專利名稱：抗病毒的含有疊氮化物的化合物的制作方法
抗病毒的含有疊氮化物的化合物
背景技術(shù)：
病毒感染造成人類和動(dòng)物的高發(fā)病率和死亡率。另外，病毒感染也導(dǎo)致大量農(nóng)業(yè)損失，其中植物病毒每年在全世界造成的農(nóng)作物產(chǎn)量損失據(jù)估測(cè)為600億美元。盡管大量資源已經(jīng)致力于鑒別具有抗病毒性質(zhì)的化合物，病毒感染仍然對(duì)人健康和農(nóng)業(yè)構(gòu)成顯著風(fēng)險(xiǎn)。另外，多藥抗藥性、差效力和/或毒性的形成限制了大多數(shù)現(xiàn)有的抗病毒治療的有用性。實(shí)際上，許多抗病毒治療是高毒性的，且可以造成嚴(yán)重的副作用，包括心臟損傷、腎功能衰竭和骨質(zhì)疏松癥。其它挑戰(zhàn)包括:創(chuàng)造出可廣泛地適用于與許多不同類型的病毒感染做斗爭(zhēng)的藥物，這在免疫受損個(gè)體的治療中是特別重要的。一種病毒(具體地，人免疫缺陷病毒(HIV))仍然在全球大范圍流行，盡管開發(fā)出了靶向HIV的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。截止至2007年，據(jù)估測(cè)超過3300萬(wàn)人被HIV感染，并且HIV相關(guān)的疾病代表一個(gè)重大的世界性健康問題。HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，其感染免疫系統(tǒng)的CD4+細(xì)胞，從而破壞或削弱它們的功能。隨著感染進(jìn)展，免疫系統(tǒng)變得更弱，使得受感染的人更易感機(jī)會(huì)性感染和腫瘤，諸如卡波西肉瘤、宮頸癌、淋巴瘤和神經(jīng)障礙。HIV感染的最晚期是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。HIV感染的人發(fā)展成AIDS需要10-15年。某些抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物甚至可以進(jìn)一步延遲該過程。盡管已經(jīng)將大量努力放在設(shè)計(jì)針對(duì)HIV的有效治療劑中，目前不存在針對(duì)HIV的治愈性的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。已經(jīng)評(píng)價(jià)了 HIV生命周期的幾個(gè)階段，作為開發(fā)治療劑的靶標(biāo)(Mitsuya，H.等人，1991，F(xiàn)ASEB J 5:2369-2381)。一個(gè)焦點(diǎn)領(lǐng)域已經(jīng)是HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)將HIV的單鏈RNA基因組復(fù)制成雙鏈病毒DNA。所述病毒DNA然后整合進(jìn)宿主的染色體DNA中，在那 里使用宿主的細(xì)胞過程(如轉(zhuǎn)錄和翻譯)來(lái)生產(chǎn)病毒蛋白，并最終生產(chǎn)新的病毒顆粒。因此，干擾逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)抑制HIV的復(fù)制能力。一類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是核苷類似物，諸如齊多夫定(AZT)、去羥肌苷(ddl)、扎西他濱(ddC)和司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韋(ABC)、恩曲他濱(FTC)、恩替卡韋(INN)和阿立他濱(ATC) (Mitsuya，H.等人，1991, Science249:1533-1544 ；E1 Kouni, Curr Pharm Des, 2002,8:581-93 ;Sharma 等人，Cur Top Med Chem，2004，4:895-919)。另一類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是核苷酸類似物，諸如替諾福韋(富馬酸替諾福韋二吡呋酯)和阿德福韋(bis-POM PMPA) (Palmer等人，AIDSRes Hum Retroviruses, 2001,17:1167-73)。這些核苷和核苷酸化合物是天然存在的脫氧核糖核苷酸的類似物，但是，所述類似物缺少在脫氧核糖上的3’ -羥基。結(jié)果，當(dāng)所述類似物被摻入增長(zhǎng)的病毒DNA鏈中時(shí)，新來(lái)的脫氧核苷酸不會(huì)與所述類似物形成延長(zhǎng)DNA鏈所需的磷酸二酯鍵。因而，所述類似物會(huì)終止病毒DNA復(fù)制。另一類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，諸如依法韋侖、奈韋拉平、地拉韋啶和依曲韋林(El Safadi等人，ApplMicrobiol Biotechnol, 2007, 75:723-37)。它們具有與核苷和核苷酸抑制劑不同的作用模式:結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶，并干擾它的功能。HIV復(fù)制的晚期包括:在最終裝配新病毒粒子之前，加工某些病毒蛋白。該晚期加工部分地依賴于病毒蛋白酶的活性。因而，在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的開發(fā)中的另一個(gè)焦點(diǎn)領(lǐng)域是蛋白酶抑制劑，諸如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、氨普那韋、洛匹那韋和阿扎那韋(Erickson, J.，1990，Science249:527-533 ；Klei 等人，J Virol,81:9525-35)。其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物靶向病毒向細(xì)胞中的進(jìn)入，即HIV感染的最早階段。HIV為了進(jìn)入細(xì)胞，它的表面gpl20蛋白會(huì)結(jié)合CD4，從而暴露與CCR5或CXCR4共受體結(jié)合的gpl20保守區(qū)。在gpl20與共受體結(jié)合以后，在gp41包膜蛋白的N-端處的疏水融合肽被暴露，并插入細(xì)胞的膜中。進(jìn)入抑制劑通過干擾病毒進(jìn)入過程的任何階段來(lái)起作用。例如，已經(jīng)證實(shí)，例如重組可溶性的⑶4會(huì)抑制某些HIV-1株對(duì)⑶-4+ T-細(xì)胞的感染(Smith，D.H.等人，1987，Science238:1704-1707)。類似地，TNX-355是一種與CD4結(jié)合的單克隆抗體，并抑制與 gpl20 的結(jié)合(Kuritzkes 等人，JInfect Dis, 2004,189:286-91)。BMS-806 會(huì)結(jié)合病毒包膜蛋白，并抑制與CD4的結(jié)合(Veazy等人，Nature2003，438:99-102)。共受體結(jié)合可以被幾種CCR5抑制劑抑制，所述CCR5抑制劑包括SCH-C和SCH_D、UK_427、857、馬拉韋羅、維立韋羅和抗-CCR5 抗體(PRO-140) (Emmelkamp 等人，Eur J Med Res, 2007,12:409-17)。共受體結(jié)合還可以被 CXCR4 抑制劑 AMD3100 和 AMD070 抑制(De Clerq,Nature Reviews DrugDiscovery2003, 2:581-87)。其它化合物(諸如恩夫韋肽)會(huì)結(jié)合gp41，并干擾它的介導(dǎo)膜融合和進(jìn)入的能力(La Bonte 等人，Nature Reviews Drug Discovery 2OO3, 2 =IM5-36)。在有益的同時(shí)，這些抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物經(jīng)常表現(xiàn)出毒副作用，諸如骨髓抑制、嘔吐和肝功能異常。另外，它們不是治愈性的，可能是由于抗藥性的HIV突變體的迅速出現(xiàn)(Lander, B.等人，1989，Science 243:1731-1734)。由于HIV的非常高的遺傳變異性，形成抗藥性的HIV株。該遺傳變異性源自幾種因素，包括HIV的快速?gòu)?fù)制循環(huán)，其中每天產(chǎn)生IO9至101°個(gè)病毒粒子，每個(gè)核苷酸堿基在每個(gè)復(fù)制循環(huán)中大約3xl0_5的高突變率，和逆轉(zhuǎn)錄酶的重組基因性質(zhì)。為了對(duì)抗抗藥性的HIV株的形成，已經(jīng)組合多種藥物作為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)的一部分(El Safadi 等人，Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75:723-37 ；Sharma 等人，Cur Top Med Chem, 2004,4:895-919)。目前，HAART 通常包括:組合至少 3 種藥物，所述藥物屬于至少2類抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒藥劑。如以上所討論的，這些類別包括核苷或核苷酸類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和進(jìn)入抑制劑。因而，盡管大量努力正在指向抗病毒藥物的設(shè)計(jì)和試驗(yàn)，仍然在尋找新的和改進(jìn)的治療病毒感染(諸如HIV)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本公開內(nèi)容提供了使用疊氮化物修飾的生物分子(諸如疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì))或其藥學(xué)上可接受的鹽治療病毒感染(諸如Hiv感染)或標(biāo)記病毒(諸如HIV)的蛋白的方法，以及含有疊氮化物修飾的生物分子或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。本公開內(nèi)容的一個(gè)方面涉及一種治療受試者的方法，所述受試者被植物、昆蟲或動(dòng)物病毒感染且需要治療所述感染，所述方法包括:給所述受試者施用治療有效量的疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽具有下式:Y-CH2-X-CO2H [I]其中，Y是H或疊氮基；和當(dāng)Y是疊氮基時(shí)，X是包含6-28個(gè)碳的直鏈或支鏈碳鏈，其中所述碳中的一個(gè)或多個(gè)可以獨(dú)立地被氧、硒、硅、硫、so、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此鄰接的一對(duì)或多對(duì)可以通過雙鍵或三鍵彼此連接；或當(dāng)Y是H時(shí)，X是包含6-28個(gè)碳的直鏈或支鏈碳鏈，其中在所述碳之一上的一個(gè)氫被疊氮基替代，且其中所述碳中不具有與其相連的疊氮基的一個(gè)或多個(gè)可以獨(dú)立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此鄰接且不具有疊氮基的一對(duì)或多對(duì)可以通過雙鍵或三鍵彼此連接；其中，R1是H或包含1-6個(gè)碳的烷基。在這些中的一些中，Y是疊氮基。在這些中的一些中，X是直鏈碳鏈。在這些中的一些中，所述直鏈碳鏈包含 8-15個(gè)碳。在這些中的一些中，所述直鏈碳鏈不含有氧、硒、娃、硫、SO、S02*NRlt)在這些中的一些中，所述碳鏈不含有雙鍵或三鍵。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是15-疊氮基十五烷酸、12-疊氮基十二烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙?；腘-疊氮基乙酰基半乳糖胺、四乙?；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或四乙?；腘-疊氮基乙酰基葡糖胺。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)是疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是非人動(dòng)物病毒或人動(dòng)物病毒。在有些實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物病毒是小RNA病毒、瘟病毒、動(dòng)脈病毒、冠狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、里奧病毒、豬病毒(porcine)、圓環(huán)病毒、皰疫病毒、非洲豬痕病病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、黃病毒或彈狀病毒。在有些實(shí)施方案中，所述人動(dòng)物病毒是腺病毒、星狀病毒、嗜肝性DNA病毒、皰疹病毒、乳多泡病毒、痘病毒、沙粒病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒(calcivirus)、冠狀病毒、纖絲病毒、黃病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、里奧病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒或披膜病毒。在這些中的一些中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是人免疫缺陷病毒或人T細(xì)胞淋巴營(yíng)養(yǎng)病毒。在這些中的一些中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是人免疫缺陷病毒HIV-1。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是植物病毒。在這些中的一些中，所述植物病毒是苜?；ㄈ~病毒、青蔥病毒、α潛隱病毒、禽副黏液病毒(anulavirus)、蘋果北美疤類病毒、金病毒、燕麥病毒、鱷梨白斑類病毒、桿狀DNA病毒、菜豆金色花葉病毒、甜菜壞死黃脈病毒、β潛隱病毒、β彎曲病毒科、雀麥花葉病毒、大麥黃化花葉病毒、毛狀病毒、石竹隱潛病毒、麝香石竹斑駁病毒、花椰菜花葉病毒、木薯葉脈鑲嵌樣病毒、櫻桃銼葉病毒、線形病毒、椰子死亡類病毒、錦紫蘇類病毒、豇豆花葉病毒、線性病毒、黃瓜花葉病毒、植物昆蟲病毒、質(zhì)型彈狀病毒、香石竹病毒、碗豆耳突花葉病毒、傘形植物病毒和B-型衛(wèi)星病毒、蠶豆病毒、斐濟(jì)病毒、真菌傳桿狀病毒、大麥病毒、啤酒花矮化類病毒、懸鉤子病毒、等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒、甘薯病毒、黃矮病毒、玉米褪綠斑駁病毒、橙?；ㄈ~病毒、玉米雷亞多非納病毒、玉米線條病毒、納米病毒、壞死病毒、蠕傳多角體病毒、核型彈狀病毒、油橄欖病毒、柑橘鱗皮病毒、水稻病毒、帕尼科病毒、花生叢簇病毒、牽牛花葉脈透明樣病毒、植物呼腸病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯病毒、馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、里奧病毒、彈狀病毒、黑麥草花葉病毒、溫州蜜柑矮縮病毒、SbCMV-樣病毒、伴生病毒、南方菜豆花葉病毒、纖細(xì)病毒、TNsatV-樣衛(wèi)星病毒、煙草花葉病毒、番爺假曲頂病毒、蕃爺斑萎病毒、蘋果退綠葉斑病毒、小麥花葉病毒、水稻衰退桿狀樣病毒、蕪菁黃花葉病毒、傘形植物病毒、巨脈病毒、葡萄屬病毒或矮化病毒。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是昆蟲病毒。在這些中的一些中，所述昆蟲病毒是濃核病毒、虹彩病毒、綠色虹彩病毒、桿狀病毒、多DNA病毒、昆蟲痘病毒、囊泡病毒、昆蟲小RNA病毒、杯狀病毒或野田村病毒。在有些實(shí)施方案中,所述受試者是人動(dòng)物。本公開內(nèi)容的另一個(gè)方面涉及一種抑制病毒侵染性的方法，所述方法包括:使被病毒感染的細(xì)胞接觸有效地抑制病毒侵染性的量的疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽具有如上所述的式[I]。在這些中的一些中，Y是疊氮基。在這些中的一些中，X是直鏈碳鏈。在這些中的一些中，所述直鏈碳鏈包含8-15個(gè)碳。在這些中的一些中,所述直鏈碳鏈不含有氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR115在這些中的一些中，所述碳鏈不含有雙鍵或三鍵。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是15-疊氮基十五烷酸、12-疊氮基十二烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前?、四乙酰化的N-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或四乙?；腘-疊氮基乙?；咸前贰Ｔ谟行?shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)是疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是非人動(dòng)物病毒或人動(dòng)物病毒。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是非人動(dòng)物病毒。在有些實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物病毒是小RNA病毒、痕病毒、動(dòng)脈病毒、冠狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、里奧病毒、豬、圓環(huán)病毒、皰疫病毒、非洲豬痕病病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、黃病毒或彈狀病毒。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是人動(dòng)物病毒。在這些中的一些中，所述人動(dòng)物病毒是腺病毒、星狀病毒、嗜肝性DNA病毒、皰疫病毒、乳多泡病毒、痘病毒、沙粒病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、冠狀病毒、纖絲病毒、黃病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、里奧病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒或披膜病毒。在這些中的一些中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是人免疫缺陷病毒或人T細(xì)胞淋巴營(yíng)養(yǎng)病毒。 在這些中的一些中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是人免疫缺陷病毒HIV-1。
在有些實(shí)施方案中，所述病毒是植物病毒。在這些中的一些中，所述植物病毒是苜?；ㄈ~病毒、青蔥病毒、α潛隱病毒、禽副黏液病毒、蘋果北美疤類病毒、金病毒、燕麥病毒、鱷梨白斑類病毒、桿狀DNA病毒、菜豆金色花葉病毒、甜菜壞死黃脈病毒、β潛隱病毒、β彎曲病毒科、雀麥花葉病毒、大麥黃化花葉病毒、毛狀病毒、石竹隱潛病毒、磨香石竹斑駁病毒、花椰菜花葉病毒、木薯葉脈鑲嵌樣病毒、櫻桃銼葉病毒、線形病毒、椰子死亡類病毒、錦紫蘇類病毒、豇豆花葉病毒、線性病毒、黃瓜花葉病毒、植物昆蟲病毒、質(zhì)型彈狀病毒、香石竹病毒、碗豆耳突花葉病毒、傘形植物病毒和B-型衛(wèi)星病毒、蠶豆病毒、斐濟(jì)病毒、真菌傳桿狀病毒、大麥病毒、啤酒花矮化類病毒、懸鉤子病毒、等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒、甘薯病毒、黃矮病毒、玉米褪綠斑駁病毒、橙?；ㄈ~病毒、玉米雷亞多非納病毒、玉米線條病毒、納米病毒、壞死病毒、蠕傳多角體病毒、核型彈狀病毒、油橄欖病毒、柑橘鱗皮病毒、水稻病毒、帕尼科病毒、花生叢簇病毒、牽?；ㄈ~脈透明樣病毒、植物呼腸病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯病毒、馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、里奧病毒、彈狀病毒、黑麥草花葉病毒、溫州蜜柑矮縮病毒、SbCMV-樣病毒、伴生病毒、南方菜豆花葉病毒、纖細(xì)病毒、TNsatV-樣衛(wèi)星病毒、煙草花葉病毒、番爺假曲頂病毒、蕃爺斑萎病毒、蘋果退綠葉斑病毒、小麥花葉病毒、水稻衰退桿狀樣病毒、蕪菁黃花葉病毒、傘形植物病毒、巨脈病毒、葡萄屬病毒或矮化病毒。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是昆蟲病毒。在這些中的一些中，所述昆蟲病毒是濃核病毒、虹彩病毒、綠色虹彩病毒、桿狀病毒、多DNA病毒、昆蟲痘病毒、囊泡病毒、昆蟲小RNA病毒、杯狀病毒或野田村病毒。在有些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。本公開內(nèi)容的第三方面涉及一種生產(chǎn)病毒的方法，所述病毒被疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽標(biāo)記，所述方法包括:使被病毒感染的細(xì)胞接觸所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物、所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽，使得所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物、所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽進(jìn)入所述細(xì)胞中，并摻入所述病毒的蛋白中，由此生產(chǎn)被標(biāo)記的病毒。在有些實(shí)施方案中，所述方法是生產(chǎn)被疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽標(biāo)記的人免疫缺陷病毒的方法，所述方法包括:使被所述人免疫缺陷病毒感染的細(xì)胞接觸所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物、所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽，使得所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物、所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽進(jìn)入所述細(xì)胞中，并摻入所述病毒的蛋白中，由此生成被標(biāo)記的病毒。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽具有如上所述的式[I]。在這些中的一些中，Y是疊氮基。在這些中的一些中，X是直鏈碳鏈。在這些中的一些中，所述直鏈碳鏈包含8-15個(gè)碳。在這些中的一些中,所述直鏈碳鏈不含有氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR115在這些中的一些中，所述碳 鏈不含有雙鍵或三鍵。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是15-疊氮基十五烷酸、12-疊氮基十二烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙酰化的N-疊氮基乙?；肴樘前?、四乙?；腘-疊氮基乙酰基-D-甘露糖胺或四乙?；腘-疊氮基乙酰基葡糖胺。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)是疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。在有些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是人免疫缺陷病毒，而在其它實(shí)施方案中，所述病毒是桿狀病毒。
在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制。在有些實(shí)施方案中，所述方法另外包括下述步驟:給所述細(xì)胞施用與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制的所述疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽。本公開內(nèi)容的第四方面涉及一種在體內(nèi)跟蹤病毒的方法，所述方法包括下述步驟:使培養(yǎng)的細(xì)胞或受試者接觸疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽；使所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者接觸炔烴標(biāo)記的報(bào)告物分子；和在所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者中跟蹤報(bào)告物標(biāo)記的病毒。在有些實(shí)施方案中，使所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者接觸疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽具有如上所述的式[I]。在有些實(shí)施方案中，Y是疊氮基。在這些中的一些中，X是直鏈碳鏈。在這些中的一些中，所述直鏈碳鏈包含8-15個(gè)碳。在這些中的一些中，所述直鏈碳鏈不含有氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR115在這些中的一些中，所述碳鏈不含有雙鍵或三鍵。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是15-疊氮基十五烷酸、12-疊氮基十二烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。本公開內(nèi)容的另一個(gè)方面涉及一種藥物組合物，其包含疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽具有如上所述的式[I]。在這些中的一些中，Y是疊氮基。在這些中的一些中，X是直鏈碳鏈。在這些中的一些中，所述直鏈碳鏈包含8-15個(gè)碳。在這些中的一些中,所述直鏈碳鏈不含有氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR115在這些中的一些中，所述碳鏈不含有雙鍵或三鍵。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是15-疊氮基十五烷酸、12-疊氮基十二烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前?、四乙?；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或四乙酰化的N-疊氮基乙?；咸前?。在有些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基。在這些中的一些中，所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)是疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。在有些實(shí)施方案中，所述組合物另外包含至少一種抗病毒劑。在這些中的一些中，所述抗病毒劑選自:逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、病毒蛋白酶抑制劑、病毒融合抑制劑、病毒整合酶抑制劑、糖苷酶抑制劑、病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑、M2蛋白抑制劑、兩性霉素B、羥基脲、α -干擾素、干擾素、Y-干擾素和反義寡核苷酸。在這些中的一些中，所述逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是下述的至少一種:齊多夫定(AZT)、去輕肌苷(ddl)、扎西他濱(ddC)、ddA、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韋(ABC)、恩曲他濱(FTC)、恩替卡韋(INN)、阿立他濱(ATC)、Atevirap ine、利巴韋林、阿昔洛韋、泛昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋、伐昔洛韋、替諾福韋、阿德福韋、PMPA、 西多福韋、依法韋侖、奈韋拉平、地拉韋啶或依曲韋林；其中所述病毒蛋白酶抑制劑是下述的至少一種:替拉那韋、達(dá)蘆那韋、茚地那韋、洛匹那韋、呋山那韋、阿扎那韋、沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋或氨普那韋；其中所述病毒融合抑制劑是下述的至少一種:CD4拮抗劑、CCR5拮抗劑、CXCR4拮抗劑或恩夫韋肽；其中所述病毒整合酶是拉替拉韋；其中所述糖苷酶抑制劑是下述的至少一種:SC-48334或MDL-28574 ;其中所述病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑是下述的至少一種:奧塞米韋、培拉米韋、扎那米韋和拉尼米韋；和其中所述M2蛋白抑制劑是下述的至少一種:金剛燒胺或金剛乙胺(rimantidine)。在有些實(shí)施方案 中，所述組合物另外包含一種試劑，所述試劑用于給細(xì)胞遞送所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物、所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽。在這些中的一些中，用于給細(xì)胞遞送所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)的試劑。


附圖(其并入本說明書中，并且構(gòu)成本說明書的一部分)解釋了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，并與書面描述一起，用于解釋本發(fā)明的某些原理。圖1顯示了疊氮化物修飾的蛋白在HIV感染的CEMx 174細(xì)胞中的時(shí)程。用下述物質(zhì)標(biāo)記CEMxl74感染的細(xì)胞:(A) 15-疊氮基十五烷酸、(B) 12-疊氮基十二烷酸、(C)四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前坊?D)四乙?；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺，并在感染后12、24、72小時(shí)和14天時(shí)收獲。圖1 (E)顯示了用下述總蛋白染色劑染色以后的代表
性凝膠:SYPROuRllby蛋白染色劑(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)。圖2顯示了從慢性感染的CEMxl74細(xì)胞生產(chǎn)的HIV得到的疊氮化物修飾的蛋白的凝膠電泳。圖2 (A)顯示了用四乙?；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺(Man)、四乙?；腘-疊氮基乙酰基半乳糖胺(GalNaz)、15-疊氮基十五燒酸(Palmitic)、12-疊氮基十二燒酸
(Myristic)標(biāo)記的和用TAMRA標(biāo)記的病毒蛋白。圖2 (B)顯示了使用SYPRO Rubyj
白染色劑(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)的總蛋白染色。
圖3顯示了螢光素酶報(bào)告物測(cè)定(Applied Biosytems螢光素酶試劑)的結(jié)果，所述測(cè)定用于測(cè)量未標(biāo)記的HIV(對(duì)照)或用15-疊氮基十五烷酸(PALM)、12-疊氮基十二烷酸(MYR)、四乙?；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺(MAN)或四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前?GAL)標(biāo)記的HIV的侵染性。圖4顯示了螢光素酶報(bào)告物測(cè)定(Promega螢光素酶試劑)的結(jié)果，所述測(cè)定用于測(cè)量未標(biāo)記的HIV (對(duì)照)或用15-疊氮基十五烷酸(PALM)、12-疊氮基十二烷酸(MYR)、四乙?；腘-疊氮基乙酰基-D-甘露糖胺(MAN)或四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前?GAL)標(biāo)記的HIV的侵染性。圖5顯示了翻譯后修飾(PTM)類似物摻入對(duì)BacMam進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的能力的影響結(jié)果。小圖顯示了被PTM類似物標(biāo)記的BacMam病毒感染的U2-0S細(xì)胞的相(phase)(下一行小圖)和熒 光GFP圖像(上一行小圖)。定義除非另外定義，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。為了可以更容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。在詳細(xì)描述中闡述了其它定義。在沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。本文使用的“疊氮化物修飾的脂肪酸”表示這樣的脂肪酸:其包含疊氮基且具有下式R-N3，其中R包含具有至少一個(gè)羧酸官能團(tuán)的烴鏈，所述羧酸官能團(tuán)通常(盡管不一定)在末端位置。本文使用的“疊氮化物修飾的碳水化合物”表示這樣的碳水化合物:其包含疊氮基且具有下式R-N3，其中R是碳水化合物。本文使用的“疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)”表示含有異戊二烯的脂質(zhì)或其衍生物。所述疊氮化物修飾的類異戊二烯包含疊氮基且具有下式R-N3，其中R是含有異戊二烯的脂質(zhì)，諸如C15法呢基類異戊二烯脂質(zhì)或C2tl香葉基香葉基類異戊二烯脂質(zhì)或其衍生物，包括、但不限于疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。本文使用的“動(dòng)物病毒”表示感染非人動(dòng)物或人動(dòng)物細(xì)胞的病毒。非人動(dòng)物病毒會(huì)感染非人動(dòng)物細(xì)胞。在某些情況下，感染非人動(dòng)物細(xì)胞的病毒也能夠感染人動(dòng)物細(xì)胞。人動(dòng)物病毒會(huì)感染人動(dòng)物細(xì)胞。在某些情況下，感染人動(dòng)物細(xì)胞的病毒也能夠感染非人動(dòng)物細(xì)胞。本文使用的“生物分子”表示蛋白、肽、氨基酸、糖蛋白、核酸、核苷酸、核苷、寡核苷酸、糖、寡糖、脂質(zhì)、激素、蛋白聚糖、碳水化合物、多肽、多核苷酸、多糖，其具有在活生物體中發(fā)現(xiàn)的分子的典型特征，且可以是天然存在的，或可以是人工的(在自然界中不存在，且與在自然界中發(fā)現(xiàn)的分子不同)。本文使用的“點(diǎn)擊化學(xué)”表示，Huisgen環(huán)加成或者銅⑴催化的疊氮化物和末端炔烴之間的1，3_偶極環(huán)加成(以形成1，2，4_三唑)的變體。這樣的化學(xué)反應(yīng)可以使用、但不限于簡(jiǎn)單的雜原子有機(jī)反應(yīng)物，且是可靠的、選擇性的、立體特異性的和放熱的。本文使用的“環(huán)加成”表示這樣的化學(xué)反應(yīng):其中2個(gè)或更多個(gè)π (pi) -電子系統(tǒng)(例如，不飽和分子或相同分子的不飽和部分)結(jié)合以形成環(huán)狀產(chǎn)物，其中存在鍵多樣性的凈減少。在環(huán)加成中，π (pi)電子用于形成新的π (pi)鍵。環(huán)加成的產(chǎn)物稱作“加成化合物”或“環(huán)加成化合物”。不同類型的環(huán)加成是本領(lǐng)域已知的，包括、但不限于[3+2]環(huán)加成和Diels-Alder反應(yīng)。[3+2]環(huán)加成(其也稱作I，3-偶極環(huán)加成)發(fā)生在1，3_偶極和親偶極物之間，且通常用于構(gòu)建5元雜環(huán)。術(shù)語(yǔ)“[3+2]環(huán)加成”也包括由Bertozzi等人.J.Am.Chem.Soc.,2004,126 =15046-15047描述的疊氮化物和環(huán)辛炔和二氟環(huán)辛炔之間的“無(wú)銅”[3+2]環(huán)加成。本文使用的“DNA病毒”表示，具有脫氧核糖核酸(DNA)作為它的遺傳物質(zhì)的病毒。DNA病毒通常是雙鏈的，但是也可以是單鏈的。本文使用的“糖蛋白”表示，已經(jīng)被糖基化的蛋白，和已經(jīng)在體內(nèi)或在體外酶修飾成包含糖基的那些蛋白。本文使用的“HIV”和“人免疫缺陷病毒”表示人免疫缺陷病毒I和2(HIV_1和HIV-2)。本文使用的“侵染性”表示，病毒進(jìn)入或離開細(xì)胞的能力。本文使用的“昆蟲病毒”表示，感染昆蟲細(xì)胞的病毒。某些昆蟲病毒，例如，未修飾的桿狀病毒或修飾的桿狀病毒(BacMam)，還可以感染非人動(dòng)物和/或人動(dòng)物細(xì)胞。本文使用的“植物病毒” 表示，感染植物細(xì)胞的病毒。本文使用的“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括:與藥用相容的溶劑、分散介質(zhì)、稀釋齊U、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑等。這些試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的應(yīng)用是本領(lǐng)域眾所周知的。本文使用的“蛋白”和“多肽”在一般意義上用于包括，任意長(zhǎng)度的氨基酸殘基的聚合物。術(shù)語(yǔ)“肽”在本文中用于表示這樣的多肽:其具有小于100個(gè)氨基酸殘基，通常小于10個(gè)氨基酸殘基。該術(shù)語(yǔ)適用于這樣的氨基酸聚合物:其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物。本文使用的“報(bào)告物分子”表示，能夠與本發(fā)明的翻譯后修飾的蛋白連接并直接地或間接地檢測(cè)到的任意部分。報(bào)告物分子包括，但不限于:生色團(tuán)、熒光團(tuán)、熒光蛋白、磷光染料、串聯(lián)染料、a顆粒、半抗原、酶和放射性同位素。優(yōu)選的報(bào)告物分子包括熒光團(tuán)、熒光蛋白、半抗原和酶。本文使用的“RNA病毒”表示，具有核糖核酸(RNA)作為它的遺傳物質(zhì)的病毒。RNA病毒通常是單鏈的，但是也可以是雙鏈的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”意圖包括人和非人動(dòng)物、植物和昆蟲。受試者可以包括具有病毒感染(包括、但不限于HIV感染)的人患者。術(shù)語(yǔ)本發(fā)明的“非人動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，諸如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、牛、山羊、馬、雞、豬、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。本文使用的“治療”表示治療性或預(yù)防性措施。所述治療可以施用給具有病癥(在受試者是動(dòng)物的情況下，所述病癥可以包括、但不限于醫(yī)學(xué)病癥)或最終可能罹患病癥的受試者，以便預(yù)防、治愈、延遲、減輕病癥或復(fù)發(fā)性病癥的嚴(yán)重性和/或改善其一種或多種征狀，或以便延長(zhǎng)受試者的存活期超過在沒有這種治療存在下的預(yù)期值。本文使用的“治療有效量”或“有效量”是指這樣的化合物的量:當(dāng)為了治療疾病而施用給非人動(dòng)物或人動(dòng)物、植物、昆蟲或其它受試者時(shí)，其足以實(shí)現(xiàn)所述疾病的這種治療?！坝行Я俊睂㈦S化合物、疾病和它的嚴(yán)重性以及要治療的受試者的年齡、體重等而變化。必須指出，如在本說明書中和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另外指明。因而，例如，對(duì)“一種病毒”的提及包括多種病毒，除非上下文另外指明。盡管已經(jīng)參考本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案具體地顯示和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，可以在其中做出在形式和細(xì)節(jié)方面的不同變化，而不脫離由所附權(quán)利要求書包括的本發(fā)明的范圍。另外，所述材料、方法、和實(shí)施例僅僅是示例性的，無(wú)意是限制性的。在本文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)通過引用以它們的整體并入。
具體實(shí)施例方式本公開內(nèi)容涉及:疊氮化物修飾的生物分子(諸如脂肪酸或碳水化合物)用于治療病毒感染的用途，以及含有疊氮化物修飾的生物分子的藥物組合物。以前已經(jīng)將疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物和疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)描述為可用于標(biāo)記和檢測(cè)目標(biāo)蛋白的試劑，所述目標(biāo)蛋白作為點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的一部分，所述點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)包括銅(I)催化的疊氮化物和炔烴之間的環(huán)加成反應(yīng)。關(guān)于蛋白的代謝標(biāo)記試劑，參見CLJCK-FT 丨(Invitrogen, Carlsbad, CA);也參見:美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2007/0249014和美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20050222427，它們的公開內(nèi)容特此通過引用整體并入。但是，申請(qǐng)人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，這些疊氮化物修飾的生物分子具有抗病毒活性，且可以用于治療病毒感染。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，這些疊氮化物修飾的生物分子會(huì)深遠(yuǎn)地影響病毒侵染性，并且用這些疊氮化物修飾的生物分子標(biāo)記病毒會(huì)抑制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中。不希望受任何理論的約束，在通常被未修飾的生物分子(諸如飽和脂肪酸，例如肉豆蘧酸和棕櫚酸)占據(jù)的位點(diǎn)處用疊氮基修飾的生物分子對(duì)病毒蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，似乎可以導(dǎo)致病毒侵染性的抑制，所述抑制的方式類似于這些生物分子在這些位點(diǎn)處不存在。點(diǎn)擊化學(xué)疊氮化物和末端或內(nèi)部炔烴可以發(fā)生1，3_偶極環(huán)加成(Huisgen環(huán)加成)反應(yīng)以生成1，2，3_三唑。但是 ，該反應(yīng)需要長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間和高溫。可替換地，疊氮化物和末端炔烴可以在室溫發(fā)生銅(I)催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成(CuAAC)。這樣的銅(I)催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成(也稱作點(diǎn)擊化學(xué))是Huisgenl，3-偶極環(huán)加成的變體，其中有機(jī)疊氮化物和末端炔烴反應(yīng)以生成1，2，3-三唑的I，4-位置異構(gòu)體。Sharpless等人描述了點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的實(shí)例(美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20050222427，PCT/US03/17311 ;Lewis W G，等人，Angewandte Chemie-1nt1 I Ed.41 (6): 1053 ;在 Kolb, H.C.,等人，Angew.Chem.1nst.Ed.2001,40 =2004-2021中綜述的方法)，其開發(fā)了以高收率且以在雜原子連接(與碳-碳鍵相反)中的極少副反應(yīng)彼此反應(yīng)的試劑，以便建立化學(xué)化合物的文庫(kù)。點(diǎn)擊化學(xué)已經(jīng)用于標(biāo)記和檢測(cè)目標(biāo)蛋白。例如，C;LIC:K-1TK| (Invitrogen,Carlsbad, CA)反應(yīng)是一種兩步標(biāo)記技術(shù)，其包括:將修飾的代謝前體(諸如疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì))摻入蛋白中作為化學(xué)“手柄”，隨后進(jìn)行疊氮化物和炔烴之間的化學(xué)選擇性連接(或“點(diǎn)擊”反應(yīng))。在點(diǎn)擊反應(yīng)中，用對(duì)應(yīng)的含有疊氮化物或炔烴的染料或半抗原檢測(cè)經(jīng)修飾的蛋白。CLICK-1T 代謝標(biāo)記試劑已經(jīng)用于監(jiān)測(cè)蛋白的翻譯后修飾，諸如?；⑻腔彤愇於┗?，且包括:1)疊氮化物修飾的脂肪酸，諸如CLIGK-1T ,棕櫚酸疊氮化物(即，15-疊氮基十五烷酸)和G:LIGK；_rr 肉豆蘧酸疊氮化物(即，12-疊氮基十二烷酸)，它們分別用于標(biāo)記棕櫚?；暮腿舛罐觉；牡鞍?；2)疊氮化物修飾的碳水化合物，包括用于標(biāo)記O-連接的糖蛋白的CUCK-1TliGaINAz (四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前?，用于標(biāo)記唾液酸修飾的糖蛋白的(四乙?；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺)，和用于標(biāo)記O-GlcNAz修飾的糖蛋白的CLICK-1T GlcNAz (四乙酰化的N-疊氮基乙?；咸前?；和3)疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)，諸如clicut 法呢醇疊氮化物和CLIGK-1Tk香葉基香葉醇疊氮化物。如上面所指出的，申請(qǐng)人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，這些疊氮化物修飾的生物分子具有抗病毒活性，且可以用于治療病毒感染。糖基化糖基化是一個(gè)酶促的過程，其中碳水化合物與細(xì)胞中的蛋白、脂質(zhì)或其它有機(jī)分子連接。糖蛋白是由與碳水化合物共價(jià)連接的蛋白組成的生物分子。某些翻譯后修飾會(huì)在蛋白上添加糖部分(碳水化合物)，從而形成糖蛋白。在糖蛋白中發(fā)現(xiàn)的常見單糖包括，但不限于:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、N-乙?；肴樘前?GalNAc)、N-乙?；咸前?GlcNAc)和N-乙?；窠?jīng)氨酸(NANA，也稱作唾液酸)。N-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc)是神經(jīng)氨酸(包括NANA)的前體。2個(gè)相同或不同的單糖可以連接到一起形成二糖。更多個(gè)單糖的添加會(huì)導(dǎo)致遞增長(zhǎng)度的寡糖的形成。另外，所述糖部分可以是糖基。在糖蛋白中，碳水化合物可以通過N-糖基化或O-糖基化與蛋白組分連接。N-糖基化通常通過在天冬酰胺或精氨酸側(cè)鏈上的氮而發(fā)生，從而形成經(jīng)由酰胺基的N-糖苷鍵。O-糖基化通常發(fā)生在羥基賴氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈的羥基氧處，從而形成O-糖苷鍵。GalNAc和GlcNAc都是O-連接的碳水化合物。唾液酸存在于N-和O-連接的碳水化合物上。蛋白糖基化是最豐富的翻譯后修飾之一，并在生物系統(tǒng)的控制中起重要作用。例如，糖基化會(huì) 影響蛋白折疊，且可以幫助穩(wěn)定蛋白和防止它們的降解。糖基化也可以影響蛋白的與其它分子結(jié)合的能力，并介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的信號(hào)傳遞途徑。例如，碳水化合物修飾對(duì)于宿主-病原體相互作用、炎癥、發(fā)育和惡性腫瘤而言是重要的(Varki，A.Glycobiology 1993, 3, 97-130 ;Lasky, L.A.Annu.Rev.Biochem.1995,64,113-139.(c)Capila, 1.；Linhardt, R.J.Angew.Chem.，Int.Ed.2002,41, 391-412 ；Rudd, P.M.；Elliott,T.；Cresswell, P.；ffilson, 1.A.；Dwek, R.A.Science2001，291，2370-2376)。一種這樣的共價(jià)修飾是Ο-GlcNAc糖基化，它是D-N-乙?；咸前穼?duì)絲氨酸和蘇氨酸殘基的共價(jià)修飾(Wells, L.；Vosseller, K.；Hart, G.ff.Science2001, 291, 2376-2378 ；Zachara, N.E.；Hart,G.ff.Chem.Rev.2002，102,431)。O-GlcNAc修飾存在于從秀麗隱桿線蟲至人類的所有高等真核生物體中，且已經(jīng)被證實(shí)是普遍存在的、可誘導(dǎo)的和高動(dòng)態(tài)的，從而提示與磷酸化類似的調(diào)節(jié)作用。脂肪酸?；舅狨；且粋€(gè)酶促過程，其中脂肪酸與細(xì)胞中的蛋白連接。該過程可以影響蛋白的功能以及它的細(xì)胞定位，且是細(xì)胞和病毒起源的蛋白所共有的(Towler等人，ProcNatl Acad Sci USA1986，83:2812-16)。肉豆蘧酸和棕櫚酸是與蛋白連接的2種最常見的脂肪酸(Olson等人，J Biol Chem 261(5):2458-66)。一般而言，肉豆蘧酸經(jīng)由酰胺鍵連接至可溶性蛋白和膜蛋白的氨基端甘氨酸(其在N-蛋氨酸殘基除去過程中暴露)，盡管它還可以連接其它氨基酸。肉豆蘧?；€可以發(fā)生在翻譯后，例如，當(dāng)?shù)鞍酌盖懈疃嚯牟⒈┞陡拾彼釟埢鶗r(shí)。棕櫚酸經(jīng)由酯鍵或硫代酸酯鍵與膜蛋白連接。肉豆蘧?；妥貦磅；坪踉诘鞍自谀じ羰抑g的亞細(xì)胞運(yùn)輸中以及在調(diào)控蛋白-蛋白相互作用中起重要作用。
脂肪酸具有2個(gè)不同的區(qū)域:長(zhǎng)的疏水烴鏈和羧酸基團(tuán)，所述羧酸基團(tuán)通常在溶液中離子化(C00-)，是極端親水的，且容易形成酯和酰胺。天然的脂肪酸通常具有4-28個(gè)碳的鏈(通常是直鏈的，甚至是有限的)，且可以是飽和的或不飽和的。飽和的脂肪酸在烴鏈中不含有雙鍵，包括月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸。不飽和的脂肪酸在烴鏈中含有至少一個(gè)雙鍵，包括肉豆蘧烯酸、棕櫚油酸、十六碳烯-6-酸、油酸、亞油酸、α -亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。
異戊二烯基化
蛋白異戊二烯基化包括類異戊二烯脂質(zhì)(諸如法呢基或香葉基-香葉基部分)與革巴蛋白的 C-端半胱氨酸的連接(McTaggert，Cell Mol Life Sci 2006，63:255-67)。這些反應(yīng)由法呢基轉(zhuǎn)移酶、香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶和Rab香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶催化(Magee和Seabra, Bioch em J 2003, 376:e3_4)。由于類異戍二烯脂質(zhì)的疏水性,大多數(shù)異戍二烯基化的蛋白與膜結(jié)合。大多數(shù)法呢基化的蛋白參與細(xì)胞信號(hào)傳遞(其中膜結(jié)合對(duì)于功能而言是重要的)。對(duì)于通過專門的異戊二烯基結(jié)合域介導(dǎo)蛋白-蛋白結(jié)合而言，類異戊二烯脂質(zhì)也是重要的。
在病毒中的翻譯后修飾
許多病毒蛋白被翻譯后修飾(包括、但不限于糖基化、?；彤愇於┗?廣泛地修飾。在許多情況下，病毒感染宿主細(xì)胞和/或逃避免疫系統(tǒng)需要這些翻譯后修飾。翻譯后修飾在病毒學(xué)中是特別重要的，因?yàn)椋话愣?，病毒基因組是較小的，因而存在增強(qiáng)的編碼節(jié)儉的壓力。通過利用宿主的翻譯后機(jī)制，病毒可以開發(fā)出多條途徑并用最小的基因組發(fā)揮作用，因?yàn)閱蝹€(gè)翻譯后修飾可以改變蛋白的功能或細(xì)胞的位置。
例如，在HIV和猴免疫缺陷病毒(SIV)中，糖基化在侵染循環(huán)的多個(gè)階段中起重要作用。在感染過程中，病毒糖蛋白會(huì)影響病毒蛋白gpl20和gp41與宿主細(xì)胞CD4受體和CXCR4和CCR5共受體的結(jié)合(Chen等人，Virus Res2001, 79:91-101)。糖基化負(fù)責(zé)gpl60 (gpl20 和gp41的前體)的適當(dāng)折疊和加工(Land等人，Biochimie 2001,83:783-90)，且可以增強(qiáng)HIV和SIV與不同細(xì)胞類型(包括樹突細(xì)胞)的相互作用(Gei jtenbeek 等人，Curr Top Microbiol Immuno12003, 276:31-54) gpl20 在 HIV 生物學(xué)中的正常作用是，經(jīng)由在靶細(xì)胞上表達(dá)的⑶4受體和CXCR4和CCR5共受體，啟動(dòng)病毒與細(xì)胞的結(jié)合。當(dāng)gpl20結(jié)合CD4時(shí)，在gpl20中發(fā)生構(gòu)象變化，所述構(gòu)象變化會(huì)暴露出共受體結(jié)合位點(diǎn)，并觸發(fā)gp41中的構(gòu)象變化。在gp41中的構(gòu)象變化又會(huì)暴露出在gp41中的融合肽，所述融合肽介導(dǎo)病毒包膜和靶細(xì)胞之間的融合(Chen等人，Virus Res 2001,79:91-101)。在gpl20中的單個(gè)殘基(N197)處的一種碳水化合物的變化，會(huì)將病毒嗜性從CD4嗜性徹底改變成不依賴于CD4 (Kolchinksy等人，J Virol 2001,75:3435-43)。改變高甘露糖相對(duì)于在gpl20中存在的復(fù)雜型碳水化合物(含有唾液酸)的總比例，會(huì)影響病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合程度(Fenouillet等人，J Gen Virol 1991，1919-26)。在感染以后，包膜前體蛋白(gpl60)切割成gpl20和gp41需要糖基化。在從被感染的細(xì)胞釋放病毒以后，糖基化對(duì)于免疫逃避而言也是重要的，因?yàn)榘ぬ腔淖兓瘯?huì)顯著地改變針對(duì)病毒的體液免疫應(yīng)答(Kwong 等人，Nature2002,420:678-82 ；Shi 等人，J Gen Virol2005,86:3385-96)。
病毒蛋白的?；瘜?duì)于HIV生物學(xué)而言也是重要的。HIV芽殖是一個(gè)復(fù)雜的過程，其包括許多細(xì)胞蛋白和病毒蛋白的協(xié)調(diào)(Resh Trends Microbiol 2001,9:57 ；Freed, JVirol 2002,76:4679-87)。HIV芽殖指向在膜筏中富含的質(zhì)膜區(qū)域(Lindwasser等人，JVirol 2001，75:7913-24 ;Nguyen 等人，J Virol 2000，74:3264-72 ;0no 等人，Proc NatlAcad Sci USA 2001，98:13925-30 ;Hermida-Matsumoto 等人，J Virol 2000，74:8670-79)，所述膜筏以前被稱作脂質(zhì)筏(Pike等人，JLipid Res2006,47:1597-98)，所述HIV芽殖通過衣殼蛋白多聚蛋白前體(pr55gag)的N-端甘氨酸的肉豆蘧?；瘜?shí)現(xiàn)(Lindwasser等人，JVirol 2001，75:7913-24 ;Nguyen 等人，J Virol 2000，74:3264-72 ;0no 等人，Proc NatlAcad Sci USA 2001，98:13925-30)。gpl20 蛋白通過棕櫚?；赶蚰し?Yang 等人，ProcNatl Acad Sci USA 1995，92:9871-75)。膜筏在幾種細(xì)胞過程(包括胞吞、囊泡運(yùn)輸、膽固醇分選、細(xì)胞凋亡和通過T細(xì)胞受體的信號(hào)傳遞)中起重要作用(Jordan等人，JImmunol2003，171:78-87 ；Viola 等人，Apmis 1999，107:615-23 ；Viola 等人，Science 1999，283:680-82 ;Bezomb es 等人，Curr Med Chem Ant1-Canc Agents 2002,3:263-70 ；Kabouridis等人，Eur J Immunol2000，30:954-63)。HIV蛋白向這些區(qū)域的指向，可以允許病毒粒子更有效地劫持這些途徑，因而可能可能解釋與AIDS的疾病進(jìn)展有關(guān)的復(fù)雜致病性。實(shí)際上，從HIV顆粒除去膽固醇(一種重要的膜筏組分)，會(huì)通過至少2個(gè)機(jī)理導(dǎo)致滅活:喪失與靶細(xì)胞融合的能力，和喪失病毒粒子完整性(導(dǎo)致病毒的透化)(Guyader等人，J Virol2002.76:10356-64 ；Campbe11 等人，J Virol 2004,78:10556-65 ；Viard 等人，J Virol2002.76:11584-595 ； Campbe 11 等人，Aids 2002，16:2253-61 ;Liao 等人，AIDS Res HumRetroviruses 2003，19:675-87 ;Graham 等人，J Vorol 2003,77:8237-48)
病毒還可以使用宿主細(xì)胞機(jī)制，通過添加類異戊二烯脂質(zhì)(諸如法呢基和香葉基香葉基)來(lái)修飾病毒蛋白。例如，異戊二烯基化在δ肝炎病毒(HDV)的生命周期中起重要作用，所述δ肝炎病毒是與乙型肝炎病毒有關(guān)的急性和慢性肝病的病原體(Einav和 Glenn, JAntimicrobial Chemotherapy 2003,52:883-86)。HDV 蛋白之一(大 δ 抗原(LHDAg))對(duì)于病毒裝配而言是關(guān)鍵性的，并且在體外翻譯系統(tǒng)中和在完整細(xì)胞中發(fā)生法呢基化(Einav 和 Glenn, J Antimicrobial Chemotherapy 2003,52:883-86)。通過使用法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑抑制異戊二烯基化，會(huì)阻止HDV裝配，并清除HDV的小鼠模型中的HDV病毒血癥,從而強(qiáng)調(diào)了異戊二烯基化在某些病毒的生命周期中的重要性(Einav和Glenn，JAntimicrobial Chemotherapy 2003,52:883-86)。
與HIV、SIV和HDV類似，其它病毒依賴于病毒蛋白的翻譯后修飾來(lái)介導(dǎo)向宿主細(xì)胞中的進(jìn)入和/或逃避宿主免疫系統(tǒng)。因而，預(yù)期本文所述的疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物和疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)具有廣譜抗病毒活性(諸如如下調(diào)控活性:通過抑制或阻止HIV病毒基因組的反轉(zhuǎn)錄、在新病毒粒子的最終裝配之前某些病毒蛋白的晚期加工、或病毒向細(xì)胞中的進(jìn)入)，且可以用于治療多種病毒感染。
使用方法
1.治療病毒感染的方法
本公開內(nèi)容提供了一種治療被病毒感染的植物、昆蟲或動(dòng)物的方法，所述方法包括:給所述植物、昆蟲或動(dòng)物施用有效量的疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是飽和脂肪酸，諸如15-疊氮基十五烷酸或12-疊氮基十二烷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-疊氮基乙?；肴樘前贰-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或N-疊氮基乙?；咸前?。所述疊氮化物修飾的碳水化合物任選地包含促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞中的部分，包括、但不限于四乙酰基部分。因而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙酰化的N-疊氮基乙?；肴樘前贰⑺囊阴；腘-疊氮基乙酰基-D-甘露糖胺或四乙?；腘-疊氮基乙?；咸前?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基，且包括、但不限于:疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。
所述病毒可以是植物病毒、昆蟲病毒或動(dòng)物病毒。在某些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是人，所述病毒是人病毒，諸如腺病毒、星狀病毒、嗜肝性DNA病毒、皰疹病毒、乳多泡病毒、痘病毒、沙粒病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、冠狀病毒、纖絲病毒、黃病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、里奧病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒或披膜病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是人，所述病毒是人免疫缺陷病毒。優(yōu)選地，所述人免疫缺陷病毒是HIV-1。
使用本領(lǐng)域已知的多種測(cè)定中的任一種，可以確定所述疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)是否可有效地治療病毒感染。例如，現(xiàn)有的病毒感染的動(dòng)物模型或體外模型可以用于確定給定的化合物是否可有效地減少病毒載量。就HIV而言,作為實(shí)例,在實(shí)施例2中描述的體外螢光素酶報(bào)告物測(cè)定可以用于測(cè)量疊氮化物修飾的化合物的效力。在人受試者中，通過測(cè)量病毒載量和/或測(cè)量病毒感染的一種或多種征狀，可以確定化合物的效力。通過測(cè)量血清中的病毒的滴度或水平，可以測(cè)量病毒載量。這些方法包括，但不限于定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和分支DNA(bDNA)試驗(yàn)。
2.抑制病毒侵染性的方法
還提供了抑制病毒侵染性的方法，所述方法包括:使被病毒感染的細(xì)胞接觸有效地抑制病毒侵染性的量的疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是飽和脂肪酸，諸如15-疊氮基十五烷酸或12-疊氮基十二烷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-疊氮基乙?；肴樘前?、N-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或N-疊氮基乙?；咸前?。所述疊氮化物修飾的碳水化合物任選地包含促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞中的部分，包括、但不限于四乙?；糠?。因而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前?、四乙?；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或四乙?；腘-疊氮基乙酰基葡糖胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基，且包括、但不限于:疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或 疊氮基香葉基香葉醇。
所述病毒可以是植物病毒、昆蟲病毒或動(dòng)物病毒。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞，所述病毒是人病毒，諸如腺病毒、星狀病毒、嗜肝性DNA病毒、皰疹病毒、乳多泡病毒、痘病毒、沙粒病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、冠狀病毒、纖絲病毒、黃病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、里奧病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒或披膜病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是人，所述病毒是人免疫缺陷病毒。優(yōu)選地，所述人免疫缺陷病毒是HIV-1。
使用本領(lǐng)域已知的多種測(cè)定(包括報(bào)道基因測(cè)定，諸如在實(shí)施例2中描述的螢光素酶測(cè)定)中的任一種，可以確定所述疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)是否可有效地抑制病毒侵染性。
3.標(biāo)記病毒蛋白的方法
疊氮化物修飾的脂肪酸還可以用于標(biāo)記病毒蛋白，所述病毒蛋白通過翻譯后?；?包括、但不限于棕櫚?；腿舛罐觉；?被脂質(zhì)修飾。在這樣的翻譯后修飾中，疊氮化物修飾的脂肪酸被用于標(biāo)記病毒蛋白。如果需要的話，使用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可以使疊氮化物標(biāo)記的病毒蛋白與炔烴標(biāo)記的報(bào)告物分子偶聯(lián)，以允許檢測(cè)疊氮化物標(biāo)記的病毒蛋白。
類似地，疊氮化物修飾的碳水化合物可以用于標(biāo)記病毒蛋白，所述病毒蛋白通過翻譯后糖基化(包括、但不限于N-連接的糖基化和O-連接的糖基化)被碳水化合物修飾。在這樣的翻譯后修飾中，疊氮化物修飾的碳水化合物被用于標(biāo)記病毒蛋白。如果需要的話，使用點(diǎn)擊化學(xué)，可以使疊氮化物標(biāo)記的病毒蛋白與炔烴標(biāo)記的報(bào)告物分子偶聯(lián)，以允許檢測(cè)置氣化物標(biāo)記的病毒蛋白。
疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)同樣可以用于標(biāo)記病毒蛋白，所述病毒蛋白通過翻譯后異戊二烯基化(包括、但不限于法呢基化和香葉基香葉基化)被脂質(zhì)修飾。在這樣的翻譯后修飾中，疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)被用于標(biāo)記病毒蛋白。如果需要的話，使用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可以使疊氮化物標(biāo)記的病毒蛋白與炔烴標(biāo)記的報(bào)告物分子偶聯(lián)，以允許檢測(cè)置氣化物標(biāo)記的病毒蛋白。
如上所述標(biāo)記的任意病毒可以與炔烴標(biāo)記的報(bào)告物分子或載體分子偶聯(lián)。術(shù)語(yǔ)“炔烴”包括、但不限于末端炔烴和內(nèi)部炔烴，例如，由Agard等人，J.Am.Chem.Soc.,2004,126(46):15046-15047 描述的環(huán)辛炔和二氟環(huán)辛炔，由 Boon 等人，W02009/067663Al (2009)描述的二苯并環(huán)辛炔，和由Debets等人，Chem.Comm.，2010，46:97-99描述的氮雜二苯并環(huán)辛炔。在本文所述的方法和組合物中使用的報(bào)告物分子可以含有、但不限于:生色團(tuán)、熒光團(tuán)、熒光蛋白、磷光染料、串聯(lián)染料、納米晶體顆粒、半抗原、酶和放射性同位素。在某些實(shí)施方案中，這樣的報(bào)告物分子包括熒光團(tuán)、熒光蛋白、半抗原和酶。
疊氮化物標(biāo)記的病 毒可以用于在體內(nèi)跟蹤病毒侵染性，其中使用被疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)標(biāo)記的病毒來(lái)感染培養(yǎng)的細(xì)胞或受試者?？梢愿腥炯?xì)胞一段時(shí)間，然后固定，滲透化處理，并用熒光炔烴染料點(diǎn)擊標(biāo)記(click-labeled)?？梢允篃晒獠《绢w粒的細(xì)胞內(nèi)定位(或在時(shí)程內(nèi)的運(yùn)輸)顯影，例如，通過顯微術(shù)。類似地，可以用疊氮化物標(biāo)記的病毒處理小動(dòng)物，并用于跟蹤在不同組織中的病毒生物利用度，包括通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)和細(xì)胞/組織切片顯微術(shù)檢測(cè)在循環(huán)的白血細(xì)胞中的病毒。在有些實(shí)施方案中，在體內(nèi)跟蹤病毒的方法包括下述步驟:使培養(yǎng)的細(xì)胞或受試者接觸疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽；使所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者接觸炔烴標(biāo)記的報(bào)告物分子；和在所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者中跟蹤報(bào)告物標(biāo)記的病毒。在有些實(shí)施方案中，在體內(nèi)跟蹤病毒的方法包括下述步驟:使培養(yǎng)的細(xì)胞或受試者接觸疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽；使所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者接觸炔烴標(biāo)記的報(bào)告物分子；和在所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者中跟蹤報(bào)告物標(biāo)記的病毒。
因而，本公開內(nèi)容的另一個(gè)方面涉及一種生產(chǎn)被疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)標(biāo)記的人免疫缺陷病毒的方法，所述方法包括:使被所述人免疫缺陷病毒感染的細(xì)胞接觸所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)，使得所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)進(jìn)入所述細(xì)胞中并摻入所述病毒的蛋白中，由此生成被標(biāo)記的病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是飽和脂肪酸，諸如15-疊氮基十五烷酸或12-疊氮基十二烷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-疊氮基乙?；肴樘前?、N-疊氮基乙酰基-D-甘露糖胺或N-疊氮基乙?；咸前贰Ｔ诹硪粋€(gè)實(shí)施方案中，所述類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基，且包括、但不限于:疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。所述疊氮化物修飾的碳水化合物任選地包含促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞中的部分，包括、但不限于四乙酰基部分。因而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前贰⑺囊阴；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或四乙酰化的N-疊氮基乙?；咸前?。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
病毒
所述疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)優(yōu)選地靶向大多數(shù)病毒共有的翻譯后修飾，并因而代表一類新的抗病毒劑，其具有針對(duì)廣譜病毒的抗病毒活性潛力。大體而言，這些化合物可以用于治療被任意病毒感染的植物、昆蟲或動(dòng)物。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是植物病毒。在有些實(shí)施方案中，所述病毒是昆蟲病毒。在其它實(shí)施方案中，所述病毒是動(dòng)物病毒。在其它實(shí)施方案中，所述病毒是人病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒是感染非人哺乳動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物家畜動(dòng)物，包括、但不限于牛、馬、豬、山羊或綿羊)的病毒。
在其它實(shí)施方案中，所述病毒是DNA病毒。DNA病毒包括、但不限于屬于下述家族的病毒:腺病毒、星狀病毒、嗜肝性DNA病毒、皰疫病毒、乳多泡病毒和痘病毒。在其它實(shí)施方案中，所述病毒是RNA病毒 。RNA病毒包括、但不限于屬于下述家族的病毒:沙粒病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、冠狀病毒、纖絲病毒、黃病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、里奧病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒和披膜病毒。
1.非人動(dòng)物病毒
在指向在非人動(dòng)物中治療病毒感染或抑制病毒侵染性的方法中，所述動(dòng)物病毒優(yōu)選地選自:小RNA病毒屬，諸如牛腸道病毒、豬腸道病毒B、口蹄疫病毒、馬鼻炎A病毒、牛鼻炎B病毒、Ijungan病毒、馬鼻炎B病毒、愛知病毒、牛嵴病毒、豬捷申病毒、豬扎幌病毒、猴扎幌病毒、禽扎幌病毒、禽腦脊髓炎病毒、鴨甲型肝炎病毒或猴腸道病毒A ;瘟病毒屬，諸如邊緣病病毒、牛病毒性腹瀉病毒或古典豬瘟病毒；動(dòng)脈病毒屬，諸如馬動(dòng)脈炎病毒、豬生殖和呼吸綜合征病毒、乳酸脫氫酶活性病毒或猴出血熱病毒；冠狀病毒屬，諸如牛冠狀病毒、豬冠狀病毒、貓冠狀病毒或犬冠狀病毒；副粘病毒屬，諸如亨德拉病毒、尼帕病毒、犬痕熱病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒和牛呼吸道合胞體病毒；正粘病毒屬，諸如流感A病毒、流感B病毒或流感C病毒；里奧病毒屬，諸如藍(lán)舌病毒；豬圓環(huán)病毒、皰疹病毒屬，諸如假性狂犬病病毒或牛皰疫病毒I型；非洲豬痕病病毒屬，諸如非洲豬痕病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，諸如猴免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、貓白血病病毒、綿羊肺腺瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒或山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒；黃病毒屬，諸如黃熱病病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒、蝶傳腦炎病毒或牛病毒性腹瀉病毒；或彈狀病毒屬，諸如狂犬病病毒。
2.人動(dòng)物病毒
在指向在人類中治療病毒感染或抑制病毒侵染性的方法中，所述人病毒優(yōu)選地選自:腺病毒、星狀病毒、嗜肝性DNA病毒、皰疫病毒、乳多泡病毒、痘病毒、沙粒病毒、布尼亞病毒、杯狀病毒、冠狀病毒、纖絲病毒、黃病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、里奧病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、彈狀病毒或披膜病毒。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腺病毒包括、但不限于人腺病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述星狀病毒包括、但不限于哺乳動(dòng)物星狀病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述嗜肝性DNA病毒包括、但不限于乙型肝炎病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述皰疹病毒包括、但不限于單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒2型、人巨細(xì)胞病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、水痘帶狀皰疹病毒、薔薇疹病毒和卡波西肉瘤-相關(guān)的皰疹病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述乳多泡病毒包括、但不限于人乳頭瘤病毒和人多瘤病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述痘病毒包括、但不限于天花病毒(variola virus)、痘苗病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、天花病毒(smallpoxvirus)、假牛痘病毒、丘疹狀口炎·病毒、塔納痘病毒、雅巴猴瘤病毒和傳染性軟疣病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述沙?！げ《景?、但不限于淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、拉沙病毒、machupo病毒和胡寧病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述布尼亞病毒包括、但不限于漢他病毒、內(nèi)羅畢病毒、正布尼亞病毒和白蛉病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述杯狀病毒包括、但不限于囊病毒、諾羅病毒，諸如諾沃克病毒和扎幌病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述冠狀病毒包括、但不限于人冠狀病毒(嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)的病原體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述纖絲病毒包括、但不限于埃波拉病毒和馬爾堡病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述黃病毒包括、但不限于黃熱病病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒、丙型肝炎病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒、墨累河谷腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、俄羅斯春夏腦炎病毒、鄂木斯克出血熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒、科薩努爾森林病病毒和波瓦生腦炎病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述正粘病毒包括、但不限于流感病毒A型、流感病毒B型和流感病毒C型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述副粘病毒包括、但不限于副流感病毒、腮腺炎病毒(腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、肺病毒，諸如人呼吸道合胞體病毒和亞急性硬化性全腦炎病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述小RNA病毒包括、但不限于脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒A型、柯薩奇病毒B型、甲型肝炎病毒、?？刹《竞湍c道病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述里奧病毒包括、但不限于科羅拉多蜱傳熱病毒和輪狀病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包括、但不限于慢病毒，諸如人免疫缺陷病毒和人T細(xì)胞淋巴營(yíng)養(yǎng)病毒(HTLV)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述彈狀病毒包括、但不限于狂犬病病毒(Iyssavirus),諸如狂犬病病毒(rabies virus)、水皰性口炎病毒和傳染性造血壞死病毒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述披膜病毒包括、但不限于甲病毒，諸如羅斯河病毒、奧絨絨病毒、Sindbis病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒和西方馬腦炎病毒和風(fēng)疫病毒。
3.植物病毒
在指向在植物中治療病毒感染或抑制病毒侵染性的方法中，所述植物病毒選自:苜蓿花葉病毒、青蔥病毒、α潛隱病毒、禽副黏液病毒、蘋果北美疤類病毒、金病毒、燕麥病毒、鱷梨白斑類病毒、桿狀DNA病毒、菜豆金色花葉病毒、甜菜壞死黃脈病毒、β潛隱病毒、β彎曲病毒科、雀麥花葉病毒、大麥黃化花葉病毒、毛狀病毒、石竹隱潛病毒、磨香石竹斑駁病毒、花椰菜花葉病毒、木薯葉脈鑲嵌樣病毒、櫻桃銼葉病毒、線形病毒、椰子死亡類病毒、錦紫蘇類病毒、豇豆花葉病毒、線性病毒、黃瓜花葉病毒、植物昆蟲病毒、質(zhì)型彈狀病毒、香石竹病毒、碗豆耳突花葉病毒、傘形植物病毒和B-型衛(wèi)星病毒、蠶豆病毒、斐濟(jì)病毒、真菌傳桿狀病毒、大麥病毒、啤酒花矮化類病毒、懸鉤子病毒、等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒、甘薯病毒、黃矮病毒、玉米褪綠斑駁病毒、橙?；ㄈ~病毒、玉米雷亞多非納病毒、玉米線條病毒、納米病毒、壞死病毒、蠕傳多角體病毒、核型彈狀病毒、油橄欖病毒、柑橘鱗皮病毒、水稻病毒、帕尼科病毒、花生叢簇病毒、牽?；ㄈ~脈透明樣病毒、植物呼腸病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯病毒、馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、里奧病毒、彈狀病毒、黑麥草花葉病毒、溫州蜜柑矮縮病毒、SbCMV-樣病毒、伴生病毒、南方菜豆花葉病毒、纖細(xì)病毒、TNsatV-樣衛(wèi)星病毒、煙草花葉病毒、番爺假曲頂病毒、蕃爺斑萎病毒、蘋果退綠葉斑病毒、小麥花葉病毒、水稻衰退桿狀樣病毒、蕪菁黃花葉病毒、傘形植物病毒、巨脈病毒、葡萄屬病毒或矮化病毒。
4.昆蟲病毒
在指向標(biāo)記昆蟲病毒、治療昆蟲病毒感染或抑制昆蟲病毒侵染性的方法中，所述昆蟲病毒優(yōu)選地選自:濃核病毒屬，諸如鹿眼蛺蝶濃核病毒、家蠶濃核病毒、埃及伊蚊濃核病毒或黑胸大蠊?jié)夂瞬《荆缓绮什《緦?，諸如虹彩病毒6型；綠色虹彩病毒屬,桿狀病毒屬，諸如核型多角體病毒或粒狀病毒；多DNA病毒屬，諸如a姬蜂病毒或繭蜂病毒；昆蟲痘病毒屬，諸如昆蟲痘病毒A屬、昆蟲痘病毒B屬或昆蟲痘病毒C屬；囊泡病毒屬,諸如草地貪夜蛾囊泡病毒Ia型、粉紋夜 蛾囊泡病毒2a型或美雙緣姬蜂囊泡病毒4a型；昆蟲小RNA病毒屬，諸如蜜蜂急性麻痹病毒、果蠅P、C或A病毒、蜜蜂X病毒或蠶軟化病病毒；杯狀病毒屬；野田村病毒屬，諸如黑蟑螂病毒、禽獸棚病毒、野田村病毒、pariacoto病毒或舞毒蛾病毒。
疊氮化物修飾的生物分子
本文所述的疊氮化物修飾的生物分子代表一類新的抗病毒劑。在某些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的生物分子是碳水化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物或前體藥物。所述碳水化合物可以選自商購(gòu)可得的和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛已知的多種碳水化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇會(huì)阻止、抑制和/或延遲細(xì)胞的病毒感染的碳水化合物。優(yōu)選地，所述碳水化合物是天然存在的。應(yīng)當(dāng)理解，可以修飾所述含有疊氮化物的碳水化合物(無(wú)論是否是天然存在的)，例如，通過短鏈烷基化諸如甲基化或乙?；Ⅴセ?、以及其它維持抗病毒活性的衍生化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述碳水化合物是，通過在細(xì)胞中的糖基化反應(yīng)與蛋白直接地或間接地連接的碳水化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述碳水化合物是N-疊氮基乙酰基半乳糖胺、N-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或N-疊氮基乙?；咸前贰?br> 在某些實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物含有促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞中的部分，包括、但不限于四乙酰基部分。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙酰化形式的N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙?；腘-疊氮基乙酰基半乳糖胺、四乙酰化的N-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或四乙?；腘-疊氮基乙酰基葡糖胺。
在其它實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的生物分子是脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的衍生物或前體藥物。所述脂肪酸可以選自商購(gòu)可得的和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛已知的多種脂肪酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇會(huì)阻止、抑制和/或延遲細(xì)胞的病毒感染的脂肪酸。優(yōu)選地，所述脂肪酸是天然存在的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂肪酸是飽和的或不飽和的，且具有含偶數(shù)個(gè)碳原子(諸如4-24個(gè)碳原子)的烴鏈。合適的不飽和的游離脂肪酸具有含14-24個(gè)碳原子的烴鏈，且包括棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α和Y亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十四碳烯酸。合適的飽和脂肪酸具有含4-18個(gè)碳原子的烴鏈，且優(yōu)選地選自丁酸或異丁酸、琥珀酸、己酸、己二酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸和花生酸。應(yīng)當(dāng)理解，可以通過化學(xué)取代來(lái)修飾含有疊氮化物的脂肪酸(無(wú)論是否是天然存在的)，所述化學(xué)取代包括、但不限于短鏈烷基化諸如甲基化或乙?；?、酯化、以及其它維持抗病毒活性的衍生化。另外，可能用炔烴、酮或其它小分子(其已經(jīng)被證實(shí)是代謝上相容的)替代所述疊氮化物修飾的生物分子中的脂肪酸。
在有些實(shí)施方案中，疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽具有下式:Y-CH2-X-CO2H,其中，Y是H或疊氮基；且當(dāng)Y是疊氮基時(shí)，X是包含6_28個(gè)碳的直鏈或支鏈碳鏈，其中所述碳中的一個(gè)或多個(gè)可以獨(dú)立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此鄰接的一對(duì)或多對(duì)可以通過雙鍵或三鍵彼此連接；或者當(dāng)Y是H時(shí)，X是包含6-28個(gè)碳的直鏈或支鏈碳鏈,其中在所述碳之一上的一個(gè)氫被疊氮基替代，且其中所述碳中不具有與其相連的疊氮基的一個(gè)或多個(gè)可以獨(dú)立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此鄰接且不具有疊氮基的一對(duì)或多對(duì)可以通過雙鍵或三鍵彼此連接；其中，R1是H或包含1-6個(gè)碳的烷基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂肪酸是，通過在細(xì)胞中的?；磻?yīng)(例如，棕櫚?；蛉舛罐觉；?與蛋白連接的脂肪酸。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是飽和脂肪酸，諸如15-疊氮基十五烷酸(棕櫚酸，疊氮化物)或12-疊氮基十二烷酸(肉豆蘧酸，疊氮化物)。在本發(fā)明的方法中使用的化合物可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式存在。為了用于藥物中，本發(fā)明的化合物的鹽是指無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的鹽。
這些化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽和堿加成鹽。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”包括通常用于形成堿金屬鹽和用于形成游離酸或游離堿的加成鹽的鹽。所述鹽的性質(zhì)不是關(guān)鍵性的，前提條件是，它是藥學(xué)上可接受的。
可以從無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸制備這些化合物的合適的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。這樣的無(wú)機(jī)酸的實(shí)例是鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)酸可以選自脂肪族酸、環(huán)脂肪族酸、芳族酸、芳基脂肪族酸、雜環(huán)酸、羧酸和磺酸類別的有機(jī)酸，其實(shí)例是甲酸、醋酸、丙酸、琥珀酸、羥乙酸、葡糖酸、馬來(lái)酸、雙羥萘酸(撲酸)、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、泛酸、苯磺酸、甲苯磺 酸、對(duì)氨基苯磺酸、甲磺酸、環(huán)己基氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸、羥基丁酸、丙二酸、半乳酸和半乳糖醛酸。
藥學(xué)上可接受的酸性的/陰離子的鹽也包括:乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、依地酸鹽、乙二磺酸鹽、依托酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(glyceptate)、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇?；鶎?duì)氨基苯胂酸鹽、己基間苯二酚鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥基萘甲酸鹽、碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、撲酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽(diphospate)、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、次醋酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、氫硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、8-氯茶堿鹽、甲苯磺酸鹽和三乙基碘鹽。
公開的化合物的合適的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽包括，但不限于:由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制成的金屬性鹽，或由N，N' - 二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基還原葡糖胺、賴氨酸、精氨酸和普魯卡因制成的有機(jī)鹽。所有這些鹽都可以通過常規(guī)方式從由公開的化合物代表的對(duì)應(yīng)化合物制備，例如，通過用適當(dāng)?shù)乃峄驂A處理公開的化合物。藥學(xué)上可接受的堿性的/陽(yáng)離子的鹽也包括二乙醇胺鹽、銨鹽、乙醇胺鹽、哌嗪鹽和三乙醇胺鹽。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以形成這樣的鹽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的生物分子是疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的衍生物或前體藥物。所述類異戊二烯脂質(zhì)可以選自商購(gòu)可得的和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛已知的多種類異戊二烯脂質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇會(huì)阻止、抑制和/或延遲細(xì)胞的病毒感染的類異戊二烯脂質(zhì)。優(yōu)選地，所述類異戊二烯脂質(zhì)是天然存在的。應(yīng)當(dāng)理解，可以修飾所述含有疊氮化物的類異戊二烯脂質(zhì)(無(wú)論是否是天然存在的)，例如，通過短鏈烷基化諸如甲基化或乙?；?、酯化、以及其它維持抗病毒活性的衍生化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述類異戊二烯脂質(zhì)是，通過在細(xì)胞中的異戊二烯基化反應(yīng)與蛋白連接的類異戊二烯脂質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在有法呢基轉(zhuǎn)移酶或香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶的催化活性存在下，所述類異戊二烯脂質(zhì)在細(xì)胞中與蛋白連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基，且包括、但不限于:疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。使用本領(lǐng)域已知的方法，包括在美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20050222427、美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2007/0249014和Hang,H.C.等人，J Am Chem Soc 2007，129:2744-45 (它們的公開內(nèi)容通過引用整體并入)中公開的那些方法，可以制備本文所述的疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸和疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)。
聯(lián)合治療
在一個(gè)實(shí)施方案中，在聯(lián)合治療中施用藥物組合物，所述藥物組合物包含疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)和至少一種抗病毒劑。所述治療可用于治療病毒感染，包括、但不限于HIV感染。在該背景下，術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合”是指:基本上同時(shí)地(同時(shí)地或順序地)施用所述疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)和所述抗病毒劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果順序地施用，在第二種化合物開始施用時(shí)，兩種化合物中的第一種在治療部位處的有效濃度仍然是可檢測(cè)的。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果順序地施用，在第二種化合物開始施用時(shí)，兩種化合物中的第一種在治療部位處的有效濃度是不可檢測(cè)的。
例如，聯(lián)合治療可以包括:與至少一種其它的抗病毒劑一起共同配制和/或共同施用疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)。盡管提供了抗病毒劑的具體實(shí)例，大體而言，可以與可用于治療病毒感染的任意藥物組合物一起組合所述疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)。這樣的聯(lián)合治療可以有利地降低施用的治療劑的劑量，從而避免與各種單一療法有關(guān)的可能的毒性或并發(fā)癥。此外，本文公開的其它抗病毒劑起作用的病毒感染途徑或階段，是累加在所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)所影響的病毒感染途徑或階段之上或與其不同，因而預(yù)期會(huì)增強(qiáng)所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)的作用和/或與所述作用協(xié)同。所述其它抗病毒劑可以包括至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、病毒蛋白酶抑制劑、病毒融合抑制劑、病毒整合酶抑制劑、糖苷酶抑制劑、病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑、M2蛋白抑制劑、兩性霉素B、羥基脲、α -干擾素、β -干擾素、Y-干擾素和反義寡核苷酸。
所述至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括、但不限于:一種或多種核苷類似物，諸如齊多夫定(AZT)、去輕肌苷(ddl)、扎西他濱(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韋(ABC)、恩曲他濱(FTC)、恩替卡韋(INN)、阿立他濱(ATC)、Atevirapine、利巴韋林、阿昔洛韋、泛昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋和伐昔洛韋；一種或多種核苷酸類似物，諸如替諾福韋(富馬酸替諾福韋二吡呋酯)、阿德福韋(bis-POM PMPA)、PMPA和西多福韋；或一種或多種非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，諸如依法韋侖、奈韋拉平、地拉韋啶和依曲韋林。
所述至少一種病毒蛋白酶抑制劑包括、但不限于:替拉那韋、達(dá)蘆那韋、茚地那韋、洛匹那韋、呋山那韋、阿扎那韋、沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋和氨普那韋。
所述至少一種病毒融合抑制劑包括、但不限于:⑶4拮抗劑，諸如可溶性的⑶4，或與 CD4 結(jié)合的抗體，諸如 TNX-355、BMS-806 ；CCR5 拮抗劑，諸如 SCH-C、SCH-D、UK_427、857、馬拉韋羅、維立韋羅，或與CCR5結(jié)合的抗體，諸如PR0-140 ；CXCR4拮抗劑，例如，AMD3100或AMD070 ;*gp41的拮抗劑，諸如恩夫韋肽。
所述至少一種病毒整合酶抑制劑包括、但不限于拉替拉韋。
所述至少 一種糖苷酶抑制劑包括、但不限于SC-48334或MDL-28574。
所述至少一種病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑包括、但不限于奧塞米韋、培拉米韋、扎那米韋和拉尼米韋。神經(jīng)氨酸酶是在流感病毒的表面上的蛋白，其介導(dǎo)病毒從受感染的細(xì)胞的釋放(Bossart-Whitaker 等人，J Mol Biol, 1993, 232:1069-83) 流感病毒使用病毒血凝素蛋白附著于細(xì)胞膜上。所述血凝素蛋白會(huì)結(jié)合在宿主細(xì)胞膜中的糖蛋白上存在的唾液酸部分。為了從細(xì)胞中釋放出病毒，神經(jīng)氨酸酶必須從宿主糖蛋白酶促地切割唾液酸基團(tuán)。因而，抑制神經(jīng)氨酸酶會(huì)阻止流感病毒從受感染的細(xì)胞的釋放。
所述至少一種M2抑制劑包括、但不限于金剛烷胺和金剛乙胺。M2是在流感病毒的病毒包膜中發(fā)現(xiàn)的一種離子通道蛋白(Henckel等人，J Biol Chem, 1998, 273 =6518-24) 所述M2蛋白在控制流感病毒的脫殼中起重要作用，從而導(dǎo)致病毒粒子內(nèi)容物釋放進(jìn)宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。阻斷M2會(huì)抑制病毒復(fù)制。
本文公開的疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)可以與其它治療劑聯(lián)合使用，用于治療在下文中進(jìn)一步詳細(xì)討論的具體病毒感染。
用于治療HIV感染的藥劑(所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)可以與其組合)的非限制性實(shí)例包括下述的至少一種:齊多夫定(AZT),去輕肌苷(ddl),扎西他濱(ddC),司他夫定(d4T),拉米夫定(3TC)，阿巴卡韋(ABC)，恩曲他濱(FTC)，恩替卡韋(INN)，阿立他濱(ATC)，替諾福韋(富馬酸替諾福韋二吡呋酯)，阿德福韋(bis-POM PMPA)依法韋侖，奈韋拉平，地拉韋啶，依曲韋林，替拉那韋，達(dá)蘆那韋，茚地那韋，洛匹那韋，呋山那韋，阿扎那韋，沙奎那韋，利托那韋，茚地那韋，奈非那韋，氨普那韋，CD4拮抗劑，諸如可溶性的CD4，或與CD4結(jié)合的抗體，諸如TNX-355、BMS-806，CCR5 拮抗劑，諸如 SCH-C、SCH-D、UK-427,857,馬拉韋羅、維立韋羅，或與CCR5結(jié)合的抗體，諸如PR0-140，CXCR4拮抗劑，例如，AMD3100或AMD070，或gp41的拮抗劑，諸如恩夫韋肽。
可以用于治療HIV感染的聯(lián)合治療的具體實(shí)例包括，但不限于，與下述藥劑相組合的疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì):1)替諾福韋、恩曲他濱和依法韋侖；2)洛匹那韋和利托那韋；3)拉米夫定和齊多夫定；4)阿巴卡韋、拉米夫定和齊多夫定；5)拉米夫定和阿巴卡韋；或6)替諾福韋和恩曲他濱。
用于治療皰疹病毒感 染的藥劑(所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)可以與其組合)的非限制性實(shí)例包括:阿昔洛韋、泛昔洛韋、伐昔洛韋、西多福韋、膦甲酸、更昔洛韋和伐昔洛韋。
用于治療流感病毒感染的藥劑(所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)可以與其組合)的非限制性實(shí)例包括:金剛烷胺、金剛乙胺、奧塞米韋、培拉米韋、扎那米韋和拉尼米韋。
用于治療呼吸道合孢病毒感染的藥劑(所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)可以與其組合)的非限制性實(shí)例包括利巴韋林。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及試劑盒，所述試劑盒用于實(shí)現(xiàn)所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)與其它治療劑的聯(lián)合施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含:在藥用賦形劑中配制的所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)，和在適當(dāng)時(shí)配制在一種或多種單獨(dú)的藥物制劑中的至少一種抗病毒劑。
藥物組合物和施用方法
本公開內(nèi)容提供了適合藥用和施用給患者的組合物。所述藥物組合物包含疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或本文所述的任一種化合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的脂肪酸是飽和脂肪酸，諸如15-疊氮基十五烷酸或12-疊氮基十二烷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是N-疊氮基乙?；肴樘前贰-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或N-疊氮基乙酰基葡糖胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物含有促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞中的部分，包括、但不限于四乙?；糠?。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙酰化形式的N-連接的碳水化合物或O-連接的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疊氮化物修飾的碳水化合物是四乙?；腘-疊氮基乙?；肴樘前?、四乙?；腘-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺或四乙?；腘-疊氮基乙酰基葡糖胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述類異戊二烯脂質(zhì)包含法呢基或香葉基香葉基，且包括、但不限于:疊氮基法呢基二磷酸、疊氮基法呢醇、疊氮基香葉基香葉基二磷酸或疊氮基香葉基香葉醇。所述藥物組合物也可以與給藥說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。
將藥物組合物配制成與它的預(yù)期給藥途徑相容。實(shí)現(xiàn)給藥的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。藥物組合物可以局部地或口服地給藥，或能夠跨粘膜傳遞。藥物組合物的給藥實(shí)例包括口服或吸入。給藥也可以是靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、腔內(nèi)的、皮下的、皮膚的或透皮的。
用于真皮內(nèi)或皮下施用的溶液或混懸液通常包括至少一種下述組分:無(wú)菌的稀釋劑諸如水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗細(xì)菌劑諸如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸(EDTA);緩沖劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和張度劑諸如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A調(diào)節(jié)pH。這樣的制劑可以包封在安瓿、一次用棄注射器或多次劑量管形瓶中。
用于靜脈內(nèi)給藥的溶液或混懸液包括:載體諸如生理鹽水、抑制細(xì)菌的水、克列莫佛ELTM(BASF，Parsippany，NJ)、乙醇或多元醇。在所有情況下，所述組合物必須是無(wú)菌的且易于注射的流體。經(jīng)常使用卵磷脂或表 面活性劑來(lái)獲得適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。所述組合物還必須在生產(chǎn)和貯存條件下是穩(wěn)定的。利用抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等，可以預(yù)防微生物。在許多情況下，可以在組合物中包括等張劑(糖)、多元醇(甘露醇和山梨醇)或氯化鈉。通過加入延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以實(shí)現(xiàn)組合物的延長(zhǎng)吸收。
口服組合物包括惰性稀釋劑或可食用的載體。所述組合物可以包封在明膠中或壓制成片劑。就口服給藥目的而言，可以將所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)與賦形劑一起摻合，并制成片劑、糖錠或膠囊劑。在所述組合物中可以包括藥學(xué)上適合的粘合劑或輔料。所述片劑、糖錠和膠囊劑可以含有:(I)粘合劑諸如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；(2)賦形劑諸如淀粉或乳糖、(3)崩解劑諸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；(4)潤(rùn)滑劑諸如硬脂酸鎂；(5)助流劑諸如膠體二氧化硅；或(6)甜味劑或矯味劑。
還可以通過透粘膜或透皮途徑施用所述組合物。通過使用錠劑、鼻噴霧劑、吸入器或栓劑，可以實(shí)現(xiàn)透粘膜給藥。還可以通過使用含有組合物的本領(lǐng)域已知的軟膏劑、油膏齊U、凝膠或乳膏劑實(shí)現(xiàn)透皮給藥。就透粘膜給藥或透皮給藥而言，使用適合要滲透的屏障的穿透劑。
就吸入給藥而言，從加壓容器或分配器(其含有推進(jìn)劑(例如，液體或氣體))或噴霧器中以氣溶膠噴霧形式遞送所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，與載體一起制備所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)，以保護(hù)所述化合物免于從體內(nèi)快速消除。經(jīng)常使用可生物降解的聚合物(例如，乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸)。用于制備這樣的制劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在其它實(shí)施方案中，所述組合物包含用于將所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)遞送給細(xì)胞的遞送劑，包括、但不限于脂質(zhì)體。脂質(zhì)體(也稱作脂囊泡)是從極性脂質(zhì)分子制成的膠體顆粒，所述脂質(zhì)分子源自天然來(lái)源或化學(xué)合成。這樣的由彎曲的脂質(zhì)雙層組成的球形封閉結(jié)構(gòu)，通常用于捕集藥物(其經(jīng)常是細(xì)胞毒性的)，以便降低毒性和/或增加效力。經(jīng)常以干燥的(例如冷凍干燥)形式提供脂質(zhì)體捕集的藥物制劑，其以后在即將給藥之前用水溶液重構(gòu)。這樣做是為了使例如細(xì)胞毒性藥物在水溶液中的泄漏可能性最小化，并從而減少脂質(zhì)體的捕集效應(yīng)。
包含脂質(zhì)體包囊的活性成分以及其它試劑的制劑的實(shí)例公開在美國(guó)專利號(hào)4，427，649、美國(guó)專利號(hào)4，522，811、美國(guó)專利號(hào)4，839，175、美國(guó)專利號(hào)5，569，464,EP 249561、WO 00/38681、WO 88/01862、WO 98/58629、WO 98/00111、WO 03/105805、美國(guó)專利號(hào)5，049，388、美國(guó)專利號(hào)5，141，674、美國(guó)專利號(hào)5，498，420、美國(guó)專利號(hào)5，422，120、WO87/01586、WO 2005/039533、US 2005/0112199 和美國(guó)專利號(hào) 6，228，393 中，它們都特此通過引用整體并入。
以描述的治療有效量施用含有疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)的組合物。治療有效量可以隨受試者的年齡、狀況、性別和醫(yī)學(xué)狀況的嚴(yán)重性而變化。適當(dāng)?shù)膭┝靠梢杂舍t(yī)師基于臨床適應(yīng)癥而確定。含有疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)的組合物可以作為單次劑量(bolus dose)施用，以使所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)的循環(huán)水平最大化并保持最長(zhǎng)的時(shí)間。在單次劑量以后，也可以使用連續(xù)輸注。
可給受試者施用的劑量范圍的實(shí)例可以選自:1 μ g/kg至20mg/kg、l μ g/kg至10mg/kg、I μ g/kg 至 lmg/kg、10 μ g/kg 至 lmg/kg、10 μ g/kg 至 100 μ g/kg、100 μ g/kg 至lmg/kg>250 μ g/kg 至 2mg/kg>250 μ g/kg 至 lmg/kg、500 μ g/kg 至 2mg/kg>500 μ g/kg 至lmg/kg、lmg/kg 至 2mg/kg、lmg/kg 至 5mg/kg、5mg/kg 至 10mg/kg、lOmg/kg 至 20mg/kg、15mg/kg 至 20mg/kg、lOmg/kg 至 25mg/kg、15mg/kg 至 25mg/kg、20mg/kg 至 25mg/kg、和 20mg/kg至30mg/kg(或更高)。這些劑量可以每天、每周、每2周、每個(gè)月或以更低的頻率(例如，每半年)施用，取決于劑量、給藥方法、要治療的病癥或征狀、和個(gè)體受試者特征。還可以通過連續(xù)輸注(諸如通過泵)來(lái)施用劑量。施用的劑量也可以取決于給藥途徑。例如，皮下給藥可能需要比靜脈內(nèi)給藥更高的劑量。
在某些情況下，可以有利地以劑量單位形式配制組合物，以實(shí)現(xiàn)易于給藥和劑量均勻度。本文使用的“劑量單位形式”表示適合患者的物理上離散的單元。每個(gè)劑量單位含有與載體相組合的經(jīng)計(jì)算會(huì)產(chǎn)生治療效果的預(yù)定量的疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)。所述劑量單位取決于所述疊氮化物修飾的脂肪酸、 所述疊氮化物修飾的碳水化合物或所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)的特性和要實(shí)現(xiàn)的特定治療效果。
組合物的毒性和療效可以通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序來(lái)確定，例如用于測(cè)定LD5tl(對(duì)50%的群體致死的劑量)和ED5tl(在50%的群體中治療上有效的劑量)的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，它可以表示為比率LD5(i/ED5(i。
從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究得到的數(shù)據(jù)可以用于以公式表示在人類中的劑量范圍。這些化合物的劑量可以位于所述疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)在血液中的循環(huán)濃度范圍內(nèi)，所述循環(huán)濃度包括幾乎沒有毒性或沒有毒性時(shí)的ED5tlt5所述劑量可以在該范圍內(nèi)變化，取決于采用的劑量組合物形式和給藥途徑。就在本文所述方法中使用的任意疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物或疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)而言，使用細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定可以初步估測(cè)治療有效劑量。可以在動(dòng)物模型中用公式表示劑量，以達(dá)到包括IC5(I(即，實(shí)現(xiàn)征狀的半數(shù)最大抑制時(shí)的抗體濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。通過合適的生物測(cè)定法，可以監(jiān)測(cè)任何特定劑量的效果。
所述組合物也可以含有提供補(bǔ)充、附加或增強(qiáng)治療功能的其它活性化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物另外包含至少一種抗病毒劑，諸如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、病毒蛋白酶抑制劑、病毒融 合抑制劑、病毒整合酶抑制劑、糖苷酶抑制劑、兩性霉素B、羥基脲、α -干擾素、干擾素、Y-干擾素和反義寡核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括、但不限于:一種或多種核苷類似物，諸如齊多夫定(AZT)、去羥肌苷(ddl)、扎西他濱(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、阿巴卡韋(ABC)、恩曲他濱(FTC)、恩替卡韋(INN)、阿立他濱(ATC) ,Atevirapine,利巴韋林、阿昔洛韋、泛昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋和伐昔洛韋；一種或多種核苷酸類似物，諸如替諾福韋(富馬酸替諾福韋二吡呋酯)、阿德福韋(bis-POM PMPA)、PMPA和西多福韋；或一種或多種非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，諸如依法韋侖、奈韋拉平、地拉韋啶和依曲韋林。
在其它實(shí)施方案中，所述至少一種病毒蛋白酶抑制劑包括、但不限于:替拉那韋、達(dá)蘆那韋、茚地那韋、洛匹那韋、呋山那韋、阿扎那韋、沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋和氨普那韋。
在其它實(shí)施方案中，所述至少一種病毒融合抑制劑包括、但不限于:CD4拮抗劑，諸如可溶性的CD4，或與CD4結(jié)合的抗體，諸如TNX-355、BMS-806 ；CCR5拮抗劑，諸如SCH-C、SCH-D、UK-427、857、馬拉韋羅、維立韋羅，或與CCR5結(jié)合的抗體，諸如PR0-140 ；CXCR4拮抗齊[J，例如，AMD3100或AMD070 ;或gp41的拮抗劑，諸如恩夫韋肽。
在其它實(shí)施方案中，所述至少一種病毒整合酶抑制劑包括、但不限于拉替拉韋。
在其它實(shí)施方案中，所述至少一種糖苷酶抑制劑包括、但不限于SC-48334或MDL-28574。
現(xiàn)在將詳細(xì)地提及不同的示例性的實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解，提供下面的詳細(xì)描述，是為了使讀者更充分地理解本發(fā)明的各個(gè)方面的某些實(shí)施方案、特征和細(xì)節(jié)，不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1:用疊氮化物修飾的生物分子標(biāo)記HIV
在T-150燒瓶中用HIVnm_3轉(zhuǎn)染CEMxl74細(xì)胞，并通過逆轉(zhuǎn)錄酶活性監(jiān)測(cè)病毒生產(chǎn)，直到達(dá)到高峰病毒生產(chǎn)(通常在轉(zhuǎn)染后7-9天)。在轉(zhuǎn)染之前，用下述疊氮化物修飾的生物分子刺激(spike) CEMxl74細(xì)胞:15-疊氮基十五烷酸(50-100 μ M)、12-疊氮基十二烷酸(50-100 μ Μ)、四乙酰化的N-疊氮基乙?；肴樘前?20-40 μ Μ)和四乙酰化的N-疊氮基乙?；?D-甘露糖胺(20-40 μ Μ)。
在12、24、72小時(shí)和14天，收獲被感染的細(xì)胞。分離并裂解收獲的細(xì)胞。然后將細(xì)胞裂解物與GLICK-1T 」檢測(cè)試劑、四甲基羅丹明(TAMRA)炔烴和CLIGK_IT 蛋白反應(yīng)緩沖液試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA) 一起混合。使細(xì)胞裂解物樣品在一維凝膠上泳動(dòng)，以監(jiān)測(cè)疊氮化物標(biāo)記的蛋白隨時(shí)間的變化(圖1)。
還從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞得到標(biāo)記的病毒。更具體地，收集含有病毒的上清液，并如以前所述(Graham,D.R.等人,Proteomics 2008,8:4919-30),通過20%鹿糖純化病毒。然后將純化的病毒與CLICK-1T^檢測(cè)試劑、四甲基羅丹明(TAMRA)炔烴和CLIdlT 蛋白反應(yīng)緩沖液試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA) —起混合。使病毒樣品在一維凝膠上泳動(dòng)，以顯示疊氮化物標(biāo)記的病毒蛋白(圖2)。將病毒水平標(biāo)準(zhǔn)化為p24含量，并通過一維凝膠電泳進(jìn)行。
沒有觀察到HIV的急性或慢性復(fù)制對(duì)宿主細(xì)胞蛋白修飾的明顯影響(圖1，將標(biāo)記與對(duì)照組相對(duì)比)。但是，所述疊氮化物修飾的生物分子確實(shí)標(biāo)記了病毒蛋白，并允許在14天時(shí)在慢性感染的細(xì)胞中在HIV病毒蛋白的預(yù)期分子量處檢測(cè)到它們:55KDa(gag-肉豆蘧酰化的)、41KDa(gp41-棕櫚?；?和I2OKDa (gp12O-N-糖基化的)(圖1)。
實(shí)施例2:抑制HIV的侵染性
為了檢查所述疊氮化物修飾的生物分子對(duì)病毒的先天性生物學(xué)的影響，從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分離出疊氮化物標(biāo)記的病毒，并在細(xì)胞感染研究中進(jìn)行試驗(yàn)。使用未標(biāo)記的HIV(其濃度為試驗(yàn)樣品的1/100)作為對(duì)照。將病毒載量標(biāo)準(zhǔn)化為p24豐度，并在報(bào)告細(xì)胞系(TZM/BI)上溫育病毒12小時(shí)。TZM/BI是一種遺傳工程改造的HeLa細(xì)胞系，其表達(dá)⑶4、CXCR4和CCR5，且含有Tat-可誘導(dǎo)的螢光素酶和β-Gal報(bào)道基因。通過用2種不同的螢光素酶試劑測(cè)量細(xì)胞螢光素酶活性，確定病毒侵染性。使用單循環(huán)復(fù)制系統(tǒng)的結(jié)果表明，用所述疊氮化物修飾的生物分子(具體地，12-疊氮基十二烷酸，和在更低的程度上，15-疊氮基十五烷酸和四乙?；腘-疊氮基乙酰基半乳糖胺)標(biāo)記的病毒對(duì)病毒侵染性具有深遠(yuǎn)影響(圖3和4)。觀察到的病毒進(jìn)入的抑制水平與在用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑(諸如融合抑制劑或核苷類似物)預(yù)處理的細(xì)胞中觀察到的抑制水平相當(dāng)。
實(shí)施例3:毒性譜
使用這些疊氮化物修 飾的生物分子在不同的真核細(xì)胞系中幾乎沒有觀察到或根本沒有觀察到毒性，從而表明這些化合物具有極微小的毒性譜，并支持它們?cè)谥委焾?chǎng)合中的應(yīng)用。
實(shí)施例4:抑制昆蟲細(xì)胞桿狀病毒侵染性
用疊氮基脂肪酸類似物抑制昆蟲細(xì)胞桿狀病毒侵染性=BacMam系統(tǒng)使用經(jīng)改進(jìn)的昆蟲細(xì)胞病毒(桿狀病毒)作為媒介物來(lái)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效地遞送和表達(dá)基因。使用Nuclear-GFP BacMam2.0表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen, C10602)作為模型，以確定所述病毒的PTM類似物標(biāo)記是否會(huì)影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞侵染性。用不同的PTM類似物標(biāo)記病毒，并用于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。通過nuclear-GFP的表達(dá)來(lái)確定侵染性，因?yàn)镚FP蛋白的表達(dá)需要病毒進(jìn)入細(xì)胞中。
Nuclear-GFP BacMam 2.0病毒的標(biāo)記和擴(kuò)增:為了標(biāo)記、擴(kuò)增和富集含有疊氮化物/炔烴翻譯后修飾(PTM)類似物的BacMam病毒，以0.1病毒/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)，用Nuclear-GFP BacMam2.0感染20ml在Sf-900II SFM昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中的Sf9昆蟲細(xì)胞(濃度為1.5E6細(xì)胞/ml)。同時(shí)將在DMSO或100%乙醇中的不同的PTM類似物加給昆蟲細(xì)胞至50uM的終濃度，所述PTM類似物包括:棕櫚酸疊氮化物(15-疊氮基十五烷酸)(Invitrogen, C10265)、肉豆蘧酸疊氮化物(12-疊氮基十二燒酸))(Invitrogen, C10268)、巖藻糖炔烴(Invitrogen, C10264)、ManNAz (四乙?；腘-疊氮基乙?；鵢d_甘露糖胺)(Invitrogen, C33366),和GalNAz (四乙酰化的N-疊氮基乙?；肴樘前?(Invitrogen,C33365)。將所述培養(yǎng)物在黑暗中在27°C搖動(dòng)(120rpm)4天。通過在IOOOxg離心15分鐘，收獲BacMam桿狀病毒。穿過0.22um無(wú)菌濾器，將得到的上清液過濾進(jìn)單獨(dú)的無(wú)菌的琥珀色的50ml錐形瓶中，并在4°C保存。
BacMam病毒生產(chǎn)的表征:為了驗(yàn)證、量化和標(biāo)準(zhǔn)化從昆蟲細(xì)胞上清液得到的富集病毒的量，在SDS樣品制備緩沖液(SPB)中裂解每種病毒的樣品，用探頭尖超聲破碎器進(jìn)行超聲處理，并在90°C加熱，以完全溶解病毒蛋白。然后測(cè)定裂解物的病毒蛋白濃度。通過ID SDS-PAGE分離病毒裂解物樣品，然后使用針對(duì)病毒特異性蛋白的抗體gp64[eBiosciences，小鼠單克隆抗體，14-69995-85)和VSV-G (Sigma，兔多克隆抗體，V4888)]通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。使用從蛋白分析和蛋白質(zhì)印跡法得到的相對(duì)病毒濃度，標(biāo)準(zhǔn)化在隨后的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中的病毒添加。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞感染方案:為了確定PTM類似物標(biāo)記的病毒是否保留感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力，將50，000 個(gè)似-03細(xì)胞(人骨肉瘤細(xì)胞系)鋪板在6孔室玻璃底平板上。將20或50uL富集的病毒加入2ml終體積的培養(yǎng)基+血清(McCoy' s+10% FBS)中。然后將所述平板在5% CO2中在37°C溫育過夜。次日，使用白光和GFP濾光片，在AMG EVOS熒光顯微鏡上在10X或20X放大率拍攝細(xì)胞(圖5)。
為了確定PTM類似物摻入對(duì)BacMam的進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的能力的影響，使用了表達(dá)細(xì)胞核GFP的BacMam構(gòu)建體。由于BacMam病毒在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制，但不在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，在SF9昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)糖和脂肪酸類似物標(biāo)記的病毒，然后使用所述標(biāo)記的病毒來(lái)確定在U2-0S細(xì)胞(人骨肉瘤細(xì)胞系)中的侵染性。僅在病毒能夠進(jìn)入細(xì)胞中的情況下，才在U2-0S細(xì)胞中發(fā)生細(xì)胞核GFP表達(dá)。圖5的小圖顯示了被PTM類似物標(biāo)記的BacMam病毒感染的U2-0S細(xì)胞的相(下一行小圖)和熒光GFP圖像(上一行小圖)。在這些小圖中，用肉豆蘧酸鹽-疊氮化物和棕櫚酸鹽-疊氮化物標(biāo)記的病毒處理的細(xì)胞沒有表現(xiàn)出細(xì)胞核-GFP表達(dá)，而對(duì)照細(xì)胞(沒有病毒)和用糖標(biāo)記的病毒處理的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞核GFP表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)病毒的方法，所述病毒被疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽標(biāo)記，所述方法包括:使被所述病毒感染的細(xì)胞接觸所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物、所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽，使得所述疊氮化物修飾的脂肪酸、所述疊氮化物修飾的碳水化合物、所述疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽進(jìn)入所述細(xì)胞中，并摻入所述病毒的蛋白中，由此生成被標(biāo)記的病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽具有下式:Y-CH2-X-CO2H 其中， Y是H或置氣基；和 當(dāng)Y是疊氮基時(shí)，X是包含6-28個(gè)碳的直鏈或支鏈碳鏈，其中所述碳中的一個(gè)或多個(gè)可以獨(dú)立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此鄰接的一對(duì)或多對(duì)可以通過雙鍵或三鍵彼此連接；或 當(dāng)Y是H時(shí)，X是包含6-28個(gè)碳的直鏈或支鏈碳鏈，其中在所述碳之一上的一個(gè)氫被疊氮基替代，且其中所述碳中不具有與其相連的疊氮基的一個(gè)或多個(gè)可以獨(dú)立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此鄰接且不具有疊氮基的一對(duì)或多對(duì)可以通過雙鍵或三鍵彼此連接； 其中，R1是H或包含1-6個(gè)碳的烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2 述的方法，其中Y是疊氮基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中X是直鏈碳鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述碳鏈包含8-15個(gè)碳。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述碳鏈不含有氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR115
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述碳鏈不含有雙鍵或三鍵。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述疊氮化物修飾的脂肪酸是15-疊氮基十五烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述疊氮化物修飾的脂肪酸是12-疊氮基十二烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病毒是桿狀病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或藥學(xué)上可接受的鹽與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其另外包括下述步驟:給所述細(xì)胞施用與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制的所述疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或藥學(xué)上可接受的鹽。
16.一種在體內(nèi)跟蹤病毒的方法，所述方法包括下述步驟:使培養(yǎng)的細(xì)胞或受試者接觸疊氮化物修飾的碳水化合物、疊氮化物修飾的脂肪酸、疊氮化物修飾的類異戊二烯脂質(zhì)或其藥學(xué)上可接受的鹽； 使所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者接觸炔烴標(biāo)記的報(bào)告物分子；和 在所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者中跟蹤報(bào)告物標(biāo)記的病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中使所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述受試者接觸疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述疊氮化物修飾的脂肪酸或其藥學(xué)上可接受的鹽具有下式:Y-CH2-X-CO2H 其中， Y是H或置氣基；和 當(dāng)Y是疊氮基時(shí)，X是包含6-28個(gè)碳的直鏈或支鏈碳鏈，其中所述碳中的一個(gè)或多個(gè)可以獨(dú)立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此鄰接的一對(duì)或多對(duì)可以通過雙鍵或三鍵彼此連接；或 當(dāng)Y是H時(shí)，X是包含6-28個(gè)碳的直鏈或支鏈碳鏈，其中在所述碳之一上的一個(gè)氫被疊氮基替代，且其中所述碳中不具有與其相連的疊氮基的一個(gè)或多個(gè)可以獨(dú)立地被氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR1替代，或其中所述碳中彼此鄰接且不具有疊氮基的一對(duì)或多對(duì)可以通過雙鍵或三鍵彼此連接； 其中，R1是H或包含1- 6個(gè)碳的烷基。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中Y是疊氮基。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中X是直鏈碳鏈。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述碳鏈包含8-15個(gè)碳。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述碳鏈不含有氧、硒、硅、硫、SO、SO2或NR115
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述碳鏈不含有雙鍵或三鍵。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述疊氮化物修飾的脂肪酸是15-疊氮基十五烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述疊氮化物修飾的脂肪酸是12-疊氮基十二烷酸或其藥學(xué)上可接受的鹽。
全文摘要
提供了使用疊氮化物修飾的生物分子(諸如脂肪酸、碳水化合物和脂質(zhì))治療被病毒感染的植物、昆蟲或動(dòng)物或抑制病毒(諸如人免疫缺陷病毒)的侵染性的方法。也提供了用疊氮化物修飾的生物分子(諸如脂肪酸、碳水化合物或類異戊二烯脂質(zhì))標(biāo)記病毒(諸如人免疫缺陷病毒)的方法。并且，提供了用疊氮化物修飾的生物分子(諸如脂肪酸、碳水化合物或類異戊二烯脂質(zhì))在體內(nèi)跟蹤病毒的方法。所述疊氮化物修飾的生物分子可以與藥學(xué)上可接受的賦形劑相組合，以生成藥物組合物，所述藥物組合物任選地含有其它抗病毒劑和/或遞送劑，諸如脂質(zhì)體。
文檔編號(hào)A61K31/00GK103228271SQ201180046966
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者B.阿格紐, U.辛赫, S.格里相 申請(qǐng)人:生命科技公司