專利名稱：重組腦膜炎奈瑟氏菌PorA孔蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)成修飾形式的腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)PorA蛋白的新蛋白質(zhì)，編碼這些蛋白質(zhì)的核酸，及其在治療性和預(yù)防性方法中的用途、組合物、特別是疫苗。更特別地，通過破壞PorA表面環(huán)中的非保守氨基酸，本發(fā)明提供了可用于疫苗的蛋白質(zhì)和編碼核酸，與相應(yīng)的野生型PorA蛋白的預(yù)期結(jié)果相比，所述疫苗針對更廣譜的腦膜炎奈瑟氏菌菌株提供有效免疫。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟氏菌是革蘭氏陰性菌，是流行性腦脊髓膜炎和敗血癥的病原體。其已知的唯一宿主是人，約10 %的人群可無癥狀地?cái)y帶它(Caugant等，1994, J.Clin.Microbiol.32323)。腦膜炎奈瑟氏菌可表達(dá)多糖莢膜，而這允許其根據(jù)所表達(dá)莢膜的性質(zhì)對該細(xì)菌進(jìn)行分類。腦膜炎奈瑟氏菌有至少十二個(gè)血清組:A、B、C、29-E、H、1、K、L、W135、X、Y和Z，其中血清組A、B和C引起90 %的腦膜炎球菌病(Poolman等，1995, Infect.Agents andDis.413)。有針對血清組A和C的疫苗可用，但是血清組B莢膜多糖的免疫原性不佳，在人中不誘導(dǎo)保護(hù)。

因此正在檢查另一些膜組分和胞外組分是否適合包含在疫苗中。實(shí)例包括1、2和3類外膜蛋白(孔蛋白(porin) ; Spor基因編碼)和4類外膜蛋白(Rmp)和5類外膜蛋白(Opacity蛋白；由opa和opc基因編碼)。但是,腦膜炎奈瑟氏菌通過抗原性和相變異而非常有效地逃避免疫應(yīng)答。例如，Opc蛋白是具有高度免疫原性(Wiertz等，1996，InfectImmun.64298-304)的粘附素 / 侵襲素(Vir ji 等，1995，Mol Microbiol.18741-54)，但是其表達(dá)是可相變的(phase-variable) (Sarkari 等，1994, Mol Microbiol.13207-17),并且通過轉(zhuǎn)換(diversion)產(chǎn)生針對高免疫原性移動(dòng)靶標(biāo)(特別是PorA)的免疫應(yīng)答。PorA在菌株之間高度可變并且在患者和無癥狀攜帶者中均產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其程度使得它已作為代表血清亞型系統(tǒng)的用于菌株鑒定的標(biāo)志物(McGuinness等，1990，J ExpMed.1711871-82)。PorA是關(guān)鍵抗原，其已用于先前有效且已注冊的疫苗制劑中，并且被認(rèn)為是引發(fā)有效殺菌抗體的理想抗原。但是，表面環(huán)在菌株之間的可變性使得靶標(biāo)可變，并且疫苗通常是PorA類型特異性的。雖然已做出了許多努力以產(chǎn)生覆蓋多至六種不同PorA類型的多價(jià) PorA 疫苗(van der Voort 等，1996, Infect Immun.642745-51),但是該祀標(biāo)已被斷定為可變性過高，因此最近的疫苗開發(fā)基本拋棄了這種抗原。PorA單體拓?fù)鋵W(xué)的現(xiàn)有模型顯示出八個(gè)胞外環(huán)(Derrick等，1999, Infect.Tmmun.672406-13 ；van der Ley 等，1991, Infect.Tmmun.592963)。最長的環(huán)(I 和 4)可變性最高，因此稱為可變區(qū)I (VRl)和可變區(qū)2 (VR2)。環(huán)5和6中看到的可變性較低(分別為半可變區(qū)SVRl和2)，其余的環(huán)中基本上沒有可變性。預(yù)計(jì)環(huán)3在由PorA三聚體的每一個(gè)亞基形成的孔中形成“塞(Plug)”。即使在VRl和VR2內(nèi)，大部分可變性只限于預(yù)測形成每個(gè)環(huán)尖端的殘基。實(shí)際上，在小鼠和經(jīng)免疫的人志愿者中，表位作圖都表明大多數(shù)抗體應(yīng)答針對環(huán)I和4的“頂端”-菌株之間可變的區(qū)域(van der Voort等，1997, FEMS Immunol.Med.Microbiol.17139-48),推測這解釋了抗PorA應(yīng)答的菌株特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人認(rèn)識到，PorA的高免疫原性表面環(huán)是引發(fā)不具廣泛保護(hù)性的菌株特異性免疫應(yīng)答的原因，使得摻入來源于特定腦膜炎奈瑟氏菌菌株的PorA蛋白的疫苗傾向于優(yōu)先針對該特定菌株提供免疫。因此，本發(fā)明人試圖生產(chǎn)這樣的PorA蛋白:其引發(fā)的免疫應(yīng)答的菌株特異性不像野生型PorA引發(fā)的免疫應(yīng)答那樣高。與用野生型PorA免疫后的預(yù)期結(jié)果相比，通過使免疫應(yīng)答主要針對保守性表位，包含所述分離蛋白質(zhì)的疫苗應(yīng)針對更廣譜的腦膜炎奈瑟氏菌菌株提供免疫。在第一方面中，本發(fā)明提供了包含腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白之氨基酸序列的分離蛋白質(zhì)，其中所述PorA蛋白的可變區(qū)中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被破壞。合適地，所述PorA蛋白可變區(qū)中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸通過包含一個(gè)或更多個(gè)PorA保守區(qū)或保守區(qū)氨基酸而被破壞(例如，與野生型PorA相比)。優(yōu)選地，所述保守區(qū)是保守環(huán)2、保守環(huán)3、保守環(huán)7和/或保守環(huán)8的氨基酸序列，或者包含以上氨基酸序列。合適地，所述可變區(qū)選自VR1、VR2、SVR1和SVR2區(qū)。 優(yōu)選地，所述可變區(qū)選自VRl和VR2區(qū)。所述可變區(qū)和所述保守區(qū)可以是、衍生自或來源于相同或不同的PorA蛋白。合適地，本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答 的菌株特異性低于由相應(yīng)的野生型PorA蛋白引發(fā)的免疫應(yīng)答。更優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答提供了針對一種或更多種腦膜炎奈瑟氏菌菌株(或者甚至更優(yōu)選地針對多種腦膜炎奈瑟氏菌菌株)的保護(hù)。本發(fā)明提供了本方面分離蛋白質(zhì)的一些具體實(shí)施方案。圖1和2提供了本方面分離蛋白質(zhì)的一些具體實(shí)例(SEQ ID NO:11-22)。優(yōu)選地，所述分離蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO:11-22中任一個(gè)所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述分離蛋白質(zhì)中被破壞的可變區(qū)不由VRl和/或VR2區(qū)的缺失組成(例如 SEQ ID NO:2-4 所述)。根據(jù)第一方面，本發(fā)明包括本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的同源物、片段、變體和衍生物。在該方面的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述分離蛋白質(zhì)存在于外膜蛋白囊泡(OuterMembrane Protein Vesicle, OMV)中。在第二方面中，本發(fā)明提供了編碼根據(jù)第一方面的多肽的分離核酸。圖2中提供了本方面分離核酸的一些具體實(shí)例(SEQ ID NO:23_43)。優(yōu)選地，所述分離核酸包括SEQ ID NO:32-43中任一個(gè)所述的核苷酸序列。根據(jù)第二方面，本發(fā)明包括本發(fā)明分離核酸的同源物、片段、變體和衍生物。在第三方面中，本發(fā)明提供了包含根據(jù)第二方面的分離核酸和一種或更多種其他核苷酸序列的基因構(gòu)建體。在一種優(yōu)選形式中，所述基因構(gòu)建體是包含表達(dá)載體和根據(jù)第二方面的分離核酸的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述分離核酸與所述表達(dá)載體中的一種或更多種調(diào)節(jié)核酸有效連接。
在第四方面中，本發(fā)明提供了包含根據(jù)第三方面的基因構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是包含染色體整合的表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)菌。優(yōu)選地，所述細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏菌。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種產(chǎn)生根據(jù)第一方面的重組分離蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟:(i)培養(yǎng)包含根據(jù)第三方面的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以使所述多肽在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)；以及(ii)分離所述重組多肽。在第六方面中， 本發(fā)明提供了與本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)、其片段、變體或衍生物結(jié)合或者針對它們而產(chǎn)生的抗體或抗體片段。在第七方面中，本發(fā)明提供了一種檢測腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌的方法，所述方法包括以下步驟:_(i)使第六方面的抗體或抗體片段與得自哺乳動(dòng)物的生物樣品合并；以及(ii)確定所述樣品中是否存在包含所述抗體或抗體片段與腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌和/或腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物存在指示所述腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌。在第八方面中，本發(fā)明提供了一種檢測針對腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:_(i)使得自哺乳動(dòng)物的生物樣品與第一方面的分離蛋白質(zhì)相接觸；以及(ii)確定所述樣品中是否存在包含所述分離蛋白質(zhì)與腦膜炎奈瑟氏菌PorA抗體的復(fù)合物。在第九方面中，本發(fā)明提供了一種檢測針對腦膜炎奈瑟氏菌的殺菌抗體的方法，所述方法包括以下步驟:_(i)使得自經(jīng)第一方面分離蛋白質(zhì)免疫之哺乳動(dòng)物的生物樣品與腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌相接觸；以及(ii)確定所述樣品中是否存在所述殺菌抗體。在第十方面中，提供了一種檢測腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌的方法，所述方法包括以下步驟:檢測得自哺乳動(dòng)物的生物樣品中根據(jù)第二方面的核酸序列，從而指示存在所述細(xì)菌。優(yōu)選地,所述哺乳動(dòng)物是人。在第十一方面中，本發(fā)明提供了用于檢測腦膜炎奈瑟氏菌感染的試劑盒，所述試劑盒包含:根據(jù)第一方面的分離蛋白質(zhì)；根據(jù)第二方面的分離核酸；和/或第六方面的抗體或抗體片段；和任選的一種或更多種其他試劑。在第十二方面中，本發(fā)明提供了包含以下的藥物組合物:根據(jù)第一方面的分離蛋白質(zhì)；根據(jù)第二方面的分離核酸；根據(jù)第三方面的基因構(gòu)建體；根據(jù)第四方面的宿主細(xì)胞；和/或根據(jù)第六方面的抗體或抗體片段；和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含含有染色體整合的表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)菌。優(yōu)選地,所述細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含外膜蛋白囊泡(OMV)中的分離蛋白質(zhì)。
合適地,所述藥物組合物是免疫原性組合物。優(yōu)選地,所述藥物組合物是疫苗。在第十三方面中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物的腦膜炎奈瑟氏菌感染的方法，所述方法包括以下步驟:將根據(jù)第一方面的分離蛋白質(zhì)、根據(jù)第二方面的分離核酸、根據(jù)第三方面的基因構(gòu)建體、根據(jù)第四方面的宿主細(xì)胞、根據(jù)第六方面的抗體或抗體片段和/或根據(jù)第十二方面的藥物組合物施用于哺乳動(dòng)物，從而預(yù)防或治療所述哺乳動(dòng)物的所述腦膜炎奈瑟氏菌感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法施用包含染色體整合的表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)菌。優(yōu)選地,所述細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法施用外膜蛋白囊泡(OMV)中的分離蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，上述方面的哺乳動(dòng)物是人。 貫穿完整本說明書，除非上下文另有要求，否則詞語“包含”、“含有”和“包括”將被理解為意在包括所述的整體或整體群，但并不排除任何其他的整體或整體群。


圖1:與本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的一些實(shí)施方案相比的野生型PorA氨基酸序列的排列。粗體下劃線表不 van der Ley 模型環(huán)(van der Ley 等，1991, Infect.1mmun.592963)。斜體表示VRl和VR2。-表示插入空格以實(shí)現(xiàn)比對。野生型MC58菌株P(guān)orA氨基酸序列(SEQ ID NO:1)、pPorDELLl (SEQ ID NO:2)、pPorDELL4 (SEQ ID NO:3)、pPorDELLl-4 (SEQID NO:4)、pPorDELLl-4-5 (SEQ ID NO:5)、pDELVRl (SEQ ID NO:6)、pDELVR2 (SEQ ID NO:7)、pDELVRl-2 (SEQ ID NO:8)、pDELVRl-2-5 (SEQ ID NO:9)、pDELVRl-2-5-6 (SEQ ID NO:10)、pVR2-7 (SEQ ID NO: 11)、pVR2_8 (SEQ ID NO: 12), p Δ VR1VR2-7 (SEQ ID NO:13)、p Δ VR1VR2-8(SEQ ID NO: 14)、pVRl_7VR2_8(SEQ ID NO:15)、pVRl_7VR2_8Λ 5(SEQ ID NO:16)、pP0R7inl (SEQ ID NO: 17)、pPor8in4 (SEQ ID NO:18)和 pP0R7inl，8in4 (SEQ ID NO:19)。圖2:(A)本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的一些實(shí)施方案的氨基酸序列(SEQ ID NO:2-18,參見圖1)和編碼核酸序列如下:pPor Λ LI (SEQ ID NO:23)、pPor Λ L4 (SEQ ID NO:24)、pPorALl-4(SEQ ID NO:25)、pPorDELl-4-5 (SEQ ID NO:26)、pDELVRl (SEQ ID NO:27)、PDELVR2 (SEQ ID NO:28)、pDELVRl-2 (SEQ ID NO:29)、pDELVRl-2-5 (SEQ ID NO:30)、pDELVRl-2-5-6(SEQ ID NO:31)、pVR2_7 (SEQ ID NO:32)、pVR2_8 (SEQ ID NO:33)、p Δ VR1VR2-7 (SEQ ID NO:34)、P Λ VR1VR2-8 (SEQ ID NO:35)、pVRl_7VR2_8 (SEQ ID NO:36)、pVR1-7VR2-8 Δ 5 (SEQ ID NO:37)、pP0R7inl (SEQ ID NO:38)、pPor8in4 (SEQ ID NO:39)和pP0R7inl，8in4(SEQ ID NO:40)。還提供了野生型MC58菌株porA核苷酸序列(SEQID NO:44)。(B)其中VRl和/或VR2區(qū)已缺失并且被保守的環(huán)7或環(huán)8氨基酸替換的本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的另一些實(shí)施方案的氨基酸序列和編碼核酸。氨基酸序列PVR1-7VR2-7 (SEQID NO:20)、VR18VR28 (SEQ ID NO:21)氨基酸序列 pVRl_8VR2_7 (SEQ ID NO:22)、DNA序列 pVRl-7VR2-7 (SEQ ID NO:41)、DNA 序列 pVRl_8VR2_8 (SEQ ID NO:42)和 DNA 序列PVR1-8VR2-7(SEQ ID NO:43)。圖3:(A)在VR1、VR2、SVR1和SVR2中的一個(gè)或更多個(gè)中存在不同序列的MC58和另兩種PorA野生型的部分氨基酸序列排列(SEQ ID NO:85-87)。粗體下劃線表示MC58PorA的van der Ley 模型(van der Ley 等，1991, Infect.1mmun.592963)環(huán)。斜體表不 MC58PorA的VRl和VR2。-指示插入空格以實(shí)現(xiàn)比對。比對下的*表示在全部3種序列中相同的殘基，而圓點(diǎn)表示序列之間的保守氨基酸。(B)來自菌株MC58、BZ133、BZ232和400的PorA序列與共有序列(SEQ ID NO:1和88-90)的比對。環(huán)1、4、5、6、7和8突出顯示并且如vander Ley等1991 (見上)或者Derrick等1999 (見上)的模型所述。在比對中，.表示與MC58PorA相同的序列，-表示序列比對中的缺口。在共有序列中，*表示在全部這些序列中保守的氨基酸。:表示保守殘基。.表示半保守殘基。圖4:PorA蛋白構(gòu)建體的Western印跡檢測。將腦膜炎奈瑟氏菌的脫氧膽酸鹽OMV在預(yù)制的8-12% Novex聚丙烯酰胺凝膠上分離并用考馬斯亮藍(lán)染色(左圖)或進(jìn)行Western 印跡(右圖)。使用抗 PorA 多克隆抗體(Santa-Cruz Biotechnology Inc.)檢測PorA。泳道1:分子量標(biāo)志物(左側(cè)指示表觀大小，以kDa為單位)。泳道2:e9 OMV,泳道 3:9-Fix0MV,泳道 4:9-10MV,泳道 5:1728-20MV,泳道 6:027-3,泳道 7:028-100MV,泳道8:145-50MV。表5中描述了菌株。圖5:porA蛋白構(gòu)建體的Western印跡檢測。從不同PorA血清亞型及其同基因porA::tet突變體的四種菌株中通過十二燒酰基肌氨酸鈉(sarkosyl)提取制備膜蛋白，通過電泳分離，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色(上圖)或western免疫印跡(下圖)。通過10只用來自菌株1728-2之脫氧膽酸鹽OMV接種疫苗的小鼠的合并血清來檢測Western印跡中的蛋白質(zhì)。圖6:用來自表達(dá)重組PorA構(gòu)建體之菌株的OMV接種疫苗的小鼠血清的ELISA分析:檢測對異源PorA的表面表位的交叉反應(yīng)性。示出了實(shí)驗(yàn)I (A)和實(shí)驗(yàn)2 (B)的幾何平均效價(jià)數(shù)據(jù)(來自一式三份的孔)的倒數(shù)。發(fā)明詳述應(yīng)理解，本發(fā) 明的核心是認(rèn)識到，通過破壞野生型PorA蛋白中包含非保守氨基酸的表面環(huán)，免疫后可引發(fā)免疫應(yīng)答，其通過使免疫應(yīng)答針對保守表位序列，將提供對抗多種異源腦膜炎奈瑟氏菌菌株的保護(hù)。在一方面中，本發(fā)明提供了包含腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白氨基酸序列的分離蛋白質(zhì)，其中所述PorA蛋白的一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)被破壞，使得該分離PorA蛋白引發(fā)針對多種腦膜炎奈瑟氏菌菌株的免疫應(yīng)答。合適地，所述PorA蛋白的可變區(qū)中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸通過包含一個(gè)或更多個(gè)PorA保守區(qū)或保守區(qū)氨基酸而被破壞(例如，與野生型PorA蛋白相比)。為了本發(fā)明的目的，“分離的”意指材料已從其天然狀態(tài)移出或者已經(jīng)受人為操作。分離的材料可大體上或基本上不含在天然狀態(tài)下通常與其相伴隨的組分，或者可經(jīng)操作而與在其天然狀態(tài)下通常與其相伴隨的組分一起處于人工狀態(tài)。分離的材料可以是天然或重組形式。“蛋白質(zhì)”意指氨基酸多聚體。所述氨基酸可以是本領(lǐng)域所公知的天然氨基酸或非天然氨基酸?！半摹笔蔷哂胁欢嘤诹?60)個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。多肽是具有多于六十(60)個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
本文中的“破壞”意指雖然本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)包含PorA蛋白的氨基酸序列(包括跨膜和/或胞內(nèi)氨基酸序列)，但是一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)或可變區(qū)氨基酸至少部分或者完全缺失并且已被一個(gè)或更多個(gè)保守區(qū)氨基酸替換，和/或所述一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)在可變區(qū)氨基酸序列中存在或插入了一個(gè)或更多個(gè)保守區(qū)氨基酸。合適地，所述可變區(qū)選自VR1、VR2、SVR1和SVR2區(qū)。優(yōu)選地，所述分離的蛋白質(zhì)中被破壞的可變區(qū)不由VRl和/或VR2區(qū)(例如SEQ ID NO:2_4中所述)的缺失組成。表I提供了本文所述可變區(qū)(即VR1、VR2、SVRU SVR2)和本文所述保守區(qū)與PorA(例如，例如腦膜炎奈瑟氏菌菌株MC58野生型PorA蛋白的氨基酸序列；SEQ ID NO:I)的表面環(huán)或胞外環(huán)1-8的氨基酸序列比較。還參照圖3A和3B，其展示了腦膜炎奈瑟氏菌的多個(gè)菌株和血清型之間可變區(qū)氨基酸序列的多樣性。參照http://pubmlst.0re/neisseria/PorA/vrl.shtml 和 http: //pubmlst.0rg/neisseria/PorA/vr2.shtml,并且如Russell 等，2004, Emerg Infect Dis.10674-8 所述，更充分說明了 VRl 和 VR2 的可變性。因此，應(yīng)理解，本發(fā)明適用于腦膜炎奈瑟氏菌任何菌株或血清型的PorA。圖1和2提供了本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)的一些具體實(shí)例(SEQ ID N0:5_22，或者優(yōu)選 SEQ ID NO:11-22)。以上可變區(qū)中可變性最高的是VRl和VR2。SVRl和SVR2是半可變區(qū)，SVRl包含的非保守氨基酸比SVR2多。因此，優(yōu)選被破壞的可變區(qū)是VRl和/或VR2區(qū)。但是，在一些具體實(shí)施方案中，SVRl被單獨(dú)破壞或者與一個(gè)或更多個(gè)其他可變區(qū)(如VRl和/或VR2)一起被破壞。特別地，由圖3和表I將明顯看出，環(huán)1、4、5和6—般與本文所涉及的可變區(qū)相關(guān)。但是，應(yīng)理解，VRl是環(huán)I的非保守或可變子序列(例如，AQAANGGASGQVKVTKVTKA ；SEQ IDNO:45)并且VR2是環(huán)4的非保守或可變子序列(例如，YYTKNTNNNLTLVP ；SEQ ID NO:46)。因此，除VRl和/或VR2破壞之外，本發(fā)明分離蛋白質(zhì)可在環(huán)I和/或4中不是VRl和VR2一部分的一個(gè)或更多個(gè) 氨基酸處被破壞。相似地，除SVRl和/或SVR2破壞之外，本發(fā)明分離蛋白質(zhì)可在環(huán)I和/或6中不是SVRl和SVR2 —部分的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸處被破壞。在Claudio 等，1998, Clin Diagn, Lab Immunol.5845-855 中，根據(jù)菌株 MC50 的PorA基因(登錄號X12899)將SVRl和SVR2最初定義為247至261位(SVRl)和299至302位(SVR2)位氨基酸。本文所涉及的van der Ley模型具有環(huán)6，如包含LSENGDKAKTKNSTTE (SEQID NO:52 ;參見表I)。根據(jù)圖3B所示排列中這些其他殘基中的一些中所看到的變化，SVR2區(qū)通常(但不必然)可包含大多數(shù)而并非所有的環(huán)6氨基酸，例如ENGDKTKN (SEQ ID NO:91)。從以上應(yīng)理解，在一個(gè)一般性實(shí)施方案中，本發(fā)明分離蛋白質(zhì)中可缺失一個(gè)或更多個(gè)完整的PorA可變區(qū)，或者可缺失一個(gè)或更多個(gè)PorA可變區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其中一個(gè)或多個(gè)保守PorA氨基酸(例如環(huán)2、3、7和/或8的氨基酸)或者完整的保守環(huán)(例如環(huán)2、3、7和/或8)有效替換缺失的可變區(qū)或可變區(qū)氨基酸。一些具體實(shí)施方案包括SEQ ID NO:5_16和20_22所述的氨基酸序列。一些優(yōu)選實(shí)施方案包括SEQ ID NO:11-16和20-22所述的氨基酸序列。應(yīng)理解，每個(gè)VR1、VR2、SVR1和/或SVR2區(qū)可獨(dú)立地被操作為缺失(例如，SEQ IDNO:5-10)，被保守環(huán)7或8的氨基酸替換(例如，SEQ ID NO:11-16和20-22)。這種操作可以組合在一起，使得一個(gè)可變區(qū)可缺失而另一個(gè)可變區(qū)被保守環(huán)7或8的氨基酸替換(例如，SEQ ID NO:13&14)，或者不同可變區(qū)可均被保守環(huán)7或8的氨基酸替換(例如，SEQ IDNO:15,16 和 20-22)。例如，多個(gè)可變區(qū)氨基酸可以是任何可變區(qū)(包括VR1、VR2、SVRl和SVR2在內(nèi))的 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 25 個(gè)或更多個(gè)氨基酸。合適地，所述氨基酸是連續(xù)的。表2和表3和圖1提供了一些具體實(shí)例。還例如，環(huán)2、3、7或8的多個(gè)保守氨基酸可以是這些環(huán)中任何一個(gè)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)或更多個(gè)氨基酸。合適地，氨基酸是連續(xù)的。表2和表3和圖1提供了一些具體實(shí)例。優(yōu)選地，VRl和VR2完全缺失，或者一個(gè)或多個(gè)VRl或VR2氨基酸缺失。在一些具體實(shí)施方案中，環(huán)7氨基酸替換整個(gè)VRl區(qū)和/或環(huán)8氨基酸替換整個(gè)VR2區(qū)(SEQ ID NO:11-16)。在另一些實(shí)施方案中，VRl區(qū)缺失并且被保守的環(huán)8或環(huán)7氨基酸序列替換，和/或VRl區(qū)缺失并且被保守的環(huán)7或環(huán)8氨基酸序列替換(SEQ ID NO:20-22)。在另一個(gè)一般性實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸(例如環(huán)2、3、7和/或8氨基酸)或整個(gè)保守環(huán)(例如環(huán)2、3、7和/或8)插入到或以其他方式存在于PorA可變區(qū)(包括VR1、VR2、SVR1和SVR2在內(nèi))中。合適地，存在一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)中的氨基酸，其中所述保守環(huán)氨基酸存在于或插入到可變區(qū)氨基酸序列中。優(yōu)選地，所述保守環(huán)氨基酸存在于或插入到PorA的VRl和/或VR2區(qū)中。一些具體實(shí)施方案包括SEQ ID NO:17-19所述的氨基酸序列。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，所述PorA蛋白的一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)被破壞(例如，與野生型PorA蛋白相 比)并且不包含一個(gè)或更多個(gè)PorA保守區(qū)或保守區(qū)氨基酸。SEQ IDNO:5-10中提供了該替代實(shí)施方案的一些優(yōu)選實(shí)例，其中一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)缺失并且未插入或存在一個(gè)或更多個(gè)PorA保守區(qū)或保守區(qū)氨基酸。還應(yīng)理解，雖然圖1 (SEQ ID NO:1)和表I涉及腦膜炎奈瑟氏菌菌株MC58，但是本發(fā)明可對腦膜炎奈瑟氏菌的任何菌株實(shí)施。更特別地，本發(fā)明分離蛋白質(zhì)可包含多種不同腦膜炎奈瑟氏菌菌株的氨基酸序列。例如，包含基本來源于或?qū)?yīng)于腦膜炎奈瑟氏菌菌株M1336PorA(基因庫登錄號AAF70297.1)的氨基酸序列的PorA蛋白中可包含腦膜炎奈瑟氏菌菌株2996PorA(基因庫登錄號X60105.1)的保守氨基酸。表7中提供了 PorA蛋白構(gòu)建體的總結(jié)。應(yīng)理解，破壞一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)使得分離蛋白質(zhì)保守氨基酸序列的免疫原性改變、修飾或以其他方式提高(相對于野生型或未破壞的PorA蛋白)。合適地，本發(fā)明分離蛋白質(zhì)引發(fā)針對多種腦膜炎奈瑟氏菌菌株的免疫應(yīng)答。本文使用的“引發(fā)免疫應(yīng)答”指本發(fā)明分離蛋白質(zhì)在其所施用的哺乳動(dòng)物中能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其中所述應(yīng)答針對腦膜炎奈瑟氏菌和/或所述蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生殺菌抗體。更優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答對腦膜炎奈瑟氏菌感染具有保護(hù)性。合適地，與由野生型PorA蛋白和/或沒有破壞一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)的PorA蛋白引發(fā)的免疫應(yīng)答相比，所述分離蛋白質(zhì)引發(fā)的免疫應(yīng)答的菌株特異性更低，或交叉反應(yīng)性更大。
本文上下文中使用的“菌株特異性”是指免疫應(yīng)答針對或至少主要針對自體腦膜炎奈瑟氏菌菌株。本文使用的“交叉反應(yīng)性”意指本發(fā)明分離蛋白質(zhì)能夠引發(fā)針對一種或更多種異源腦膜炎奈瑟氏菌菌株的免疫應(yīng)答。本文使用的“交叉保護(hù)性”意指本發(fā)明分離蛋白質(zhì)能引發(fā)免疫應(yīng)答，從而提供對抗一種或更多種異源腦膜炎奈瑟氏菌菌株感染的保護(hù)。本發(fā)明還提供了本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的片段、同源物和衍生物，例如包含SEQ IDNO:2-22(或優(yōu)選SEQ ID NO: 11-22)中任一個(gè)所述的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)“片段”包含構(gòu)成所述分離蛋白質(zhì)的少于100%，但至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 % 或 90-99 % 的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“片段”是長度為例如至少6個(gè)，優(yōu)選至少10、12、15個(gè)，更優(yōu)選至少20或30個(gè)氨基酸的肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述片段包含本文所述被破壞的可變區(qū)的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述片段不由VRl和/或VR2區(qū)的缺失組成(例如SEQ ID NO:2~4所述)。肽片段可通過采用標(biāo)準(zhǔn)重組核酸技術(shù)得到或者使用常規(guī)液相或固相合成技術(shù)合成。例如，例如，可參照書名為“Synthetic Vaccines”的出版物(Nicholson編輯,BlackwellScientific Publications 出版)中包含的第九章(Atherton 和 Shephard,名為 “PeptideSynthesis”)中所述的溶液合成或固相合成?；蛘?，通過用蛋白酶(如endoLys_C、endoArg-C、endoGlu_C和葡萄球菌V8-蛋白酶)消化本發(fā)明多肽可產(chǎn)生肽。消化片段可通過例如高效液相色譜(HPLC)技術(shù)進(jìn)行純化。
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還應(yīng)理解，考慮了包含多個(gè)相同或不同片段的較大肽和多肽。合適地，本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的片段包含一個(gè)或更多個(gè)抗原決定簇或表位。優(yōu)選地，所述抗原決定簇或表位能夠引發(fā)針對多種腦膜炎奈瑟氏菌菌株的免疫應(yīng)答。免疫原性片段可通過將所述片段施用于哺乳動(dòng)物并檢測哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答來鑒定。這種應(yīng)答包括產(chǎn)生特異性結(jié)合腦膜炎奈瑟氏菌和/或所述分離蛋白質(zhì)、變體或衍生物的要素，和/或產(chǎn)生對抗腦膜炎奈瑟氏菌感染的保護(hù)性作用。任選地，在上述方法中測試具體片段的免疫原性之前，可使用多種預(yù)測性方法來推斷具體片段是否可用于得到與天然抗原交叉反應(yīng)的抗體。這些預(yù)測性方法可基于氨基末端或羧基末端序列，如例如Ausubel等，第11.14章(見上)所述?；蛘?，這些預(yù)測性方法可基于親水性預(yù)測，如例如 Kyte&Doolittlel982, J.Mol.Biol.157105 和 Hopp&ffoods,1983, Mol.1mmunol.20483 (通過引用并入本文)所述；或基于二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，如例如Choo&Fasman, 1978, Ann.Rev.Biochem.47251 (通過引用并入本文)所述。此外，“表位作圖”使用本發(fā)明抗體通過以下過程鑒定交叉反應(yīng)性表位:首先測試其提供交叉保護(hù)的能力，然后鑒定所述抗體識別的表位。Coligan等，⑶RRENT PROTOCOLSIN IMMUNOLOGY(Mi)提供了一種示例性方法。本文使用的蛋白質(zhì)“同源物”與本發(fā)明分離蛋白質(zhì)具有可確定的核苷酸或氨基酸序列關(guān)系。合適地，與野生型PorA蛋白相比，所述同源物的可變區(qū)(例如，VR1、VR2、SVRl和/或SVR2)包含一個(gè)或更多個(gè)被破壞的氨基酸。合適地,所述同源物不是野生型PorA蛋白。優(yōu)選地,所述變體不由VRl和/或VR2區(qū)的缺失組成(例如SEQ ID NO:2-4所述)。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)同源物與本發(fā)明氨基酸序列具有至少70%或75%，優(yōu)選至少80%或 85% 或更優(yōu)選至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，本發(fā)明氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO:5-22或優(yōu)選SEQ ID NO:11-22中任何一個(gè)所述的氨基酸序列。例如，這些同源物具有的氨基酸序列不同于本文示例的那些，但是具有免疫原性并且優(yōu)選提供交叉保護(hù)性免疫。本文使用的術(shù)語“同源物”包括變體蛋白質(zhì)。本文使用的本發(fā)明“變體”蛋白質(zhì)的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸缺失或者被替換為不同氨基酸。本領(lǐng)域公認(rèn)的是，一些氨基酸可在不改變多肽免疫原性活性的情況下被替換或缺失(保守替換)。通過引入保守性較低的替換或缺失(非保守替換)可使免疫原性有更顯著的改
變。·術(shù)語“變體”還包括由等位基因變體的氨基酸序列產(chǎn)生或者包含該氨基酸序列的本發(fā)明分離蛋白質(zhì)。本文中一般用于描述各個(gè)蛋白質(zhì)及核酸之間序列關(guān)系的術(shù)語包括“比較窗(comparison window) ”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“實(shí)質(zhì)同源性”。因?yàn)楦鱾€(gè)核酸/蛋白質(zhì)可各自包含(I)核酸/蛋白質(zhì)共有的完全核酸/蛋白質(zhì)序列中的一個(gè)或更多個(gè)部分，和(2)核酸/蛋白質(zhì)之間不同的一個(gè)或更多個(gè)部分，所以序列比較通常如下進(jìn)行:在“比較窗”中比較序列，從而鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性。“比較窗”指與參照序列相t匕，通常6、9或12個(gè)連續(xù)殘基的概念性片段。比較窗可包括與參照序列相比約20%或更少的添加或缺失(即缺口)，以實(shí)現(xiàn)與相應(yīng)序列的最佳比對。用于比對比較窗的最佳序列比對可通過計(jì)算機(jī)執(zhí)行算法(Intelligenetics的Geneworks程序;Wisconsin Genetics軟件包版本 7.0 中的 GAP，BE STFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575ScienceDrive Madison，WI，USA，通過引用并入本文)進(jìn)行，或者通過觀察和選定的多種方法中任何一種來產(chǎn)生的最佳比對(即，在比較窗中產(chǎn)生最高百分比同源性)進(jìn)行。還可參照如例如Altschul等，1997, Nucl.Acids Res.253389 (通過引用并入本文)公開的程序BLAST家族進(jìn)行。在 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel 等編著(John ffiley&SonsInc NY, 1995-1999)的第19.3單元中可發(fā)現(xiàn)序列分析的詳細(xì)討論。本文使用的術(shù)語“序列同一性”以其最廣泛含義使用，包括考慮到使用標(biāo)準(zhǔn)算法進(jìn)行的合適比對、比較窗中的同一性程度的精確核苷酸或氨基酸匹配數(shù)。因此，“序列同一性百分比”通過以下來計(jì)算:在比較窗中比較兩個(gè)最佳比對的序列，確定兩條序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(如A、T、C、G、I)位置的數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，用匹配位置數(shù)目除以比較窗中總位置數(shù)目(即，窗大小)，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。例如，“序列同一性”可理解為意指通過DNASIS計(jì)算機(jī)程序(Windows為2.5版本，得自于HitachiSoftware engineering C0., Ltd., South San Francisco, California, USA)計(jì)算的“匹配百分比”。因此，技術(shù)人員完全有能力通過重組DNA技術(shù)制備本發(fā)明蛋白質(zhì)和核酸同源物，例如以上定義的變體。例如，本發(fā)明核酸可使用隨機(jī)誘變(例如使用轉(zhuǎn)座子誘變)或者定點(diǎn)誘變進(jìn)行突變。然后所得DNA片段被克隆到合適的表達(dá)宿主(例如大腸桿菌)中。
本文使用的“衍生物”蛋白質(zhì)已通過以下方法改變:例如，通過與另一些化學(xué)部分綴合或復(fù)合，通過翻譯后修飾(例如磷酸化、乙酰化等)、糖基化修飾(例如，添加、移除或改變糖基化)和/或包含本領(lǐng)域理解的另外的氨基酸序列。另外的氨基酸序列可包括產(chǎn)生融合蛋白的融合伴侶氨基酸序列。例如，融合伴侶氨基酸序列可有助于所述分離的融合蛋白的檢測和/或純化。非限制性實(shí)例包括金屬結(jié)合(如多組氨酸)融合伴侶、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、蛋白A、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、熒光蛋白序列(如GFP)、表位標(biāo)簽(如myc、FLAG和血凝素標(biāo)簽)。另一些衍生物包括具有可與基于寡糖的疫苗組分相融合的多肽的分離蛋白質(zhì)，其中所述多肽充當(dāng)載體蛋白。本發(fā)明考慮的另一些衍生物包括但不限于，修飾側(cè)鏈，在肽、多肽或蛋白質(zhì)合成期間并入非天然氨基酸和/或其衍生物，和使用交聯(lián)劑和其他方法在本發(fā)明多肽、片段和變體上施加構(gòu)象限制。本發(fā)明的另一方面提供了編碼本發(fā)明分離蛋白質(zhì)(包括分離蛋白質(zhì)的片段變體和衍生物在內(nèi))的分離核酸。本文使用的術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈DNU和RNA。DNA包括基因組DNA和cDNA。RNA包括mRNA、RNA、RNA1、siRNA、cRNA和自催化RNA。核酸也可以是DNA-RNA雜交體。核酸包含通常含有A、G、C、T或U堿基的核苷酸的核苷酸序列。但是，核苷酸序列可包括另一些堿基，例如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫脲核苷，但不限于此。“多核苷酸”是具有八十(80)個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”具有少于八十(80)個(gè)連續(xù)核苷酸?！疤结槨笨梢允菫榱死缭跈z測Northern或Southern印跡中檢測互補(bǔ)序列而被合適標(biāo)記的單鏈或雙鏈寡核苷酸或多核苷酸。“引物”通常是單鏈寡核苷酸，優(yōu)選具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸，其能夠退火至互補(bǔ)核酸“模板”上，通過DNA聚合酶(如Tag聚合酶、RNA依賴性DNA聚合酶或Sequenase )以模板依賴性方式延伸。本發(fā)明分離核酸的一些具體實(shí)施方案包含圖2所述的核苷酸序列(SEQ ID NO:26-43)。優(yōu)選地，所述分離核酸包含SEQ ID NO:32_43中任何一個(gè)所述的核苷酸序列。本發(fā)明的另一具體方面提供了編碼本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的分離核酸同源物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸同源物編碼本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的同源物或變體。合適地，核酸同源物不編碼腦膜炎奈瑟氏菌的野生型PorA蛋白。優(yōu)選地，核酸同源物包含編碼PorA中一個(gè)或更多個(gè)被破壞可變區(qū)的核苷酸序列，如本文所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸同源物與本發(fā)明分離核酸(例如，圖2中舉例說明的和/或SEQ ID NO:26-43，或優(yōu)選SEQ ID NO:32-43)具有至少60%或65%，優(yōu)選至少70%或75 %，更優(yōu)選至少80 %或85 %，甚至更優(yōu)選至少90 %或95 %的核苷酸序列同一性。在又一個(gè)實(shí)施 方案中，在至少低嚴(yán)格度條件下，優(yōu)選在至少中度嚴(yán)格度條件下，更優(yōu)選在高嚴(yán)格度條件下，核酸同源物與本發(fā)明分離核酸(例如圖2中舉例說明的和/或SEQID NO:26-43，或優(yōu)選 SEQ ID NO: 32-43)雜交。本文使用的“雜交”指使至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列配對以產(chǎn)生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA雜交體。包含互補(bǔ)核苷酸序列的雜交體序列通過本領(lǐng)域所公知的互補(bǔ)嘌呤和嘧啶之間的堿基配對發(fā)生。就這一點(diǎn)而言，應(yīng)理解修飾嘌呤(例如，肌苷、甲基肌苷和甲基腺苷)和修飾嘧啶(硫脲核苷和甲基胞嘧啶)也可參加堿基配對。本文使用的“嚴(yán)格度”指溫度和離子強(qiáng)度條件，以及在雜交期間是否存在某些有機(jī)溶劑和/或去污劑。嚴(yán)格度越高，雜交核苷酸序列之間所需的互補(bǔ)性水平越高。“高嚴(yán)格度條件”指僅有具有高頻率互補(bǔ)堿基的核酸會(huì)雜交的那些條件。本文涉及的高嚴(yán)格度條件包括并涵蓋:_(i)在42°C下至少約31% v/v至至少約50% v/v的甲酰胺和至少約0.0lM至至少約0.15M的鹽用于雜交，以及在42°C下至少約0.0lM至至少約0.15M的鹽用于清洗；(ii)在 65 °C 下 I % BSAUmM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7 % SDS 用于雜交，和在超過 65 °C 的溫度下(a) 0.1 X SSC, 0.1 % SDS ;或(b) 0.5 % BSA、ImM EDTA、40mMNaHPO4 (ρΗ7.2),1% SDS用于清洗約I小時(shí)；和(iii)在 68°C或 68°C 以上 0.2X SSC, 0.1% SDS 用于清洗約 20 分鐘。一般 來說，清洗在Tm = 69.3+0.41 (G+C) % _12°C下進(jìn)行。一般來說，錯(cuò)配堿基數(shù)目每增加I %，雙螺旋DNA的Tm降低約I °C。盡管如此，但是嚴(yán)格度條件也為本領(lǐng)域所公知，例如Ausubel等(見上)的第2.9和2.10章中描述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還認(rèn)識到，可對多種因素進(jìn)行操作以優(yōu)化雜交特異性。最終清洗的嚴(yán)格度的優(yōu)化可起到確保高雜交程度的作用。通常，通過印跡技術(shù)鑒定互補(bǔ)核苷酸序列，所述印跡技術(shù)包括將核苷酸固定化到基質(zhì)(優(yōu)選合成膜，如硝酸纖維素)上的步驟，雜交步驟，和通常使用標(biāo)記探針或其他互補(bǔ)核酸的檢測步驟。Southern印跡用于鑒定互補(bǔ)DNA序列；northern印跡用于鑒定互補(bǔ)RNA序列。斑點(diǎn)印記(dot blotting)和狹縫印跡(slot blotting)可用于鑒定互補(bǔ)DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA多核苷酸序列。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且已在Ausubel等(見上)的第2.9.1至2.9.20頁中進(jìn)行描述。根據(jù)這些方法，Southern印跡包括:通過凝膠電泳根據(jù)大小分離DNA分子，將經(jīng)大小分離的DNA轉(zhuǎn)移至合成膜，以及使與膜結(jié)合的DNA與互補(bǔ)核苷酸序列雜交。當(dāng)在cDNA或基因組DNA文庫中鑒定互補(bǔ)核酸時(shí)，使用替代的印跡步驟，例如通過菌斑雜交或菌落雜交。在Sambrook等(見上)的第8_12章中描述了該方法的另一些典型實(shí)例。用于檢測雜交至固定化核酸的標(biāo)記核酸的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。這些方法包括放射自顯影、化學(xué)發(fā)光、熒光和比色檢測。核酸也可被分離、檢測和/或進(jìn)行使用核酸序列擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)的重組DNA技術(shù)。合適的核酸擴(kuò)增技術(shù)為技術(shù)人員所公知，其包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、滾環(huán)復(fù)制(RCR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、Q-13復(fù)制酶擴(kuò)增和螺旋酶依賴性擴(kuò)增，但是并不限于此。本文使用的“擴(kuò)增產(chǎn)物”指由核酸擴(kuò)增產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。核酸擴(kuò)增技術(shù)可包括具體的定量和半定量技術(shù)，例如本領(lǐng)域公知的qPCR、實(shí)時(shí)PCR和競爭PCR。本發(fā)明的又一方面提供了包含本發(fā)明分離核酸和一種或更多種另外的核苷酸序列的基因構(gòu)建體。合適地，所述基因構(gòu)建體的形式為本領(lǐng)域公知的質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母或細(xì)菌人工染色體，或者包含它們的遺傳組分?；驑?gòu)建體可適合用于在細(xì)菌或其他宿主細(xì)胞中維持并擴(kuò)增分離核酸，用于通過重組DNA技術(shù)操作和/或表達(dá)本發(fā)明核酸或編碼蛋白質(zhì)。為了進(jìn)行宿主細(xì)胞表達(dá)，所述基因構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體。合適地，所述表達(dá)構(gòu)建體包含本發(fā)明核酸，所述本發(fā)明核酸與一種或更多種表達(dá)載體中另外的序列有效連接。表2和表3中提供了表達(dá)構(gòu)建體的一些非限制性實(shí)例?！氨磉_(dá)載體”可以是自主復(fù)制的外染色體載體(extra-chromosomal vector)(例如質(zhì)粒)或整合到宿主基因組中的載體。

“有效連接”指所述另外的核苷酸序列相對于本發(fā)明核酸被定位成引發(fā)、調(diào)節(jié)或以其他方式控制轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的核苷酸序列是調(diào)控序列。調(diào)控核苷酸序列一般適合于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域已知多種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和合適的調(diào)控序列用于多種宿主細(xì)胞。通常，所述一種或更多種調(diào)控核苷酸序列可包括但不限于，啟動(dòng)子序列、前導(dǎo)或信號序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和終止序列、翻譯啟動(dòng)和終止序列和增強(qiáng)子或激活子序列。本發(fā)明考慮了本領(lǐng)域已知的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是天然啟動(dòng)子，或?qū)⒍嘤谝环N啟動(dòng)子元件組合在一起的雜合啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述另外的核苷酸序列是允許選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因?yàn)楸绢I(lǐng)域所公知并且可隨所使用的宿主細(xì)胞改變而改變。另外的核苷酸序列的一個(gè)具體實(shí)施方案包含修飾的多聚G序列。野生型porA基因在其啟動(dòng)子中具有多聚G區(qū)段(tract)，其在菌株內(nèi)和菌株之間可變，從而引起可變表達(dá)水平。為了確保本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的一致表達(dá)，可對多聚G區(qū)段進(jìn)行修飾以減少變化，因?yàn)镚11與PorA的最佳表達(dá)有關(guān)。為了減少多聚G區(qū)段中的改變，可對其進(jìn)行修飾使得它被替換為G5AG5。所述表達(dá)構(gòu)建體還可包含編碼融合伴侶的另外的核苷酸序列(通常由表達(dá)載體提供)，使得本發(fā)明重組多肽表達(dá)為前文所述的融合蛋白。所述表達(dá)構(gòu)建體還可包含一種或更多種有助于表達(dá)構(gòu)建體中的分離核酸同源重組到細(xì)菌基因組中的另外的核苷酸序列。僅舉例說明，腦膜炎奈瑟氏菌的內(nèi)源性porA基因可被替換為外源性核苷酸序列(例如，pLK6的LacZ-Kanlr盒；Szabo等，1992,J.Bacterioll747245-7252)或 pJJ260 的 SacB-Kanr-Tefr 盒(Neil 等，2009，InfectImmun.772285-2293)，所述外源性核苷酸序列使得能夠選擇轉(zhuǎn)化體并與包含本發(fā)明分離核酸和另外的核苷酸序列(例如，PLK6的LacZ-Kanlr盒或pJJ260的SacB-Kanjr-Teflr盒)的表達(dá)構(gòu)建體同源重組。另一些同源重組方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。為了通過親和色譜純化融合多肽的具體目的，用于親和色譜的相關(guān)基質(zhì)分別是谷胱甘肽、淀粉糖、和鎳或鈷綴合樹脂。許多這樣的基質(zhì)可以以“試劑盒”形式使用，例如與(HIS6)融合伴侶使用的QIAexpress 系統(tǒng)(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統(tǒng)。
優(yōu)選地，所述融合伴侶還具有蛋白酶切割位點(diǎn)，例如Xa因子或凝血酶，其允許相關(guān)蛋白酶部分地消化本發(fā)明融合多肽，從而從其中釋放本發(fā)明重組多肽。然后可通過后續(xù)的色譜分離將釋放的多肽與融合伴侶分離。本發(fā)明分離蛋白質(zhì)(包括片段、衍生物和同源物在內(nèi))可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法來制備。優(yōu)選地，所述分離蛋白質(zhì)是重組蛋白質(zhì)。僅舉例說明，本發(fā)明重組分離蛋白質(zhì)可通過包括以下步驟的方法來產(chǎn)生:(i)制備表達(dá)構(gòu)建體，其包含與一種或更多種調(diào)控核苷酸序列有效連接的本發(fā)明分離核酸；(ii)用該表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞；(iii)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白；以及(iv)分離所述重組蛋白與所述宿主細(xì)胞。用于表達(dá)的合適宿主細(xì)胞可以是原核或真核的。例如，合適宿主細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。用于表達(dá)本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的一種優(yōu)選宿主細(xì)胞是細(xì)菌。所用細(xì)菌可以是大腸桿菌或腦膜炎奈瑟氏菌。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是腦膜炎奈瑟氏菌。優(yōu)選地，腦膜炎奈瑟氏菌宿主細(xì)胞被修飾成不表達(dá)內(nèi)源性PorA、Opa、Opc或莢膜多糖并且表達(dá)期望的脂多糖表型。將基因構(gòu)建體引入宿 主細(xì)胞(無論是原核還是真核)為本領(lǐng)域所公知，如例如 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY.Ausubel 等編著(John ffiley&Sons,Inc.1995-2009)，特別是第9和16章中所述。關(guān)于腦膜炎奈瑟氏菌的轉(zhuǎn)化，這些方法為本領(lǐng)域所公知。還應(yīng)理解，腦膜炎奈瑟氏菌是“天然”可轉(zhuǎn)化的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用標(biāo)準(zhǔn)方法便利地制備重組蛋白，所述標(biāo)準(zhǔn)方法如例如Sambrook 等，MOLECULAR CLONING.A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press,1989)，特別是第 16 和 17 部分；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY.Ausubel 等編著(John ffiley&Sons, Inc.1995-2009)，特別是第 10 和 16 章中 ^CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE.Coligan 等編著(John ffiley&Sons, Inc.1995-2009)，特別是第 1、5 和 6章中所述。本發(fā)明還提供了針對本文所公開的分離蛋白質(zhì)、片段、同源物和衍生物產(chǎn)生并且與其結(jié)合的抗體和/或抗體片段。合適地，所述抗體和/或抗體片段不結(jié)合野生型PorA蛋白。優(yōu)選地，所述抗體和/或抗體片段特異性結(jié)合被破壞的PorA可變區(qū)(例如，VR1、VR2、SVRl或SVR2區(qū))并且不結(jié)合野生型PorA可變區(qū)(例如，VR1、VR2、SVRl或SVR2區(qū))?？贵w可以是多克隆的或單克隆的，天然的或重組的。例如，在Coligan等，⑶RRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John ffiley&Sons NY，1991-1994)的第 2 章和 Harlow，E.&Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarboriCold Spring HarborLaboratory，1988(兩篇均通過引用并入本文)中可發(fā)現(xiàn)適用于抗體生產(chǎn)、純化和使用的公知方案。一般來說，本發(fā)明抗體與本發(fā)明分離蛋白質(zhì)、片段、同源物或衍生物結(jié)合或綴合。例如，所述抗體可以是多克隆抗體。例如，可通過將本發(fā)明分離蛋白質(zhì)、片段、同源物或衍生物注射到生產(chǎn)物種(可包括小鼠或兔子)中以得到多克隆抗血清來制備這種抗體。生產(chǎn)多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，在Coligan等，⑶RRENT PROTOCOLSINIMMUNOLOGY (見上)和Harlow，E.&Lane, 1988(見上)中描述了可使用的示例性方法。單克隆抗體可使用標(biāo)準(zhǔn)方法來產(chǎn)生，如例如Kiihler &Milstein，1975，Nature256，495的文章(通過引用并入本文)中所述,或者通過其最近的修改方法,如例如Coligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (見上)中所述，通過使來源于生產(chǎn)物種的脾或其他抗體生產(chǎn)細(xì)胞永生化來進(jìn)行，所述生物物種已用一種或更多種本發(fā)明分離蛋白質(zhì)、片段、同源物或衍生物接種。本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括抗體片段，例如以上提及的多克隆或單克隆抗體的Fe、Fab或F(ab)2片段?；蛘?所述抗體或抗體片段可包括針對本發(fā)明肽的單鏈Fv抗體(scFv)。例如，根據(jù)美國專利 No5, 091，513、歐洲專利 No239, 400 或Winter&Milstein，1991，Nature349293的文章中分別描述的方法，可制備這種svFv?？贵w和抗體片段可用于針對腦膜炎奈瑟氏菌感染的被動(dòng)免疫。優(yōu)選地，所述抗體具有殺菌性?？贵w和抗體片段可用于前文所述的表位作圖。本發(fā)明抗體和抗體片段可用于親和色譜。例如，可參照Coligan等，⑶RRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY第9.5章(見上)中描述的免疫親和色譜方法?？贵w和抗體片段可用于檢測腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌和/或腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白。在一方面中，一種檢測哺乳動(dòng)物的腦膜炎奈瑟氏菌的方法包括以下步驟:_(i)使本發(fā)明抗體或 抗體片段與得自于哺乳動(dòng)物的生物樣品合并；以及(ii)確定所述樣品中是否存在包含所述抗體或抗體片段與腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌和/或腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物存在指示所述腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌。生物樣品中是否存在腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌可通過以下方法來確定:從哺乳動(dòng)物中得到生物樣品，將上述抗體或抗體片段與生物樣品混合，檢測指示樣品中腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌存在的特異性結(jié)合抗體或抗體片段。通常，所述特異性結(jié)合的抗體或抗體片段與生物樣品中的腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白形成復(fù)合物。合適地，所述腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白衍生自或來源于感染所述哺乳動(dòng)物的腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌。本文使用的術(shù)語“生物樣品”指可從個(gè)體(如患者)中提取、未處理、處理、稀釋或濃縮的樣品。合適地，所述生物樣品選自全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹水、腹膜液、滑液、羊水、腦脊液、皮膚活檢等。在另一方面中，一種檢測生物樣品中針對腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白的抗體的方法包括以下步驟:_(i)使得自于哺乳動(dòng)物的生物樣品與本發(fā)明分離蛋白質(zhì)(例如，根據(jù)SEQ ID NO:2-22或優(yōu)選SEQ ID NO: 11-22)相接觸；以及(ii)確定所述樣品中是否存在包含所述分離蛋白質(zhì)與抗腦膜炎奈瑟氏菌PorA抗體的復(fù)合物。合適地，所述抗腦膜炎奈瑟氏菌PorA抗體是應(yīng)答于腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌感染哺乳動(dòng)物而弓I發(fā)的內(nèi)源性抗體?？墒褂糜糜诘鞍踪|(zhì)檢測的任何合適技術(shù)，其包括免疫測定、蛋白質(zhì)陣列(包括蛋白質(zhì)原位陣列、DNA-蛋白質(zhì)陣列和核酸可編程陣列和二維(2D)表達(dá)譜)，但是并不限于此。免疫測定可包括但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的免疫印跡、Western印跡和斑點(diǎn)印跡、放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和免疫色譜技術(shù)(ICT)。例如，可參照CoIigan 等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(Mi)的第 7 章，其公開了可根據(jù)本發(fā)明使用的多種免疫測定。免疫測定可包括本領(lǐng)域理解的競爭性測定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過用標(biāo)記修飾所述分離蛋白質(zhì)、片段、同源物或衍生物或者所述抗體或抗體片段來實(shí)現(xiàn)檢測。一個(gè)實(shí)施方案在免疫測定中使用標(biāo)記蛋白質(zhì)、片段、同源物或衍生物來檢測腦膜炎奈瑟氏菌特異性抗體。另一個(gè)實(shí)施方案在免疫測定中使用標(biāo)記抗體或抗體片段來檢測PorA蛋白。關(guān)于抗體和抗體片段，所述標(biāo)記可包括以下:(A)將標(biāo)記與抗體或抗體片段直接連接；(B)將標(biāo)記與抗體或抗體片段間接連接；即，標(biāo)記與另一種試劑(例如二抗)連接，后者進(jìn)而與抗體或抗體片段結(jié)合；和 (C)與抗體或抗體片段的后續(xù)反應(yīng)產(chǎn)物連接。所述標(biāo)記可選自色素原(chromogen)、催化劑、酶、突光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光分子、鑭系離子(如銪Eu34)、放射性同位素和直接可視標(biāo)記。在直接可視標(biāo)記的情況下，可使用膠體金屬或非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、有機(jī)聚合物、膠乳顆粒、脂質(zhì)體或其他包含信號產(chǎn)生物質(zhì)的囊泡等。用于本發(fā)明的酶標(biāo)記的非限制性實(shí)例包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光素酶、半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等，所述酶標(biāo)記可單獨(dú)使用或與溶液中的第二酶組合使用。熒光團(tuán)的非限制性實(shí)例包括異硫氰酸熒光素(FITC)、別藻藍(lán)素(APC)、熒光素衍生物(如FAM和R0X)、德克薩斯紅(Texas Red)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITL)、R-藻紅蛋白(RPE)、Alexa和Bodipy突光團(tuán)，但是并不限于此。本發(fā)明還提供了一種檢測生物樣品中抗腦膜炎奈瑟氏菌抗體(例如，殺菌抗體)的方法。在一方面中，提供了一種檢測針對腦膜炎奈瑟氏菌的殺菌抗體的方法，其包括以下步驟:_(i)使得自于經(jīng)本發(fā)明分離蛋白質(zhì)(例如，根據(jù)SEQ ID NO:2-22或優(yōu)選SEQ IDNO:11-22)免疫之哺乳動(dòng)物的生物樣品與腦膜炎奈瑟氏菌相接觸；以及(ii)確定所述樣品中是否存在所述殺菌抗體。通常，所述殺菌抗體應(yīng)答于分離蛋白質(zhì)的免疫而引發(fā)。下文實(shí)施例中提供了檢測殺菌抗體的殺菌測定的一個(gè)實(shí)例。在另一個(gè)一般性方面中，本發(fā)明提供了基于核酸的檢測方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種檢測生物樣品中腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌的方法包括以下步驟:從患者中分離生物樣品，并且使用本發(fā)明分離核酸來檢測樣品中編碼PorA蛋白的核酸序列。核酸的檢測可使用任何合適技術(shù)進(jìn)行。例如，如本領(lǐng)域所公知，本發(fā)明的標(biāo)記核酸可作為探針用于得自于患者的核酸提取物的Southern印跡?；蛘?本發(fā)明的標(biāo)記核酸可作為探針用于患者的RNA或eDNA提取物的Northern印跡。優(yōu)選地，將患者的核酸提取物與對應(yīng)于本發(fā)明核酸序列有義序列和反義序列的寡核苷酸引物配合使用，通過核酸擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過多種技術(shù)中的任何一種進(jìn)行檢測，例如通過上文所述的探針雜交。多種自動(dòng)化固相檢測技術(shù)也適用于檢測核酸。這些技術(shù)包括本領(lǐng)域公知的超大規(guī)模固定化引物陣列(VLSIPS )、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基于磁珠的捕獲和核酸陣列。本發(fā)明還提供了用于檢測腦膜炎奈瑟氏菌感染的試劑盒。所述試劑盒可包含一種或更多種用于檢測生物樣品中腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌、內(nèi)源性腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白或編碼核酸、或抗體的檢測劑。根據(jù)所采用測試方法的性質(zhì)，所述試劑盒包含一種或更多種上述的具體檢測劑。在這一點(diǎn)上，所述試劑盒可包含本發(fā)明分離蛋白質(zhì)、片段、同源物、衍生物、抗體、抗體片段或核酸(例如，引物或探針)中的一種或更多種。如上文所述，這些物質(zhì)的任何一種或更多種可被標(biāo)記。根據(jù)所采用的檢測方法，所述試劑盒還可任選地包含一種或更多種其他試劑，例如檢測試劑(如標(biāo)記的二抗、用于比色或生物性發(fā)光檢測的酶和/或底物)、陽性和/或陰性對照、清洗液、稀釋緩沖液、蛋白質(zhì)或核酸大小標(biāo)記、DNA聚合酶、DNA連接酶、Taq聚合酶等。 本發(fā)明的另一些方面提供了用于治療哺乳動(dòng)物腦膜炎奈瑟氏菌感染的預(yù)防性和治療性方法和/或藥物組合物。在一個(gè)具體方面中，預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物腦膜炎奈瑟氏菌感染的方法包括向哺乳動(dòng)物施用免疫原性劑的步驟，所述免疫原性劑選自:⑴本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)(例如，根據(jù)SEQ ID NO:2_22或優(yōu)選SEQ ID NO:11-22),包括其同源物、衍生物和片段；(ii)本發(fā)明的分離核酸(例如，SEQ ID NO:23_43或優(yōu)選SEQ ID NO:32-43)，包括其同源物、衍生物和片段；(iii)編碼(ii)的分離核酸的表達(dá)構(gòu)建體；(iv)包含(iii)的表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞；(V)與本發(fā)明分離蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或抗體片段；和/或(vi)包含(i)-(v)中一種或更多種，從而預(yù)防或治療所述哺乳動(dòng)物的所述腦膜炎奈瑟氏菌感染的藥物組合物。合適地，所述免疫原性劑在所述哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答，其與由野生型PorA蛋白和/或沒有一個(gè)或更多個(gè)被破壞可變區(qū)的PorA蛋白引發(fā)的免疫應(yīng)答相比菌株特異性更低，或交叉免疫性更高。優(yōu)選地，所引發(fā)的免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明分離蛋白質(zhì)(包括其同源物、衍生物和片段)存在于OMV中。制備OMV疫苗有許多公知方法,例如，如Frasch, C, L.van Alphen等.(2001).0uter Membrane Protein Vesicle Vaccines for Meningococcal Disease.MeningococcalVaccines !Methods and Protocols.A.Pollard and M.Maiden 編著，Humana Press.66:81-107中所述。
在另一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明分離蛋白質(zhì)(包括其同源物、衍生物和片段)由包含染色體整合的表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)菌表達(dá)。優(yōu)選地，所述細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏菌。合適地，所述藥物組合物包含可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。“可藥用載體、稀釋劑或賦形劑”指可安全用于全身施用的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。根據(jù)具體的施用途徑，可使用本領(lǐng)域公知的多種載體。這些載體可選自糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸鹽緩沖溶液、乳化劑、等滲鹽水和鹽(如礦物鹽,包括鹽酸鹽、溴化物和硫酸鹽)、有機(jī)酸(如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽)和無熱原水。一篇描述可藥用載體、稀釋劑和賦形劑的有用文獻(xiàn)是Remington' sPharmaceutical Sciences (Mack Publishing C0.N.J.USA, 1991),其通過弓I用并入本文。任何安全的施用途徑可用于施用本發(fā)明免疫原性劑。例如，可采用經(jīng)口、直腸、腸胃夕卜、舌下、口含、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)、透皮等。例如,肌內(nèi)和皮下注射適用于施用免疫原性組合物、疫苗和DNA疫苗。劑型包括片劑、分散體、懸液、注射劑、溶液、糖漿劑、錠劑、膠囊、栓劑、氣霧劑、透皮貼劑等。這些劑型還可包括特別設(shè)計(jì)成具體用于該目的的注射或植入控制釋放裝置或者經(jīng)修飾而額外發(fā)揮這種作用的其他形式的植入物。例如，可用例如疏水聚合物包被治療劑來實(shí)現(xiàn)所述治療劑的控制釋放，所述疏水聚合物包括丙烯酸樹脂、蠟、高碳脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸和某些纖維素衍生物(如羥丙甲纖維素)。此外，可通過使用其他聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球來實(shí)現(xiàn)控制釋放。適用于口服或腸胃外施用的本發(fā)明藥物組合物可呈現(xiàn)為離散單元(如膠囊、小袋或片劑，其各自包含預(yù)定量的一種或更多種本發(fā)明治療劑)，粉末或顆粒，或者水性液體、非水性液體中的溶液或懸液、水包油乳液或油包水液體乳液。這些組合物可使用制藥業(yè)方法中的任何一種來制備，但是所有的方法都包括將一種或更多種上述免疫原性劑與構(gòu)成一種或更多種必需成分的載體結(jié)合的步驟。一般來說，所述組合物通過以下過程制備:使本發(fā)明免疫原性劑與液體載體或細(xì)小固體載體或二者均勻并密切混合，然后，如果需要，則使產(chǎn)物成形為期望外觀。可以以與劑型配方相容的方式和免疫原性有效的這種量施用上述組合物，以使患者免于腦膜炎奈瑟氏菌感染或治療已有的感染。在本發(fā)明上下文中，施用于患者的劑量應(yīng)足以隨時(shí)間在患者中產(chǎn)生有益應(yīng)答，例如降低腦膜炎奈瑟氏菌水平，或抑制腦膜炎奈瑟氏菌感染。待施用免疫原性劑的量可取決于待治療對象，包括其年齡、性別、體重和一般健康狀況。在這一點(diǎn)上，施用所需免疫原性劑的確切量取決于醫(yī)師的判斷。在確定治療或預(yù)防腦膜炎奈瑟氏菌中待施用免疫原性藥劑的有效量時(shí)，醫(yī)生可評價(jià)循環(huán)血漿水平、疾病進(jìn)展和抗腦膜炎奈瑟氏菌抗體的產(chǎn)生。無論如何，本領(lǐng)域技術(shù)人員都可容易地確定本發(fā)明免疫原性劑的合適劑量。該劑量可以是約幾納克至幾毫克的本發(fā)明免疫原性劑。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫原性劑可以以治療性或預(yù)防性疫苗施用。因此，本發(fā)明延伸至涉及生產(chǎn)包含一種或更多種本發(fā)明免疫原性劑作為活性物質(zhì)的疫苗。關(guān)于生產(chǎn)這樣疫苗考慮了多種可 用方法。示例性方法包括，例如NEW GENERATIONVACCINES (1997, Levine 等，Marcel Dekker, Inc.New York, Basel Hong Kong)所述的那些方法，其通過引用并入本文。本發(fā)明免疫原性劑可與其他抗原(包括其他抗原的B或T細(xì)胞表位)混合、綴合或融合。此外，它可與下述載體綴合。當(dāng)使用本發(fā)明半抗原肽(即，與相應(yīng)抗體反應(yīng)，但自身不可引發(fā)免疫應(yīng)答的肽)時(shí)，其可與免疫原性載體綴合。有用的載體為本領(lǐng)域所公知并且包括例如:甲狀腺球蛋白；白蛋白，如人血清白蛋白；來自破傷風(fēng)、白喉百日咳、假單胞菌(Pseudomonas)、大腸桿菌、葡萄球菌(Staphylococcus)和鏈球菌(Streptococcus)毒素的毒素，類毒素或任何突變的交叉反應(yīng)性材料(crossreactive material, CRM);聚氨基酸,如聚(賴氨酸:谷氨酸)；流感病毒；輪狀病毒VP6、細(xì)小病毒VPl和VP2 ；乙型肝炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重組疫苗等?；蛘?，可使用載體蛋白或其他免疫原性蛋白質(zhì)的片段或表位。例如，本發(fā)明半抗原肽可與細(xì)菌毒素、類毒素或CRM的T細(xì)胞表位偶聯(lián)。在這一點(diǎn)上，可參照美國專利No5,785, 973。本發(fā)明免疫原性劑可以與腦膜炎奈瑟氏菌抗原或其他生物體(包括病原菌流感嗜血桿菌(H.1nfIuenzae) 、卡他莫拉菌(M.catarrhalis)、淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)、大腸桿菌、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)等)的抗原組合作為多價(jià)亞單元疫苗施用?；蛘呋蛄硗猓鼈兛膳c腦膜炎奈瑟氏菌的寡糖或多糖組分配合施用。疫苗和其他免疫原性組合物可包含本領(lǐng)域所公知的佐劑。本發(fā)明考慮的佐劑包括但不限于:表面活性物質(zhì)，例如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基雙十八烷基溴化銨、N，N-雙十八烷基-N’，N’雙(2-羥乙基-丙二酰胺)、甲氧基十六燒基甘油和多聚醇(pluronic polyol);聚胺,例如批喃、硫酸葡聚糖、聚IC卡波姆；肽,例如胞壁酰二肽和衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬肽(tuftsin);油乳劑；以及礦物凝膠如磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬；淋巴因子、QuilA和免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)。在關(guān)于OMV遞送的一些實(shí)施方案中，這些囊泡可通過或不通過佐劑(如鋁鹽)產(chǎn)生。關(guān)于佐劑的實(shí)例，也可參照國際公開W099/36544，其通過弓I用并入本文。在一些具體實(shí)施方案中，用于治療腦膜炎奈瑟氏菌感染的組合物和方法(包括疫苗和免疫方法)可包括編碼本發(fā)明分離蛋白質(zhì)的DNA表達(dá)構(gòu)建體。例如，本發(fā)明免疫原性劑可由減毒的病毒宿主表達(dá)。“減毒的病毒宿主”指天然基本無毒性或被處理成基本無毒性的病毒載體。可通過任何合適的物理方法(如熱處理)或化學(xué)方法(如甲醛處理)使病毒基本無毒性。“基本無毒性”指其感染性被破壞的病毒。理想地，破壞病毒的感染性而不影響攜帶病毒免疫原性的蛋白質(zhì)。由上可知，應(yīng)理解，減毒的病毒宿主可包含活病毒或滅活病毒?？捎糜诒景l(fā)明疫苗的減毒病毒宿主可包含病毒載體，包括腺病毒、巨細(xì)胞病毒，并優(yōu)選痘病毒，如牛痘(例如美國專利N0.4，603，112)和減毒的沙門氏菌(Salmonella)菌株(例如，如美國專利N0.4，550，081所述)。因?yàn)榛钜呙鐚?dǎo)致可給予基本持久性免疫的延長刺激，所以其特別有利。描述了多種可適用于使用奈瑟氏菌蛋白質(zhì)免疫的病毒載體和遞送方法的另一篇參考文獻(xiàn)是國際公開W099/36544，其通過引用并入本文。多價(jià)疫苗可由一種或更多種表達(dá)腦膜炎奈瑟氏菌不同表位(例如，腦膜炎奈瑟氏菌的其他表面蛋白質(zhì)或表位)的微生物來制備。此外，疫苗中可摻入其他病原微生物的表位。例如，這可包括構(gòu)建重組牛痘病毒以表達(dá)本發(fā)明核酸序列。在引入到宿主之后，所述重組牛痘病毒表達(dá)免疫原性劑，從而引發(fā)宿主CTL應(yīng)答。例如，可參照美國專利No4, 722，848 (通過引用并入本文)，其描述了用于免疫方法的牛痘載體和方法。用于本發(fā)明免疫原性劑的治療性施用或免疫的多種其他載體對本公開領(lǐng)域技術(shù)人員是很明顯的。為了可容易理解本發(fā)明并產(chǎn)生實(shí)際效果，現(xiàn)借助以下非限制性實(shí)施例描述一些具體的優(yōu)選實(shí)施方案。
實(shí)施例引言PorA是腦膜炎奈瑟氏菌的主要蛋白質(zhì)。PorA在菌株之間高度可變并且在患者和無癥狀攜帶者中均產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其程度使得其已被用作代表血清亞型系統(tǒng)的菌株鑒定標(biāo)志物(McGuinness等1990,見上)。PorA單體拓?fù)鋵W(xué)的通用模型顯示出八個(gè)胞外環(huán)(Derrick等1999,見上；van der Ley等1991,見上)。如表I所歸納,最長的環(huán)(I和4)可變性最大，環(huán)5和6中看到的可變性較小(分別為半可變區(qū)SVRl和2)，其余的環(huán)中基本上沒有可變性。預(yù)計(jì)環(huán)3在由PorA三聚體的每一個(gè)亞基形成的孔中形成“塞(plug)”。即使在環(huán)I和4中，菌株之間的大部分變化限于預(yù)計(jì)形成每個(gè)環(huán)尖端的那些殘基。這些被稱為可變區(qū)(VR) I和2。已鑒定了許多菌株的VRl和VR2序列(參見，例如圖3和表3和
4；Russell 等,2004, Emerg.1nfect.Dis.10674:http://pubmlst.0rg/neisseria/PorA/vrl.shtml 和 http://pubmlst.0re/neisseria/PorA/vr2.shtml)。出乎意料地，有大量科學(xué)文獻(xiàn)描述了 VR1/VR2外側(cè)區(qū)域如何也有助于針對腦膜炎奈瑟氏菌的免疫應(yīng)答(Jordans等，2004, Infect.Tmmun.726503-10 ；van der Voort 等，1996,見上；Mart in 等，2000,Vaccine 182476-81 ；ffedege 等，2003, Infect.Tmmun.713775-81 ；Kotelnikova 等，2005,Bull.Exp.Biol.139593-5 ;美國專利 7，238，345)。本發(fā)明提供了 本文舉例說明的兩個(gè)一般性實(shí)施方案:(1)缺失可變區(qū)，以使免疫應(yīng)答集中于在腦膜炎奈瑟氏菌菌株之間保守的PorA區(qū)域；和(2)新提供的保守區(qū)增強(qiáng)了針對腦膜炎奈瑟氏菌保守區(qū)的免疫應(yīng)答。實(shí)施例1產(chǎn)生可變環(huán)或可變區(qū)缺失的PorA等位基因，帶有選擇標(biāo)記的porA等位基因porA基因和側(cè)翼序列由腦膜炎奈瑟氏菌菌株MC58的基因組DNA通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增并克隆到pGEMTeasy中以產(chǎn)生pPorA。將該質(zhì)粒用作模板用于多個(gè)反向PCR反應(yīng)，或用于限制性酶消化介導(dǎo)的重組構(gòu)建。對質(zhì)粒進(jìn)行測序。以這種方式制備的質(zhì)粒具有表2和表3所列的一種或更多種缺失和/或破壞。其他質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(限制性酶消化、連接、克隆)構(gòu)建，以產(chǎn)生用選擇標(biāo)記替換PorA基因的質(zhì)粒(參見表2)。很明顯，氨基酸缺失的數(shù)目可以大于或小于所述的那些。實(shí)施例2用保守區(qū)替換了可變區(qū)的質(zhì)粒將質(zhì)粒pDELVRl-2和pPorA用作模板，通過PCR和其他標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生多個(gè)PorA等位基因，所述PorA等位基因中porA的VRl和VR2編碼區(qū)被表3和圖1所述的環(huán)7和8序列替換或修飾。很明顯，編碼PorA其他保守氨基酸序列(例如，稱為“環(huán)2”的序列，VSVGGGATQffGNR (SEQ ID NO:48))或任何其他保守PorA肽序列的DNA序列可摻入到環(huán)I和/或4中以增強(qiáng)對人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)的呈遞。圖1示出所述MC58和重組PorA序列的排列。實(shí)施例3用表達(dá)重組PorA的基因替換野生型PorA可通過自然轉(zhuǎn)化和同源重組將帶有表2、表3和圖1和圖2所述PorA核苷酸序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到腦膜炎奈瑟氏菌中，導(dǎo)致野生型PorA被替換為重組序列。或者，重組porA等位基因可由包含所述重組porA等位基因的質(zhì)粒擴(kuò)增，這些擴(kuò)增產(chǎn)物可用于轉(zhuǎn)化腦膜炎奈瑟氏菌。為了有助于鑒定轉(zhuǎn)化體，制備了受體腦膜炎奈瑟氏菌菌株，其中PorA基因缺失并且被替換為PLK6基因的LacZ-Kanlr盒或pJJ260的SacB-Kanlr-Tetlr盒(參見表2)。菌株￠3是受體菌株(Virji等，1995,見上)。菌株(*9 (Virji等，1995,見上)也用pPorDe1: LacZkan轉(zhuǎn)化，在包含X-Gal的培養(yǎng)基上生長之后選擇藍(lán)色菌落。然后將￠2:deIPorASacb的染色體DNA轉(zhuǎn)化到￠9:deIPorALacZ中并在X-Gal上選擇,選擇白色菌落以產(chǎn)生09de丨PorASacb。將后一菌株作為用于以包含變體PorA等位基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體。在含10%蔗糖的培養(yǎng)基上生長允許選擇porA: sacB等位基因已被替換為變體PorA基因的克隆。以這種方法，產(chǎn)生了腦膜炎奈瑟氏菌菌株，其表達(dá)缺失環(huán)1、4和5或者VRl和VR2分別被環(huán)7和8替換或修飾的PorA。很明顯，重組porA基因可與其他啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄連接并且可通過同源重組插入到腦膜炎奈瑟氏菌染色體中。實(shí)施例4修飾多聚G區(qū)段以改善細(xì)菌表達(dá)野生型porA基因在其啟動(dòng)子中具有在菌株內(nèi)或菌株之間可變的多聚G區(qū)段，并且引起可變的表達(dá)。為了確 保PorA和變體的一致表達(dá)，對多聚G區(qū)段進(jìn)行修飾以減少變化，因?yàn)镮lG與PorA的最優(yōu)表達(dá)有關(guān)。為了減少多聚G區(qū)段中的變化，可對其進(jìn)行修飾使得其被替換SG5AG515該序列與G11長度相同，但是其長度變化不像G11同聚物區(qū)段那樣頻繁。為此，合成了包含PorA上游約330個(gè)核苷酸的序列，其修飾區(qū)域包含替代天然多聚G區(qū)段的G5AG50該序列包含編碼PorA前38個(gè)氨基酸的核苷酸，并且還整合有PJJ260卡那霉素抗性基因的一部分。該序列通過DNA2.0合成，克隆到質(zhì)粒載體中。其用SphI和RsrII進(jìn)行切除，并用于替換pPorDel:SacB的Sph1-RsrII片段。將所得質(zhì)粒pPorDelSacFixG轉(zhuǎn)化到腦膜炎奈瑟氏菌菌株￠9中(Virji等，1995,見上)，得到菌株<3-Fix。這種受體的porA啟動(dòng)子的所有或一部分可被替換。03-Fix (用于后續(xù)轉(zhuǎn)化)在啟動(dòng)子中包含G11。用包含重組porA的DNA進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致TetRSacBKan區(qū)域被替換為變體porA等位基因。以這種方式，質(zhì)粒 DNA 或 PCR 擴(kuò)增物(用引物 PorAFl:5’GTTCGGTCGTTTCCGATAA-3’ (SEQ ID NO:54)和 0MWF5’ -GGGGTATAATTGAAGACGTATCGG-3’ (SEQ ID NO:92)擴(kuò)增)或基因組 DNA 通過在含10%蔗糖的培養(yǎng)基上選擇而允許鑒定具有重組porA表達(dá)的菌株。后續(xù)分析進(jìn)一步鑒定了啟動(dòng)子中G殘基的數(shù)目(參見表5)。很明顯，重組porA基因可與其他啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄連接并通過同源重組插入到腦膜炎奈瑟氏菌的染色體中。例如，腦膜炎奈瑟氏菌PorB基因的啟動(dòng)子和奈瑟氏菌opa基因的啟動(dòng)子從腦膜炎奈瑟氏菌或淋病奈瑟氏菌的基因組DNA擴(kuò)增，并且在將重組等位基因轉(zhuǎn)化到腦膜炎奈瑟氏菌之前，使用擴(kuò)增物替換表3所述質(zhì)粒中任何一種的porA啟動(dòng)子。例如，登錄號AE002098.2的核苷酸2157459-2157528包含腦膜炎奈瑟氏菌菌株 MC58porB 基因的啟動(dòng)子(5 ’ -TAAATGCAAAGCTAAGCGGCTTGGAAAGCCCGGCCGGCTTAA ATTTCTTAACCAAAAAAGGAATACAGCA-3’；SEQ ID NO:93)。相似地，如 Belland 等.1997，MolMicrobiol.23:123-35所述，使用引物通過PCR可擴(kuò)增淋病奈瑟氏菌菌株MSllopaA的啟動(dòng)子。實(shí)施例5重組PorA引發(fā)針對異源PorA表位的交叉反應(yīng)性可由腦膜炎奈瑟氏菌制備包含本發(fā)明PorA蛋白的外膜囊泡(OMV)并作為疫苗施用。制備OMV疫苗及其帶有或不帶有佐劑(如鋁鹽)的制劑有許多公知的方法，如Frasch等.(2001), Outer Membrane Protein Vesicle Vaccines for Meningococcal Disease.Meningococcal Vaccines:Methods and Protocols.A.Pollard and M.Maiden編著，HumanaPress.66:81-107 所述。簡言之，通過脫氧膽酸鹽方法分離OMV蛋白并通過BCA測定蛋白質(zhì)濃度，然后吸附于氫氧化鋁凝膠(Sigma)。在第0、21和28天向10只BALB/c小鼠的組注射0.1-10 μ g總蛋白質(zhì)，然后在最后一次施用疫苗14天后通過末端放血收集血液。可由通過公知方法由血液制備血清。簡言之，使血液在室溫下凝固I至2小時(shí)，然后在4°C孵育過夜。在4°C下5分鐘以10，OOOXg離心10分鐘后收集作為上清液的血清。將血清稀釋于PBS并用于針對四種菌株及其同基因AporA::tet突變體的十二烷基肌氨酸鈉不溶性蛋白質(zhì)的Western免疫印跡。二抗是山羊抗小鼠IgG堿性磷酸酶綴合物(Sigma)，并且使用NBT/BCIP (Sigma)通過比色法來檢測結(jié)合。這表明接種OMV的小鼠的血清識別所有菌株的PorA(參見表5和圖5)，所述OMV包含菌株1728-2(表達(dá)VRl替換為環(huán)7和VR2替換為環(huán)8的PorA;SEQ ID NO:15)的分離蛋白質(zhì)。所用菌株(及其相關(guān)PorA血清亞型)是此58$1.7，16-2)、82133( 1.18-1,3)、BZ232 (P1.5-2, 2-2)和 400 (P1.19，15)。實(shí)施例6重組PorA引發(fā)針對異源PorA表面表位的交叉反應(yīng)性(通過ELSIA測定)將在固體培養(yǎng)基(BHI瓊脂)上過夜培養(yǎng)的細(xì)菌傳代培養(yǎng)4小時(shí)，然后重懸至A600nm = 0.1,熱滅活(56。。，30分鐘)，然后涂覆平底96孔板(Nunc immunosorp)。如實(shí)施例5所述從接種了 0.1-0.5 μ g蛋白質(zhì)(作為OMV制備)的小鼠中收集血清。在本測定中對來自疫苗接種小鼠的血清識別細(xì)菌細(xì)胞的能力進(jìn)行測試。二抗是山羊抗小鼠免疫球蛋白HRP綴合物(DAK0 P0447，針對小鼠免疫球蛋白(主要是IgG)產(chǎn)生)。圖6A和6B和表6中報(bào)道的倒數(shù)幾何平均效價(jià)是讀數(shù)高于在陰性對照(定義為陰性對照OD加3SD的平均值)的最后一次稀釋度。在每種情況下，針對親本菌株(400、BZ133和BZ232)和各自的同基因PorA突變菌株對血清進(jìn)行測試。出乎意料地，來自菌株1728-2(表達(dá)VRl替換為環(huán)7和VR2替換為環(huán)8的PorA ;SEQ ID NO:15)和菌株D145 (表達(dá)環(huán)1、4和5缺失的PorA ;SEQID NO:5)的OMV引發(fā)識別這三種測試菌株的抗體，其效價(jià)高于三種測試PorA突變菌株。相反地，在本實(shí)驗(yàn)中來自菌株0 9 (表達(dá)PorA Pl.7，16-2)、菌株027-3(表達(dá)SEQ ID N0:13的PorA)和菌株028-10 (表達(dá)SEQ ID NO:14的PorA)沒有一致地引發(fā)與PorA突變菌株相比更好地識別野生型菌株的鼠抗體。實(shí)施例7
評價(jià)帶有變體PorA的OMV靶向自體或異源菌株之能力的殺菌測定通過Hoogerhout 等.I995Infection and Immunity63:3473-3478 所述方法的修改方法進(jìn)行本測定。簡言之，細(xì)菌在5% CO2中在37°C在BHI板上過夜培養(yǎng)。將來自此過夜培養(yǎng)物的細(xì)菌在相同條件下傳代培養(yǎng)4至6小時(shí)，然后重懸于ImL PBS中。將細(xì)菌懸液調(diào)節(jié)為PBS中約105cfu/mL。在56°C將待測試血清熱滅活45分鐘。幼兔補(bǔ)體得自于商品供應(yīng)商(如PelFreez)。在無菌聚苯乙烯平底96孔微滴定板上進(jìn)行測定。每個(gè)孔的總體積是24 μ L，其包含:12 μ L PBS中的兩倍連續(xù)稀釋的血清和6μ L細(xì)菌懸液(包含300-900個(gè)細(xì)菌)。將血清和細(xì)菌在室溫下孵育10分鐘，然后添加6 μ L PBS中的80%補(bǔ)體(最終濃度為20% v/v)。對照是a)TOS、細(xì)菌和補(bǔ)體；b)TOS、細(xì)菌和血清。在添加所有組分并混合之后，將每個(gè)對照孔中的7 μ L等份試樣轉(zhuǎn)移至BHI瓊脂板。將微滴定板在5% CO2中在37°C孵育60分鐘。這次孵育之后，將每個(gè)對照孔中的7yL等份試樣轉(zhuǎn)移至BHI瓊脂板。所有的BHI板在5% CO2中在37°C孵育14-18小時(shí)，然后對細(xì)菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。血清殺菌報(bào)告為至少90%細(xì)菌被殺死的最高倒數(shù)稀釋度。在每種情況下，針對MC58、MC58por::tet和針對表達(dá)異源性PorA或其PorA突變體的菌株測試了單獨(dú)或合并的小鼠血清(MC58PorA是Pl.7,16.2，而例如菌株2996和皿990分別是？1.5.1,2-2和Pl.18，25，參見圖3A)。貫穿本說明書的目的是描述一些本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，而并非將本發(fā)明限制在任何一個(gè)實(shí)施方案或特征的具體集合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，根據(jù)本公開內(nèi)容，在不偏離本發(fā)明范圍的情況下可對舉例的具體實(shí)施方案進(jìn)行多種修飾和改變。本文提及的所有計(jì)算機(jī)程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)均通過引用并入本文。表1.MC58PorA(Pl.7，16.2，登錄號AF226344)的環(huán)序列。粗體指示血清亞型之間相同或保守的殘基。環(huán)的范圍遵循van der Ley等，1991 (見上)或Derrick等，1999 (見上)提出的PorA模型的先例。
權(quán)利要求
1.分離的蛋白質(zhì)，其包含腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)PorA蛋白的氨基酸序列，其中所述PorA蛋白的一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)通過包含一個(gè)或更多個(gè)PorA保守區(qū)或保守區(qū)氨基酸而被破壞。
2.權(quán)利要求1所述分離的蛋白質(zhì)，其中所述一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)選自VRl區(qū)、VR2區(qū)、SVRl區(qū)和SVR2區(qū)。
3.權(quán)利要求2所述分離的蛋白質(zhì)，其中所述一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)選自VRl區(qū)和VR2區(qū)。
4.權(quán)利要求1所述分離的蛋白質(zhì)，其中所述porA保守區(qū)是環(huán)2、環(huán)3、環(huán)7和/或環(huán)8的氨基酸序列，或者包含所述氨基酸序列。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)，其中所述一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)或其一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被缺失。
6.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)，其中所述一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)包含一個(gè)或更多個(gè)插入到其中的PorA保守區(qū)或保守區(qū)氨基酸。
7.前述權(quán)利要求 中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)，其包含SEQID NO:5-22中任一個(gè)所示的氨基酸序列。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)，其包含SEQID NO:11-22中任一個(gè)所示的氨基酸序列。
9.分離的蛋白質(zhì)，其是前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)的變體，并與其具有至少80%的序列同一性，其中所述分離的蛋白質(zhì)不是野生型PorA蛋白。
10.分離的蛋白質(zhì)，其是前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)的衍生物。
11.分離的蛋白質(zhì)，其是包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)的至少二十(20)個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，或者包含所述片段。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)，其能夠引發(fā)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答與所述相應(yīng)野生型PorA蛋白所引發(fā)的免疫應(yīng)答相比菌株特異性更低。
13.權(quán)利要求12所述分離的蛋白質(zhì)，其中所述免疫應(yīng)答提供針對多種腦膜炎奈瑟氏菌菌株的保護(hù)。
14.外膜蛋白囊泡(OMV)，其包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)。
15.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)。
16.權(quán)利要求15所述分離的核酸,其包含SEQID NO:26-43中任一個(gè)所不的核苷酸序列。
17.權(quán)利要求15所述分離的核酸,其包含SEQID NO:32-43中任一個(gè)所不的核苷酸序列。
18.分離的核酸,其包含與權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述核苷酸序列具有至少80%同一'I"生的核苷酸序列。
19.基因構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述分離的核酸以及一種或更多種另外的核苷酸序列。
20.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求19的基因構(gòu)建體。
21.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌。
22.權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其是腦膜炎奈瑟氏菌。
23.一種制備重組蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟:(i)培養(yǎng)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，使得所述重組蛋白質(zhì)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)；以及 ( )分離所述重組蛋白質(zhì)。
24.抗體或抗體片段，其與權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)相結(jié)合，或者針對所述蛋白質(zhì)而產(chǎn)生。
25.一種檢測哺乳動(dòng)物中的腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌的方法，所述方法包括以下步驟: (i)使權(quán)利要求24的抗體或抗體片段與得自哺乳動(dòng)物的生物樣品合并；以及 ( )確定所述樣品中是否存在包含所述抗體或抗體片段和腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌或PorA蛋白的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的存在指示所述腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌。
26.一種檢測針對腦膜炎奈瑟氏菌PorA蛋白的抗體的方法，所述方法包括以下步驟: (i)使得自哺乳動(dòng)物的生物樣品與權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)相接觸；以及 ( )確定所述樣品中是否存在包含所述分離的蛋白質(zhì)和腦膜炎奈瑟氏菌PorA抗體的復(fù)合物。
27.一種檢測針對腦膜炎奈瑟氏菌的殺菌抗體的方法，所述方法包括以下步驟: (i)使得自用權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行了免疫的哺乳動(dòng)物的生物樣品與腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌相接觸；以及( )確定所述樣品中是 否存在所殺菌抗體。
28.一種檢測腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌的方法，所述方法包括以下步驟:使用權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述分離的核酸對得自哺乳動(dòng)物的生物樣品中的核酸序列進(jìn)行檢測，以指示所述腦膜炎奈瑟氏菌細(xì)菌的存在。
29.權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品可得自于人。
30.用于檢測腦膜炎奈瑟氏菌感染的試劑盒，所述試劑盒包含:權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)，權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述分離的核酸，和/或權(quán)利要求24的抗體或抗體片段，和任選的一種或更多種其他試劑。
31.藥物組合物，其包含:權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)，權(quán)利要求14的外膜囊泡(OMV)，權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述分離的核酸，權(quán)利要求19的基因構(gòu)建體，權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，權(quán)利要求24的抗體或抗體片段，和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
32.權(quán)利要求31的藥物組合物，其是疫苗。
33.權(quán)利要求31或權(quán)利要求32的藥物組合物，其包含處于外膜蛋白囊泡(OMV)中的所述分離的蛋白質(zhì)。
34.權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的藥物組合物，其包含細(xì)菌，所述細(xì)菌含有染色體整合的基因構(gòu)建體。
35.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所述細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏菌。
36.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物的腦膜炎奈瑟氏菌感染的方法，所述方法包括以下步驟:向所述哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)，權(quán)利要求14的外膜囊泡，權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述分離的核酸，權(quán)利要求19的基因構(gòu)建體，權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，權(quán)利要求24的抗體或抗體片段，和/或權(quán)利要求31至35中任一項(xiàng)的藥物組合物，從而預(yù)防或治療所述哺乳動(dòng)物的所述腦膜炎奈瑟氏菌感染。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌，所述細(xì)菌包含染色體整合的基因構(gòu)建體。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏菌。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述分離的蛋白質(zhì)處于外膜蛋白囊泡(oMV)中。
40.權(quán)利要求36至39中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
41.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述分離的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求14的外膜囊泡、權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述分離的核酸、權(quán)利要求19的基因構(gòu)建體、權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求24的抗體或抗體片段，其用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物的腦膜炎奈瑟氏菌感染。
42.權(quán)利要求41之用途的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌，所述細(xì)菌包含染色體整合的基因構(gòu)建體。
43.權(quán)利要求42之用途的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌是腦膜炎奈瑟氏菌。
44.權(quán)利要求31所述分離的蛋白質(zhì)，其處于外膜蛋白囊泡(oMV)中。
全文摘要
本發(fā)明提供了腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)PorA構(gòu)建體，其一個(gè)或更多個(gè)可變區(qū)通過插入完整保守區(qū)或保守區(qū)氨基酸而被破壞。PorA的高免疫原性可變區(qū)是引發(fā)不具有廣泛保護(hù)性的菌株特異性免疫應(yīng)答的原因，所以破壞可變區(qū)使得免疫應(yīng)答針對保守區(qū)表位，從而針對更廣譜的腦膜炎奈瑟氏菌菌株提供有效免疫。本發(fā)明還提供了編碼核酸、基因構(gòu)建體、表達(dá)PorA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，以及用于檢測和治療腦膜炎奈瑟氏菌感染的組合物、試劑盒和方法。
文檔編號A61K39/095GK103189387SQ201180047044
公開日2013年7月3日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者邁克爾·保羅·詹寧斯, 伊恩·理查德·安塞爾姆·皮克 申請人:格里菲斯大學(xué)