專利名稱：治療慢性創(chuàng)傷的光活性維生素納米顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為光動(dòng)力抗微生物劑的含光敏劑納米顆粒，尤其涉及含光活性維生素納米顆粒，其用于組織修復(fù)，包括治療慢性創(chuàng)傷。
背景技術(shù)：
部分由于缺少適當(dāng)?shù)闹委煼椒?，慢性?chuàng)傷是世界范圍內(nèi)的健康問題。而且，不正確的診斷、全身性抗生素的過度使用和加壓療法(compression therapy)的無效使用經(jīng)常使并發(fā)癥惡化。2010年，世界范圍內(nèi)超過7百萬人遭受慢性創(chuàng)傷，并且預(yù)測(cè)的年增長(zhǎng)為至少10%o而且，由于未適當(dāng)治愈的創(chuàng)傷,每年約80，000人進(jìn)行截肢。全球范圍內(nèi)在喪失勞動(dòng)力、住院治療、虛弱以及甚至死亡上的費(fèi)用是昂貴的。殺死細(xì)菌的常規(guī)方法(包括抗生素和消毒)由于多元抗藥性逐漸增加的速率通常無效并且可對(duì)周圍組織造成附加損傷，因此抑制痊愈和總體上成功的外科手術(shù)結(jié)果。治療已經(jīng)免疫抑制的患者所需要的大劑量抗微生物劑醫(yī)學(xué)上是不期望的，并且日益無效。

研究表明致病的生物膜是創(chuàng)傷愈合的主要障礙。生物膜中的細(xì)菌種類特別抗許多傳統(tǒng)的療法。光動(dòng)力抗微生物劑化療(PACT)是針對(duì)抗藥性微生物的潛在替代性的抗細(xì)菌、抗真菌的和抗病毒的治療，用于治療慢性創(chuàng)傷。對(duì)于細(xì)胞毒性活性分子比如光敏劑產(chǎn)生的活性氧種類(ROS)，生物極不可能發(fā)展抗性。但是，該技術(shù)的主要限制是微生物對(duì)光敏劑的吸收動(dòng)力學(xué)。已經(jīng)表明，數(shù)種細(xì)菌種類的組合經(jīng)常寄居慢性創(chuàng)傷，形成高度持久的生物膜群落。慢性創(chuàng)傷致病生物膜是宿主病原體環(huán)境，其中許多細(xì)菌種類共存并且共同生活以促進(jìn)它們自身的生存。普遍的誤解是單獨(dú)全身性抗生素可治療這些感染。單獨(dú)使用抗生素通常是有害的，因?yàn)閷?duì)正在使用的抗生素有抗性的細(xì)菌發(fā)展。光動(dòng)力療法(PDT)是涉及PACT的治療方案，其使用光和無毒性藥物的組合以破壞特定靶細(xì)胞。在無活性的和無毒的藥物局部施用或注射之后，藥物停留在所選擇的組織中并且可僅僅被某些波長(zhǎng)光的照射活化。當(dāng)這些光敏藥物被活化時(shí)，它們可產(chǎn)生高度活性中間體并且最終導(dǎo)致靶向細(xì)胞的選擇性死亡而不影響正常組織。目前，PDT主要用于治療癌癥。但是，數(shù)個(gè)研究已經(jīng)顯示，PDT也可有效地用于抗微生物劑處理。(Wainwright, M.(1998) ;Chen 等(2002) ;Douglas, L.J 和 Wainwright 等(2004))。由于抗生素廣泛可獲得，多年來，對(duì)抗微生物劑TOT的研究興趣減少。但是，近年來，包括甲氧苯青霉素抗性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (MRSA)和萬古霉素抗性幾腸球菌(Enterococcusfaecalis)的抗生素抗性細(xì)菌菌株的出現(xiàn)已經(jīng)重新引起對(duì)替代性治療的興趣。已經(jīng)確定存在包括在所有慢性創(chuàng)傷生物膜中的特定的細(xì)菌主要種群。發(fā)現(xiàn)包括葡萄球菌(Staphylococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、嗜腺菌(Peptoniphilus)、腸桿菌(Enterobacter)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)、芬爾德氏菌(Finegoldia)和沙雷菌(Serratia spp)的種類是常見的慢性創(chuàng)傷病原體。(Dar6czy等)。細(xì)菌生物膜是生活在保護(hù)性細(xì)胞外基質(zhì)中的高度組織的微生物群落。它們難以覺察并且對(duì)免疫或抗生素清除具有高度抗性。已經(jīng)表明，生物膜的存在可能促進(jìn)在慢性創(chuàng)傷中可見的難處理的發(fā)炎過程。數(shù)個(gè)臨床研究已經(jīng)顯示發(fā)展生物膜的慢性創(chuàng)傷患者(>60%)與發(fā)展生物膜的急性創(chuàng)傷患者(6%)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(P〈0.001)相關(guān)性。慢性創(chuàng)傷樣品的分子分析已經(jīng)揭示不同的多微生物群落和存在細(xì)菌建群。(Dowd等；GjodSbol等和Ngo等)。已經(jīng)調(diào)查了各種金屬化合物它們作為PDT劑的效用，尤其值得注意的是癌癥治療中的順鉬。(Lutterman等)。順鉬的主要問題是其對(duì)各種形式癌癥的選擇性效用、其對(duì)人細(xì)胞的毒性和腫瘤細(xì)胞可針對(duì)其發(fā)展的抗性。也已經(jīng)調(diào)查了其他金屬化合物它們的光敏性質(zhì)和它們作為PDT劑并且更具體地作為PACT劑的效用。盡管許多金屬化合物具有與順鉬相同的缺點(diǎn)，但一些不表現(xiàn)相同的副作用。但是，所有的此類金屬化合物基于它們復(fù)雜的合成(synthese)難以合成并且制造昂貴。天然存在的化合物不具有與合成相關(guān)的缺點(diǎn)。天然存在的化合物具有不損傷正常組織的附加優(yōu)勢(shì)。即，它們保 持惰性直到光活化一因此它們是用作PACT劑的優(yōu)異替代物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及組合物的制備和使用，所述組合物包括用作光動(dòng)力抗微生物劑化療(PACT)劑的含光敏劑并且特別是光活性維生素的或含酞菁的納米顆粒，其用于組織修復(fù)，包括治療連同燒傷的慢性創(chuàng)傷、軟組織感染以及皮膚和角膜感染。本文所述的組合物和方法使用便宜的、無毒的光活性維生素納米顆粒作為新的光動(dòng)力抗微生物劑化療劑提供例如慢性創(chuàng)傷的愈合的顯著改善。特別地，本發(fā)明通過提供基于熟知的、相對(duì)便宜的和無毒的水性維生素納米顆粒結(jié)合光療法的新的、充分表征的治療，解決了許多與創(chuàng)傷后感染相關(guān)的主要問題。如本文所述的，包括核黃素(維生素民)、鈷胺素(維生素B12)、葉綠醌(維生素!^)和甲基萘醌類(維生素K2)的無毒維生素是優(yōu)異的光敏劑，當(dāng)照射時(shí)其可產(chǎn)生單線態(tài)氧和自由基。其他合適的光敏劑包括酞菁，如本文所述的。也公開了獨(dú)特的納米乳液，其用于增加這些否則難以溶解的疏水維生素和其他光敏劑的溶解度，以使得能夠更快、更有效地輸送至靶細(xì)胞。本發(fā)明提供新的光動(dòng)力化療方案，用于治療微生物生物膜引起的慢性創(chuàng)傷潰瘍。需要新的策略以便立即使用，已經(jīng)顯示PACT是有效的替代物。另外，該方法的其他應(yīng)用為其他環(huán)境友好的用途比如生物補(bǔ)救危險(xiǎn)廢物場(chǎng)所、生物過濾工業(yè)水和形成生物屏障以避免油和地下水污染提供了機(jī)會(huì)。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠，其表示在30分鐘溫育和30分鐘照射之后將質(zhì)粒DNA從形式I (超螺旋的)光切割為形式II (被核黃素切口的)；圖2顯示作為照射時(shí)間函數(shù)的通過核黃素產(chǎn)生單線態(tài)氧；圖3是封裝維生素K的納米顆粒的透射電子顯微鏡(TEM)圖像；
圖4表示用根據(jù)本發(fā)明形成的納米乳液，核黃素在水溶液中溶解性增加；圖5是UV-Vis吸收光譜，將作為波長(zhǎng)函數(shù)的維生素B12在水溶液中的吸收強(qiáng)度(線a)與捕獲在炔二醇-磷酸膽堿雙重涂布的納米顆粒中的維生素B12的增強(qiáng)吸收強(qiáng)度(線b)進(jìn)行比較；圖6是熒光光譜，顯示包括核黃素的封裝納米顆粒的各種制劑的作為波長(zhǎng)函數(shù)的熒光強(qiáng)度；和圖7顯示在炔二醇-泊洛沙姆(poloxamer)(線I)和炔二醇-磷酸膽堿(線2)雙重涂布的納米顆粒中捕獲的酞菁銅。發(fā)明詳述如本文所述的，本發(fā)明涉及治療與生物膜的形成相關(guān)的慢性創(chuàng)傷的組合物，其包含由共聚物形成的納米顆粒，納米顆粒含有治療有效量的至少一種光敏劑，借此光敏劑的照射提供組織修復(fù)。在一種實(shí)施方式中，共聚物可包括聚氧乙烯和聚氧丙烯，并且優(yōu)選地是泊洛沙姆衍生物。尤其地，可用于本發(fā)明實(shí)踐的共聚物優(yōu)選地包括泊洛沙姆，其包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆338、泊洛沙姆237、泊洛沙姆188和泊洛沙姆124 ;聚山梨醇酯，其包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80 ;聚乙二醇，其包括PEG 200,PEG 300和PEG 400 ;聚氧乙烯醚；乳酸/羥基乙酸共聚物；和其衍生物、混合物和摻合物。而且，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，光敏劑選自核黃素(維生素民)、鈷胺素(維生素B12)、葉綠醌(維生素10和甲基萘醌類(維生素k2)。光敏劑也可包括酞菁，選自酞菁銅、雙磺化酞菁鋁和酞菁鋅。優(yōu)選地以適合局 部施用的形式提供組合物，其可包括液體、洗液、乳脂或軟膏。在可選形式中，組合物可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)作為氣溶膠施用。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于組織修復(fù)——包括治療慢性創(chuàng)傷——的組合物，其包含由第一共聚物形成的第一納米顆粒，和由第二共聚物形成的第二納米顆粒，所述第一納米顆粒含有治療有效量的第一光活性維生素，所述第二納米顆粒含有治療有效量的第二光活性維生素，借此第一和第二光活性維生素的照射提供組織修復(fù)。在另外的實(shí)施方式中，提供治療慢性創(chuàng)傷和其他皮膚病癥的方法，其包括施用治療有效量的藥物組合物至對(duì)象的傷口并且照射對(duì)象以活化光敏劑或光活性維生素并且提供組織修復(fù)，所述藥物組合物包含由共聚物或聚合物基質(zhì)形成的納米顆粒并且含有治療有效量的至少一種光敏劑或光活性維生素。如本文所使用，術(shù)語“納米顆?！卑ㄖ|(zhì)體、膠束、反膠束(inversemicelles)、雙涂布的脂質(zhì)體、納米乳液和聚合物基質(zhì)。聚合物基質(zhì)可用于任何前述實(shí)施方式并且可包括一種或多種下述聚合物:聚乙二醇醚、聚乙二醇、磷酸膽堿、聚乙烯醇和泊洛沙姆。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，聚合物基質(zhì)包含第一聚合物和第二聚合物，其中第一聚合物是聚乙二醇醚，第二聚合物選自聚乙二醇、磷酸膽堿、聚乙烯醇和泊洛沙姆，包括其衍生物、混合物和摻合物。包括脂質(zhì)體、膠束、反膠束和納米乳液的納米顆粒的生產(chǎn)方法的綜述提供在Liposomes, Marc Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc.New York, 1983 中，其相關(guān)部分通過引用并入本文。也見 Szoka, Jr.等，(Ann.Rev.Biophys.Bioeng., 1980, 9:467)，其相關(guān)部分也通過引用并入本文。如本文所使用，“治療有效量”指在患者或?qū)ο笾挟a(chǎn)生期望的作用尤其是組織修復(fù)和愈合的光敏劑或光活性維生素的量。該量將取決于許多因素，包括光敏劑或光活性維生素的性質(zhì)、對(duì)象的物理特征和細(xì)菌感染的程度。本領(lǐng)域的健康衛(wèi)生專業(yè)人員可容易地確定對(duì)于獲得治療期望結(jié)果所需要的有效量的范圍。在實(shí)施時(shí)，用一定波長(zhǎng)的光照射對(duì)象，以便光敏劑或光活性維生素相對(duì)本文指出的包括細(xì)菌種類的非期望生物產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，以促進(jìn)組織修復(fù)和愈合。許多光敏劑產(chǎn)生自由基和單線態(tài)氧，它們是高度活性的并且對(duì)包括細(xì)菌種類的生物可以是毒性的。使用文獻(xiàn)資源或直接測(cè)量，確定活化光敏劑的波長(zhǎng)。合適的光源包括能夠產(chǎn)生活化光敏劑或光活性維生素所需波長(zhǎng)的光的任何設(shè)備。目前的數(shù)據(jù)表明核黃素(7，8-二甲基-10-核糖基-異咯嗪或維生素B2)具有優(yōu)異的DNA結(jié)合常數(shù)(KbMO4M4)。如圖1中所顯示，核黃素可在用可見光U>395nm)的照射下切割DNA。溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠顯示在30分鐘溫育和30分鐘照射之后120 y M質(zhì)粒DNA從形式I——超螺旋的——光切割為形式II——被核黃素切口的。從左邊:泳道1:僅僅DNA，暗。泳道2:僅僅DNA，照射。泳道3:DNA+25 u M核黃素，暗。泳道4:DNA+25 y M核黃素，照射。泳道5:DNA+50 u M核黃素，暗。泳道6:DNA+50 u M核黃素，照射(18.8mg/Kg)。參考圖2，使用 蒽-9，10-二丙酸(ADPA)作為單線態(tài)氧傳感物的單線態(tài)氧研究顯示核黃素能夠僅僅在15分鐘的照射之后產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧。因?yàn)榇蠖鄶?shù)光活性維生素本質(zhì)上是疏水的或低溶解性的，因此已經(jīng)開發(fā)生物相容性納米乳液，以便更有效地輸送親脂性維生素和其他光敏劑至靶細(xì)胞。HLB(親水親油平衡)乳液系統(tǒng)用于制備水包油納米顆粒。維生素F(亞油酸和a-亞油酸的混合物)用作初始脂肪酸并且具有14-15的HLB。它也符合使水包油溶解的標(biāo)準(zhǔn)。HLB值需要在13-18之間。適合用于本發(fā)明的脂肪酸包括棕櫚酸、亞油酸、a -亞油酸、油酸、反式油酸、硬脂酸、花生酸和二十四烷酸。吐溫20 (聚山梨醇酯20或聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單月桂酸酯)具有16.7的HLB并且是合適的乳化劑。制造乳液:油16%乳化劑4%水80%初始乳液:具有疏水維生素的維生素F4份水2 份吐溫20 (乳化劑)I份首先，將疏水維生素溶于脂肪酸(維生素F)中。將一份吐溫20溶入2份(w/v)水中。通過逐滴添加具有疏水維生素的維生素F到含水吐溫20中，伴隨攪拌，將之前兩種結(jié)合，形成初始乳液，以提供清澈的乳液。將初始乳液超聲處理約I小時(shí)。以1:10(按體積計(jì))稀釋初始乳液以避免聚集并且接著超聲處理約另外的30分鐘。圖3是根據(jù)本發(fā)明的封裝維生素K的納米顆粒的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。圖4顯示作為納米乳液，核黃素溶解度增加超過3倍。左邊的小瓶顯示水中250 U m核黃素的核黃素沉淀。右邊的小瓶顯示750 PM核黃素的清澈溶液作為根據(jù)本發(fā)明形成的納米乳液。抗菌研究已經(jīng)顯示，1小時(shí)溫育和用低強(qiáng)度光(約5J/cm2) 30分鐘照射之后，低至85mg/Kg的核黃素濃度可造成50%細(xì)菌死亡。這是與基于MSDS記錄的LD50>10g/Kg的急性口服毒性比較。因此，本文使用的用于根除細(xì)菌的濃度對(duì)正常的人細(xì)胞沒有可觀察到的影響。在葉綠醌研究中也獲得相同的結(jié)果。表I顯示細(xì)菌研究的完整總結(jié)，LD50值以mg/Kg計(jì)。表1:在照射和暗條件下核黃素和葉綠醌的LD50 (以mg/Kg計(jì)的致死劑量50)。二者的急性口服全身毒性引用自MSDS。
權(quán)利要求
1.治療慢性創(chuàng)傷的組合物，其包含由共聚物形成的納米顆粒，所述納米顆粒含有治療有效量的至少一種光敏劑，借此所述光敏劑的照射提供組織修復(fù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述共聚物包括聚氧乙烯和聚氧丙烯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述共聚物選自:泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚乙二醇、聚乙二醇醚、磷酸膽堿、聚乙烯醇、乳酸/羥基乙酸共聚物，和其衍生物、混合物和摻合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述光敏劑選自核黃素(維生素民)、鈷胺素(維生素B12)、葉綠醌(維生素K1)、甲基萘醌類(維生素K2)和酞菁。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述酞菁選自酞菁銅、雙磺化酞菁鋁和酞菁鋅。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物為適合局部施用的形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物為選自下述的形式:液體、洗液、乳脂或軟膏。
8.治療慢性創(chuàng)傷的組合物，其包含由共聚物形成的納米顆粒，所述納米顆粒含有治療有效量的至少一種光活性維生素，借此所述光活性維生素的照射提供組織修復(fù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述共聚物包括聚氧乙烯和聚氧丙烯。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述共聚物選自:泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚乙二醇、聚乙二醇醚、磷酸膽堿、聚乙烯醇、乳酸/羥基乙酸共聚物，和其衍生物、混合物和摻合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求 8所述的組合物，其中所述維生素選自:核黃素(維生素民)、鈷胺素(維生素B12)、葉綠醌(維生素K1)和甲基萘醌類(維生素K2)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述組合物為適合局部施用的形式。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述組合物為選自下述的形式:液體、洗液、乳脂或軟膏。
14.治療慢性創(chuàng)傷的組合物，其包含由第一共聚物形成的第一納米顆粒和由第二共聚物形成的第二納米顆粒，所述第一納米顆粒含有治療有效量的第一光活性維生素，所述第二納米顆粒含有治療有效量的第二光活性維生素，借此所述第一光活性維生素和所述第二光活性維生素的照射提供組織修復(fù)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述第一共聚物和所述第二共聚物包括聚氧乙烯和聚氧丙烯。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述第一共聚物和第二共聚物選自:泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚乙二醇、聚乙二醇醚、磷酸膽堿、聚乙烯醇、乳酸/羥基乙酸共聚物，和其衍生物、混合物和摻合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述第一光活性維生素和所述第二光活性維生素選自:核黃素(維生素B2)、鈷胺素(維生素B12)、葉綠醌(維生素K1)和甲基萘醌類(維生素K2)。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述組合物為適合局部施用的形式。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述組合物為選自下述的形式:液體、洗液、乳脂或軟膏。
20.治療慢性創(chuàng)傷的方法,包括:將有效量的藥物組合物施用至對(duì)象的傷口，所述藥物組合物包含由聚合物基質(zhì)形成的納米顆粒并且含有治療有效量的至少一種光活性維生素；和 照射所述對(duì)象以活化所述光活性維生素和提供組織修復(fù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述聚合物基質(zhì)包括至少一種選自下述的聚合物:聚乙二醇醚、聚乙二醇、磷酸膽堿、乳酸/羥基乙酸共聚物、聚乙烯醇和泊洛沙姆，包括其衍生物、混合物和摻合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述聚合物基質(zhì)包括第一聚合物和第二聚合物，其中所述第一聚合物是聚乙二醇醚和所述第二聚合物選自聚乙二醇、磷酸膽堿、乳酸/羥基乙酸共聚物、聚乙烯醇和泊洛沙姆，包括其衍生物、混合物和摻合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述光活性維生素選自核黃素(維生素民)、鈷胺素(維生素B12)、葉綠醌(維生素K1)和甲基萘醌類(維生素K2)。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述組合物為適合局部施用的形式。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述組合物為選自下述的形式:液體、洗液、乳脂或軟膏。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于組織修復(fù)——包括治療慢性創(chuàng)傷——的作為光動(dòng)力抗微生物劑的含光敏劑納米顆粒——包括含光活性維生素納米顆粒的——的制備和使用。
文檔編號(hào)A61N5/06GK103189105SQ201180035660
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月21日
發(fā)明者P-F·賈爾斯 申請(qǐng)人:P·傅賈爾斯