專(zhuān)利名稱(chēng)：用于穩(wěn)定含有蛋白質(zhì)的制劑的含有烷基糖苷的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及某些烷基糖苷組合物用于防止抗體和其他蛋白質(zhì)在其治療上有用的制劑中聚集和氧化的用途。
背景技術(shù)：
當(dāng)需要蛋白制劑的穩(wěn)定劑來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)免于在搖動(dòng)、攪動(dòng)、剪切和冷凍-融化時(shí)變性或者保護(hù)其在界面處于靜息狀態(tài)時(shí)，通常使用非離子去污劑(即表面活性劑)(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，183，746)。這由在許多含有蛋白質(zhì)的產(chǎn)品中使用聚山梨酯所例`示。例如，在生物治療產(chǎn)品的制劑中使用聚山梨酯20和80 (Tween 20和Tween 80),用于防止表面吸附并用作防止蛋白質(zhì)聚集的穩(wěn)定劑(Kerwin, J. Pharm. Sc1. 97 (8)2924-2936 (2008)) o聚山梨酯是由聚氧乙烯(POE)脫水山梨糖醇的脂肪酸酯構(gòu)成的兩性非離子型表面活性劑，對(duì)于聚山梨酯20，是聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯，并且對(duì)于聚山梨酯80，是聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。然而，不幸地是，聚山梨酯可通過(guò)氧化或水解而發(fā)生降解。當(dāng)聚山梨酯分子降解時(shí)，其產(chǎn)生不同的降解副產(chǎn)物，包括例如脂肪酸、POE脫水山梨糖醇、PEG、PEG酯和烷基酸。這些聚山梨酯降解副產(chǎn)物中的某些(包括游離脂肪酸)可引起含有蛋白質(zhì)的制劑的濁度升高和蛋白質(zhì)聚集。因此，雖然通常將聚山梨酯用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，但是隨時(shí)間推移由聚山梨酯降解釋放的脂肪酸和其他降解副產(chǎn)物可能不利地影響聚山梨酯在含有蛋白質(zhì)的制劑中顯示的保護(hù)作用。在純化和貯存期間，蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的降解，其中氧化(包括光誘導(dǎo)的氧化)是主要降解途徑之一，其對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和效力具有破壞作用。氧化反應(yīng)引起氨基酸殘基的破壞、肽鍵的水解，從而由于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化和蛋白質(zhì)聚集導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性(Davies, J. Biol. Chem. 262 :9895-901 (1987))。Nguyen (蛋白質(zhì)和肽制劑和遞送中的第 4 章(Chapter4in Formulation and Delivery of Protein and Peptides)(1994)) > Hovorka(J. Pharm Sc1. 90 :25369 (2001))和 Li (Biotech Bioengineering48 490-500 (1995))已經(jīng)綜述了蛋白質(zhì)藥物的氧化。根據(jù)上述，顯然需要鑒定可用于提高含有蛋白質(zhì)的制劑中的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和防止含有蛋白質(zhì)的制劑中的蛋白質(zhì)的聚集和/或氧化的組合物。發(fā)明簡(jiǎn)沭本發(fā)明是基于如下新發(fā)現(xiàn)某些烷基糖苷組合物可用于穩(wěn)定和/或降低治療上有用的制劑中的抗體或其他蛋白質(zhì)的聚集或免疫原性。此外，本發(fā)明還基于如下新發(fā)現(xiàn)某些烷基糖苷組合物可用于防止治療上有用的制劑中的抗體或其他蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基特別是色氨酸殘基的氧化。更尤其是，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及使用具有至少1. OmM臨界膠束濃度(CMC)值的烷基糖苷類(lèi)作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑或作為降低蛋白質(zhì)聚集的物質(zhì)的方法。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，以低于其各自CMC值的濃度，在含有抗體或其他蛋白質(zhì)的制劑中使用烷基糖苷組合物。因此,一方面,本發(fā)明涉及含有蛋白質(zhì)和燒基糖苷的物質(zhì)組合物(composition ofmatter)，所述烷基糖苷在25oC下、在水中具有大約1. OmM或更大的CMC值。在一些實(shí)施方案中，存在于物質(zhì)組合物中的蛋白質(zhì)是抗體，其可以任選地是單克隆抗體。在其他實(shí)施方案中，烷基糖苷選自正己基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-0 -D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-P -D-吡喃葡萄糖苷、3-環(huán)己基_1_丙基_ P _D_匍萄糖昔、3_環(huán)己基-1- 丁基_ P _D_匍萄糖昔、正己基_ P -D-卩比喃麥芽糖苷、正辛基-P -D-吡喃麥芽糖苷、正壬基-P -D-吡喃麥芽糖苷、正癸基-P -D-吡喃麥芽糖苷、環(huán)己基-甲基-P -D-麥芽糖苷、2-環(huán)己基-乙基-P -D-麥芽糖苷、3-環(huán)己基-丙基-0 -D-麥芽糖昔、4_環(huán)己基_ 丁基_ P -D-麥芽糖昔和5_環(huán)己基_戍基_ P -D-麥芽糖苷。在其它實(shí)施方案中，所述物質(zhì)組合物含有抑制攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的量或者防止氧化的量的烷基糖苷。在另一實(shí)施方案中，烷基糖苷以比25°C下水中的烷基糖苷CMC值更低的濃度存在于物質(zhì)組合物中。所述物質(zhì)組合物可以是含水的，可以在大約2-8° C溫度下穩(wěn)定至少一年，和/或可以在大約3 0° C的溫度下穩(wěn)定至少一個(gè)月。任選地，所述物質(zhì)組合物不是凍干的并且沒(méi)有進(jìn)行預(yù)先凍干(prior lyophilization)或者可以是重構(gòu)的凍干制劑。另一方面，本發(fā)明涉及于制品(article of manufacture),該制品包含容納上述物質(zhì)組合物的容器。本發(fā)明的另一方面涉及制備藥物制劑，其包括制備上述的物質(zhì)組合物和評(píng)價(jià)所述物質(zhì)組合物中蛋白質(zhì)的物理穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性或生物活性。本發(fā)明的另一方面涉及抑制存在于第一水溶液中的蛋白質(zhì)的攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的方法，其中該方法包括向第一水溶液中加入抑制攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的量的烷基糖苷的步驟，所述烷基糖苷在25°C、在水中具有大約1. OmM或更大的CMC值，由此提供第二水溶液。本發(fā)明的另一方面涉及防止存在于第一水溶液中的蛋白質(zhì)氧化的方法，其中該方法包括向第一水溶液中加入抑制氧化的量的烷基糖苷的步驟，所述烷基糖苷在25°C、在水中具有大約1. OmM或更大的CMC值，由此提供第二水溶液。


圖1顯示某些表面活性劑對(duì)水溶液中的抗-MUC16單克隆抗體的攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的作用。圖2顯示某些表面活性劑對(duì)水溶液中的抗-MUC16單克隆抗體的攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的作用。圖3顯示某些表面活性劑對(duì)水溶液中的抗-MUC16單克隆抗體的攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的作用。圖4顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷對(duì)含有抗-MUC16單克隆抗體的水溶液的濁度的作用。圖5顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷對(duì)維持水溶液中抗-MUC16單克隆抗體的％單體的作用。圖6顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20對(duì)含有抗-MUC16單克隆抗體的水溶液的濁度的作用。圖7顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20對(duì)含有抗-1gE單克隆抗體的水溶液的濁度的作用。圖8顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20對(duì)含有抗-⑶Ila單克隆抗體的水溶液的濁度的作用。圖9顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20對(duì)含有抗-⑶22單克隆抗體的水溶液的濁度的作用。圖10顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20對(duì)維持水溶液中抗-MUC16單克隆抗體的％單體的作用。

圖11顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20對(duì)維持水溶液中抗-1gE單克隆抗體的％單體的作用。圖12顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20對(duì)維持水溶液中抗-⑶IIa單克隆抗體的％單體的作用。圖13顯示正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20對(duì)維持水溶液中抗-⑶22單克隆抗體的％單體的作用。圖14顯示隨時(shí)間推移由溶液中的各種烷基糖苷或聚山梨酯20產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的量。圖15顯示各種烷基糖苷或聚山梨酯20對(duì)防止水溶液中抗-⑶IIa抗體氧化的作用。圖16顯示各種烷基糖苷或聚山梨酯20對(duì)防止水溶液中抗-⑶22抗體氧化的作用。優(yōu)選實(shí)施方案詳述通過(guò)參考以下具體實(shí)施方案詳述以及文中包括的實(shí)施例，可以更容易地理解本發(fā)明。除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管與本文描述的類(lèi)似或等價(jià)的任意方法和材料均可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但以下描述了優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物均在此全文引入本文作為參考。文中，以術(shù)語(yǔ)“大約”開(kāi)始的數(shù)值范圍或者量明確包括所述確切的范圍或者確切數(shù)
值的量?？贵w和其他蛋白質(zhì)的聚集主要由最終導(dǎo)致變性的疏水作用引起。當(dāng)部分或完全展開(kāi)的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)暴露于水中時(shí)，由于正常包埋的疏水內(nèi)部現(xiàn)在暴露于親水的水性環(huán)境中的事實(shí)，這造成熱力學(xué)不利的情形。因此，形成疏水區(qū)周?chē)乃肿拥撵亟档推仁棺冃缘牡鞍踪|(zhì)聚集，其主要通過(guò)暴露的疏水區(qū)進(jìn)行。因此，還可能損害蛋白質(zhì)的溶解性。在一些情況下，蛋白質(zhì)亞基的自聯(lián)(天然的或錯(cuò)誤折疊的)可于一些條件下發(fā)生，并且其可引起沉淀和活性喪失。影響溶液中蛋白質(zhì)聚集的因素通常包括蛋白質(zhì)濃度、pH、溫度、其他賦形劑和物理應(yīng)力。一些因素(例如溫度)在純化、混合、生產(chǎn)、貯存和使用期間比其他因素(例如物理應(yīng)力)可能更容易控制。制劑研究將指導(dǎo)適當(dāng)選擇不會(huì)誘導(dǎo)聚集和/或事實(shí)上將有助于防止聚集的PH和賦形劑。蛋白質(zhì)濃度由需要的治療劑量決定，并且取決于該濃度是什么，其將決定是否存在更高聯(lián)合狀態(tài)(二聚體、四聚體等)的可能性，這可隨后引起溶液中的聚集。制劑研發(fā)期間，必須進(jìn)行仔細(xì)研究，以確定什么因素影響蛋白質(zhì)的聚集，然后如何能夠消除或控制這些因素。對(duì)鑒定用于腸胃外給藥或其他給藥的抗體或其他蛋白質(zhì)的穩(wěn)定溶液制劑的需求能夠?qū)е掠糜谠u(píng)價(jià)各種添加劑對(duì)物理穩(wěn)定性的影響的檢驗(yàn)方法學(xué)的發(fā)展?；谟绊懙鞍踪|(zhì)聚集和所述施用需求的已知因素，可利用涉及攪動(dòng)或旋轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)溶液的機(jī)械操作來(lái)評(píng)價(jià)物理穩(wěn)定性。用于鑒定各種添加劑防止聚集的能力的物理性應(yīng)力測(cè)試方法學(xué)可能涉及暴露于在水平面的搖動(dòng)或攪拌或者在垂直面以n轉(zhuǎn)/min從旋轉(zhuǎn)的輪子的軸轉(zhuǎn)動(dòng)X cm。通常通過(guò)視力檢查或者光散射分析作為時(shí)間函數(shù)來(lái)測(cè)定聚集導(dǎo)致的濁度?；蛘?，可通過(guò)HPLC分析作為時(shí)間函數(shù)來(lái)定量測(cè)定由于沉淀引起的可溶蛋白含量的減少。本發(fā)明是基于下述新發(fā)現(xiàn)某些烷基糖苷組合物可用于穩(wěn)定和/或降低治療上有用的制劑中的抗體或其他蛋白質(zhì)的聚集和免疫原性。此外，本發(fā)明還基于下述新發(fā)現(xiàn)某些烷基糖苷組合物可用于防止或降低治療上有用的制劑中的抗體或其他蛋白質(zhì)的氧化?！氨砻婊钚詣笔且?yàn)槠浜杏H水和疏水基團(tuán)的化學(xué)組成而能在固體-固體、固體-液體、液體-液體和液體-空氣表面發(fā)揮其作用的表面活性物質(zhì)。這些物質(zhì)降低稀溶液中的蛋白質(zhì)在能吸附和潛在聚集蛋白質(zhì)的空氣-水和/或水-固體界面處的濃度。表面活性劑可結(jié)合至蛋白質(zhì)制劑的疏水界面。特別是當(dāng)攪動(dòng)時(shí)，由于解折疊和隨后的蛋白質(zhì)單層的聚集，水表面的蛋白質(zhì)將聚集?！氨砻婊钚詣笨墒沟鞍踪|(zhì)變性，但是也可穩(wěn)定蛋白質(zhì)，免于表面變性。一般來(lái)講，離子型表面活性劑可使蛋白質(zhì)變性。然而，即使在相對(duì)高的濃度(1%W/V)，非離子型表面活性劑通常不使蛋白質(zhì)變性。大多數(shù)雙親 (parentally)可接受的非離子型表面活性劑來(lái)自聚山梨酯或聚醚組。聚山梨酯20和80是市售蛋白制劑中的同代的表面活性劑穩(wěn)定劑。然而，蛋白制劑中所用的其他表面活性劑包括Pluronic F-68和“布里杰(Brij) ”類(lèi)的成員。這些無(wú)一個(gè)是本發(fā)明的烷基糖苷類(lèi)。物理事件可致使暴露于化學(xué)事件。蛋白質(zhì)的化學(xué)不穩(wěn)定性可能涉及蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵的裂解或形成。已報(bào)道蛋白質(zhì)中的數(shù)個(gè)氧化反應(yīng)。在堿性或中性媒介中，氨基酸殘基半胱氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸尤其易于氧化。然而，在酸性條件中，甲硫氨酸是敏感的。通常，氧化反應(yīng)引起生物活性的顯著喪失甚至免疫原性。暴露于光線(xiàn)可引起蛋白質(zhì)中氨基酸殘基尤其是色氨酸殘基的氧化是本領(lǐng)域眾所周知的。過(guò)氧化物是非離子型表面活性劑的已知污染物。聚山梨酯中的過(guò)氧化物可引起蛋白質(zhì)的氧化降解。制劑設(shè)計(jì)者(Formulators)往往就過(guò)氧化物污染篩選蛋白制劑中的聚山梨酯源和其他多聚體添加劑，并對(duì)于使用所述添建立過(guò)氧化物規(guī)范。或者，對(duì)于氧氣-敏感的蛋白質(zhì)，引入抗氧化劑用于幫助克服非離子型表面活性劑作為氧化催化劑的潛力?！氨砻婊钚詣笔蔷哂蟹浅Ｃ鞔_的極性和非極性區(qū)域的分子，所述極性和非極性區(qū)域使得它們?cè)谌芤褐芯奂?，形成膠束。根據(jù)極性區(qū)的性質(zhì)，表面活性劑可是非離子的、陰離子的、陽(yáng)離子的和兩性離子的。非離子型表面活性劑可以是基于糖的?；谔堑谋砻婊钚詣┛梢允峭榛擒疹?lèi)。如文中所用的，“烷基糖苷”指通過(guò)鏈接(linkage)連接至任何疏水烷基的任何糖，這是本領(lǐng)域所公知的。疏水烷基鏈和親水糖類(lèi)之間的鏈接可尤其包括糖苷、酯、硫苷、硫酯、醚、酰胺或酰脲鍵或者鏈接。文中描述了其示例。文中，術(shù)語(yǔ)烷基糖苷和烷基糖可互換使用。本發(fā)明的烷基糖苷的通用結(jié)構(gòu)是R1-O-(CH2)x-R,其中R可以是例如CH3、環(huán)己基(C6H11)或其它烷基鏈，包括其異構(gòu)體，并且R1是糖，典型地是葡萄糖或麥芽糖。示例性烷基糖苷包括下述那些，其中R1是葡萄糖，R是CH3,且X是5 (正己基-0 -D-吡喃葡萄糖苷)，X是6 (正庚基-P -D-吡喃葡萄糖苷)，X是7 (正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷)，X是8 (正壬基-0 -D-吡喃葡萄糖苷)，X是9 (正癸基-P -D-吡喃葡萄糖苷)，并且X是11 (正十二烷基-0 -D-吡喃葡萄糖苷)。有時(shí)，將吡喃葡萄糖苷稱(chēng)作葡萄糖苷。示例性烷基糖苷還包括下述那些，其中R1是麥芽糖，R是CH3,且X是5 (正己基-0 -D-卩比喃麥芽糖昔)，X是7 (正羊基_ P -D-卩比喃麥芽糖昔)，X是8 (正壬基_ P -D-批喃麥芽糖苷)，X是9 (正癸基-P -D-吡喃麥芽糖苷)，X是10 ( 烷基-P -D-吡喃麥芽糖苷)，X是11 (正十二烷基-P -D-吡喃麥芽糖苷)，X是12 (正十三烷基-P -D-吡喃麥芽糖苷)，X是13 (正十四烷基 -P -D-吡喃麥芽糖苷和X是15 (正十六烷基-P -D-吡喃麥芽糖苷)。有時(shí)，將吡喃麥芽糖苷稱(chēng)作麥芽糖苷。示例性烷基糖苷還包括下述那些，其中R1是葡萄糖，X是3，且R是環(huán)己基(3-環(huán)己基_1_丙基_D_匍萄糖苷)；和其中R1是麥芽糖，X是4,且R是環(huán)己基(4-環(huán)己基-1-丁基-P-D-麥芽糖苷)。在本發(fā)明的一特定方面，本發(fā)明中所用的烷基糖苷是在20-25 °C優(yōu)選25°C、在水中顯示大約1. OmM或更大的臨界膠束濃度(CMC)值的那些。下面表I中顯示具有所述CMC值的示例性烷基糖苷，其中其它的是本領(lǐng)域眾所周知的。轟I烷磨苷CMC 值(mM) CMC 值(w/v) 正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷250 mM6.6% w/v 正庚基-P-D-吡喃葡萄糖苷70 mM1.9% w/v
正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷18 inM0.53%、v/、
正壬基-P-D-吡喃葡萄糖苷6.5 mM0.2% w/v
正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷2.2 inM0.07% w/v
3-環(huán)己基-1-丙基-[5-D-葡萄糖苷28 mM0.86% w/v
3-環(huán)己基-1-丁基-[5-D-葡萄糖苷1.8 mM0.058% w/v
正己基-P-D-吡喃麥芽糖苷210 mM8.9% w/v正辛基-P-D-吡喃麥芽糖苷丨9.5mM0.89% w/v 正壬基-P-丨)-吡喃麥芽糖苷6 mM0.28% w/v 正癸基-P-D-吡喃麥芽糖苷丨.8 mM0.087% w/v 環(huán)己基-甲基-P-D-麥芽糖苷340 mM15% w/v
2-環(huán)己基-乙基-P-D-麥芽糖苷120 mM5.4% w/v
3-環(huán)己基-丙基-(3-D-麥芽糖苷34.5 mM1.6% w/v
4-環(huán)己基-丁基-P-D-麥芽糖苷7.6 mM0.37% w/v
5-環(huán)己基-戌基-(3-D-麥芽糖苷2.4 mM0.12% w/v正十二烷基-P-D-吡喃麥芽糖苷0.17 mM0.0087 w/v正十二燒基-P-D-吡喃葡萄糖苷0.19 mM0.0066 w/v
特定的烷基糖苷可單獨(dú)用作抗體或其它蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑(或降低聚集的物質(zhì)或降低氧化的物質(zhì))，或者可將其與其它烷基糖苷聯(lián)合使用。發(fā)現(xiàn)在水溶液的寬濃度范圍內(nèi)烷基糖苷作為抗體或其它蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑(或降低聚集的物質(zhì)或降低氧化的物質(zhì))的用途。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，烷基糖苷(如果作為單一物質(zhì)使用)或者烷基糖苷類(lèi)(如果聯(lián)合使用)可以以大約0. OOlmM至大約500mM、更優(yōu)選大約0. 005mM至大約400mM、更優(yōu)選大約0. OlmM至大約300mM、更優(yōu)選大約0. 02mM至大約250mM、更優(yōu)選大約0. 03mM至大約200mM、更優(yōu)選大約0. 05mM至大約100mM、更優(yōu)選大約0.1mM至大約100mM、更優(yōu)選大約0.1mM至大約50mM的濃度存在于含有抗體或其它蛋白質(zhì)的水性制劑中。在本發(fā)明的一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將特定的烷基糖苷以比其各自CMC值低的濃度用作抗體或其它蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑(或降低聚集的物質(zhì)或降低氧化的物質(zhì))。根據(jù)上述，在本領(lǐng)域可理解的是，文中描述的化合物例如烷基糖苷類(lèi)的化學(xué)合成產(chǎn)生有些非均一的化合物混合物而不是完全均質(zhì)的制備物。如此，當(dāng)文中描述使用一具體的烷基糖苷時(shí)，應(yīng)該理解所述定義指從其化學(xué)合成得到的非均一混合物的主要成分。
“多肽”或“蛋白質(zhì)”是指其鏈長(zhǎng)足以產(chǎn)生較高水平的三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。因此，蛋白質(zhì)區(qū)別于也是基于氨基酸的分子但沒(méi)有此類(lèi)結(jié)構(gòu)的“肽”。通常，本文所使用的蛋白質(zhì)具有至少約5-20kD、或者至少約15-20kD、優(yōu)選至少約20kD的分子量?！半摹笔侵竿ǔ２徽宫F(xiàn)出較高水平的三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。肽通常具有少于約5kD的分子量。包括在本文定義之內(nèi)的多肽的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，例如，腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a -1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；濾泡刺激激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、組織因子和血管性血友病因子(vonffiIlebrands factor);抗凝血因子如蛋白質(zhì)C ;心鈉素；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，如尿激酶或者人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-a和-P ;腦啡肽酶；RANTES(活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)因子(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted));人巨嗤細(xì)胞炎性蛋白(MIP-l-a);血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏(Muellerian)抑制物；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原(prorelaxin);鼠促性腺素關(guān)連肽；微生物蛋白，諸如P -內(nèi)酰胺酶；脫氧核糖核酸酶(DNase) ；IgE ;細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，如CTLA-4 ;抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白質(zhì)A或D ;類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如骨衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或_6(NT_3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGN-P ;血小板衍生生長(zhǎng)因子(I3DGF);成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子如aFGF和bFGF ;表皮生長(zhǎng)因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-a和TGF-3，包括 TGF-31、TGF-P 2、TGF-P 3、TGF-P 4 或 TGF-P 5 ;胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 和-1I (IGF-1和IGF-1I) ;des (1-3)-1GF-1 (腦IGF-1);胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs) ;CD蛋白，如 CD3、CD4、CD8、CD19 和 CD20 ;促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BM`P);干擾素，如干擾素-a、-P和-Y ;集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ;白細(xì)胞介素(IL)，如IL-1至IL-10 ;超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，例如AIDS外膜的部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4和VCAM ;腫瘤相關(guān)抗原，如CA125 (卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受體；免疫粘附素；以及上述任何蛋白的片段和/或變體，以及與上述任何蛋白結(jié)合的抗體包括抗體片段。被配制的蛋白質(zhì)優(yōu)選是基本上純的，以及最好基本上是同質(zhì)的(即沒(méi)有污染蛋白)。“基本上純的”蛋白質(zhì)意指以組合物的總重量計(jì)包含至少約90%(重量)蛋白質(zhì)、優(yōu)選至少約95%(重量)蛋白質(zhì)的組合物?！盎旧贤|(zhì)”的蛋白質(zhì)意指以組合物的總重量計(jì)，包含至少約99%(重量)的蛋白質(zhì)的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是抗體。本文的抗體針對(duì)所關(guān)注的“抗原”。優(yōu)選的，所述抗原是生物學(xué)上重要的蛋白質(zhì)，并且施用所述抗體至罹患疾病或病癥的哺乳動(dòng)物可在該哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生治療益處。然而，也還考慮針對(duì)非蛋白抗原(如腫瘤相關(guān)糖脂抗原，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，091，178)的抗體。當(dāng)抗原是蛋白質(zhì)時(shí)，其可以是跨膜分子(例如受體)，或配體，如生長(zhǎng)因子。示例性的抗原包括上文討論的那些蛋白質(zhì)。本發(fā)明包括的抗體的優(yōu)選分子靶標(biāo)包括⑶多肽，如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、⑶20和⑶34 ；HER受體家族的成員，如EGF受體(HERl)、HER2、HER3 或 HER4 受體；細(xì)胞粘附分子，如 LFA_l、Macl、pl50、95、VLA-4、ICAM-UVCAM和av/b3整聯(lián)蛋白，包括它的a或b亞基(如，抗-⑶11a、抗-⑶18或抗⑶Ilb抗體)；生長(zhǎng)因子如VEGF ；IgE ;血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA_4 ;多肽C等?？扇芸乖蚱淦?任選與其它分子綴合的)可用作免疫原用于產(chǎn)生抗體。對(duì)于跨膜分子，諸如受體，則它們的片段(例如，受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原。或者，表達(dá)所述跨膜分子的細(xì)胞可用作免疫原。此類(lèi)細(xì)胞可衍生自天然來(lái)源(例如，癌細(xì)胞系)或可以是通過(guò)重組技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化以表達(dá)所述跨膜分子的細(xì)胞。本文中 被純化的抗體的實(shí)例包括但不限于HER2抗體，包括曲妥珠單抗(HERCEPTIN : ) (Carter 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 89:4285-4289 (1992)，美
國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，725，856)以及培妥珠單抗(OMNITARG ) (W001/00245) ；CD20抗體(參見(jiàn)下面)；IL-8 抗體(St John 等，Chest, 103:932(1993)，以及國(guó)際公開(kāi)號(hào) TO95/23865)；VEGF或VEGF受體抗體，包括人源化和/或親和力成熟的VEGF抗體，如人源化VEGF抗體huA4. 6.1 貝伐珠單抗(AVASTIN :)和雷珠單抗(LUCENTIS ) (Kim 等，GrowthFactors, 7:53-64(1992)，國(guó)際公開(kāi)號(hào) W096/30046,以及 W098/45331,1998 年 10 月 15日公開(kāi))；PSCA抗體(W001/40309) ;CDlla抗體，包括依法珠單抗(:RAPTIVA )(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，037，454，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，622，700，W098/23761, Stoppa 等，TransplantIntl. 4:3-7 (1991)，以及 Hourmant 等,Transplantation58:377-380 (1994))；與 IgE 結(jié)合的抗體，包括奧馬佐單抗(XOLAIR ) (Presta 等，J.1mmunol. 151:2623-2632 (1993),以及國(guó)際公開(kāi)號(hào)W095/19181 ;1998年2月3日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，714，338，或1992年2月25日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，091，313，1993年3月4日公開(kāi)的TO93/04173，或1998年6月30日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枺?17^598/13410，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，714，338) ;CD18抗體(1997年4月22日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，622,700，或1997年7月31日公開(kāi)的W097/26912) ;Apo_2受體抗體抗體(1998年11月19日公開(kāi)的W098/51793);組織因子(TF)抗體(1994年11月9日授權(quán)的歐洲專(zhuān)利號(hào)0 420 937 BI) ;a4-a7整聯(lián)蛋白抗體(1998年2月19日公開(kāi)
的TO98/06248) ；EGFR抗體(例如，嵌合或人源化225抗體，西妥昔單抗，ERBUTIX ，在1996年12月19日公開(kāi)的W096/40210中);CD3抗體，諸如0KT3(1985年5月7日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，515，893) ;CD25或Tac抗體，諸如CH1-621 ( SIMLiLECT )和
ZENAPAX (參見(jiàn)1997年12月2日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，693，762) ;CD4抗體，諸如 cM-7412 抗體(Choy 等,Arthritis Rheum39(l) :52-56(1996)) ；CD52 抗體，諸如CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann 等,Nature332:323-337 (1988)) ；Fc 受體抗體，諸如 M22 抗體，其針對(duì) Fe YRI 如在 Graziano 等，J.1mmunol. 155(10) :4996-5002(1995)中)；癌胚抗原(CEA)抗體，諸如 hMN-14 (Sharkey 等,Cancer Res. 55 (23Suppl) : 5935s-5945s (1995));針對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的抗體，包括 huBrE_3、hu_Mc3 和 CHL6 (Ceriani等，Cancer Res. 55 (23) : 5852s-5856s (1995)；以及 Richman 等，Cancer Res. 55 (23Supp) :5916s-5920s (1995));與結(jié)腸癌細(xì)胞結(jié)合的抗體，諸如 C242 (Litton等，Eur J.1mmunol. 26(1) : 1-9(1996)) ；CD38 抗體，例如 AH3/5 (Ellis 等，J.1mmunol. 155(2) :925-937(1995)) ;CD33 抗體，諸如 Hu M195 (Jurcic 等，Cancer Res55(23Suppl):5908s-5910s (1995))以及 CMA-676 或 CDP771 ;EpCAM 抗體，諸如17-1A( PANOREX ) ；Gpiib/nia 抗體，諸如阿昔單抗或 C7E3Fab ( REOPRO )；RSV 抗體，諸如 MED1-493 ( SYNAGIS ；) ；CMV 抗體，諸如 PROTOVIR ；
HIV抗體，諸如PR0542 ;肝炎抗體，諸如H印B抗體OSTAVIR ;CA125抗體，包括抗-MUC16(W02007/001851;Yin,BffT 和 Lloyd, KO, J. Biol. Chem. 276:27371-27375(2001))以及OvaRex ;個(gè)體基因型⑶3表位抗體BEC2 ; a v 0 3抗體(例如，VITAXIN ;Medimmune);人腎細(xì)胞癌抗體，諸如 ch_G250 ;ING_1 ;抗-人 17-lAn 抗體(3622W94)；抗-人結(jié)腸直腸腫瘤抗體(A33);針對(duì)GD3神經(jīng)節(jié)苷脂的抗-人黑色素瘤抗體R24;抗-人鱗狀細(xì)胞癌(SF-25);人白細(xì)胞抗原(HLA)抗體，諸如Smart IDlO和抗-HLA DR抗體 Oncolym(Lym-1) ；CD37 抗體，諸如 TRU016 (Trubion) ;IL_21 抗體(Zymogenetics/Novo Nordisk);抗-B 細(xì)胞抗體(Impheron) ;B 細(xì)胞革巴向的 MAb (Immunogen/Aventis)；1D09C3(Morphosys/GPC) ；LymphoRadl31(HGS) ；Lym-1 抗體，諸如 Lym-1Y-90(USC)或抗-Lym-1OncoIym(USC/Peregrine) ；LIF226 (Enhanced Lifesc1.) ；BAFF 抗體(例如，W003/33658) ；BAFF受體抗體(例如參見(jiàn)，W002/24909) ；BR3抗體；Blys 抗體，諸如貝利木單抗(belimumab) ；LYMPHOSTAT-B ；ISF154 (UCSD/Roche/Tragen);戈利昔單抗(gomilixima) (Idecl52;Biogen Idee) ;IL_6 受體抗體，諸如atlizumab (ACTEMRA ; Ch ugai/Roche) ;IL_15 抗體，諸如 HuMax-1l-15 (Genmab/Amgen)；趨化因子受體抗體，諸如CCR2抗體(例如，MLN1202; Mi I Iieneum);抗-補(bǔ)體抗體，諸如C5抗體(例如，依庫(kù)珠單抗(eculizumab)，5G1.1; Alexion);人免疫球蛋白的口服制劑(例如，IgPO;Protein Therapeutics) ;IL_12 抗體，諸如 ABT-874(CAT/Abbott)；替萘昔單抗(Teneliximab) (BMS-224818;BMS) ;CD40抗體，包括S2C6及其人源化變體(W000/75348)和 TNXlOO (Chiron/Tanox) ；TNF- a 抗體，包括 cA2 或英夫利昔單抗(REM1CADE )、CDP571、MAK-195、阿達(dá)木單抗(HUMIRA )，PEG 化 TNF- a 抗體片段，諸如0^-870(0611七6吐)，02￡7(1(11011)，抗-1,-0 多克隆抗體(例如，PassTNF; Verigen)；CD22抗體，諸如LL2或依帕珠單抗(LYMPHOC丨DE ; Immunomedics),包括依帕珠單抗Y-90和依帕珠單抗1-131, Abiogen，s CD22抗體(Abiogen, Italy)，CMC544(ffyeth/Celltech), combotox(UT Soutwestern), BL22(NIH),以及 LympoScanTc99(Immunomedics)。⑶20抗體的實(shí)例包括“C2B8”，其現(xiàn)在稱(chēng)為“利妥昔單抗”(“RITUXAN ，，)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，736，137);釔-[90]-標(biāo)記的2B8鼠抗體，稱(chēng)為“Y2B8”或“替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan) ”( ZEVALIN )，可從 IDEC Pharmaceuticals, Inc.商業(yè)獲得(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，736，137 ;1993年6月22日在A(yíng)TCC以登錄號(hào)HB11388保藏的2B8)；鼠IgG2a “BI”，也稱(chēng)為“托西莫單抗”，任選地用131I標(biāo)記，以產(chǎn)生“1311-B1”或“碘1131托西莫單抗”抗體(BEXXAR )，其可從Corixa商業(yè)獲得(也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，595，721)；鼠單克隆抗體“1F5” (Press等，Blood69(2) :584-591(1987))及其變體，包括“框架修補(bǔ)(framework patched)，，或人源化 1F5 (W02003/002607, Leung, S. ; ATCC 保藏 HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，677，180);人源化2H7 (W02004/056312, Lowman等)；2F2 (HuMax-⑶20)，其為完全的人高親和抗體，靶向B細(xì)胞細(xì)胞膜中的⑶20分子(Genmab, Denmark;例如 參見(jiàn)，Glennie and van de ffinkel, Drug DiscoveryToday8:503-510 (2003)以及 Cragg 等，BloodlOl:1045-1052 (2003) ；W02004/035607 ；US2004/0167319) ;W02004/035607 和 US2004/0167319 中所示的人單克隆抗體(Teeling等)；US2004/0093621中描述的具有與Fe區(qū)域結(jié)合的復(fù)雜N-糖苷連接的糖鏈的抗體(Shitara等)；與CD20結(jié)合的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段(W02005/000901，Tedder等)，諸如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11 ；CD20結(jié)合分子，諸如AME系列抗體，例如 W02004/103404 和 US2005/0025764 中所示的 AME33 抗體(Watkins 等，Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME) ;CD20 結(jié)合分子,諸如 US2005/0025764 (Watkins 等)中描述的那些；A20抗體或其變體，諸如嵌合或人源化A20抗體(分別為cA20、hA20)或IMMU-106 (US2003/0219433, Immunomedics) ;CD20-結(jié)合抗體，包括去除表位的 Leu_16、lH4或 2B8,任選地與 IL-2 綴合，如在 US2005/0069545A1 和 W02005/16969 (Carr 等)中的那樣；與CD22和CD20結(jié)合的雙特異性抗體，例如hLL2xhA20(W02005/14618，Chang等);可從 International Leukocyte Typing Workshop 獲得的單克隆抗體 L27、G28_2、93_1B3、B-Cl 或 NU-B2 (Valentine 等，In:Leukocyte Typing III (McMichael,編輯，p. 440，OxfordUniversity Press(1987)) ; 1H4(Haisma 等，Blood92:184(1998));抗 _CD20auristatin E綴合物(Seattle Genetics);抗-CD20-1L2 (EMD/Biovation/City of Hope);抗-CD2OMAb治療(EpiCyte);抗-CD20 抗體 TRUO15 (Trubion)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括單克隆抗體(包括具有免疫球蛋白Fe區(qū)的全長(zhǎng)抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、雙抗體(diabodies)和單鏈分子，以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab，)jFv)。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可與“抗體”互換地使用。基本的4鏈抗體單位是由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重⑶鏈組成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個(gè)基本的異四聚體單位與另外的稱(chēng)為J鏈的多肽組成，并且包含10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而IgA抗體包含2-5個(gè)基本的4鏈單位，其中所述的基本的4鏈單位能與J鏈一起聚合形成多價(jià)的集聚物(assemblages)。對(duì)于IgG來(lái)說(shuō),4鏈單位一般約為150，000道爾頓。每條L鏈通過(guò)`一個(gè)共價(jià)二硫鍵與H鏈相連，而兩條H鏈取決于H鏈同種型通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵相互連接。每條H和L鏈也具有有規(guī)則地間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條H鏈在N-末端具有可變域(Vh)，對(duì)于a和Y鏈各自繼之以三個(gè)恒定域(Ch)、對(duì)于ii和e同種型繼之以四個(gè)Ch域。每條L鏈在N-末端具有可變域(')，在另一個(gè)末端繼之以恒定域。Vl與Vh相對(duì)應(yīng)(align)，而Q與重鏈的第一個(gè)恒定域(ChI)相對(duì)應(yīng)。認(rèn)為特殊的氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變域之間的界面。Vh和\的配對(duì)一同形成了單一抗原結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于不同類(lèi)型的抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見(jiàn)例如，Basic and Clinical Immunology, 8thEdition, Daniel P. Sties, Abba1.Terr and Tristram G. Parsolw(eds), Appleton &Lange, Norwalk, Conn. , 1994,第 71 頁(yè)和第 6 章。來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的L鏈可以根據(jù)它們恒定域的氨基酸序列被分為兩種明顯不同類(lèi)型中的一種，稱(chēng)為K和X。取決于它們的重鏈恒定域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分為不同的類(lèi)型或同種型。有五類(lèi)免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,分別具有被命名為a、S、e、Y和ii的重鏈。根據(jù)CH的序列和功能方面的相對(duì)小的差異，Y和a類(lèi)被進(jìn)一步分成亞類(lèi)，例如，人類(lèi)表達(dá)以下的亞類(lèi)IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。術(shù)語(yǔ)“可變”是指在抗體之間可變域的某些片段在序列上有很大差異的事實(shí)。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合并決定特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，可變性在整個(gè)可變域中不是均勻分布的。而是，V區(qū)由被極度可變的稱(chēng)為“高變區(qū)”或有時(shí)稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)的較短區(qū)域(每個(gè)長(zhǎng)度約9-12個(gè)氨基酸殘基)分隔的相對(duì)不變的區(qū)域組成，該相對(duì)不變的區(qū)域被稱(chēng)為框架區(qū)(FR)，具有約15-30個(gè)氨基酸殘基。天然重鏈和輕鏈的可變域各自都包含四個(gè)FR，大多采取3 -折疊構(gòu)型，通過(guò)三個(gè)高變區(qū)連接，高變區(qū)形成環(huán)形連接，有些情況下形成￠-折疊結(jié)構(gòu)的部分。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR緊密鄰近地保持在一起，并且與來(lái)自另一鏈的高變區(qū)一同，促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(見(jiàn)Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。恒定域沒(méi)有直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是顯示出各種效應(yīng)子作用，諸如參與抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”(也稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)”或⑶R)是指位于免疫球蛋白V區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的抗體氨基酸殘基(通常為三個(gè)或四個(gè)極度序列可變性的短區(qū)域)，其形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且是抗原特異性主要決定因素。有至少兩種方法來(lái)鑒定⑶R殘基(I)基于跨物種(cross-species)序列可變性的方法(即，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute ofHealth, Bethesda, MS1991);和(2)基于抗原抗體復(fù)合物的結(jié)晶學(xué)研究的方法(Chothia, C.等，J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。然而，就兩種殘基鑒定技術(shù)確定重疊的區(qū)域而不是相同的區(qū)域而言，可以組合它們來(lái)確定雜混(hybrid)CDR。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指的是從一群基本上均一的抗體中獲得的抗體，SP除了可能少量存在的可能發(fā)生的天然突變和/或翻譯后修飾(例如，異構(gòu)化、酰胺化)夕卜，群體中包含的個(gè)體抗體是相同的。單克隆抗體對(duì)單一的抗原位點(diǎn)有高度的特異性。而且，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)是它們是用雜交瘤培養(yǎng)來(lái)合成的，不被其它免疫球蛋白污染。修飾詞“單克隆”指明從基本上均一的抗體種群中獲得的抗體的特征，不應(yīng)被理解為需要任何特定的方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可用首先在Kohler等，Nature, 256:495 (1975)中描述的雜交瘤方法來(lái)制備,或可用重組DNA方法來(lái)制備(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567)?！皢慰寺】贵w”也可用例如Clackson等，Nature, 352:624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.，222:581-597(1991)描述的技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)中分離獲得。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，該“嵌合”抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的其余部分與來(lái)源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，還包括該抗體的片段，只要它們顯示出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，816，567 ；Mor rison 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 81:6851-6855 (1984))。本文感興趣的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類(lèi)化(primitized)”的抗體，其包含來(lái)源于非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，舊大陸猴(Old World Monkey)、猿(Ape)等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
“完整”抗體是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)以及CL和至少重鏈結(jié)構(gòu)域C0U Ch2和CH3的抗體。恒定域可以是天然序列的恒定域(例如，人類(lèi)天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整抗體具有一種或多種效應(yīng)子作用。“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)和/或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體；線(xiàn)性抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，641，870，實(shí)施例 2 ;Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 [1995]);單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱(chēng)為“Fab”片段，以及殘余的“Fe”片段，該命名反映易于結(jié)晶的能力。Fab片段由完整的L鏈以及H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(Vh)和一條重鏈的第一個(gè)恒定域(ChI)組成。每個(gè)Fab片段對(duì)于抗原結(jié)合是單價(jià)的，SP它具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。抗體的胃蛋白酶處理產(chǎn)生單個(gè)大的F(ab’)2片段，其大略地相應(yīng)于具有不同抗原結(jié)合活性的兩個(gè)二硫化物連接的Fab片段，并仍能夠交聯(lián)抗原。Fab’片段與Fab片段的不同在于其在ChI結(jié)構(gòu)域的羧基末端具有幾個(gè)額外的殘基，包括一個(gè)或多個(gè)來(lái)自抗體絞鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指其中恒定域的半胱氨酸殘基攜帶有游離硫醇基的Fab’。F(ab’)2抗體片段最初作為Fab’片段的成對(duì)物而產(chǎn)生,其在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。Fe片段包含由二硫 鍵連接的兩個(gè)H鏈的羧基末端部分?？贵w的效應(yīng)子作用由Fe區(qū)的序列決定，該區(qū)也是在某些類(lèi)型的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的被Fe受體(FcR)識(shí)別的區(qū)域?！癋v”是含有完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此片段由緊密地非共價(jià)連接的一個(gè)重鏈可變域與一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。這些兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊產(chǎn)生6個(gè)高變環(huán)(H和L鏈各3個(gè)環(huán))，其提供用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基，并且對(duì)抗體賦予抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或僅含有3個(gè)抗原特異性CDR的Fv的一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管與完整的結(jié)合位點(diǎn)相比其親和力較低。“單鏈Fv”也可簡(jiǎn)寫(xiě)成“sFv”或“scFv”，其為包括連接進(jìn)單個(gè)多肽鏈的VH和VL抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sFv多肽在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽連接體,其能使sFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述見(jiàn)Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學(xué)(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》，第 Il3 卷，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁(yè)(1994)。術(shù)語(yǔ)“雙抗體”是指如下制備的小的抗體片段，用短連接體(約5-10)殘基)在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間構(gòu)建sFv片段(參見(jiàn)前段)，因而獲得鏈間而不是鏈內(nèi)的V結(jié)構(gòu)域?qū)Χ频?，從而得到二價(jià)的片段，即，具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性雙抗體是兩個(gè)“交叉(crossover) ” sFv片段的異二聚體，其中所述兩個(gè)抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。雙抗體在例如 EP404, 097 ；W093/11161 ;Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sc1.USA90:6444-6448 (1993)中有更詳細(xì)的描述?！疤禺愋越Y(jié)合”特定多肽或特定多肽上的表位的抗體或者對(duì)特定多肽或特定多肽上的表位“是特異性”的抗體是與該特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合而基本上不與任何其它多肽或多肽表位結(jié)合的抗體。術(shù)語(yǔ)“固相”描述了本發(fā)明的抗體可以附著在上面的非水的基質(zhì)。本文包括的固相的實(shí)例包括部分地或全部由玻璃(例如，可控孔度玻璃)、多糖(例如，瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮(silicones)形成的那些固相。在某些實(shí)施方案中，取決于具體情況，固相可以包括分析板的孔；在其它實(shí)施方案中，其是純化柱(例如，親和色譜柱)。這個(gè)術(shù)語(yǔ)還包括離散微粒的不連續(xù)固相，例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，275，149中描述的那些。非-人(例如，鼠)抗體的“人源化”形式是主要人序列的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’ )2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列(subsequences)),它們包含最小的來(lái)源于非人免疫球蛋白的序列。對(duì)于大部分，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者高變區(qū)(也稱(chēng)CDR)的殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠或兔等非人物種(供體抗體)的高變區(qū)殘基所替代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類(lèi)殘基所替代。此外，文中所用的“人源化抗體”也可包含受者抗體或供者抗體中均不存在的殘基。為了進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化抗體表觀(guān)，進(jìn)行了所述修飾。人源化抗體最理想地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，典型地包含人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。對(duì)于進(jìn)一步的報(bào)道，參見(jiàn)Jones等，Nature, 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature, 332:323-329 (1988);和 Presta, Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596 (1992)?！拔锓N依賴(lài)性抗體(species-dependent antibody) ”,例如哺乳動(dòng)物抗人IgE抗體，是與對(duì)來(lái)自第二哺乳動(dòng)物物種的該抗原的同系物相比，對(duì)來(lái)自第一哺乳動(dòng)物物種的抗原具有更強(qiáng)的結(jié)合親和性的抗體。通常，物種依賴(lài)性抗體“特異性地結(jié)合”人抗原(即，具有不超過(guò)約I X 10_7M、或者不超過(guò)約I X 10_8M、或者不超過(guò)約I X 10_9M的結(jié)合親和性(Kd)值)，但對(duì)來(lái)自第二非人哺乳動(dòng)物物種的該抗原的同系物的結(jié)合親和性比其對(duì)所述非人抗原的結(jié)合親和性弱至少約50倍、至少約500倍、或至少約1000倍。物種依賴(lài)性抗體可以是如上述定義的各種類(lèi)型的抗體中的任何一種，但優(yōu)選是人源化或人抗體?？贵w“效應(yīng)子作用”是指歸因于抗體的Fe區(qū)(天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))并隨抗體同種型變化的那些生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)子作用的實(shí)例包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性；Fc受體`結(jié)合；抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如，B細(xì)胞受體)的下調(diào)；和B細(xì)胞活化。“抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或ADCC是指細(xì)胞毒性的形式，其中與某些細(xì)胞毒細(xì)胞(例如自然殺傷(NK)細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fe受體(FcR)結(jié)合的分泌的Ig使得這些細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞與擁有抗原的靶細(xì)胞特異性結(jié)合，并隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞。該抗體“武裝”細(xì)胞毒細(xì)胞，并且是通過(guò)這一機(jī)制殺死靶細(xì)胞所需要的。介導(dǎo)ADCC作用的主要細(xì)胞NK細(xì)胞僅表達(dá)Fe y RIII，而單核細(xì)胞則表達(dá)Fe y R1、Fe Y RII和Fe Y RIII。關(guān)于造血細(xì)胞上Fe表達(dá)的總結(jié)見(jiàn)Ravetch和Kinet, Annu. Rev.1mmunol. 9:457-92 (1991)的464頁(yè)上的表3。為了評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外A⑶D測(cè)試法，諸如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，500, 362或5，821，337中所述的。對(duì)于這類(lèi)測(cè)試法的有用效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地或另外地，可在體內(nèi)，例如在Clynes等，PNASUSA95:652-656 (1998)所述的動(dòng)物模型中，評(píng)估目的分子的ADCC活性。“Fe受體”或“FcR”描述與抗體的Fe區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcRU受體)，包括Fe Y R1、Fe Y RII和Fe Y RIII亞類(lèi)的受體(包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接型)，F(xiàn)e y RII受體包括Fe y RIIA(“活化受體”)和Fe Y RIIB ( “抑制受體”)，其具有主要區(qū)別在于其細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)域的相似的氨基酸序列?；罨荏wFe y RIIA在其細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fe y RIIB在其細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(參見(jiàn) M. Daeron, Annu. Rev. Tmmuno1. 15:203-234 (1997)。FcR 的綜述見(jiàn) Ravetch和 Kinet, Annu. Rev. Tmmuno1. 9:457-92(1991) ；CapeI 等,Immunomethods4:25-34 (1994);以及 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)。本文中術(shù)語(yǔ)“FcR” 函蓋其它 FcR，包括那些在將來(lái)將被鑒定的FcR。該術(shù)語(yǔ)還包括負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移到胎兒的新生兒受體FcRn0 Guyer 等,J. Tmmuno1. 117:587 (1976)和 Kim 等,J. Tmmuno1. 24:249 (1994)。“人類(lèi)效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子作用的白細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞表達(dá)至少Fe y RIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子作用。介導(dǎo)ADCC的人類(lèi)白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和MNK細(xì)胞。所述效應(yīng)細(xì)胞可從其天然來(lái)源中分離，例如從血液中分離?！癈DC”的“補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性”是指在補(bǔ)體的存在下靶細(xì)胞的溶胞。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化是由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一個(gè)組分(Clq)與結(jié)合它們的相應(yīng)(cognate)抗原的(適當(dāng)亞型)抗體的結(jié)合而起始的。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化作用，可進(jìn)行cdC測(cè)試,如Gazzano-Santoro等,J. Tmmun01. Methods202:163 (1996)所述的。術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”是指以允許活性成分的生物活性有效的形式存在的制劑，并且其不含對(duì)待施用該制劑的受試者具有不能接受的毒性的其它成分。如果抗體的生物活性在給定時(shí)間內(nèi)為制備藥物制劑時(shí)具有的生物活性的約10%以?xún)?nèi)(在測(cè)試法誤差之內(nèi))，則抗體在藥物制劑中擁有“生物活性”，如通過(guò)抗體在體外或體內(nèi)與抗原結(jié)合并導(dǎo)致可測(cè)量的生物學(xué)反應(yīng)的能力所確定的那樣?！胺€(wěn)定的”制劑是這樣的制劑，在貯存期間其中的蛋白質(zhì)基本上保持它的物理和/或化學(xué)穩(wěn)定性?？梢栽谶x定的溫度測(cè)量選定時(shí)段的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，制劑在室溫( 300C )或40°C穩(wěn)定至少1個(gè)月和/或在約2-8°C穩(wěn)定至少1年，并且優(yōu)選穩(wěn)定至少2年。例如，在貯存期間的聚集度可以被用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的指標(biāo)。因而，“穩(wěn)定的”制劑可以是這樣的制劑，其中少于約10%并優(yōu)選少于約5%的蛋白在該制劑中以聚集物存在。本領(lǐng)域現(xiàn)有各種測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分析技術(shù)，并且例如在Peptide and Protein DrugDelivery, 247-301, Vincent Lee編輯，Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y. , Pubs. (1991)和 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993)中有綜述。提高含有蛋白質(zhì)制劑的“穩(wěn)定性”指降低(與未處理的含有蛋白的制劑相比)或防止所述制劑中形成蛋白聚集物。術(shù)語(yǔ)“水性溶液”是指其中水是溶解介質(zhì)或溶劑的溶液。當(dāng)物質(zhì)溶解于液體中時(shí)，該混合物稱(chēng)為溶液。被溶解的物質(zhì)是溶質(zhì)，而進(jìn)行溶解的液體(該情況中為水)為溶劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”是這樣的化學(xué)物質(zhì)或化合物，即將其添加至溶液或混合物或混懸液或組合物或治療組合物中，以使其保持處于穩(wěn)定狀態(tài)或不改變的狀態(tài)；或之所以使用其是因?yàn)槠洚a(chǎn)生導(dǎo)致更穩(wěn)定或不改變的狀態(tài)的涉及原子或分子的變化的反應(yīng)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚集”是指大量或完全匯聚或集中在一起，例如肽、多肽、抗體或其變體的聚集。聚集可以是自行聚集或者可以是由于其它因素例如導(dǎo)致聚集的物質(zhì)、導(dǎo)致沉淀的物質(zhì)、攪動(dòng)或者其它致使肽、多肽、抗體或其變體匯聚的手段和方法誘導(dǎo)的聚集。攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集形成攪動(dòng)誘導(dǎo)的含有蛋白質(zhì)的溶液中的聚集物，其中攪動(dòng)是通過(guò)搖動(dòng)或攪拌而使運(yùn)動(dòng)?！耙子诰奂钡目贵w是尤其當(dāng)攪動(dòng)時(shí)，已觀(guān)察到與其它抗體分子聚集的抗體?！耙种啤睌噭?dòng)誘導(dǎo)的聚集意指防止、減輕或降低攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的量，其通過(guò)將包含至少一種攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的抑制劑的含有蛋白質(zhì)的溶液中存在的聚集物的量與不含至少一種攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的抑制劑的含有蛋白質(zhì)的溶液中存在的聚集物的量進(jìn)行比較而測(cè)量。烷基糖苷的“抑制攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集”的量是與不含烷基糖苷的相同處理的蛋白質(zhì)相比，可檢測(cè)地抑制攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的烷基糖苷的量。本文“氧化的”蛋白質(zhì)是其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被氧化的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，氧化的氨基酸是色氨酸。蛋白質(zhì)中氨基酸的氧化可由暴露于光線(xiàn)中引起，因此，本文將其稱(chēng)為“光誘導(dǎo)的氧化”?！耙子谘趸摹钡鞍踪|(zhì)是含有一個(gè)或多個(gè)已發(fā)現(xiàn)易于氧化的殘基的蛋白質(zhì)?！耙种啤被颉胺乐埂毖趸庵笢p少或降低氧化的量，其通過(guò)將包含至少一種氧化抑制劑的含有蛋白質(zhì)的溶液中存在的氧化的量與不含至少一種氧化抑制劑的含有蛋白質(zhì)的溶液中存在的氧化的量進(jìn)行比較而測(cè)量。烷基糖苷的“防止氧化”的量是與不含烷基糖苷而進(jìn)行相同處理的蛋白質(zhì)相比，可檢測(cè)地抑制或減少蛋白質(zhì)氧化的 該烷基糖苷的量?？烧业降挠糜诒景l(fā)明測(cè)量攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集和/或蛋白質(zhì)氧化的方法包括凝膠電泳、等電聚焦、毛細(xì)管電泳、色譜法(如分子排阻色譜、離子交換色譜和反相高效液相色譜)、肽譜、寡糖譜(oligosaccharide mapping)、質(zhì)譜、紫外吸收光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法、等溫滴定量熱法、示差掃描量熱法、分析型超速離心、動(dòng)態(tài)光散射、蛋白酶解和交聯(lián)、池度測(cè)量、濾器阻滯(filter retardation)分析、免疫學(xué)分析、突光染料結(jié)合分析(fluorescent dye binding assays)、蛋白染色分析(protein-staining assays)、顯微鏡檢查法和通過(guò)ELISA或其它結(jié)合測(cè)試檢測(cè)聚集物?！芭R界膠束濃度”(CMC)是表面活性劑在溶液中聚集而形成稱(chēng)作膠束的簇的閾值濃度。如文中所用的，任何特定表面活性劑的CMC值在20-25 °C、在水中測(cè)量，優(yōu)選在25°C、在水中測(cè)量，并可將其以mM或w/v單位進(jìn)行表述。因?yàn)橛山M分單體形成膠束涉及平衡，已確定對(duì)于膠束存在狹窄的濃度范圍，低于該濃度范圍，溶液含有可以忽略的量的膠束，并且高于該濃度范圍，發(fā)現(xiàn)所有另外的(additional)表面活性劑實(shí)際上為另外的膠束形式。Mukerjee，P.和MySelS，K.J. (1971)水性表面活性劑體系的臨界膠束濃度(Critical Micelle Concentrations of Aqueous Surfactant Systems), NSRDS-NBS36.Superintendent of Documents, U. S. Government Printing Office,Washington, DC 已完成了數(shù)百種化合物在水溶液中的CMCs的編輯物。還參見(jiàn)，http: //www. anatrace. com/does/detergentdata. pdf。用于測(cè)定CMC的一項(xiàng)普通技術(shù)是利用表面張力計(jì)直接測(cè)量作為表面活性劑濃度函數(shù)的平衡表面張力。其它方法包括測(cè)量作為表面活性劑濃度函數(shù)的散射光強(qiáng)度、熒光染料的增溶等。上述的和其它此類(lèi)技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且是常規(guī)使用的。
當(dāng)用于描述本文公開(kāi)的各種多肽和抗體時(shí)，“分離的”是指已從其產(chǎn)生環(huán)境的組分中鑒定、分離和/或收回的多肽或抗體。優(yōu)選地，分離的多肽沒(méi)有與來(lái)自其產(chǎn)生環(huán)境的所有其它組分相締合(association)。其產(chǎn)生環(huán)境中的污染成分(諸如從重組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生的那些)是通常將干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，并可包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)或非-蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽被純化至(I)用轉(zhuǎn)杯式序列分析儀，足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度，或者(2)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色，達(dá)到在非-還原或還原條件下SDS-PAGE同質(zhì)性的程度。然而，通常用至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備分離的多肽或抗體。編碼本文的多肽和抗體的“分離的”核酸分子是鑒定的并從至少一種污染物核酸分子分離的核酸分子，所述核酸分子通常在其產(chǎn)生的環(huán)境中與污染物核酸分子締合。優(yōu)選的，所述分離的核酸不與其產(chǎn)生環(huán)境相關(guān)的所有組分締合。編碼本文多肽和抗體的分離的核酸分子處于與其在自然狀態(tài)中被發(fā)現(xiàn)的形式或環(huán)境不同的形式。因此分離的核酸分子不同于天然存在于細(xì)胞中的編碼本文多肽和抗體的核酸。術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指在特定的宿主生物中表達(dá)可操作(operably)連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。

當(dāng)一種核酸與另一種核酸序列處于功能相關(guān)的位置時(shí)，該核酸與該另一種核酸是“可操作相連的”。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列(secretory leader)的DNA與多肽的DNA是可操作相連的，如果其表達(dá)為參與該多肽的分泌的前蛋白的話(huà)；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作相連，如果其影響該序列的轉(zhuǎn)錄的話(huà)；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操作相連，如果其位置能促進(jìn)翻譯的話(huà)。通?！翱刹僮飨噙B”指被連接的DNA序列是相鄰的，而且，在分泌前導(dǎo)序列的情況下，則是相鄰的且處于閱讀相。然而，增強(qiáng)子不必是相鄰的。連接可通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)處聯(lián)接(ligation)而實(shí)現(xiàn)。如果不存在這樣的位點(diǎn)，可根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或連接體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“附加表位(epitope tagged) ”是指包含與“標(biāo)記(tag)多肽”融合的本文描述的多肽或抗體的嵌合多肽。標(biāo)記多肽具有足夠的殘基以提供針對(duì)其可以產(chǎn)生抗體的表位，而該標(biāo)記多肽又足夠短從而不干擾與其融合的多肽的活性。標(biāo)記多肽優(yōu)選還是十分獨(dú)特的，以致所述抗體基本上不與其它表位交叉反應(yīng)。適合的標(biāo)記多肽一般具有至少六個(gè)氨基酸殘基，且通常約8至50個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選的，約10至20個(gè)氨基酸殘基)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”是指抗體樣分子，其組合了異源蛋白(“粘附素”)的結(jié)合特異性和免疫球蛋白恒定域的效應(yīng)子作用。結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包含具有所需結(jié)合特異性的氨基酸序列與免疫球蛋白恒定域序列的融合物，所述具有所需結(jié)合特異性的氨基酸序列不同于抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(即為“異源的(heterologous)”)。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以得自任何免疫球蛋白，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合物優(yōu)選包括在Ig分子內(nèi)的至少一個(gè)可變區(qū)的位置處用本文描述的多肽或抗體的結(jié)構(gòu)域替代。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白融合物包括IgGl分子的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)域；或鉸鏈、CHl、CH2和CH3區(qū)域。關(guān)于免疫球蛋白融合物的生產(chǎn)還參見(jiàn)1995年6月27日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，428，130。
“等滲的”制劑是基本上具有與人類(lèi)血液相同的滲透壓的制劑。等滲的制劑一般具有約250至350m0sm的滲透壓。術(shù)語(yǔ)“低滲的”描述滲透壓低于人類(lèi)血液滲透壓的制劑。相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)“高滲的”用于描述滲透壓高于人類(lèi)血液滲透壓的制劑。例如，可以利用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計(jì)來(lái)測(cè)量等滲性。由于鹽和/或緩沖劑的加入，本發(fā)明的制劑是高滲的?！爸貥?gòu)的(reconstituted) ”制劑是已經(jīng)通過(guò)將凍干的蛋白或抗體制劑溶解在稀釋劑中以使蛋白分散在該重構(gòu)制劑中而制備的制劑。重構(gòu)的制劑適合于向需要用目的蛋白治療的患者施用(例如，腸胃外施用)，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以是適合于皮下施用的制劑。“可藥用酸”包括無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸，在它們被配制的濃度和方式下是無(wú)毒的。例如，適合的無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、高氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亞磺酸、磺胺酸、磷酸、碳酸等等。適合的有機(jī)酸包括直鏈和支鏈的烷基、芳族的、環(huán)狀的、環(huán)脂肪族的、芳基脂肪族的、雜環(huán)的、飽和的、不飽和的、單羧酸、二羧酸和三羧酸，包括例如甲酸、乙酸、2-羥基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、鄰氨基苯甲酸、丙酸、2-羥基丙酸、2-氧代丙酸、丙二酸、環(huán)戊烷丙酸、環(huán)戊烷丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、抗壞血酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、硬脂酸、粘康酸、扁桃酸、琥拍酸、撲酸(embonic acid)、富馬酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、輕基馬來(lái)酸、丙二酸、乳酸、朽1檬酸、酒石酸、乙醇酸、葡萄糖酸(glyconic acid)、葡糖酸(gluconic acid)、丙酮酸、乙醒酸、草酸、甲磺酸、琥拍酸、水楊酸、鄰苯二甲酸、palmoic acid> palmeic acid、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、對(duì)甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基二環(huán)[2. 2. 2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4，4’-亞甲基雙-3-(羥基-2-烯-1-甲酸)、羥基萘甲酸?！翱伤幱脡A”包括無(wú)機(jī)堿和有機(jī)堿，在它們被配制的濃度和方式下是無(wú)毒的。例如，適合的堿包括由形成無(wú)機(jī)堿的金屬例如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅、錳、鋁形成的那些堿，N-甲基葡糖胺，嗎啉， 哌啶，和有機(jī)無(wú)毒堿，包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、環(huán)胺和堿離子交換樹(shù)脂[例如，N(R’)4+(其中R’獨(dú)立地是H或Cy烷基，例如，銨、Tris)]，例如，異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、氨基丁三醇(trimethamine)、二環(huán)己基胺、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明(hydrabamine)、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹(shù)脂等。特別優(yōu)選的有機(jī)無(wú)毒堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、氨基丁三醇、二環(huán)己基胺、膽堿和咖啡因。本發(fā)明可用的其它的可藥用酸和堿包括那些來(lái)源于氨基酸的酸和堿，所述氨基酸例如組氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸和天冬酰胺?！翱伤幱玫摹本彌_劑和鹽包括來(lái)源于上述指明的酸和堿加成鹽的那些緩沖劑和鹽。具體的緩沖劑和/或鹽包括組氨酸、琥珀酸鹽和乙酸鹽?！皟龈杀Ｗo(hù)劑(Iyoprotectant) ”是這樣的分子，當(dāng)其與目的蛋白質(zhì)組合時(shí),其在凍干和隨后的貯存中顯著地防止或減少蛋白質(zhì)的物理化學(xué)不穩(wěn)定性。示例性的凍干保護(hù)劑包括糖和它們相應(yīng)的糖醇；氨基酸，諸如谷氨酸單鈉或組氨酸；甲胺，諸如甜菜堿；易溶鹽,諸如硫酸鎂；多元醇，諸如三元的或較高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖、赤蘚醇、丙三醇(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics ;及其組合。其它的示例性?xún)龈杀Ｗo(hù)劑包括甘油和明膠，以及糖類(lèi)蜜二糖(mellibiose)、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇糖。還原糖的實(shí)例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原糖的實(shí)例包括非還原的多羥基化合物的糖苷，所述多羥基化合物選自糖醇及其它直鏈多元醇。優(yōu)選的糖醇是單糖苷，特別是通過(guò)將二糖諸如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖還原而獲得的那些化合物。配糖(glycosidic)側(cè)基可以是葡糖苷的(glucosidic)或半乳糖苷的(galactosidic)。糖醇的其它的實(shí)例是葡糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優(yōu)選的凍干保護(hù)劑是非還原糖海藻糖或蔗糖。將凍干保護(hù)劑以“凍干保護(hù)量”添加到凍干前的制劑中，這意味著，在存在凍干保護(hù)量的凍干保護(hù)劑的情況下對(duì)蛋白質(zhì)凍干之后，在凍干和貯存期間蛋白質(zhì)基本上保持它的物理化學(xué)穩(wěn)定性?！翱伤幱锰恰笔钱?dāng)其與目的蛋白質(zhì)組合時(shí)，在貯存期間顯著地防止或減少蛋白質(zhì)的物理化學(xué)不穩(wěn)定性的分子。當(dāng)制劑將要被凍干然后被重構(gòu)時(shí)，“可藥用糖”也可稱(chēng)為“凍干保護(hù)劑”。示例性的糖和它們相應(yīng)的糖醇包括氨基酸，諸如谷氨酸單鈉或組氨酸；甲胺，例如甜菜堿；易溶鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三元的或較高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖、赤蘚醇、丙三醇(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；
丙二醇；聚乙二醇；Pluronics ;及其組合。其它的示例性?xún)龈杀Ｗo(hù)劑包括甘油和明膠，以及糖類(lèi)蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇糖。還原糖的實(shí)例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原糖的實(shí)例包括非還原的多羥基化合物的糖苷，所述多羥基化合物選自糖醇及其它直鏈多元醇。優(yōu)選的糖醇是單糖苷，特別是通過(guò)將二糖例如乳糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖還原而獲得的那些化合物。配糖(glycosidic)側(cè)基可以是葡糖苷的(glucosidic)或半乳糖苷的(galactosidic)。糖醇的其它的實(shí)例是葡糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。優(yōu)選的可藥用糖是非還原糖海藻糖或蔗糖。以“保護(hù)量”將可藥用糖添加到制劑中(例如，凍干前)，這意味著在貯存期間(例如，在重構(gòu)和貯存之后)蛋白質(zhì)基本上保持它的物理化學(xué)穩(wěn)定性。本文感興趣的“稀釋劑”是可藥用的(對(duì)于向人類(lèi)施用是安全的和無(wú)毒的)、可用于配制液體制劑的稀釋劑，所述液體制劑諸如是在凍干之后重構(gòu)的制劑。示例性的稀釋劑包括無(wú)菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)、無(wú)菌鹽水溶液、Ringer’s溶液或葡萄糖溶液。在備選的實(shí)施方案中，稀釋劑可以包括鹽和/或緩沖劑的水溶液?！胺栏瘎笔强杀惶砑拥奖疚闹苿┲幸越档图?xì)菌活性的化合物。添加防腐劑可以，例如便于生產(chǎn)多次使用(多劑量)的制劑?？赡艿姆栏瘎┑膶?shí)例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、六甲氯銨、苯扎氯銨(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基基團(tuán)是長(zhǎng)鏈化合物)和芐索氯銨。其它類(lèi)型的防腐劑包括芳香醇類(lèi)，諸如苯酚、丁基和芐基醇、烷基對(duì)羥苯甲酸酯，諸如甲基或丙基對(duì)羥苯甲酸酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇、和m-甲酚。本文最優(yōu)選的防腐劑是芐醇。“治療”是指治療處理以及預(yù)防性或防范性措施。需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有疾病以及需要預(yù)防疾病的那些對(duì)象 。用于治療目的的“哺乳動(dòng)物”是指被分類(lèi)為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人類(lèi)、家養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、和動(dòng)物園、體育或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如狗、馬、兔、牛、豬、倉(cāng)鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓等等。優(yōu)選的，哺乳動(dòng)物是人?！凹膊　笔菍乃龅鞍踪|(zhì)治療中受益的任何病患。這包括慢性的和急性的病癥或疾病，包括使得哺乳動(dòng)物易患所談?wù)摰募膊〉哪切┎±韺W(xué)情況。文中待被治療的疾病的非限制性實(shí)例包括癌和炎癥?！爸委熡行Я俊敝辽偈菍?duì)于特定的疾病引起可測(cè)量的改善或預(yù)防所需的最小濃度。已知蛋白的治療有效量是本領(lǐng)域公知的，在下文中揭示的蛋白質(zhì)的有效量可以通過(guò)技術(shù)人員例如普通醫(yī)師的能力范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)確定。制備可如本文描述的那樣配制的抗體(包括與毒素綴合的抗體)及其它蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域公知的，并且例如詳述于W02007/001851?？贵w和其它蛋白質(zhì)可根據(jù)本發(fā)明配制為水性(aqueous)形式或凍干形式,如果能重構(gòu)為水性形式，后者是可能的。本文描述的制劑可以被制備為重構(gòu)的凍干制劑。凍干本文描述的蛋白質(zhì)或抗體，然后重構(gòu)以廣生本發(fā)明的液體制劑。在這一特定的實(shí)施方案中，在如上所述制備感興趣的蛋白質(zhì)之后，產(chǎn)生“凍干前(pre-lyophilized)制劑”。存在于所述凍干前制劑中的蛋白的量考慮到期望的劑量體積、施用的方式等來(lái)確定。例如，完整抗體的起始濃度可以為約2mg/ml至約50mg/ml,優(yōu)選約5mg/ml至約40mg/ml以及最優(yōu)選約20_30mg/ml。待配制的蛋白一般存在于溶液中。例如，在本發(fā)明的液體制劑中，蛋白可以存在于PH值約4-8、優(yōu)選約5-7的pH緩沖溶液中。取決于，例如，緩沖液和期望的制劑張力(例如重構(gòu)的制劑的張力)，緩沖液濃度可以為約ImM至約20mM，備選地約3mM至約15mM。示例性的緩沖劑和/或鹽是可藥用的、并可以從適合的酸、堿和它們的鹽產(chǎn)生的那些緩沖劑或鹽，諸如在“可藥用”酸、堿或緩沖劑下定義的那些。
`
在一個(gè)實(shí)施方案中，向凍干前制劑中添加凍干保護(hù)劑。在凍干前制劑中凍干保護(hù)劑的量一般要使得一旦重構(gòu)產(chǎn)生的制劑是等滲的。然而，高滲的重構(gòu)制劑也可能是適合的。此外，凍干保護(hù)劑的量不能太低，以致在凍干時(shí)發(fā)生無(wú)法接受量的蛋白質(zhì)降解/聚集。然而，在凍干前制劑中示例性的凍干保護(hù)劑濃度是約IOmM至約400mM，備選地約30mM至約300mM,備選地約50mM至約100mM。示例性的凍干保護(hù)劑包括糖和糖醇，諸如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。然而，在特定的環(huán)境下，某些凍干保護(hù)劑也可增加制劑的粘度。如此，應(yīng)當(dāng)小心地選擇能最小化并中和該影響的特定的凍干保護(hù)劑。在“凍干保護(hù)齊U”的定義下的上述額外的凍干保護(hù)劑在本文中也稱(chēng)為“可藥用糖”。對(duì)于每一特定的蛋白質(zhì)或抗體與凍干保護(hù)劑的組合，蛋白質(zhì)與凍干保護(hù)劑的比例可以變化。對(duì)于抗體作為選取的蛋白以及糖(例如，蔗糖或海藻糖)作為凍干保護(hù)劑用來(lái)產(chǎn)生高蛋白濃度的等滲重構(gòu)制劑的情況，凍干保護(hù)劑與抗體的摩爾比例可以是約100至約1500摩爾凍干保護(hù)劑比I摩爾抗體，以及優(yōu)選地約200至約1000摩爾凍干保護(hù)劑比I摩爾抗體，例如約200至約600摩爾凍干保護(hù)劑比I摩爾抗體。可以在所述凍干前制劑的制備中使用凍干保護(hù)劑(例如蔗糖或海藻糖)和填充劑(例如甘露醇或甘氨酸)的混合物。填充劑可以容許產(chǎn)生沒(méi)有過(guò)多孔穴在其中的均勻的凍干塊。其它可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，諸如在Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，0sol，A.Ed. (1980)中描述的那些，可以被包括在凍干前制劑(和/或凍干制劑和/或重構(gòu)制劑)中，只要它們不會(huì)對(duì)制劑的期望特性有不利的影響?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在應(yīng)用的劑量和濃度下對(duì)于接受者是無(wú)毒的，包括其它的緩沖劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑，諸如EDTA ;金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；可生物降解的聚合物，諸如聚酯；和/或成鹽抗衡離子，諸如鈉。本文的制劑也可包含超過(guò)一種的為被治療的特定適應(yīng)征所必需的蛋白質(zhì)，優(yōu)選具有不對(duì)其它蛋白質(zhì)造成不利影響的互補(bǔ)活性的那些。例如，在單個(gè)制劑中提供與期望的靶點(diǎn)(例如，受體或抗原)結(jié)合的兩種或更多種抗體可能是需要的。此類(lèi)蛋白質(zhì)以對(duì)預(yù)定目的有效的量適當(dāng)?shù)亟M合存在。用于體內(nèi)施用的制劑必須是無(wú)菌的。在凍干和重構(gòu)之前，或在之后，這可以用無(wú)菌過(guò)濾膜來(lái)過(guò)濾來(lái)很容易地實(shí)現(xiàn)。備選地，可以通過(guò)對(duì)除蛋白以外的成分，在約120°C高壓滅菌例如約30分鐘來(lái)實(shí)現(xiàn)整個(gè)混合物的無(wú)菌化。在蛋白、任選的凍干保護(hù)劑及其它任選組分混合在一起之后，將制劑凍干。為此，許多不同的冷凍干燥器是可用的，例如Hul 150 (Hull，USA)或GT20 (LeyboId-Heraeus，Germany)冷凍干燥器。通過(guò)冷凍制劑，隨后在適合于初級(jí)干燥的溫度下從冷凍的內(nèi)容物中升華冰來(lái)實(shí)現(xiàn)凍干。在這一情況中，產(chǎn)品溫度低于制劑的低共熔點(diǎn)或坍縮溫度(collapsetemperature)。一般地,用于 初級(jí)干燥的擱板溫度(shelf temperature)范圍為約_30°C至25°C (前提是初級(jí)干燥期間產(chǎn)物保持冷凍)，處于適當(dāng)?shù)膲毫ο?，范圍一般為約50至250mTorr。制劑、容納樣品的容器的大小和類(lèi)型(例如,玻璃小瓶)和液體的體積將主要決定干燥所需的時(shí)間，其可以在幾小時(shí)到幾天(例如，40-60小時(shí))的范圍內(nèi)變動(dòng)。任選地，取決于產(chǎn)品中期望的殘留水分水平，也可以進(jìn)行次級(jí)干燥(secondary drying)階段。進(jìn)行次級(jí)干燥的溫度范圍為約0-40°C，主要取決于容器的類(lèi)型和大小以及使用的蛋白的種類(lèi)。例如，在凍干的該整個(gè)除水階段中擱板溫度可以是約15-30°C (例如，約20°C)。次級(jí)干燥所需的時(shí)間和壓力是能產(chǎn)生適合的凍干塊的時(shí)間和壓力，取決于，例如溫度及其它參數(shù)。次級(jí)干燥時(shí)間由在產(chǎn)物中期望的殘留水分水平來(lái)決定，典型地需要至少約5小時(shí)(例如，10-15小時(shí))。壓力可以是與初級(jí)干燥步驟期間使用的相同的。取決于制劑和小瓶的大小，凍干條件可以變化。在向患者施用之前，用可藥用稀釋劑重構(gòu)凍干制劑，從而使在重構(gòu)制劑中的蛋白濃度為至少約50mg/ml,例如約50mg/ml至約400mg/ml,備選地約80mg/ml至約300mg/ml,備選地約90mg/ml到約150mg/ml。當(dāng)希望在皮下遞送重構(gòu)制劑時(shí),在重構(gòu)制劑中的這種高蛋白濃度被認(rèn)為是特別有用的。然而，對(duì)于其它施用途徑，諸如靜脈內(nèi)施用，重構(gòu)制劑中較低的蛋白濃度可能是所期望的(例如，在重構(gòu)制劑中的蛋白為約5-50mg/ml，或約10_40mg/ml)。在某些實(shí)施方案中，重構(gòu)制劑中的蛋白濃度比凍干前制劑中的濃度顯著更高。例如，重構(gòu)制劑中的蛋白濃度可以是凍干前制劑中的蛋白濃度的約2-40倍、或3-10倍、或3-6倍(例如至少三倍或至少四倍)。盡管若需要的話(huà)也可以使用其它溫度，但一般地在約25°C進(jìn)行重構(gòu)以確保完全水化。重構(gòu)所需的時(shí)間取決于，例如，稀釋劑的類(lèi)型、賦形劑的量和蛋白質(zhì)。示例性的稀釋劑包括無(wú)菌水、抑菌注射用水(BWF)、pH緩沖溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)、無(wú)菌鹽水溶液、Ringer溶液或葡萄糖溶液。稀釋劑任選地含有防腐劑。示例性的防腐劑已經(jīng)在上文中描述了，其中芳香醇類(lèi)諸如芐醇或酚醇是優(yōu)選的防腐劑。使用的防腐劑的量通過(guò)就對(duì)蛋白的相容性和防腐效率試驗(yàn)而言評(píng)定不同的防腐劑濃度來(lái)確定。例如，如果防腐劑是芳香醇類(lèi)(諸如芐醇)，其可以以約0. 1-2. 0%以及優(yōu)選約0. 5-1. 5%、但最優(yōu)選約1. 0-1. 2%的量存在。優(yōu)選地，重構(gòu)制劑每小瓶含有少于6000個(gè)粒子大小彡IOum的粒子。通過(guò)將具有期望的純度的活性成分與任選的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制備用于忙存的治療制劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences第18版，MackPublishing Co. , Easton, Pa. 18042 [1990])?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度下對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑，抗氧化劑，包括抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素EJl亞硫酸氫鈉，防腐劑，等滲劑，穩(wěn)定劑，金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn蛋白質(zhì)復(fù)合物)，和/或螯合劑諸如EDTA。當(dāng)治療劑 是抗體片段時(shí)，特異地與目標(biāo)蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的最小片段是優(yōu)選的。例如，根據(jù)抗體的可變區(qū)序列，可以設(shè)計(jì)抗體片段或甚至肽分子，其保留與目標(biāo)蛋白序列結(jié)合的能力。這類(lèi)肽可以化學(xué)合成和/或通過(guò)DNA重組技術(shù)生產(chǎn)(參見(jiàn)，例如，Marasco等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA90:7889-7893[1993])。使用緩沖劑來(lái)將pH值控制在能使療效最優(yōu)化的范圍內(nèi)，特別是當(dāng)穩(wěn)定性依賴(lài)于PH值時(shí)。緩沖劑優(yōu)選以約50mM至約250mM的濃度存在。本發(fā)明使用的適合的緩沖劑包括有機(jī)的和無(wú)機(jī)的酸，和它們的鹽。例如，檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。另外，緩沖劑可以由下面物質(zhì)組成組氨酸和三甲胺鹽，例如Tris0添加防腐劑以延緩微生物生長(zhǎng)，防腐劑一般以0. 2%-l. 0%(w/v)存在。本發(fā)明使用的適合的防腐劑包括十八燒基二甲基節(jié)基氯化銨；六甲氯銨；苯甲燒銨(benzalkonium)鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)，芐索氯銨；硫柳汞，苯酚，丁基或芐基醇；烷基對(duì)羥苯甲酸酯，諸如甲基對(duì)羥苯甲酸酯或丙基對(duì)羥苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇，3-戊醇，和m-甲酚。張力劑(tonicity agent)，有時(shí)被稱(chēng)為“穩(wěn)定劑”，其用來(lái)調(diào)整或維持液體組合物的張力。當(dāng)與大的、帶電生物分子諸如蛋白和抗體一起使用時(shí)，它們通常稱(chēng)為“穩(wěn)定劑”，因?yàn)樗鼈兡芘c氨基酸側(cè)鏈的帶電基團(tuán)相互作用，從而減少分子間和分子內(nèi)相互作用的可能性。考慮其它成分的相對(duì)量，張力劑可以以0. 1%至25%重量、優(yōu)選I至5%間的任何量存在。優(yōu)選的張力劑包括多羥基糖醇，優(yōu)選三羥基或更高的糖醇，諸如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。其它的賦形劑包括可以充當(dāng)下列的一種或多種的物質(zhì)(I)填充劑，(2)增溶劑，
(3)穩(wěn)定劑和(4)防止變性或?qū)θ萜鞅诟街奈镔|(zhì)。此類(lèi)賦形劑包括多羥基糖醇(在上文中列舉的)；氨基酸，諸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等等；有機(jī)糖或糖醇，諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環(huán)多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、a -單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量蛋白，諸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其它免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；單糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麥芽糖、鹿糖)；三糖，諸如棉子糖；和多糖諸如糊精或葡聚糖。為了將制劑用于體內(nèi)施用，它們必須是無(wú)菌的。可以用無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)使制劑無(wú)菌化。本文的治療組合物一般被放入到具有無(wú)菌進(jìn)入口的容器中，例如，靜脈內(nèi)溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶。施用途徑是按照已知的和公認(rèn)的方法，諸如一次或多次推注(bolus)或以合適的方式在一段長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)輸注，例如，通過(guò)皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、病灶內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)途徑注射或輸注，局部施用，吸入或通過(guò)持續(xù)釋放或延時(shí)釋放方式。本文的制劑還可包含為被治療的特定適應(yīng)征所需要的超過(guò)一種的活性化合物，優(yōu)選不會(huì)相互帶來(lái)不利影響的具有互補(bǔ)活性的那些活性化合物。備選地或此外，所述組合物可包含細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)抑制劑。此類(lèi)分子以對(duì)預(yù)定目的有效的量適當(dāng)?shù)亍⒔M合存在。也可以將活性成分包裹在微囊、膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米粒子和納米囊)或粗乳液(macroemulsions)中,所述微囊通過(guò)例如凝聚技術(shù)或界面聚合作用來(lái)制備，分別例如羥甲基纖維素或明膠微囊和聚_(甲基丙烯酸甲脂)微囊。這些技術(shù)公開(kāi)在Remington’s Pharmaceutical Sciences第18版中，同上?？梢灾苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的適合的實(shí)例包括，含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為有形物的形式，例如薄膜，或微囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，773，919)、L-谷氨酸和Y _乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物，諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。已經(jīng)用人生長(zhǎng)激素(rhGH)、干擾素-(rhIFN-)、白細(xì)胞介素-2和麗rpgl20成功地進(jìn)行了用于持續(xù)釋放的重組蛋白的微囊化。Johnson等人，Nat. Med. 2:795-799 (1996) ; Yasuda等人，Biomed. Ther. 27:1221-1223 (1993) ; Hora 等人，Bio/Technology8:755-758 (1990) ; Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems, ^in Vaccine Design:The Subunit and AdjuvantApproach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press:New York, 1995), pp.439-462 ；W097/03692 ；W096/40072 ；W096/07399 ;以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，654，010。這些蛋白的持續(xù)釋放制劑可以利用聚乳酸-共羥基乙酸(PLGA)聚合物來(lái)開(kāi)發(fā)，因?yàn)镻LGA具有生物相容性和廣泛的生物可降解性質(zhì)。PLGA的降解產(chǎn)物(乳酸和羥基乙酸)可以很快地從人體中清除。此外，取決于其分子量和組成，這一聚合物的降解性可以從數(shù)月到數(shù)年間調(diào)整。Lewis, “Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer”，在 Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(MarcelDekker; New York, 1990), M. Chasin 和 R. Langer (編輯)pp. 1-41。聚合物諸如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸使得能夠在超過(guò)100天的時(shí)間釋放分子，某些水凝膠在較短的時(shí)期內(nèi)釋放蛋白。當(dāng)封裝的抗體在體內(nèi)保持很長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，由于在37°C暴露于的濕氣，它們可能變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性的喪失和可能的免疫原性的變化。取決于所涉及的機(jī)制，為了穩(wěn)定化可以設(shè)計(jì)出合理的策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)硫代-二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，則可以通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制含水量、利用適當(dāng)?shù)奶砑觿⒑烷_(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。脂質(zhì)體或類(lèi)蛋白組合物也可被用于配制本文公開(kāi)的蛋白或抗體。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，925，673 和 5，013，556。本文描述的蛋白和抗體的穩(wěn)定性可以通過(guò)使用無(wú)毒的“水溶性多價(jià)金屬鹽”來(lái)增強(qiáng)。實(shí)例包括 Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn3+、Al2+和 Al3+。可以與上述多價(jià)金屬陽(yáng)離子形成水溶性鹽的陰離子的實(shí)例包括由無(wú)機(jī)酸和/或有機(jī)酸形成的那些陰離子。此類(lèi)水溶鹽在水中的溶解度(20°C )是至少約20mg/ml，或至少約100mg/ml，或至少約200mg/ml。可用于形成所述“水溶性多價(jià)金屬鹽”的適合的無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、乙酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸?？梢允褂玫倪m合的有機(jī)酸包括脂肪族羧酸和芳香酸。在這個(gè)定義下的脂肪族酸可被定義為飽和的或不飽和的C2_9羧酸(例如，脂肪族的單、二和三羧酸)。例如，在這個(gè)定義中的示例性單羧酸包括飽和的C2_9單羧酸，乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和capryonic酸,和不飽和的C2_9單羧酸,丙烯酸、丙炔酸(propriolic acid)、甲基丙烯酸、巴豆酸和異巴豆酸。示例性二羧酸包括飽和的C2_9 二羧酸，丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不飽和C2_9 二羧酸包括馬來(lái)酸、富馬酸、檸康酸和甲基延胡索酸。示例性的三羧酸包括飽和的C2_9三羧酸，丙三羧酸和1，2，3-丁烷三羧酸。另外，該定義的羧酸還可包含一個(gè)或兩個(gè)羥基形成羥基羧酸。示例性的羥基羧酸類(lèi)包括羥基乙酸、乳酸、甘油酸、羥基丙二酸、蘋(píng)果酸、酒石酸和檸檬酸。這個(gè)定義中的芳香酸包括苯甲酸和水楊酸。通常使用的可用來(lái)幫助穩(wěn)定本發(fā)明的封裝的多肽的水溶性多價(jià)金屬鹽包括，例如(1)鹵化物的無(wú)機(jī)酸金屬鹽(例如，`氯化鋅、氯化鈣)、無(wú)機(jī)酸金屬的硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和硫氰酸鹽；(2)脂肪族羧酸金屬鹽(例如，乙酸鈣、乙酸鋅、丙酸鈣(calciumproprionate)、輕基乙酸鋅、乳酸I丐、乳酸鋅和酒石酸鋅)；和(3)芳香族羧酸金屬鹽,苯甲酸鹽(例如,苯甲酸鋅)和水楊酸鹽。為了預(yù)防或治療疾病，活性劑的合適劑量將取決于需治療的如上文定義的疾病類(lèi)型、疾病的嚴(yán)重度和進(jìn)程、施用活性劑是為了預(yù)防目的還是治療目的、先前的治療、患者的病史和對(duì)活性劑的反應(yīng)，以及主治醫(yī)師的判斷。一次性或在一系列治療中將活性劑適當(dāng)?shù)厥┯媒o患者?？梢詫⒈景l(fā)明的方法與已知的治療疾病的方法組合，既可以作為組合的或附加的治療步驟，也可以作為治療制劑的另外組分。本發(fā)明藥物組合物的劑量和期望的藥物濃度可取決于預(yù)想的特定用途而變化。確定合適劑量或給藥途徑完全在普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。動(dòng)物試驗(yàn)為確定用于人類(lèi)治療的有效劑量提供了可靠的指導(dǎo)。可以根據(jù)Mordenti, J.和Chappell, W. "The Useof Interspecies Scaling in Toxicokinetics,〃In Toxicokinetics and New DrugDevelopment, Yacobi 等編輯，Pergamon Press, New Yorkl989，pp. 42-46 中提出的原則進(jìn)行有效劑量的種間換算。當(dāng)進(jìn)行本文描述的多肽或抗體的體內(nèi)施用時(shí)，正常的劑量數(shù)取決于施用途徑可以從每天約10ng/kg直至約100mg/kg哺乳動(dòng)物體重或更多，優(yōu)選約lmg/kg/天到IOmg/kg/天。已經(jīng)在文獻(xiàn)中提供了對(duì)遞送的特別劑量和方法的指導(dǎo)，參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，657，760,5, 206, 344或5，225，212。包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是，不同的制劑對(duì)于不同的治療和不同的疾病是有效的，以及意圖治療特定器官或組織的施用可能需要以不同于治療另一器官或組織的方式來(lái)遞送。此外，劑量可以通過(guò)一次或多次獨(dú)立的施用，或通過(guò)連續(xù)的輸注來(lái)施用。對(duì)于持續(xù)幾天或更長(zhǎng)時(shí)間的重復(fù)施用，取決于情況，持續(xù)進(jìn)行治療直到產(chǎn)生期望的對(duì)疾病癥狀的抑制。然而，其它劑量方案可能是有用的?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的技術(shù)和測(cè)量來(lái)容易地監(jiān)測(cè)治療的進(jìn)展。根據(jù)已知的方法將本發(fā)明的制劑包括但不限于重構(gòu)制劑施用至需要用所述蛋白治療的哺乳動(dòng)物優(yōu)選人，所述已知方法例如以推注(bolus)或在一段時(shí)間內(nèi)的連續(xù)輸注的靜脈施用、通過(guò)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、鞘膜內(nèi)、口服、局部或吸入途徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)皮下施用(即，在皮膚之下)將所述制劑施予哺乳動(dòng)物。為此，可以利用注射器注射所述制劑。然而，用于施用所述制劑的其它裝置是可用的，諸如注射裝置(例如，Inject-ease 和Genject 裝置)；注射筆(諸如GenPen )；自動(dòng)注射裝置、無(wú)針的裝置(例如，Medijector 和Biojector )和皮下貼劑遞送系統(tǒng)。在一特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于單劑量施用單位的試劑盒。這種試劑盒包含治療蛋白或抗體的水性制劑的容器，包含單腔的或多腔的預(yù)填充注射器。示例性的預(yù)填充注射器可從 Vetter GmbH, Ravensburg, Germany 獲得。蛋白質(zhì)的合適劑量(“治療有效量”)將取決于，例如，需治療病患、病患的嚴(yán)重度和進(jìn)程、施用蛋白是為了預(yù)防目 的還是治療目的、先前的治療、患者的病史和對(duì)蛋白的反應(yīng)，使用的蛋白種類(lèi)、和主治醫(yī)師的判斷。一次性或在一系列治療中向患者適當(dāng)?shù)厥┯玫鞍?，也可自診斷后任何時(shí)候向患者施用。所述蛋白可以作為唯一的治療來(lái)施用，或與可用于治療所討論病患的其它藥物或治療組合施用。當(dāng)所選擇的蛋白是抗體時(shí),約0. l_20mg/kg是施用至患者的最初候選劑量,例如，不論是一次施用還是多次獨(dú)立施用。然而，其它劑量方案可能是有用的?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)來(lái)容易地監(jiān)測(cè)治療的進(jìn)展。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含所述制劑的制品，并且優(yōu)選提供它的使用說(shuō)明。所述制品包含容器。適合的容器包括，例如，瓶子、小瓶(例如，雙腔小瓶)、注射器(例如，單腔或雙腔注射器)和試管。所述容器可以由各種材料諸如玻璃或塑料制成。位于裝有所述制劑的容器上的或與之關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽可以標(biāo)明重構(gòu)和/或使用的指導(dǎo)。標(biāo)簽可進(jìn)一步指明所述制劑可用于或意欲用于皮下施用。裝有所述制劑的容器可以是多次使用的小瓶，其容許重復(fù)施用(例如，2-6次施用)重構(gòu)制劑。所述制品可進(jìn)一步包含含有適合的稀釋劑(例如，BWFI)的第二容器。一旦混合所述稀釋劑和凍干制劑，在重構(gòu)制劑中的最終蛋白濃度一般是至少50mg/ml。所述制品可進(jìn)一步包含從商業(yè)和用戶(hù)立場(chǎng)出發(fā)需要的其它材料，包括其它的緩沖劑、稀釋劑、過(guò)濾器、針、注射器和帶使用說(shuō)明的包裝說(shuō)明書(shū)。通過(guò)參考以下實(shí)施例將能更充分地理解本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被看作是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。在本公開(kāi)文本中的所有引文在此明確引入作為參考。實(shí)施例1:烷基糖苷作為非離子表面活性劑防止蛋白質(zhì)/抗體聚集的研究該實(shí)施例說(shuō)明烷基糖苷作為非離子表面活性劑防止水溶液中的抗體聚集的用途。利用兩種不同形式的攪動(dòng)搖動(dòng)(shaking)和攪拌(stirring),評(píng)價(jià)不同燒基糖苷和聚山梨酯20對(duì)抗溶液中各種單克隆抗體的攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的保護(hù)作用。
_7] 搖動(dòng)誘導(dǎo)的聚集在該組研究中，在37oC的受控溫度下，將單克隆抗體的緩沖溶液(20mM磷酸鈉緩沖液，pH7. 4)在定軌搖床上以150rpm進(jìn)行搖動(dòng)。利用3ml抗體溶液填充至6cc玻璃瓶中，進(jìn)行這些研究。以規(guī)則間隔抽取樣品，并利用分子排阻色譜分析單體的百分?jǐn)?shù)。評(píng)價(jià)烷基糖苷類(lèi)的不同表面活性劑在搖動(dòng)期間防止蛋白質(zhì)聚集的效力。將表面活性劑在低于其各自臨界膠束濃度(CMC)或高于其各自CMC的濃度下使用。攪拌誘導(dǎo)的聚集在該組研究中，使用特氟龍涂層的(Tefloncoated)磁力攪拌棒在單克隆抗體的緩沖溶液(20mM組氨酸-乙酸鹽，pH5. 5)中引起攪動(dòng)。將3ml抗體溶液填充于6cc玻璃瓶中，并利用特氟龍涂層的攪拌棒將所述溶液在500rpm下攪拌。將所述溶液攪拌90分鐘，并以規(guī)則間隔抽取樣品，并分析作為不溶聚集物形成的指征的濁度。評(píng)價(jià)烷基糖苷類(lèi)的不同表面活性劑在搖動(dòng)期間防止蛋白質(zhì)聚集的效力。將表面活性劑在低于其各自臨界膠束濃度(CMC)或高于其各自CMC的濃度下使用。MS圖1顯示在37°C下、以150rpm搖動(dòng)64小時(shí)后，不含表面活性劑的溶液中和存在不同表面活性劑的溶液中抗-MUC16單克隆抗體的單體百分?jǐn)?shù)的時(shí)間依賴(lài)性，所述表面活性劑包括正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20。以各自CMC值的濃度的一半(即1.1mM(0. 035%w/v)正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、9mM(0. 24%)正辛基-0 -D-吡喃葡萄糖苷和0. 04mM(0. 0035%)聚山梨酯20)使用表面活性劑。如圖1中所示的，在無(wú)任何表面活性劑的情況下，在搖動(dòng)64小時(shí)時(shí)，觀(guān)察到抗體單體百分?jǐn)?shù)的降低。盡管在這些條件下聚山梨酯20對(duì)防止搖動(dòng)誘導(dǎo)的單體損失是無(wú)效的，但是測(cè)試的烷基糖苷類(lèi)的兩種表面活性劑即正癸基-D-吡喃葡萄糖苷和正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷在防止搖動(dòng)引起的抗-MUC16單克隆抗體的單體損失方面是有效的。因此，正癸基-0 -D-吡喃葡萄糖苷和正辛基- P -D-吡喃葡萄糖苷(即具有大于1. OmM的CMC值的烷基糖苷)有效地防止溶液中的抗-MUC16單克隆抗體的攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集。圖2和3顯示在環(huán)境溫度下，利用特氟龍涂層的磁力攪拌棒以500rpm攪拌90分鐘后，抗-MUC16單克隆抗體的溶液中濁度形成的時(shí)程。在不含表面活性劑的溶液中和在含有不同烷基糖苷表面活性劑或聚山梨酯20的溶液中評(píng)價(jià)濁度。圖2中，使用的表面活性劑濃度是其各自CMC值的十分之一，S卩1.8mM(0.053%)正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷、
0.18mM(0. 008%)正癸基-P-D-吡喃麥芽糖苷、0. 22mM(0. 007%)正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷、25mM(0. 66%)正己基-D-吡喃葡萄糖苷和0. 008mM(0. 0007%)聚山梨酯20。圖3中，使用的表面活性劑濃度是其各自CMC值的二倍，即36mM(l. 0%)正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷、3. 6mM(0. 16%)正癸基-D-吡喃麥芽糖苷、4. 4mM(0. 14%)正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、500mM(12%)正己基-D-吡喃葡萄糖苷和0. 16mM(0. 014%)聚山梨酯20。如圖2中所示，與不含表面活性劑的抗體溶液相比，在各自CMC值的十分之一濃度下的正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷和聚山梨酯20有效防止混濁發(fā)展?；鞚岬男纬赏ǔw因于抗體的大的不溶聚集物的形成。如圖3中所示，在各自CMC的二倍濃度下，根據(jù)濁度形成測(cè)量，所述烷基糖苷類(lèi)表面活性劑都有效防止溶液中抗體的聚集。圖4中，研究了在37°C下、以300rpm搖動(dòng)72小時(shí)期間，改變正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷的濃度對(duì)抗-MUC16單克隆抗體制劑的濁度的作用。如圖4中所示，如通過(guò)濁度形成所測(cè)量，在所有不同的測(cè)試濃度下，即 0. 72mM(0. 02w/v)、1. 8mM(0. 05w/v)、3. 6mM(0. lw/v)、9mM(0. 25w/v)U8mM(0. 5w/v)，正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷在搖動(dòng)期間有效抑制可見(jiàn)的抗體聚集物的形成。圖5中，研究了在37°C下、以300rpm搖動(dòng)72小時(shí)后，改變正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷的濃度對(duì)溶液中抗-MUC16單克隆抗體的單體百分?jǐn)?shù)的作用。如圖5中所示，與在類(lèi)似條件下貯存的未搖動(dòng)樣品的單體百分?jǐn)?shù)相比，在所測(cè)試的不同濃度下，正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷都有效保持搖動(dòng)時(shí)抗-MUC16抗體的單體百分?jǐn)?shù)。圖6-9中，研究了 37 °C下、以300rpm搖動(dòng)72小時(shí)期間，0. 23mM(0. 02%w/v)聚山梨酯20或3. 6mM(0. l%w/v)正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷對(duì)抗-MUC16單克隆抗體(圖6)、抗-1gE單克隆抗體(圖7)、抗-CDlla單克隆抗體(圖8)和抗-CD22單克隆抗體(圖9)的水性制劑的濁度的作用。如圖6-9中所示，如通過(guò)濁度形成所測(cè)量，聚山梨酯20和正辛基-3 -D-吡喃葡萄糖苷都有效抑制搖動(dòng)期間所有測(cè)試抗體的可見(jiàn)的抗體聚集物的形成。在圖10-13 中，研究了在 37°C 下、以 300rpm 搖動(dòng) 72 小時(shí)期間，0. 23mM(0. 02%w/v)聚山梨酯20或3. 6mM(0. l%w/v)正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷對(duì)抗-MUC16單克隆抗體(圖10)、抗-1gE單克隆抗體(圖11)、抗-⑶Ila單克隆抗體(圖12)和抗-⑶22單克隆抗體(圖13)的水性制劑的單體百分?jǐn)?shù)的作用。如圖10-13中所示，與在類(lèi)似條件下貯存的未搖動(dòng)樣品的單體百分?jǐn)?shù)相比，正辛基-D-吡喃葡萄糖苷有效地保持搖動(dòng)時(shí)各種測(cè)試抗體的單體百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例2 :烷基糖苷作為非離子表面活性劑防止蛋白質(zhì)/抗體氧化的研究本實(shí)施例闡明烷基糖苷作為非離子表面活性劑防止水溶液中的抗體氧化的用途。在第一個(gè)試驗(yàn)中，將烷基糖苷類(lèi)表面活性劑即正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-0 -D-吡喃葡萄糖苷和正癸基-P -D-吡喃麥芽糖苷以及聚山梨酯20的0. l%w/v濃度的水溶液在40°C下貯存I個(gè)月。然后,抽取樣品，并利用Amplex Red過(guò)氧化氫檢測(cè)法分析過(guò)氧化氫的存在。圖14中顯示這些分析的結(jié)果。如圖14中所示，將含有烷基糖苷表面活性劑的溶液在40°C下貯存I個(gè)月后，這些溶液產(chǎn)生可忽略量的過(guò)氧化氫。相反，在類(lèi)似的貯存條件下，含有聚山梨酯20的溶液中形成大約IOyM過(guò)氧化氫。這些數(shù)據(jù)表明與聚山梨酯20相比，將烷基糖苷用作水性制劑中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑可能是更好的，因?yàn)橥榛擒站哂邢鄬?duì)更低的隨時(shí)間推移在溶液中產(chǎn)生氧化性過(guò)氧化氫的本性。第二個(gè)試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了含有正癸基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷或聚山梨酯20的溶液中的抗-CDlla單克隆抗體中的Met256氨基酸殘基的氧化。為了這個(gè)目的，將3ml含有0. l%w/v表面活性劑的抗體緩沖溶液(pH6. 0)在5°C或40°C下、于6cc小瓶中貯存2或4周。然后，抽取樣品，并分析抗-CDlla—級(jí)氨基酸序列中的氨基酸Met256殘基的氧化，先前已表明該殘基易于氧化。圖15中顯示了這些分析的結(jié)果。如圖15中所示，與起始樣品相比，在如上所述貯存后，在含有正癸基-D-吡喃葡萄糖苷或正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷的溶液中未觀(guān)察到抗-CDlla的氧化的Met256百分含量的顯著增加。然而，在含有聚山梨酯20的抗-CDlla溶液中，發(fā)現(xiàn)與時(shí)間點(diǎn)O的相同氨基酸殘基的大約2%的氧 化相比，在40°C下貯存4周后，大約16%的Met256殘基被氧化。因此，所述數(shù)據(jù)表明與聚山梨酯20相比，將烷基糖苷用作水性制劑中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑可能是更好的，因?yàn)橥榛擒站哂邢鄬?duì)更低的隨時(shí)間推移在溶液中氧化配制的蛋白質(zhì)的本性。在第三個(gè)試驗(yàn)中，分析抗-⑶22單克隆抗體中Met和Trp氨基酸殘基(即已知的易于氧化的氨基酸)的芬頓(Fenton)試劑誘導(dǎo)的氧化。具體地講，制備含有0.1ppm Fe3+和Ippm過(guò)氧化氫的抗-⑶22單克隆抗體的緩沖(20mM組氨酸乙酸鹽，pH5. 5)溶液，并在無(wú)表面活性劑或者存在0. 23mM(0. 02%w/v)聚山梨酯20或3. 6mM(0. l%w/v)正辛基-D-吡喃葡萄糖苷的條件下，將其在40°C貯存2周或4周。然后，抽取樣品，并從經(jīng)苯基RP-HPLC柱洗脫的抗體的早先峰(early peaks)的百分?jǐn)?shù)確定Met和Trp殘基的氧化百分?jǐn)?shù)。圖16中顯示這些分析的結(jié)果。如圖16中所示，與含有聚山梨酯20的那些溶液相比，單克隆抗-⑶22中敏感氨基酸(Trp，Met)的芬頓(Fenton)試劑誘導(dǎo)的氧化在含有正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷的溶液中得到抑制，并與不含表面活性劑的溶液相當(dāng)。因此，這些數(shù)據(jù)表明與聚山梨酯20相比，將烷基糖苷用作水性制劑中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑可能是更好的，因?yàn)橥榛擒站哂邢鄬?duì)更低的隨時(shí)間推移在溶液中氧化配制的蛋白質(zhì)的本性。實(shí)施例3:烷基糖苷作為非離子表面活性劑防止蛋白質(zhì)/抗體中色氨酸殘基的光i 秀導(dǎo)的氧化的研究本實(shí)施例闡明作為非離子表面活性劑的烷基糖苷防止水溶液中蛋白質(zhì)/抗體上色氨酸殘基的光誘導(dǎo)的氧化的 用途。所有下面試驗(yàn)如下進(jìn)行。MAb樣品和光處理基因泰克公司(Genentech, Inc.)從CHO細(xì)胞株生產(chǎn)人源化抗氧化的LDL單克隆抗體。對(duì)于光穩(wěn)定性研究，制備3個(gè)獨(dú)立的樣品1)對(duì)照樣品，用鋁箔紙包住的小瓶；2)測(cè)試樣品，光暴露的小瓶(未包裹的)；3)測(cè)試樣品，含有指明的非離子表面活性劑的光暴露的小瓶(未包裹的)。將對(duì)照&光暴露的樣品都保持于光盒中24小時(shí)。按照ICH準(zhǔn)則，采用對(duì)于A(yíng)tlas SUNTEST CPS+光盒(Light Box)的下述設(shè)置進(jìn)行光暴露發(fā)光水平=250瓦特/平方米；時(shí)間設(shè)定24小時(shí)；總UV量=538瓦特-小時(shí)/平方米；總的可見(jiàn)量=1，320, OOOlux-小時(shí)。胰蛋白酶MAb肽圖的LC/MS/MS :還原和烷基化后，將樣品用胰蛋白酶消化。將得到的肽用偶聯(lián)有安捷倫1200毛細(xì)管HPLC系統(tǒng)的Thermo LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。HPLC 柱子Jupiter5um C18250X1. 0mm,流速:70uL/min,柱子恒溫器溫度:55°C。溶劑 A
0.1%TFA 的水溶液，B :0. 09%TFA 的 90%ACN 溶液。Orbitrap 設(shè)置MS 分辨率 60000，利用 LTQ以數(shù)據(jù)依賴(lài)模式收集的MS/MS。費(fèi)光測(cè)量利用裝配有控溫水浴的Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4突光分光光度計(jì)(Edison，NJ)得到溶液的內(nèi)在的(Intrinsic)色氨酸熒光發(fā)射光譜。在295nm激發(fā)后，在300-450nm收集色氨酸發(fā)射光譜。測(cè)定光對(duì)抗氧化的LDL抗體上的色氨酸殘基的氧化作用和非離子表面活性劑對(duì)抗氧化的LDL抗體上的色氨酸殘基的氧化的保護(hù)作用。測(cè)試的抗體在氨基酸位置33 (即Trp33)和92(即Trp92)處具有色氨酸殘基，并按照上述，測(cè)定所述位點(diǎn)的光誘導(dǎo)的氧化百分?jǐn)?shù)。將所述分析的結(jié)果列于下面的表2中。表2條件/表面活性劑%氣化的 %氣化的
Trp33Trp92
無(wú)光/無(wú)表面活性劑0.0 %0.6 %
光/無(wú)表面活性劑0.3%6.0 %光/0.39m'1正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷 0.3%4.9 %
光/300 mM正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷 0.0 %1.6 %
光/0.39 mM正己基-P-D-吡喃麥芽糖苷 0.3 %5.7 %
光/300 niM正己基-P-D-吡喃麥芽糖苷 0.0 %2.2 %
光/0.03 mM正十二烷基-P-D-吡喃麥芽糖苷0.0 %10.6 %
光/0.39 mM正十二烷基-P-D-吡喃麥芽糖苷0.1 %2.7 % 光/0.03 mM正十二烷基-P-D-吡喃葡萄糖苷0.4 %8.9 % 光/0.02%聚山梨酯 200.6%8.9%益論 具有大約ImM或更大的CMC值的烷基糖苷具有針對(duì)蛋白質(zhì)包括單克隆抗體的攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的穩(wěn)定作用。具有大約ImM或更大的CMC值的烷基糖苷所提供的針對(duì)攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的穩(wěn)定性不是抗體依賴(lài)的，因?yàn)閷?duì)不同氨基酸序列的不同抗體觀(guān)察到所述有益作用。令人驚訝地，在低于其各自CMC值的濃度下應(yīng)用烷基糖苷時(shí)，觀(guān)察到具有大約ImM或更大的CMC值的烷基糖苷提供針對(duì)攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的穩(wěn)定性。不像聚山梨酯20，貯存一段延長(zhǎng)的時(shí)間后，具有大約ImM或更大的CMC值的烷基糖苷不形成過(guò)氧化氫。不像聚山梨酯20，具有大約ImM或更大的CMC值的烷基糖苷不顯著誘導(dǎo)各種單克隆抗體中的易氧化氨基酸的氧化。不像聚山梨酯20，具有大約ImM或更大的CMC值的烷基糖苷能抑制或降低抗體和其它蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的光誘導(dǎo)的氧化的量，特別是在高于其各自CMC值的濃度下使用時(shí)。
權(quán)利要求
1.物質(zhì)組合物，其包含蛋白質(zhì)和在25°C、在水中具有大約1. OmM或更大的CMC值的烷基糖苷。
2.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中蛋白質(zhì)是抗體。
3.權(quán)利要求2所述的物質(zhì)組合物，其中抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中烷基糖苷選自正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-P -D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-P -D-吡喃葡萄糖苷、3-環(huán)己基-1-丙基-P -D-葡萄糖苷、3-環(huán)己基-1- 丁基-P -D-葡萄糖苷、正己基-P -D-吡喃麥芽糖苷、正辛基-P -D-吡喃麥芽糖苷、正壬基-P -D-吡喃麥芽糖苷、正癸基-P -D-吡喃麥芽糖苷、環(huán)己基-甲基-P -D-麥芽糖苷、2-環(huán)己基-乙基-P-D-麥芽糖苷、3-環(huán)己基-丙基-P-D-麥芽糖苷、4-環(huán)己基-丁基-0 -D-麥芽糖苷和5-環(huán)己基-戍基_ P -D-麥芽糖苷。
5.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中烷基糖苷是正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷。
6.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中烷基糖苷是正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷。
7.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中烷基糖苷是正癸基-P-D-吡喃麥芽糖苷。
8.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中烷基糖苷是正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷。
9.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中烷基糖苷是正十二烷基-P-D-吡喃麥芽糖苷。
10.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中烷基糖苷是正十二烷基-P-D-批喃葡萄糖苷。
11.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其包含抑制攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的量的所述烷基糖苷。
12.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其包含防止氧化的量的所述烷基糖苷。
13.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中烷基糖苷以低于烷基糖苷在25°C、水中的CMC值的濃度存在。
14.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其是水性的。
15.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其在大約2-8°C的溫度下穩(wěn)定至少I(mǎi)年。
16.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其在大約30°C的溫度下穩(wěn)定至少I(mǎi)個(gè)月。
17.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其不是凍干的，且沒(méi)有進(jìn)行預(yù)先凍干。
18.權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其是重構(gòu)的凍干制劑。
19.權(quán)利要求2所述的物質(zhì)組合物，其中抗體是易于聚集的。
20.權(quán)利要求2所述的物質(zhì)組合物，其中抗體是易于氧化的。
21.含有容納權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物的容器的制品。
22.制備藥物制劑的方法，其包括制備權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，并評(píng)價(jià)物質(zhì)組合物中蛋白質(zhì)的物理穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性或者生物活性。
23.抑制存在于第一水溶液中的蛋白質(zhì)的攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的方法，該方法包括向所述第一水溶液中加入抑制攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集的量的烷基糖苷的步驟，所述烷基糖苷在25° C、水中具有大約1. 0mM或更大的CMC值，由此提供第二水溶液。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中蛋白質(zhì)是抗體。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中烷基糖苷選自正己基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-P-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-P-D-吡喃葡萄糖苷、3-環(huán)己基-1-丙基-P-D-葡萄糖苷、3-環(huán)己基-1-丁基-P-D-葡萄糖苷、正己基-β -D-吡喃麥芽糖苷、正辛基-β -D-吡喃麥芽糖苷、正壬基-β -D-吡喃麥芽糖苷、正癸基-β -D-吡喃麥芽糖苷、環(huán)己基-甲基-β -D-麥芽糖苷、2-環(huán)己基-乙基-β -D-麥芽糖昔、3_環(huán)己基_丙基_ β -D-麥芽糖昔、4_環(huán)己基_ 丁基_ β -D-麥芽糖昔和5_環(huán)己基-戍基_ β -D-麥芽糖昔。
27.權(quán)利要求23所述的方法，其中烷基糖苷是正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
28.權(quán)利要求23所述的方法，其中烷基糖苷是正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
29.權(quán)利要求23所述的方法，其中烷基糖苷是正癸基-β-D-吡喃麥芽糖苷。
30.權(quán)利要求23所述的方法，其中烷基糖苷是正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
31.權(quán)利要求23所述的方法，其中將烷基糖苷加至低于烷基糖苷在25°C、水中的CMC值的終濃度。
32.權(quán)利要求23所述的方法，其包括進(jìn)一步凍干所述第二水溶液的步驟。
33.防止第一水溶液中存在的蛋白質(zhì)氧化的方法，該方法包括向所述第一水溶液中加入防止氧化的量的烷基糖苷的步驟，所述烷基糖苷在25° C、水中具有大約1. OmM或更大的CMC值，由此提供第二水溶液。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中蛋白質(zhì)是抗體。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
36.權(quán)利要求33所述的方法，其中烷基糖苷選自正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-環(huán)己基-1-丙基-β-D-葡萄糖苷、3-環(huán)己基-1-丁基-β-D-葡萄糖苷、正己基-β -D-吡喃麥芽糖苷、正辛基-β -D-吡喃麥芽糖苷、正壬基-β -D-吡喃麥芽糖苷、正癸基-β -D-吡喃麥芽糖苷、環(huán)己基-甲基-β -D-麥芽糖苷、2-環(huán)己基-乙基-0 -D-麥芽糖昔、3_環(huán)己基_丙基_ β -D-麥芽糖昔、4_環(huán)己基_ 丁基_ β -D-麥芽糖昔和5_環(huán)己基-戍基_ β -D-麥芽糖昔。
37.權(quán)利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
38.權(quán)利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
39.權(quán)利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正癸基-β-D-吡喃麥芽糖苷。
40.權(quán)利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
41.權(quán)利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正十二烷基-β-D-吡喃麥芽糖苷。
42.權(quán)利要求33所述的方法，其中烷基糖苷是正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
43.權(quán)利要求33所述的方法，其中將烷基糖苷加至低于烷基糖苷在25°C、水中的CMC值的終濃度。
44.權(quán)利要求33所述的方法，其中將烷基糖苷加至高于烷基糖苷在25°C、水中的CMC值的終濃度。
45.權(quán)利要求33所述的方法，其包含進(jìn)一步凍干所述第二水溶液的步驟。
46.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述氧化是光誘導(dǎo)的氧化。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述光誘導(dǎo)的氧化是所述抗體或其它蛋白質(zhì)中的色氨酸殘基的光誘導(dǎo)的氧化。。
全文摘要
本發(fā)明涉及某些烷基糖苷組合物用于防止抗體和其他蛋白質(zhì)在其治療上有用的制劑中聚集和氧化的用途。
文檔編號(hào)A61K31/7024GK103068367SQ201180040661
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者O·厄敘爾, V·K·夏爾馬 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司