāng)天和攻擊前(第20天和第52天)采集血清，然后通過針對同源病毒的HI和VN測定以及NI測定來測量抗體應(yīng)答(圖2)。在僅用PBS或佐劑接種的對照動物中未觀察到這些測定中有應(yīng)答，而且在用無佐劑的SHA3和SNA4的混合物免疫的動物中也未觀察到。與此相反，用有佐劑的SHA3 (sHA+IMM)免疫引起了高HI滴度，在攻擊當(dāng)天幾何平均滴度為91。有趣的是，另外添加SNA4 (sHA+sNA+IMM)顯著地將平均HI滴度增加至468 (p < 0. 05 ;單因素ANOVA和杜凱氏檢驗)。另外，NI滴定顯示NA抗體的佐劑依賴性誘導(dǎo)，在一次免疫后低(圖2)但是在兩次免疫后極大加強(qiáng)(圖2)。然而，在這種情況下由于共施用SHA3這些滴度沒有明顯的增加。與觀察到的HI滴度一致，在sHA+IMM和sHA+sNA+MM接種動物中都發(fā)現(xiàn)高VN滴度(圖2)。另外，這里SNA4抗原與sHA+sNA+IMM疫苗的共施用引起平均VN滴度的增加，在sHA+IMM組和sHA+sNA+IMM組中平均值分別為1: 202至1: 468。保護(hù)對抗用2009甲型(HtNt)流感病毒感染后的臨床信號第二次接種后的第5周用106TCID5(I2009A(HlNl)攻擊經(jīng)接種的雪貂。從接種后的第2天起，在經(jīng)接種的雪貂中觀察臨床指標(biāo)，包括呼吸困難、嗜睡、食欲減少和體重減輕。一般而言，在組2、3和4的雪貂中僅觀察到輕微的臨床指標(biāo)，而在組1、5和6的雪貂中觀察到更嚴(yán)重的癥狀。在PBS和IMM接種的對照組以及無佐劑的sHA+sNA疫苗組中體重減輕明顯(圖3)。有趣的是，用sHA+IMM免疫的動物表現(xiàn)出幾乎類似的體重減輕，而在用含SNA4的兩種制劑(sNA+IMM組和sHA+sNA+IMM組)接種后體重沒有顯著變化。幾乎一致的是，尸檢后確定的雪貂的肺重量顯示這樣的相應(yīng)趨勢有佐劑的SNA4接種的動物具有最少疾病相關(guān)增加(由于肺實變)(圖3)。雪貂肺中總的病理和組織病理結(jié)果用流感病毒2009A (HlNl)病毒接種后第4天，肉眼觀察雪貂的肺并且稱重，之后取得樣品用于評估病毒復(fù)制和組織病理學(xué)變化。在經(jīng)接種的雪貂肺中肉眼觀察到暗紅色和堅實的實變區(qū)域。評估受影響的肺組織的百分比，它們在組之間是不同的。在組1、5和6的雪貂中觀察到肺中受影響的區(qū)域的平均百分比為約50%，而在組2、3和4的雪貂中實變的范圍較不明顯，顯示受影響的肺區(qū)域少于25% (圖3)。另外，與組1、5和6的雪貂相比，這些組中的相對肺重量更輕(圖3)。接種后的第4天，用PBS或僅佐劑(IMM)模擬接種或者用無佐劑的sHA3+sNA4接種的雪貂的肺中觀察到的組織病理學(xué)變化的特征在于中度至嚴(yán)重的壞死性支氣管間質(zhì)性肺炎。這些雪貂肺的肺泡中存在多病灶的，許多中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及不同數(shù)目的紅細(xì)胞、水腫流體和纖維蛋白存在于。另外，炎性浸潤存在于肺泡隔、細(xì)支氣管、支氣管以及支氣管和細(xì)支氣管的壁中。在有佐劑的SNA4接種的動物(sNA+MM組和sHA+sNA+MM組)中觀察到組織病理學(xué)變化顯著減少，而用sHA+IMM免疫的雪貂部分免于發(fā)生癥狀(圖4)。針對上呼吸道和下呼吸道中病毒復(fù)制的保護(hù)為了測量接種對呼吸道中病毒復(fù)制的影響，接種后第4天在肺、咽和鼻中確定病毒滴度。如圖5所示，在對照雪貂(PBS組和MM組)和用無佐劑的SHA3和SNA4混合物免疫的動物(sHA+sNA組)的肺中攻擊病毒有效地復(fù)制，平均病毒滴度為約IO7至IO8TCID5tl/克組織。這些病毒載量在用佐 劑中的SHA3蛋白質(zhì)免疫的動物(sHA+IMM組)和佐劑中的SHA3和SNA4共免疫的動物(sHA+sNA+IMM組)中降低約51og1(l單位。在用有佐劑的SNA4抗原免疫的動物(sNA+IMM組)中平均病毒載量降低2至31og1(l單位。在攻擊后的第4天在對照動物(PBS組和MM組；圖5)中觀察到鼻中的高病毒載量。盡管由于組內(nèi)滴度變化大而在統(tǒng)計上不顯著，但是與用有佐劑的SHA3或有佐劑的SNA4或者無佐劑的sHA3+sNA4組合免疫的動物相比，這些病毒載量表現(xiàn)出略微降低。在用有佐劑的SHA3和SNA4抗原組合免疫的動物中發(fā)現(xiàn)鼻病毒滴度減少最大。咽中的病毒滴度一般地較高，并且除了在用有佐劑的sHAjP SNA4組合免疫的動物中之外，受接種的影響不顯著。這些雪貂的咽中不具有可檢測的滴度。通過SHA2和SNA1免疫誘導(dǎo)的交叉反應(yīng)件抗體應(yīng)答為了研究由SHA3和SNA4抗原誘導(dǎo)的抗體是否與其他HlNl流感病毒交叉反應(yīng)，我們用接種后的血清進(jìn)行了另外的HI和NI測定。如期望地，針對同源病毒測量到最高的HI滴度，而用其他Hl毒株觀察到不同程度的交叉反應(yīng)(圖6A)。因此，對于A/豬/shope/1/56、A/意大利/1443/76、A/衣阿華/15/30、A/PR/8/34和IVR/148沒有檢測到交叉反應(yīng)，而針對A/NL/25/80和A/新澤西/8/76尤其針對NL/386/86測量到顯著的交叉反應(yīng)(或多或少地與它們的抗原結(jié)構(gòu)域的序列相似性一致)(參見表I)。
表1:不同HlNl菌株的HA內(nèi)抗原區(qū)域的序列同源性
權(quán)利要求
1.組合物，其包含至少ー種ISCOM復(fù)合物以及來自ー種或更多種流感病毒的至少ー種血凝素結(jié)構(gòu)域的至少ー個胞外結(jié)構(gòu)域和來自ー種或更多種流感病毒的至少ー種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的至少ー個胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域表示與所述流感病毒分離的胞外結(jié)構(gòu)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中來自至少一種血凝素結(jié)構(gòu)域的ー個或更多個胞外結(jié)構(gòu)域和來自至少ー種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的ー個或更多個胞外結(jié)構(gòu)域以雜合蛋白的形式存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述雜合蛋白是重組的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的組合物，其中來自至少一種血凝素結(jié)構(gòu)域的ー個或更多個胞外結(jié)構(gòu)域和來自至少ー種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的一個或更多個胞外結(jié)構(gòu)域為頭部結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的組合物，其中所述流感病毒選自流感的血清亞型，例如選自HxNy,其中X為I至16并且y為I至9。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述流感病毒為HlNl病毒，例如選自1918H1N1流感病毒(A/南加利福尼亞/1/18)和/或2004H5N1 (A/越南/1203/04) HlNlA/加利福尼亞/07/2009病毒和/或A/加利福尼亞/04/2009和/或A/加利福尼亞/09/2009，和/或A/肯塔基 /UR06-0258/2007 (HlNl)和/或 A/ 火雞 / 土耳其 /1/2005 (H5N1)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的組合物，其中所述組合物包含來自至少一種血凝素結(jié)構(gòu)域的I至5個胞外結(jié)構(gòu)域和來自至少一種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的I至5個頭部結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述至少ー種血凝素胞外結(jié)構(gòu)域選自A/加利福尼亞/09/2009的三聚HA胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸17-522)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述至少ー種神經(jīng)氨酸酶頭部結(jié)構(gòu)域選自A/加利福尼亞/09/2009病毒的四聚NA頭部結(jié)構(gòu)域(氨基酸75-469)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的組合物，其中所述ISCOM復(fù)合物為包含至少ー種皂苷、至少ー種脂質(zhì)和至少ー種抗原的ISC0M。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的組合物，其中所述ISCOM復(fù)合物為包含至少ー種皂苷和至少ー種脂質(zhì)的ISCOM基質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的組合物，其還包含添加剤、賦形劑、其他佐劑。
13.根據(jù)包含權(quán)利要求1至12中任一項的組合物，其用作免疫刺激藥、免疫調(diào)節(jié)藥物或疫苗，例如其針對脊椎動物如禽類和哺乳動物的流感。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述哺乳動物為人，伴侶動物如貓、狗、馬、禽類如鸚鵡，有經(jīng)濟(jì)價值的物種例如牲畜如?？苿游镂锓N、豬、綿羊、山羊或雪貂、水貂。
15.包含至少兩個室的藥盒，其中ー個室包含組合物，所述組合物包含至少ー種ISCOM復(fù)合物以及來自ー種或更多種流感病毒的至少ー種血凝素結(jié)構(gòu)域的至少ー個胞外結(jié)構(gòu)域和來自ー種或更多種流感病毒的至少ー種神經(jīng)氨酸酶結(jié)構(gòu)域的至少ー個胞外結(jié)構(gòu)域，并且另ー個室包含使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及組合物，其包含至少一種ISCOM復(fù)合物以及來自一種或更多種流感病毒的至少一種血凝素(HA)結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域和來自一種或更多種流感病毒的至少一種神經(jīng)氨酸酶(NA)結(jié)構(gòu)域的至少一個胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域表示與流感病毒分離的胞外結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還涉及藥盒。所述組合物可用作免疫刺激藥、免疫調(diào)節(jié)藥物或疫苗，例如其針對脊椎動物(例如禽類和哺乳動物)的流感。
文檔編號A61P31/16GK103052401SQ201180035658
公開日2013年4月17日 申請日期2011年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者A·D·M·E·奧斯特豪斯, 布羅·莫雷因, 卡林·本特松勒夫格倫 申請人:伊斯克諾瓦公司, 鹿特丹伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心