專利名稱：包含雙和湯或其乳酸菌發(fā)酵物的用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥的組合物，尤其涉及含有雙和湯或其乳酸菌發(fā)酵物作為有效成分，并可用于骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防及/或治療的組合物。
背景技術(shù)：
機體骨組織一直處于成骨細胞形成組織與破骨細胞吸收組織的反復(fù)的動態(tài)平衡中。當成骨細胞與破骨細胞失去平衡，骨質(zhì)吸收超過骨質(zhì)形成將會引發(fā)骨質(zhì)疏松癥，特點是骨組織的鈣減少，骨密質(zhì)變薄，而骨髓腔隨之變大；如這種狀態(tài)持續(xù)，骨硬度將會降低，易引發(fā)骨折。已知骨質(zhì)疏松癥的原因很多，如年齡增大、運動不足、低體重、吸煙、鈣攝入減少、閉經(jīng)、切除卵巢手術(shù)后等。尤其，在女性30歲之后持續(xù)骨質(zhì)減少，而且閉經(jīng)后由于體內(nèi)激素水平的變化，骨質(zhì)急劇減少。雖有一些個體差異，但在老年人、尤其閉經(jīng)期以后女性來說出現(xiàn)骨質(zhì)疏松現(xiàn)象是無法避免的，在發(fā)達國家隨著人口老齡化，人們逐漸重視治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。一般骨質(zhì)疏松癥分為三大類第一類為原因不名(idiopathic)的骨質(zhì)疏松癥，第二類為閉經(jīng)期后雌激素減少引起的I型骨質(zhì)疏松癥，第三類為高齡男女中出現(xiàn)的II型骨質(zhì)疏松癥。目前用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，大多數(shù)是雌激素類藥物，但是此類藥物長期服用容易引發(fā)癌癥、膽結(jié)石、血栓形成等副作用。骨質(zhì)疏松癥治療難點是不能短期用藥，需長期用藥，所以既可以長期服用又沒有上述副作用，還能代替雌激素的新藥的開發(fā)極其必要。近年來，人們正在研究利用大豆、豆制品等食品中含有的染料木黃酮(genistein)或黃豆苷元(daidzein)等的植物雌激素(phytoestrogen)來開發(fā)副作用小、還可以長期服用的預(yù)防及治療治療骨質(zhì)疏松癥的藥劑。
雖然作為植物性激素的植物性雌激素在生物體內(nèi)利用率較低，然而其與雌激素受體-α (ER-α)及雌激素受體-β (ER-β )親和性較好，同時發(fā)生乳腺癌等副作用機率少，可做為骨質(zhì)疏松癥治療藥物Ε2的替代品。目前最為大家所熟知的植物雌激素黃豆苷元、染料木黃酮、刺芒柄花素(formononetin)、鷹嘴豆芽素A(biochanin A)等的異黃酮(isoflanone)類化合物；擬雌內(nèi)酯(coumestrol)等的和香豆素(coumestan)類化合物；腸內(nèi)酯(enterolactone)等的木脂素(Iignan)類化合物；及腸二醇(enterodiol)等的酹類(phenol)化合物。上述化合物中的糖化合物在腸道細菌的β糖苷酶(glucosidase)或胃酸水解后，作為以非糖苷形式的游離(free)異黃酮而被吸收。另外，雙和湯又稱雙和散，主要治療心力交瘁、氣血兩損、久病虛弱、氣虛多汗等癥狀。配方組成藥物有白芍藥、熟地黃、黃芪、當歸、川芎、桂皮、甘草、生姜、大棗，熬制成湯口服。雙和湯配方中藥材的功效桂皮活化脾胃功能，有助于治療脾胃虛寒引起的消化不良、脘腹冷痛、泄瀉等；當歸具有促進血液循環(huán)、抗癌、降壓、鎮(zhèn)痛解痙、化淤活血、促進腸蠕動、改善便秘等效果；白芍藥具有減少神經(jīng)及肌肉的過度緊張，從而鎮(zhèn)痛，補血的效果；熟地黃補血；黃芪與人參一樣是補氣的代表性藥材，補氣止汗、治癰腫等效果；川芎有助于血液循環(huán)、鎮(zhèn)痛止痛，治療頭痛，活化肝功能，具有造血功能，有助于治療貧血；干姜主治消化不良、嘔吐、腹瀉、促進血液循環(huán)；大棗健胃、滋補經(jīng)脈、舒心、補脾、補津液、補氣，還調(diào)和各種藥材的功效。目前，在中藥材中加入微生物進行發(fā)酵，獲得有效成份的的技術(shù)有韓國注冊專利第185619號，中藥材熬制成湯后,在湯液中加入生長好風味優(yōu)異的乳酸菌進行混合培養(yǎng)、發(fā)酵，從而得到整腸作用的協(xié)同效果的技術(shù)；韓國公開專利第2004-0078030號，選擇部分谷物與一些中藥材發(fā)酵的大豆，通過低溫速成技術(shù)將全部原料進行發(fā)酵，從而直接保持各原料的固有性質(zhì)并增強其效果的技術(shù)，等等。然而有關(guān)雙和湯發(fā)酵藥材相關(guān)文獻卻幾乎沒有。本發(fā)明人等，在調(diào)制好雙和湯后，添加乳酸菌獲得發(fā)酵物，并發(fā)現(xiàn)所述雙和湯及其乳酸菌發(fā)酵物具有之前未曾有過的優(yōu)異的治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥功效，從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供包括雙和湯或其乳酸菌發(fā)酵物作為有效成分的用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的組合物。用于解決問題的手段為達到上述目的，本發(fā)明提供包括雙和湯或其乳酸菌發(fā)酵物作為有效成分的用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物。另外，本發(fā)明還提供包括雙和湯或其乳酸菌發(fā)酵物作為有效成分的用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的健康食品。解決問題的方法本發(fā)明提供包括雙和湯或其乳酸菌發(fā)酵物作為有效成分的用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物。所述雙和湯是由白芍藥、熟地黃、黃芪、當歸、川芎、桂皮、甘草、生姜、大棗，提取而成，優(yōu)選以白芍藥10重量份、熟地黃4-6重量份、黃芪4-6重量份、當歸4-6重量份、川芎4-6重量份、桂皮2-5重量份、甘草2-5重量份、生姜1-3重量份、大棗1_4重量份為比例制成生藥混合物后提取。通常利用純水提取，但有時也可使用有機溶劑。還可使用有機溶劑Cl或C4低級醇、丙酮，或其水溶液，但不限于此。本發(fā)明中，所述“雙和湯”包括將藥材混合物用水提取的，還包括使用有機溶劑提取的。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，為調(diào)制雙和湯乳酸菌發(fā)酵物(以下簡稱“雙和湯發(fā)酵物”)，首先向所述的生藥混合物中加入2-15倍水，在70-100°C下加熱提取。提取物冷卻后接種試料重量的O. 5-5重量％、優(yōu)選I重量％的乳酸菌，在20-40°C、優(yōu)選37°C下，發(fā)酵24-52小時、優(yōu)選48小時，從而調(diào)制成本發(fā)明的雙和湯發(fā)酵物。如以利用水以外的其它有機溶劑作為提取溶劑而制得的雙和湯提取物來調(diào)制所述雙和湯發(fā)酵物時，優(yōu)選首先將所述提取物干燥后稀釋于水，并將乳酸菌接種于此進行發(fā)酵。所述乳酸菌可使用分離菌株或市售乳酸菌株。具體有乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌、明串珠菌、片球菌、乳酸球菌中的微生物，優(yōu)選使用乳桿菌中的微生物。本發(fā)明優(yōu)選實施例中，使用諸如發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、嗜淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylophilus)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、混淆乳桿菌(Lactobacillusconfuses)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)及短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)的多種乳酸菌制成雙和湯發(fā)酵物(參考實施例1)，但可使用的乳酸菌不限于所述例示的乳酸菌。乳酸菌培養(yǎng)基可選自MRS(Man-Rogosa-Sharpe)、乳糖、M17及APT培養(yǎng)基(AsparagineEnrichment Broth),但不限于此。雙和湯可以自制或使用市面銷售產(chǎn)品。本發(fā)明的雙和湯或雙和湯發(fā)酵物在臨床上可通過口服或非口服途徑服用，并可以一般藥物制劑形式使用。具體講，本發(fā)明的雙和湯或雙和湯發(fā)酵物在實際臨床上以口服或非口服的各種制劑形式使用。上述雙和湯或雙和湯發(fā)酵物制成制劑時，可使用一般填充齊U、增量劑、結(jié)合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等的稀釋劑或賦形劑生產(chǎn)。經(jīng)口施用固體制劑有片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊等。此類固體制劑在雙和湯或雙和湯發(fā)酵物中加入一種以上賦形劑混合制成，如，淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等。單純賦形劑以外，還可使用潤滑劑，如硬脂酸鎂沿石粉(口1.·]邛咅土司釗Ol!眢彐)等。經(jīng)口施用的液體制劑有懸浮劑、內(nèi)服液劑(邙普嗎沖)、乳液劑、糖漿劑等，除了使用常見的單純稀釋劑水、液體石蠟以外，還可使用各種賦形劑，如濕潤劑、甜味劑、香料、保鮮劑等。非經(jīng)口施用制劑有無
菌水溶液、非水性溶劑、懸浮劑、乳劑、冷凍干燥制劑、栓劑。非水性溶劑、懸浮溶劑可使用丙二醇、聚乙二醇、橄欖油之類的植物油、油酸乙酯等可以注射的酯類等。栓劑的基本底劑WWitepsol(刮唱告)、聚乙二醇、吐溫6丨(！進61 )、可可脂Jauriiium(e}舍鉭7'1)、甘油、明膠等。同時，為了增強骨質(zhì)疏松癥預(yù)防與治療功能可以適當添加鈣或維生素D3。劑量單位是，例如，可以為個體劑量(711望早鐘導(dǎo))的1、2、3或者4倍；或1/2、1/3或1/4倍，個體劑量含有有效藥物的I次劑量，這相當于I日劑量的全部、1/2、1/3或1/4 倍。本發(fā)明雙和湯或雙和湯發(fā)酵物的人體劑量根據(jù)體內(nèi)活性成份的吸收、非活性化率(眚蟄勺許I )及排泄速度、患者年齡、性別、狀態(tài)、疾病程度等適當選擇，成人用量是10 300mg/Kg,優(yōu)選用量是20 100mg/Kg,每天可分I 6次服用。本發(fā)明的組合物對小鼠經(jīng)口施用及腹腔內(nèi)用藥時的毒理學實驗結(jié)果顯示，經(jīng)口毒性實驗半數(shù)致死量(LD5tl)是5g/Kg以上，為安全可用藥物。根據(jù)本發(fā)明一實施例，雙和湯或雙和湯發(fā)酵物處理破骨細胞時，明顯減少破骨細胞分化相關(guān)指標-TRAP活性及多核性破骨細胞的形成(參考圖1)，并且代表性的破骨細胞分化相關(guān)基因表達也明顯減少(參考表2)。根據(jù)利用多種乳酸菌發(fā)酵物的實施例，本發(fā)明的雙和湯發(fā)酵物整體減少破骨細胞分化相關(guān)指標-TRAP活性，在高濃度效果更明顯，明顯減少多核性破骨細胞的形成(參考圖2)。根據(jù)本發(fā)明另一實施例，雙和湯發(fā)酵物給藥后，實驗動物沒有出現(xiàn)異常癥狀或死亡。雙和湯或雙和湯發(fā)酵物處理后，不影響卵巢切除動物體重增加(參考圖3)，也未出現(xiàn)其他器官的重量變化(參考圖4)。并且，通過生化分析儀分析各組動物的血清結(jié)果顯示，雙和湯發(fā)酵物給藥組中具有明顯降低卵巢切除后增加的甘油三酯濃度的效果(參考圖5)。而且，根據(jù)本發(fā)明另一實驗例，卵巢切除引起的骨密度減少的模型中，雙和湯或雙和湯發(fā)酵物給藥后，顯示出因卵巢切除而減少的大腿骨密度增加的趨勢(參考表6)，組織分析中也明顯發(fā)現(xiàn)能改善骨小梁減少的趨勢。并且本發(fā)明還提供一種含有雙和湯或雙和湯發(fā)酵物作為有效成份的預(yù)防或減緩骨質(zhì)疏松癥的健康食品。以改善骨質(zhì)疏松癥為目的，本發(fā)明雙和湯或雙和湯發(fā)酵物可添加到健康食品中。作為食品添加劑，雙和湯或雙和湯發(fā)酵物以一般的方式適當使用，如可直接添加、與其它食品或其它食品成份混合皆可。有效成份的混合量可根據(jù)使用目的(預(yù)防、健康或治療)而適當決定。一般情況下，制造食品或飲料時，雙和湯或雙和湯發(fā)酵物以相對于原料為30重量％以下，優(yōu)選10重量％以下的量添加。但以健康及衛(wèi)生，或調(diào)節(jié)健康為目的長期攝取時，所述量可低于所述范圍，由于在食品安全方面無任何問題，因此有效成分可以以所述范圍以上的量來使用。所述食品種類，無特別限制?？商砑由鲜鑫镔|(zhì)的食品有，肉類、火腿、面包、巧克力、糖果類、零食類、餅干類、披薩、方便面、其它面類、口香糖類、包括冰淇淋類等的奶制品、各種湯類、飲料、茶、能量飲料、酒類飲料及維生素復(fù)合制劑等，包括通常意義上的所有健康食品。并且，本發(fā)明的雙和湯或雙和湯發(fā)酵物也可用于韓醫(yī)處方。本發(fā)明健康飲料組合物與通常的飲料相同，作為添加成份可加入各種食用香料或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物有如葡萄糖、果糖等的單糖類；如麥芽糖、蔗糖等的雙糖；及如糊精、環(huán)糊精等的多糖；如木糖醇、山梨醇、赤藻糖醇等的糖醇。甜味劑有如奇異果甜蛋白、甜菊提取物的天然甜味劑；或如糖精、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的合成甜味劑。所述天然碳水化合物添加比例是每IOOml雙和湯或雙和湯發(fā)酵物約O. 01 O. 04g，優(yōu)選O. 02 O. 03go 除上述添加劑以外，雙和湯或雙和湯發(fā)酵物也可添加各種營養(yǎng)劑、維生素、電解質(zhì)、風味劑、色素、果膠酸及其鹽、褐藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體增稠劑、PH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、酒精、用于碳酸飲料的碳酸劑。此外雙和湯或雙和湯發(fā)酵物也可含有為制成天然果汁、果汁飲料及蔬菜飲料的果肉。此類成份可單個或混合使用，此類添加劑比例并不大重要，但是相對于每100重量份雙和湯或雙和湯發(fā)酵物一般選擇范圍為O. 01 O.1重量份。發(fā)明效果綜上所述，雙和湯或雙和湯發(fā)酵物具有優(yōu)異的抑制破骨細胞分化及相關(guān)基因表達的效果，在生物體內(nèi)實驗中證明具有增加骨密度的效果，可以用于預(yù)防及/或治療骨質(zhì)疏松癥。


圖1 為分別表不 RAW264. 7 細胞中 RANKL (Receptor Activator for NuclearFactor kB Ligand)誘導(dǎo)的TRAP活性⑷和雙和湯及由發(fā)酵乳桿菌(NRRL (NortherRegional Research Laboratory, ARS Culture Collection， US Department ofAgricultureiPeoria, 111,USA)B4524)發(fā)酵的雙和湯發(fā)酵物對TRAP-陽性多核化破骨細胞的形成產(chǎn)生的效果(B)的圖表及照片。圖2為表示由多種乳酸菌發(fā)酵的雙和湯發(fā)酵物對在RAW264. 7細胞中RANKL誘導(dǎo)的TRAP活性(A)，TRAP-陽性多核化破骨細胞形成產(chǎn)生的效果(B)的圖表。S :雙和湯的熱水提取物樣本，S-con :雙和湯發(fā)酵前滅菌樣本，S658 :格氏乳桿菌(NCFB(NationalCollection of Food Bacteria, Reading, United Kingdom) 2233)發(fā)酵物，S692 :干酪乳桿菌(KFRI#692)發(fā)酵物，S-127 :干酪乳桿菌(KCTC2180)發(fā)酵物，S-144 :植物乳桿菌(ATCC8014)發(fā)酵物，S-150 :嗜酸乳桿菌(ATCC4356)發(fā)酵物，S-161 :嗜淀粉乳桿菌(NRRLB-4437)發(fā)酵物，S-166 :彎曲乳桿菌(NRRL B-4562)發(fā)酵物，S-217 :嗜酸乳桿菌(KCTC3168)發(fā)酵物，S-227 :混淆乳桿菌(IH14005)發(fā)酵物，S-239 :短乳桿菌(IH14003)發(fā)酵物，S-402 植物乳桿菌(ATCC8014)發(fā)酵物，S-744 :短雙歧桿菌(ATCC15700)發(fā)酵物，GM:培養(yǎng)基，RANLK :破骨細胞分化誘導(dǎo)細胞因子，LY294002 :破骨細胞分化抑制劑。圖3為雙和湯及雙和湯發(fā)酵物給藥期間，卵巢切除大鼠體重變化圖。C ;對照組，NC ;陰性對照組，SHT ;雙和湯給藥組，SFT ;由發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵的雙和湯給藥組。圖4為表示大鼠大腿骨(A)及子宮(B)的組織形態(tài)學分析結(jié)果的照片。C ;對照組，NC ;陰性對照組，SHT ;雙和湯給藥組，SFT ;由發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵的雙和湯給藥組。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施實例詳細說明。但下述實施實例只是舉例說明，并不限定本發(fā)明的范圍。實施例1 :制作雙合餳的乳酸菌發(fā)酵物所述雙和湯為 由白芍藥、熟地黃、黃芪、當歸、川芎、桂皮、甘草、生姜、大棗制成的漢方制劑，以一副為單位，制成50副用于本次實驗。一副用量為，白芍藥9. 37g、熟地黃3. 75g、黃芪3. 75g、當歸3. 75g、川芎3. 75g、桂皮2. 81g、甘草2. 81g、生姜1. 49g、大棗2. 0g，制成生藥混合物后進行提取。總50副的藥材總量是l，674g，加入其10倍量的蒸餾水16. 74L,加熱150分鐘提取(韓國，Kyungseo熬藥機(|A!平晉7] )i cosmos-600),利用標準實驗用篩(Standard testing sieve, Aperture500 μ m和150 μ m)過濾制成雙和湯。在過濾后湯藥內(nèi)加入1%體積(v/v)的乳酸菌(1-5\10*^^/!111)，在371下發(fā)酵48小時后，利用所述標準實驗用篩過濾制成雙和湯的乳酸菌發(fā)酵物。發(fā)酵物進行冷凍干燥后至使用前保存于4°C。用于制備乳酸菌發(fā)酵物的乳酸菌有發(fā)酵乳桿菌(NRRL B-4524)、格氏乳桿菌(NCFB2233)、干酪乳桿菌(KCTC2180，KFRI#692)、植物乳桿菌(ATCC8014)、嗜酸乳桿菌(ATCC4356，KCTC3168)、嗜淀粉乳桿菌(NRRL B-4437)、彎曲乳桿菌(NRRLB-4562)、混淆乳桿菌(IH14005)、短乳桿菌(IH14003)及短雙歧桿菌(ATCC15700)。實施例2 :雙和餳和發(fā)酵雙和餳分化破骨細胞的效果RAW264. 7細胞在RANKL處理時顯現(xiàn)作為破骨細胞分化的標志物的TRAP活性的增力口，并分化為破骨細胞(Minkin C. Calcif Tissue Int. 198234(3) :285_90 ；Hsu H, et al.，1999，Proc. Nat. Acad. Sc1. USA，96，35403545)。為了確認實施例1 中制成的雙和湯(SHT)和雙和湯乳酸菌發(fā)酵物(SFT)對破骨細胞分化的影響，將RAW264. 7細胞以I X IO3細胞/孔的密度，接種于96孔板中，以25-200 μ g/ml濃度雙和湯和雙和湯發(fā)酵物處理3天，使用含有分化誘導(dǎo)因子RANKL(100ng/ml)的a-MEM培養(yǎng)基(10% FBS)作為培養(yǎng)基。
實驗處理后第4天，進行確認TRAP陽性多核性破骨細胞形成的TRAP染色后，檢測了 TRAP活性。用顯微鏡確認了多核性破骨細胞。破骨細胞用10%福爾馬林固定10分鐘、乙醇/丙酮(I I, v/v)混合溶劑固定I分鐘后，利用染色試劑盒(LeukocyteAcid Phosphatase Kit387_A, Sigma, MO)進行染色。利用裝有DP控制器的顯微鏡(Olympus Opitical Co. Ltd. , Tokyo, Japan)觀察分化的多核性破骨細胞。為測定TRAP活性，在所述裝有固定的破骨細胞的96-孔板加入含IOmM酒石酸鈉、5mM對硝基苯磺酸鹽(L.1!旦砷省翌蘭)(sigma, MO)的檸檬酸鹽緩沖液(50mM, ρΗ4· 6)后，在37。。培養(yǎng)I小時。將此酶反應(yīng)液與等量0.1N NaOH混合后，在410nm波長測定吸光度。TRAP活性以與對照組相比的百分比換算而顯示。結(jié)果顯示，雙和湯及由發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵的雙和湯發(fā)酵物在200μ g/ml濃度明顯降低了 TRAP活性(圖l，p<0.01)。同時，用雙和湯及由發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵的雙和湯發(fā)酵物處理時，通過TRAP染色確認了多核性破骨細胞形成的減少(圖1B)，并且利用由多種乳酸菌發(fā)酵的雙和湯發(fā)酵物的實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明的雙和湯發(fā)酵物整體降低了 TRAP活性，特別是在100 μ g/ml濃度其效果顯著(圖2的A，P < 0. 01)。并且，由嗜淀粉乳桿菌發(fā)酵的雙和湯發(fā)酵物處理時，通過TRAP染色確認了多核性破骨細胞形成的減少(圖2的B)。實施例3.雙和湯的破骨細胞分化相關(guān)基因的表達已知TRAP、c-Src及組織蛋白酶K基因是破骨細胞分化與骨吸收功能相關(guān)的必需基因，在破骨細胞分化時其表達增加(Hsu H, et al. ,1999, Proc. Nat. Acad. Sc1. USA, 96,35403545)。為了確認抑制TRAP染色和活性的雙和湯對所述三種基因的表達所產(chǎn)生的效果，進行了實時定量PCR(real time quantitative PCR)。為此,進行RANKL處理，并在24小時后，利用TRIzol (Invitrogen，Inc. NY, USA)分離總RNA。對于破骨細胞分化相關(guān)基因特異的引物通過在線引物設(shè)計程序進行設(shè)計(Rozen and Skaletsky, 2000),對各基因的引物使用下表I中所示的 正向(Forward)及反向(Reverse)引物對。cDNA合成使用2μ g的總 RNA, I μ M 的 Oligo-ClT18 引物及 10 單位的 RNA 酶抑制劑 RNasin(Promega, WI, USA)和Omniscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen, CA)進行合成?；赟YBR Green的定量PCR擴增50倍稀釋的 cDNA 和 20pmol 引物與 Brilliant SYBR Green Master Mix (Stratagene, CA)混合后，利用Stratagene Mx3000P Real-time PCR system進行擴增。PCR程序如下為了聚合酶活性，在95°C下維持10分鐘后，在94°C下40秒(變性)，在60°C下40秒(退火)，及在72°C下I分鐘(延長)，重復(fù)40回；此后在95°C下I分鐘，在55°C下30秒，及在95°C下維持30秒，制作生成的PCR產(chǎn)物的溫度解離曲線(temperature dissociation curves,又稱熔化曲線(melting curves))。所有實驗進行3個重復(fù)，PCR數(shù)據(jù)根據(jù)2_Λ "CT方法進行分析(Livak and Schmittgen，2001)。此時，將GAPDH做為PCR的參照組來使用，將GAPDH標準化的2_ΛΛετ數(shù)據(jù)經(jīng)Student’ st_檢驗分析后，認為p < 0. 05為明顯的差異。結(jié)果顯示，RANKL處理時上述三種基因表達急劇增加，但在雙和湯處理組(200 μ g/ml)的情況下c-Src及組織蛋白酶K基因的表達明顯降低(圖2，p < 0. 05)。表I[Table I]
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物，含有雙和湯或雙和湯乳酸菌發(fā)酵物作為有效成分，所述雙合湯由在包含白芍藥、熟地黃、黃芪、當歸、川芎、桂皮、甘草、生姜、大棗的生藥混合物中加入水或有機溶劑后提取而制得，所述雙和湯乳酸菌發(fā)酵物由在所述雙和湯中接種乳酸菌進行發(fā)酵而制得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述雙和湯由在生藥混合物中加入水或有機溶劑后提取而制得，所述生藥混合物包括白芍藥10重量份、熟地黃4-6重量份、黃芪4-6重量份、當歸4-6重量份、川芎4-6重量份、桂皮2-5重量份、甘草2_5重量份、生姜1_3重量份、大棗1-4重量份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，所述有機溶劑選自C1-C4醇、丙酮及其水溶液構(gòu)成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述乳酸菌選自乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌、明串珠菌、片球菌、乳酸球菌中的微生物所組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述乳酸菌為選自發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜淀粉乳桿菌、彎曲乳桿菌、混淆乳桿菌、短乳桿菌及短雙歧桿菌組成的組的微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4及5中的任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述乳酸菌以試料重量的O. 5-5重量％進行接種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、4及5中的任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述乳酸菌在20-40°C下，發(fā)酵24-52小時。
8.一種預(yù)防或改善骨質(zhì)疏松癥的健康食品，含有雙和湯乳酸菌發(fā)酵物作為有效成分，所述雙和湯乳酸菌發(fā)酵物由向雙和湯接種乳酸菌進行發(fā)酵制得，所述雙和湯由向包含白芍藥、熟地黃、黃芪、當歸、川芎、桂皮、甘草、生姜、大棗的生藥混合物中加入水或有機溶劑后提取而制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的組合物。尤其涉及包含雙合湯或在雙合湯中接種乳酸菌進行發(fā)酵而制得的雙合湯乳酸菌發(fā)酵物作為有效成分的預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物及健康食品。本發(fā)明的包含雙合湯或雙合湯乳酸菌發(fā)酵物的組合物對抑制破骨細胞的分化及相關(guān)基因表達具有顯著效果，生物體內(nèi)試驗中也具有骨密度增加效果，因此，可用于預(yù)防及/或治療骨質(zhì)疏松癥。
文檔編號A61K36/232GK103037882SQ201180038177
公開日2013年4月10日 申請日期2011年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者馬珍烈, 沈棋奭, 李智慧 申請人:韓國韓醫(yī)學研究院