專利名稱：嵌合il-1受體i型激動劑和拮抗劑的制作方法
嵌合IL-1受體I型激動劑和拮抗劑交叉引用和優(yōu)先權申明本申請要求以下美國臨時專利申請的優(yōu)先權:2010年7月29日提交的序列號61/368，799,2011年I月25日提交的序列號61/436，178,2011年I月25日提交的序列號61/436，184,2011年6月6日提交的序列號61/493，966以及2011年6月6日提交的序列號61/493，967，并且對于美國專利申請以引用的方式并入2010年7月29日提交的序列號61/368，799,2011年I月25日提交的序列號61/436，184以及2011年6月6日提交的序列號61/493，967的內(nèi)容。
背景技術：
白介素-1a (IL-1a)和β (IL_1 β )是免疫調(diào)節(jié)細胞因子家族的原型成員，并在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中具有多種重要的作用。IL-1a和IL-1 β與白介素-1受體I(IL-1RI)結(jié)合，從而導致第二受體即白介素-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)的接合。由IL-1 α和IL-1 β激動的信號轉(zhuǎn)導導致放大的T細胞應答，包括初始T細胞的增殖和存活以及Τη17細胞的發(fā)育。發(fā)明概述本文的特征在于非天然存在的細胞因子結(jié)構域，其尤其可用于調(diào)節(jié)響應白介素-1受體I (IL-1RI)的細胞信號轉(zhuǎn)導,用于治療疾病，以及用于檢測細胞受體和/或與細胞受體結(jié)合，以及其他藥劑。在一個方面，本公開的特征在于包含細胞因子結(jié)構域的分離的蛋白質(zhì)，該細胞因子結(jié)構域含有來自至少兩個親本細胞因子結(jié)構域的氨基酸殘基，例如，來自至少兩個親本細胞因子結(jié)構域的 受體結(jié)合特征、表面特征、β鏈和環(huán)。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域與IL-1RI結(jié)合并包含來自不同親本細胞因子結(jié)構域的受體結(jié)合特征，例如，來自受體激動劑和受體拮抗劑(諸如IL-1 β和IL-1Ra，或 IL-1a 和 IL-1Ra)、來自 IL-1 β 和 IL-1 α 或來自 IL_lRa、IL_la 和 IL-1Ra 所有三者。這些受體結(jié)合特征可對應于位點A和B中的殘基、片段或區(qū)域。至于在IL-KIL-1 β、IL-1 α和IL-1Ra)的情況下對應于位點A和B的此類殘基、片段和區(qū)域，詳見下文的定義。至于位點A，該細胞因子結(jié)構域可具有:(a) (i)與第一親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位點A殘基；(a) (ii)與第一親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的擴展位點A殘基；(a) (iii)與第一親本細胞因子結(jié)構域的對應區(qū)域具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的位點A片段Al和A2 ;和/或(a) (iv)與第一親本細胞因子結(jié)構域的對應區(qū)域具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的位點A區(qū)域。至于位點B，該細胞因子結(jié)構域可具有:(b) (i)與第二親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位點B殘基；(b) (ii)與第二親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的擴展位點B殘基；(b) (iii)與第二親本細胞因子結(jié)構域的對應區(qū)域具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的位點B片段B1、B2和B3 ;和/或(b) (iv)與第二親本細胞因子結(jié)構域的對應區(qū)域具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的位點B區(qū)域。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含以下特征:(a) (i)和b(i)、(a) (ii)和b(ii)、(a) (iii)和(b) (iii)或(a) (iv)和(b) (iv),例如,其中各特征進一步通過 80、85、88、90、92、95或100%的同一性所限定。例如，第一親本細胞因子結(jié)構域可以為IL-Ιβ，以及第二親本細胞因子結(jié)構域可以為IL-1Ra。例如，第一親本細胞因子結(jié)構域可以為IL-1a，以及第二親本細胞因子結(jié)構域可以為IL-1Ra。細胞因子結(jié)構域還可以在該結(jié)構域的一個或多個位置包含來自第二親本細胞因子結(jié)構域的氨基酸，它們減弱與細胞因子第二受體(例如，IL-1RAcP)的相互作用。例如，第二親本細胞因子結(jié)構域為IL-1Ra。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含來自IL-1Ra的一個或多個位點C和/或D片段(例如，CU DU D2、D3、D4和/或D5)，或與此類片段具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的序列。例如，該細胞因子結(jié)構域包含(i)與IL-1Ra中的對應殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位點C殘基，(ii)與IL-1Ra中的對應殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位點D殘基，(iii)與I L-1Ra中的對應殘基具有至少70、75、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的Cl片段，或(iv)在至少3、4或5個殘基與IL-1Ra中的對應殘基相同的D2片段。該細胞因子結(jié)構域可包含特征(i)和(ii)或(ii)和(iii)，例如，其中各特征進一步通過80、85、88、90、92、95或100%的同一性而限定，或(iii)和(iv)。該結(jié)構域可包含來自至少兩個不同的人IL-1家族細胞因子結(jié)構域的區(qū)域，其中所述區(qū)域選自A區(qū)域(具有Al和A2片段)、B區(qū)域(具有B1、B2和B3片段)、C區(qū)域以及D區(qū)域(具有01、02、03、04和D5片段)。該細胞因子結(jié)構域可包含來自不同細胞因子結(jié)構域的位點A區(qū)域和位點B區(qū)域。位點A區(qū)域可來自天然存在的受體激動劑或拮抗劑；位點B可來自天然存在的受體激動劑。它可包含來自天然存在的受體拮抗劑的位點C區(qū)域和/或來自天然存在的受體拮抗劑的位點D區(qū)域。例如，該結(jié)構域可以是具有以下片段的嵌合結(jié)構域，所述片段長度為至少5、6、10、15,20或25個氨基酸并與來自至少兩個不同親本細胞因子結(jié)構域諸如第一和第二親本細胞因子結(jié)構域的對應片段具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。親本細胞因子結(jié)構域可以為IL-1RI結(jié)合細胞因子，諸如IL-1 β、IL-la和IL-1Ra。在一些實施方案中，不在來自第一親本細胞因子結(jié)構域的片段中的氨基酸來自兩個或更多個其他親本細胞因子結(jié)構域。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含長度為至少5、6、10、15、20或25個氨基酸的與第一親本細胞因子結(jié)構域的對應片段具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的至少兩個片段，并且不在此類片段中的氨基酸大部分(例如，至少50、60、70、80、85、88、90,92,95或100%)與第二親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基相同。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含(i)長度為至少5、6、10、15、20或25個氨基酸的與第一親本細胞因子結(jié)構域的對應片段具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的至少兩個片段，以及(ii)例如長度為至少5、6、7、8、10或15個氨基酸的與第二親本細胞因子結(jié)構域相同的至少一個、兩個或三個片段。例如，該細胞因子結(jié)構域可包含20-50、25-50、30-45或30-40個(例如，29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 個)氨基酸的第一片段，和 20-45、20-40、25-40 或 25-35 個(例如，25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個)氨基酸的第二片段，每一個均與第一親本細胞因子結(jié)構域(例如，IL-1Ra)相同(或具有至少80、85、88、90、92、95或98%同一性)，以及與第二親本細胞因子結(jié)構域(例如，IL-1 β或IL-1a )相同(或具有至少80、85、88、90、92、95或98%同一性)的第三片段。例如，第三片段長度可以為55-90、60-90、60-85或70-85個氨基酸，例如，75、76、77、78、79、80、81、82、83、84 或 85 個氨基酸。在一些實施方案中:第一片段可以為與WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ IDNO:9，本文也稱為Al片段，并對應于SEQ ID NO: 3的第16-40位殘基以及根據(jù)IL-1 β編號的第11-36位殘基)具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的片段。第二片段可以為與 SEQ ID NO: 3 (IL-1Ra)的第 120-140 或 120-141 位殘基具有至少 80、85、88、90、92、95、98或100%同一性，對應于第121-139或121-140位殘基(根據(jù)IL-1 β編號)的片段。第三片段可以與來自IL-1 β (SEQ ID NO:1)的第45-100或42-120位殘基具有至少80、85、88、90、92、95、98 或 100% 同一性。在一些情況下，第一片段可以為與SEQ ID NO:3的第14-45位殘基(對應于根據(jù)IL-1 β編號的第9-41位殘 基)具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的片段。第二片段可以為與SEQ ID NO:3的第120-145位殘基(對應于根據(jù)IL-1 β編號的第121-145位殘基)或SEQ ID NO:3的第120-147位殘基(對應于根據(jù)IL-1 β編號的第121-147位殘基)具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的片段。在一些實施方案中，至少第11-41和120-147位殘基(根據(jù)IL-1 β編號)共同地與IL-1Ra中的對應殘基具有至少80、85、88、90、92、95、98 或 100% 同一性。在一些實施方案中，第一 IL-1家族細胞因子結(jié)構域的片段之一的末端位于SEQ IDNO:1的第41位氨基酸的五個、四個、三個、兩個或一個氨基酸內(nèi)，以及第一 IL-1家族細胞因子結(jié)構域的片段之一的末端位于SEQ ID NO:1的第121位氨基酸的五個、四個、三個、兩個或一個氨基酸內(nèi)。在一些實施方案中，該結(jié)構域包含:具有SEQ ID NO:1第42位氨基酸的五個、四個、三個、兩個或一個氨基酸內(nèi)某一位置處的N端以及SEQ ID NO:1第120位氨基酸的五個、四個、三個、兩個或一個氨基酸內(nèi)的C端的片段，和/或具有SEQ ID NO:1第121位氨基酸的五個、四個、三個、兩個或一個氨基酸內(nèi)某一位置處的N端以及SEQ ID Ν0:1的第145位氨基酸的五個、四個、三個、兩個或一個氨基酸內(nèi)的C端的片段。在一些實施方案中，該結(jié)構域中在對應于11-41和120-147(根據(jù)IL-1 β編號)的位置處的殘基共同地與IL-1Ra中的對應殘基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性。該結(jié)構域還可基于來自IL-1細胞因子家族成員的序列，例如，在與前述位置相似的位置。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含以下序列中的一者、兩者、三者或更多者:WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO:9)；NLEEK(SEQ ID NO: 10)；RIffDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11)；AMEADQP(SEQ ID NO:12)；FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO: 13);和 / 或與前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的序列。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含以下序列中的一者、兩者、三者或更多者:VQGEESNDKI(SEQ ID NO: 14)；KKKMEKRF(SEQ ID NO:15)和 FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES(SEQ ID NO: 16);和 / 或與前述序列具有至少 80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的序列。在一些實施方案中，β1β2、β2β3、β8β^Ρβ 10 β 11環(huán)的一者或多者或全部與IL-1拮抗劑(如，IL-1Ra)的對應環(huán)具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。在一些實施方案中，β4β5、β5β6、β6β7和β7β 8環(huán)的一者或多者或全部與來自不同于與β1β2、β2β3、β8β9和βΙΟβΙΙ環(huán)最相似的人親本細胞因子的IL-1家族細胞因子結(jié)構域的相應環(huán)具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。例如，β4β5、β5β6、β6β7和β 7 β 8環(huán)的一者或多者或全部與來自IL-1激動劑諸如IL-1 β的此類環(huán)具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。在一些實施方案中，β 11 β 12環(huán)與來自IL-1拮抗劑例如IL-1Ra的對應環(huán)具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含與IL-1Ra的β鏈β 2、β 3、β 10和β 11中的一者、兩 者、三者或全部具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的序列。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含與IL-1 β的β4、β6、β7和β8或與IL-Ιβ的β4、β5、β6、β7和0 8的一者、兩者、三者或全部具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的序列。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域不含與SEQ ID Ν0:3的氨基酸I46-G59、A55-G59、A55-V83、I60-V83、N84-D95、I46-S110、V49-S110 或 I46-G118 具有大于 80、85、90、95或100%同一性的片段。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域不含與SEQ ID NO:1的氨基酸 N7-V41、R11-M36、N102-D145 或 Y121-D145 具有大于 80、85、90、95 或 100% 同一性的片段。一般來講，該細胞因子結(jié)構域不是天然存在的。它不同于人IL-1家族細胞因子結(jié)構域。例如，它與 IL-1Ra(SEQ ID NO: 3)、IL-1 β (SEQ ID NO:1)和 / 或 IL-1 a (SEQ IDNO:2)具有小于98、95、90、85、80、75、70、65、60或55%的同一性。該細胞因子結(jié)構域也可以與此類細胞因子具有至少30、40、45、50、55、60、65、70%同一性。例如，該嵌合結(jié)構域可以與IL-1Ra、IL-1 β和IL-1 α具有30-95%、40_90%或45-85%同一性。例如，該嵌合結(jié)構域可以與IL-1 β具有40-90%同一性以及與IL-1Ra具有35-85%同一性；與11^_10具有40-80%同一性以及與IL-1Ra具有45-80%同一性；與IL-1 β具有45-72%同一性以及與IL-1Ra具有45-80%同一性；與IL-1 β具有45-72%同一性以及與IL-1Ra具有53-80%同一性；與IL-1 β具有50-72%同一性以及與IL-1Ra具有53-70%同一性；與IL-1 β具有60-72%同一性以及與IL-1Ra具有53-68%同一性；與IL-1 β具有65-72%同一性以及與IL-1Ra具有54-60%同一性；或與IL-1 β具有68-72%同一性以及與IL-1Ra具有54-57%同一性。例如，該嵌合結(jié)構域可以與IL-1a具有40-90%同一性以及與IL-1Ra具有35-85%同一性；與IL-1 α具有40-80%同一性以及與IL-1Ra具有45-80%同一性；與IL-1 α具有45-72%同一性以及與IL-1Ra具有45-80%同一性；與IL-1 α具有45-72%同一性以及與IL-1Ra具有53-80%同一性；與IL-1a具有50-72%同一性以及與IL-1Ra具有53-70%同一性；與IL-1a具有60-72%同一性以及與IL-1Ra具有53-68%同一性；與IL-1 α具有65-72%同一性以及與IL-1Ra具有54-60%同一性；或與IL-1 α具有68-72%同一性以及與IL-1Ra具有54-57%同一I"生。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域不同于IL-1Ra，并與受體結(jié)合，同時包含天然存在的受體拮抗劑(諸如IL-1Ra)特有的位點C和/或位點D。例如，該結(jié)構域與人IL-1 β和/IL-1Ra具有小于98、95、92、90、85和80%的同一性。例如，該結(jié)構域與IL-1Ra具有40-95%、40-90%或45-85%同一性。該結(jié)構域也可以與IL-1家族細胞因子激動劑諸如IL-1a或IL-1 β具有40-95%、40-90%或45-85%同一性。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含:來自作為細胞因子信號轉(zhuǎn)導激動劑的第一親本細胞因子結(jié)構域的至少40、
45、50、55、60、65、70、75、80 或 85% 的氨基酸。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域與受體激動劑(諸如IL-1 β或IL-1 a )具有比與受體拮抗劑(IL-1Ra)更高的氨基酸同一性(例如，至少高5、10、15或20%)，但作為IL-1RI的拮抗劑發(fā)揮作用。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域為完全嵌合的，例如，該結(jié)構域中的每個氨基酸來自親本細胞因子結(jié)構域之一，例如，兩個親本細胞因子結(jié)構域之一或者三個或更多個親本細胞因子結(jié)構域之一。例如，該親本細胞因子結(jié)構域為人細胞因子結(jié)構域或非人靈長類細胞因子結(jié)構域。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域為部分嵌合的，例如，該結(jié)構域中并非所有氨基酸都來自親本細胞因子結(jié)構域之一。例如，該分離的蛋白質(zhì)與IL-1RI結(jié)合并調(diào)節(jié)受體的信號轉(zhuǎn)導，例如，激動或拮抗IL-1RI受體信號轉(zhuǎn)導活性。在一些實施方案中，該蛋白質(zhì)在接觸IL-1 β反應性人細胞時不實質(zhì)上誘導IL-6的產(chǎn)生，和/或不實質(zhì)上誘導IL-1 β反應性報告基因的產(chǎn)生，例如，以10 μ g/ml、100 μ g/ml或lmg/ml的濃度。一般來講，該蛋白質(zhì)以小于100、50、20、10或5nM的IC50抑制IL-1 β (例如，諸如在本文所述的細胞測定中以0.lng/ml的濃度)的信號轉(zhuǎn)導。該蛋白質(zhì)可以小于IL-1Ra的IC50值的IC50(例如，小至少10,20或50%)抑制IL-1 β的信號轉(zhuǎn)導。 在某些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域例如以相比于親本細胞因子結(jié)構域之一相同的或更高的親和力結(jié)合。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域以小于100、50、20、10、5或InM或小于500、400、100或50ρΜ的Kd與IL-1RI結(jié)合。例如，締合常數(shù)可大于1Χ104、3 X 104、I X IO5 或 I X IO6M^，而解離常數(shù)可小于 I X 10' I X 10'6 X 1(Γ4 或 6 X 1θ 。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域以相比于IL-1 β或IL-1Ra更高的親和力(例如，更低的Kd)和/或更慢的解離速率與IL-1RI結(jié)合。例如，該細胞因子結(jié)構域可以小于或等于IL-1Ra的解離常數(shù)的解離常數(shù)和/或以大于或等于IL-1 β的締合常數(shù)的締合常數(shù)與IL-1RI結(jié)合。該細胞因子結(jié)構域的長度可介于約120-180、140-170或148-160或150-156個氨基酸之間。在一些實施方案中，該結(jié)構域的長度為152或153個氨基酸。通常，該結(jié)構域包含至少10、11或12條β鏈，并穩(wěn)定折疊。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域具有至少 38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62 或 64°C 的 Tm，如本文所述。它可具有介于51-61、51-66、56-61或56-66°C之間的Tm。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域直到至少
48、50、51、55、57、58或59°C才開始解折疊。例如，在生理緩沖液中，它具有至少在IL-1Ra和/或IL-1 β的Tm的10°C或5°C內(nèi)的Tm。在一些實施方案中，它在生理緩沖液中比IL-1Ra和/或IL-1 β更加熱穩(wěn)定。例如，該結(jié)構域在生理緩沖液中可具有比IL-1Ra和/或IL-1 β的Tm高至少2、4、6、7或8°C的Tm，例如，在約0.5mg/ml的濃度下比IL-1Ra和/或IL-1 β的 Tm 高約 5-12、5-10 或 7-10°C。該蛋白質(zhì)可包含本文所述的其他特征。在另一方面，本公開的特征在于包含嵌合IL-1家族細胞因子結(jié)構域的分離的蛋白質(zhì)。IL-1細胞因子家族成員的實例包括IL-1 a、IL-1 β、IL-lRa、IL-18、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1F10和IL-33。該細胞因子結(jié)構域可包含前述細胞因子之一的受體結(jié)合區(qū)或包含一種或多種此類細胞因子的元件的蛋白質(zhì)序列。例如，該細胞因子結(jié)構域可包含兩種或更多種IL-1細胞因子家族成員的嵌合體。在一個實施方案中，該嵌合結(jié)構域包含:長度為至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、
30、35、40、45、 50、55、60、65或70個氨基酸并與第一 IL-1家族細胞因子具有氨基酸同一性(或至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性)的至少一個片段，以及長度為至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸并與第二 IL-1家族細胞因子具有氨基酸同一性(或至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性)的另一片段。該嵌合結(jié)構域與第一和第二 IL-1家族細胞因子之一或兩者具有可小于90、85、80或75%的同一I"生。在一個實施方案中，第一和第二 IL-1家族細胞因子選自IL-Ιβ、IL-1a和IL-1Ra。在另一個實施方案中，第一和第二 IL-1家族細胞因子選自IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7和IL-1F8。在另一個實施方案中，第一 IL-1家族細胞因子選自激動劑，而第二 IL-1家族細胞因子選自拮抗劑。在一些實施方案中，該嵌合結(jié)構域包含少于120、110、100、90或80個來自相同親本細胞因子結(jié)構域的鄰接氨基酸。在一個實施方案中，該嵌合結(jié)構域在至少50、60、70、80、90、100、110或120個位置與第一 IL-1家族細胞因子相同，以及在至少50、60、70、80、90、100、110或120個位置與第二 IL-1家族細胞因子相同(包括可以單獨地與這兩種細胞因子均相同的位置)。在一個實施方案中，該嵌合結(jié)構域包含至少兩個、三個或四個不連續(xù)片段，每一個的長度為至少5、6、7、8、9、10、15或20個氨基酸并與第一 IL-1家族細胞因子的對應片段具有氨基酸同一性(或至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性)以及在其余的位置包含大部分來自第二 IL-1家族細胞因子的氨基酸。在一個實施方案中，該嵌合結(jié)構域包含4、5、6或7個片段，其中相鄰的片段來自不同的親本IL-1家族細胞因子結(jié)構域。例如，該結(jié)構域中的每個氨基酸位于來自天然存在的人IL-1家族細胞因子結(jié)構域的長度為至少5或6個氨基酸的肽內(nèi)。在一個實施方案中，該嵌合結(jié)構域包含以下至少一者、兩者或三者:(i)來自IL-1 β的長度為至少50、60、65、70或75個氨基酸的片段；(ii)來自IL-1Ra的長度為至少15、20、25個氨基酸的片段；以及(iii)來自IL-1Ra的長度為至少15、
20、25個氨基酸的另一片段。在一個實施方案中，根據(jù)IL-1 β中此類位置的編號，該不連續(xù)片段包含(i)第1-6和 45-61 位，(ii)第 1-6 和 86-95 位，(iii)第 45-61 和 86-95 位，(iv)第 1-6 和 148-153位，(V)第45-61和148-153位或(vi)第86-95和148-153位殘基。根據(jù)IL-1 β中此類位置的編號，來自第一 IL-1家族細胞因子的該三個不連續(xù)片段可包含(例如)第1-8、42-120和 141-153 位殘基，第 1-10、37-125 和 131-153 位殘基或第 1-6、45_61、86_95 和 148-153 位殘基。該嵌合結(jié)構域在其余的位置可以與第二 IL-1家族細胞因子具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98、99或100%同一性。在一個實施方案中，該不連續(xù)片段的邊界的一個或多個位于其中第一和第二 IL-1家族細胞因子為相同的或保守的位置處。該蛋白質(zhì)可具有本文所述的其他特征。在另一方面，本公開的特征在于包含與IL-1RI結(jié)合的IL-1家族細胞因子結(jié)構域的分離的IL-1抑制劑。例如，該IL-1抑制劑包含上文或本文其他地方所述的一種或多種特征。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含:(a)在以下位置與IL-1Ra相同的氨基酸:ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLU128、ASN129、MET130 和 GLN141 (根據(jù) IL-1 β 的編號)；以及(b)在以下位置與IL-1 β相同的氨基酸=ALAU PR02、VAL3、ARG4、LEU6、ΡΗΕ46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PR057、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150和SER152。在一些實施方案中，位點A片段Al和A2與IL-1Ra的對應片段具有至少80%同一性(共同地)。在一些實施方案中，位點B片段B1、B2和B3與IL-1 β的對應片段具有至少80%同一性(共同地)。例如，位點A片段Al和Α2與IL-1Ra的對應片段具有至少90%同一性(共同地)；而位點B片段B1、Β2和Β3與IL-1 β的對應片段具有至少90%同一性(共同地)。例如，位點A片段Al和Α2與IL-1Ra的對應片段相同；而位點B片段B1、Β2和Β3與IL-1 β的對應片段相同。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含與IL-1Ra的β鏈β 2、β 3、β 10和β 11具有至少80%同一性(共同地)的序列以及與IL-1 β的β鏈β 4、β 6、β 7和β 8具有至少80%同一性(共同地)的序列。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含與IL-1Ra的β鏈β2、β3、β 10和β 11相同的序列以及與IL-1 β的β鏈β4、β6、β7和β8相同的序列。在一些實施方案中，得自IL-Ιβ的上文確定的片段和特征衍生自IL-1a，或IL-1 β或IL-1a的組合。在一些實施方案中，該IL-1抑制劑包含以下性質(zhì)的一種或多種(例如，至少2、3、
4、5、6或7種):(i) 與IL-1 HL-1 a或IL-1Ra中的對應殘基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位點A或位點B殘基(和/或擴展位點A和擴展位點B殘基)；
(ii)與IL-1Ra中的對應殘基共同地具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的Al和A2片段；(iii)與IL-1 β或IL-1 α中的對應殘基共同地具有至少80%同一性的Β1、Β2和Β3片段；(iv)與IL-1Ra中的對應殘基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位點A區(qū)域；(V)與IL-1 β或IL-1a中的對應殘基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位點B區(qū)域；(vi)與IL-1Ra或IL36Ra中的對應殘基具有至少50、60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位點C和/或位點D殘基；(vii)與IL-1Ra中的對應殘基具有至少70、75、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的Cl片段；(viii)在至少3、4或5個殘基與IL-1Ra中的對應殘基相同的D2片段。該細胞因子結(jié)構域不同于IL-1Ra，例如，該細胞因子結(jié)構域與IL-1Ra具有小于99、98、95、90、85、80、75、70、65、60%的同一性，和/ 或與 IL-1Ra 具有至少 30、40、45、50、55、60、65、70% 同一性，例如，與 IL-1Ra 具有 40-95%、40-90%或45-85%同一性。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域不含與SEQ ID N0:3的氨基酸 I46-G59、A55-G59、A55-V83、I60-V83、N84-D95、I46-S110、V49-S110 或 I46-G118 具有大于80、85、90、95或100%的同一性的片段。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域不含與 SEQ ID NO:1 的氨基酸 N7-V41、R11-M37、N102-D144 或 Y121-D144 具有大于 80、85、90、95或100%的同一性的片段。在一些實施方案中，該抑制劑以小于100、50、20、10、5或InM的Kd與IL-1RI結(jié)合。在一些實施方案中，該抑制劑以相比于IL-1 β或IL-1Ra更高的親和力(例如，更低的Kd)和/或更慢的解離速率與IL-1RI結(jié)合。在一些實施方案中，該抑制劑在接觸IL-1 β反應性人細胞時不實質(zhì)上誘導IL-6表達。一般來講，該抑制劑以小于100、50、20、10或5ηΜ的IC50抑制IL-1 β的信號轉(zhuǎn)導。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含以下序列中的一者、兩者、三者或更多者:WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO:9)；NLEEK(SEQ ID NO: 10)；
RIffDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11)；AMEADQP(SEQ ID NO:12)；FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY (SEQ ID NO: 13);和 / 或與前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的序列。在一些實施方案中，該細胞因子結(jié)構域包含以下序列中的一者、兩者、三者或更多者:VQGEESNDKI(SEQ ID NO: 14)；KKKMEKRF (SEQ ID NO:15)和 FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES (SEQ ID NO: 16);和 / 或與前述序列具有至少 80、85、88、90、92、95,98或100%同一性的序列。該抑制劑可包含本文所述的其他特征。在另一方面，本公開提供分離的蛋白質(zhì)，其包含與本文所公開的序列具有至少80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 或 100% 同一性的氨基酸序列，例如，表4和實施例1中所列的序列，例如，P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序列，或?qū)嵤├?、5、6或本文其他地方的序列。在一些實施方案中，該氨基酸序列包含至少一個取代、插入或缺失。該氨基酸序列可包含少于15、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個非保守取代或少于15、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個總?cè)〈?。該氨基酸序列可包含至?、2、3、4或5個取代，例如保守取代。本發(fā)明還提供包含N端甲硫氨酸到P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序列或?qū)嵤├?、5、6或本文其他地方的序列的分離蛋白質(zhì)，以及包含P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序列或?qū)嵤├?、5、6或本文其他地方的序列(其中不存在N端丙氨酸)的分離蛋白質(zhì)。前述序列可包含本文所公開的其他特征。例如，該序列可進一步包含標記，諸如六組氨酸序列，例如，在相對于IL-1RI結(jié)合序列的N或C端。該序列可進一步包含改變IL-1RI結(jié)合序列的穩(wěn)定性或藥動學的部分。對于該序列而言，可進一步包含血清白蛋白和/或Fe結(jié)構域，或其一個或多個結(jié)構域，例如，一個或多個免疫球蛋白恒定結(jié)構域或一個或多個白蛋白結(jié)構域。該蛋白質(zhì)可具有本文所述的其他特征。在一些實施方案中，該分離的蛋白質(zhì)由本文所公開的序列或嵌合結(jié)構域組成或基本上由其組成。在另一方面，本公開提供分離的蛋白質(zhì)，其包含的結(jié)構域具有本文所述的細胞因子結(jié)構域的循環(huán)排列形式，例如，表4中所列的細胞因子結(jié)構域和/或包含SEQ ID N0:3的結(jié)構域。該蛋白質(zhì)可進一步在該排列形式的N或C端包含異源序列(諸如Fe結(jié)構域或白蛋白)，其任選地通過接頭隔開。該蛋白質(zhì)可具有本文所述的其他特征。本公開的特征還在于包含本文所述的一種或多種受體結(jié)合劑(諸如包含嵌合細胞因子結(jié)構域的蛋白質(zhì))的藥物組合物。該組合物可以為眼科藥物組合物、局部用組合物或用于腸胃外施用的組合物。在另一方面，本公開的特征在于調(diào)節(jié)受試者免疫或炎性反應的方法。該方法可包括以有效調(diào)節(jié)受試者免疫或炎性反應的量向該受試者施用包含本文所述的受體結(jié)合劑的組合物。在另一方面，本公開的特征在于治療受試者的IL-1介導的疾病的方法。該方法包括向受試者施用包含可與IL-1RI結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如本文所述的受體結(jié)合劑)的組合物。例如，該疾病可以是自身免疫疾病，如類風濕性關節(jié)炎或幼年型慢性關節(jié)炎、硬皮病、舍格倫綜合征(Sjogren’s syndrome)、強直性脊柱炎、白塞氏綜合征(Behcet’ s syndrome)、炎性腸病、哮喘、血管炎或牛皮癬。該疾病可以是與聚集體形成相關的疾病，例如高尿酸血癥、痛風、糖尿病(包括非胰島素依賴型糖尿病)、阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease)、繼發(fā)型反應性淀粉樣變性、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、亨丁頓舞蹈癥或帕金森病。該疾病還可以是CAPS (CIAS1相關周期綜合征)疾病或本文所述的其他疾病。在另一方面，本公開的特征在于治療受試者的IL-1介導的眼部疾病的方法。該方法可包括向受試者施用包含可與IL-1RI結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如本文所述的受體結(jié)合劑)的組合物。例如，該組合物是局部施用到受試者眼睛或周圍區(qū)域的眼科組合物。在一個實施方案中，該疾病是干眼病。在一些實施方案中，該受試者無全身性自身免疫疾病的表現(xiàn)。在一些實施方案中，該受試者患有舍格倫綜合征。在一些實施方案中，該受試者患有移植物抗宿主病(GVHD)。在其他實施方案中，該疾病為葡萄膜炎。在另一方面，本公開的特征在于抑制IL-1活性的方法。該方法包括使可與IL-1RI結(jié)合的受體結(jié)合劑接觸對IL-1有反應的細胞或接觸受試者。一般而言，該蛋白質(zhì)以有效抑制與細胞相關的或受試者中的IL-1活性的量提供?？墒乖摰鞍踪|(zhì)在體外接觸來自受試者的細胞。在另一方面，本公開的特征在于分離的核酸，其包含編碼本文所述的蛋白質(zhì)的一個或多個序列或本文所公開的核酸(例如，見表5)，與此類核酸雜交或與此類核酸具有80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或 100% 同一性的序列。示例性雜交序列的長度可為至少200、300、400、420或450個核苷酸，例如，長度為420-480個核苷酸。該核酸還可以包含本文所公開的其他特征。本發(fā)明的特征還在于重組宿主細胞，其包含的核酸包含編碼本文所述的蛋白質(zhì)及其多肽鏈的一個或多個序列?？梢酝ㄟ^以下方法產(chǎn)生受體結(jié)合劑，該方法包括:將宿主細胞維持在允許受體結(jié)合劑表達的條件下，以及任選地(例如)從細胞或與宿主細胞相關的培養(yǎng)基中回收受體結(jié)合劑。例如，受體結(jié)合劑可從細胞裂解物中純化。純化的受體結(jié)合劑可(例如)與賦形劑、穩(wěn)定劑和緩沖劑的一者或多者一起配制。 本發(fā)明的特征還在于提供嵌合蛋白結(jié)構域的方法。該方法包括:鑒定具有共同折疊的至少兩種親本蛋白(例如，第一親本蛋白和第二親本蛋白)，定位第一親本蛋白內(nèi)的至少兩個片段，以及構建核酸，該核酸具有編碼嵌合氨基酸序列的序列，該嵌合氨基酸序列包含來自第一親本蛋白的兩個片段以及在其余位置大部分來自第二親本蛋白的殘基。該結(jié)構域可以為主要由β折疊組成的結(jié)構域，或主要由α螺旋組成的結(jié)構域，或具有此類元件的組合的結(jié)構域。例如，該結(jié)構域可具有細胞因子的折疊。該第一和第二親本蛋白可通過同源性而相關，例如10-40%的氨基酸同一性。在一些實施方案中，來自第一蛋白的所述片段位于單個折疊蛋白結(jié)構域內(nèi)，并且所述嵌合氨基酸序列包含與第一和第二親本蛋白中的對應結(jié)構域不同的折疊蛋白結(jié)構域的一種形式。在一些實施方案中，所述兩種親本蛋白具有不同的功能特性，并且所述嵌合結(jié)構域可具有所述親本蛋白的一者或兩者的特性。在一些實施方案中，所述嵌合結(jié)構域具有一個來自第一親本蛋白的結(jié)合界面以及另一個來自第二親本蛋白的結(jié)合界面。本文提及了 IL-1家族細胞因子中關于位點A、B、C和D的各種區(qū)域、片段和殘基。此類殘基、片段和區(qū)域在人IL-1 β (SEQ ID NO:1)序列中的定位以及對應位置在下文和

圖1中提供:位點A.1L-1 β 中的位點 A 殘基包括:ARG11、SER13、GLN14、GLN15、SER21、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLU128、ASN129 和 MET 130以及其他ILl細胞因子家族成員的對應殘基(本文稱為“位點A殘基”)。在某些情況下，尤其是與IL-1 β有關，提及了包括位點A殘基以及GLN149與ΡΗΕ150和其他ILl細胞因子家族成員的對應殘基的 “擴展位點A殘基”。此外，可以定義如圖4所示的“位點A區(qū)域”，包括(例如)Al片段(在IL-1 β中對應于SEQ ID NO:1的第11-36位)和Α2片段(在IL-1 β中對應于SEQ ID NO:1的第125-131位)以及其他ILl細胞因子家族成員中的對應片段。位點B.1L-1 β 中的位點 B 殘基包括=ALAU PR02、ARG4、GLN48、GLU51、ASN53、ILE56、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105 和 ASN108，以及其他 ILl 細胞因子家族成員的對應殘基(本文稱為“位點B殘基”)。在某些情況下，尤其是與IL-1 β有關，提及了包括位點B殘基以及在圖4位點B區(qū)域之外的ΡΗΕ46和SER152的“擴展位點B殘基”。此外，可以定義如圖4所示的“位點B區(qū)域”，包括(例如)B1片段(在IL-1 β中對應于SEQ ID NO:1的第1-5位)、Β2片段(在IL-1 β中對應于SEQ ID NO:1的第48-56位)和Β3片段(在IL-1 β中對應于SEQ ID NO:1的第92-98位)以及其他ILl細胞因子家族成員中的對應片段。位點C.1L-1 β 中的位點 C 殘基包括:ILE104、ILE106、ASN107、LYS109、GLUllUTHR137、LYS138、GLY139、GLY140、GLN141、THR144 和 ASP145 以及其他 ILl 細胞因子家族成員的對應殘基(本文稱為“位點C殘基”)。此外，可以定義如圖4所示的“位點C區(qū)域”，包括(例如)C1片段(在IL-Ιβ中對應于SEQ ID NO:1的第136-145位)以及其他ILl細胞因子家族成員中的對應片段。位點D.1L-1 β 中的位點 D 殘基包括:LEU6、THR9、LYS63、GLU64、LYS65 和 ASN66 及其他ILl細胞因子家族成員的對應殘基(本文稱為“位點D殘基”)。此外，可以定義如圖4所示的“位點D區(qū)域”，包括(例如)D1片段(在IL-1 β中對應于SEQ ID NO:1的第6-9位)、D2片段(在IL-Ιβ中對應于SEQ ID NO:1的第37-41位)和D3片段(在IL-1 β中對應于SEQ IDN0:1的第63-66位)、D4片段(在IL-Ιβ中對應于SEQ ID NO:1的第86-91位)和D5段(在IL-Ιβ中對應于SEQ ID NO:1的第150-153位)以及其他ILl細胞因子家族成員中對應片段?？赏ㄟ^將所考慮的細胞因子與圖4所示的序列進行比對來獲得對位點A、B、C與D的殘基和區(qū)域的定位的進一步鑒定。如本文所提及的IL-1 β (人)的氨基酸序列為:APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAEMMFVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS(SEQIDNO:1)。如本文所提及的IL-1a (人)的氨基酸序列為:SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDALNQSIIRANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGPPSITDFQILENQA(SEQ ID NO:2) 如本文所提及的IL-1Ra (人)的氨基酸序列為:RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDWPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKS⑶ETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED(SEQ ID NO:3)。如本文所用的術語IL-1 β、IL-1 α和IL-1Ra是指各自的成熟蛋白質(zhì)。本文提及的以及如圖4所示的β折疊是指以下序列:表I
權利要求
1.一種包含嵌合白介素-1 (IL-1)家族細胞因子結(jié)構域的分離的蛋白質(zhì)，其中所述結(jié)構域的至少第一片段的長度為至少20個氨基酸并與第一 IL-1家族細胞因子的對應片段具有至少80%氨基酸同一性，以及 所述結(jié)構域的至少第二片段的長度為至少20個氨基酸并與第二 IL-1家族細胞因子的對應片段具有至少80%的氨基酸同一性。
2.根據(jù)權利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述第一和第二IL-1家族細胞因子選自IL-1 β、IL-1 α 和 IL-1Ra。
3.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述第一IL-1家族細胞因子為IL-1 β，以及所述第二 IL-1家族細胞因子為IL-1Ra。
4.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與ILl受體I結(jié)合并抑制IL-1受體I活性。
5.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域的所述第一片段具有至少20或30個氨基酸的長度并與IL-1 β的對應片段相同。
6.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域包含與IL-1Ra中的對應殘基具有至少80%同一性的位點A殘基以及與IL-1 β中的對應殘基具有至少80%同一性的位點B殘基。
7.根據(jù)權利要求3所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域包含(a)在以下位置與IL-1Ra 相同的氨基酸:ARGlK SER 13、GLN14、GLNl5, GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLUl 28, ASN129、MET130 和GLN141 (根據(jù)IL-1 β的編號)，以及 (b)在以下位置與 IL-1 β 相同的氨基酸:ALA1、PR02、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PR057、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150 和 SER152 (根據(jù) IL-1 β 的編號)。
8.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域包含與IL-1Ra的β鏈β2、β3、β 10和β 11相同的序列以及與IL-1 β的β鏈β4、β6、β7和β 8相同的序列。
9.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述β1β2、β2β3、β8β9、βΙΟβΙΙ和β 11 β 12環(huán)的一者或多者與IL-1Ra的對應環(huán)具有至少90%同一性。
10.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域包含長度為至少20個氨基酸的至少兩個不連續(xù)片段，它們與IL-1 β的各自對應片段具有至少90%同一性。
11.根據(jù)權利要求10所述的蛋白質(zhì)，其中所述兩個不連續(xù)片段與IL-Ιβ的各自對應片段相同。
12.根據(jù)權利要求10所述的蛋白質(zhì)，其中所述兩個不連續(xù)片段的長度為25至40個氨基酸。
13.根據(jù)權利要求10、11或12所述的蛋白質(zhì)，其中不在所述兩個不連續(xù)片段中的氨基酸與IL-1Ra具有至少90%同一性。
14.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)由長度為150至160個氨基酸的單條多肽鏈組成。
15.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域在至少50個位置與所述第一 IL-1家族細胞因子相同以及在至少50個位置與所述第二 IL-1家族細胞因子相同。
16.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中至少第11-41位殘基和第120-147位殘基(根據(jù)IL-1 β編號)總和起來與IL-1Ra中的對應殘基具有至少90%同一性。
17.根據(jù)權利要求3所述的蛋白質(zhì)，其中至少第1-6位、第45-61位和第148-153位殘基(根據(jù)IL-1 β編號)總和起來與IL-1 β中的對應殘基具有至少90%同一性。
18.根據(jù)權利要求3所述的蛋白質(zhì)，其中至少第1-8位、第42-120位和第148-153位殘基(根據(jù)IL-1 β編號)總和起來與IL-1 β中的對應殘基具有至少90%同一性。
19.根據(jù)權利要求3所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域與Ρ01、Ρ02、Ρ03、Ρ04或Ρ05具有至少80%同一性。
20.根據(jù)權利要求19所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域與Ρ01、Ρ02、Ρ03、Ρ04或Ρ05具有至少90%同一性。
21.根據(jù)權利要求 20所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域與Ρ01、Ρ02、Ρ03、Ρ04或Ρ05具有至少95%同一性。
22.根據(jù)權利要求21所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域與Ρ01、Ρ02或Ρ03相同。
23.根據(jù)權利要求21所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域與Ρ04相同。
24.根據(jù)權利要求21所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域與Ρ05相同。
25.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域比IL-1β和IL-1Ra具有更聞的熱穩(wěn)定性。
26.根據(jù)權利要求2所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域具有比IL-1β和IL-1Ra高至少2度的1 。
27.根據(jù)權利要求3所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在細胞信號轉(zhuǎn)導測定中對于抑制IL-1 β (以 0.lng/ml)具有低于 10ng/ml 的 IC50。
28.根據(jù)權利要求3所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)相比于人IL-1Ra以較高的親和力KD、較慢的解離速率和/或較快的締合速率與IL-1RI結(jié)合。
29.根據(jù)權利要求3所述的蛋白質(zhì)，其中所述細胞因子結(jié)構域包含以下一者或多者: (a)位點A: i.與第一親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基具有至少80%同一性的位點A殘基； ii.與第一親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基具有至少80%同一性的擴展位點A殘基; ii1.與第一親本細胞因子結(jié)構域的對應片段具有至少80%同一性的位點A片段Al和A2 ;或 iv.與第一親本細胞因子結(jié)構域的對應區(qū)域具有至少80%同一性的位點A區(qū)域； (b)位點B: i.與第二親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基具有至少80%同一性的位點B殘基； ii.與第二親本細胞因子結(jié)構域中的對應殘基具有至少80%同一性的擴展位點B殘基; ii1.與第二親本細胞因子結(jié)構域的對應片段具有至少80%同一性的位點B片段B1、B2和B3 ;或 iv.與第二親本細胞因子結(jié)構域的對應區(qū)域具有至少80%同一性的位點B區(qū)域；
30.一種包含IL-1家族細胞因子結(jié)構域的分離的IL-1抑制劑，所述抑制劑與IL-1RI結(jié)合并包含 ⑴與IL-1Ra中的對應殘基具有至少70%同一性的Cl片段；以及( )與IL-1 β ,IL-1 α或IL-1Ra中的對應殘基具有至少80%同一性的位點A或位點B殘基，并且 其中所述結(jié)構域與IL-1Ra具有40%-90%同一性。
31.根據(jù)權利要求30所述的IL-1抑制劑，其中所述Cl片段與IL-1Ra中的對應殘基具有至少80%同一性。
32.根據(jù)權利要求30所述的IL-1抑制劑，其中所述Cl片段與IL-1Ra中的對應殘基相同。
33.根據(jù)權利要求30所述的IL-1抑制劑，其中所述D2片段與IL-1Ra中的對應殘基具有至少80%同一性。
34.根據(jù)權利要求30所述的IL-1抑制劑，其中所述Al和Α2片段總和起來與IL-1Ra中的對應殘基具有至少80%同一性。
35.根據(jù)權利要求30所述的IL-1抑制劑，其中所述B1、Β2和Β3片段與IL-1β中的對應殘基具有至少80%同一性。
36.根據(jù)權利要求30所 述的IL-1抑制劑，所述抑制劑抑制IL-1β的信號轉(zhuǎn)導。
37.根據(jù)權利要求30所述的IL-1抑制劑，所述抑制劑以小于InM的親和力與IL-1RI彡口口
38.一種分離的受體結(jié)合蛋白，其包含: (a)在以下位置與IL-1Ra 相同的氨基酸:ARG11、SER13、GLN14、GLNl5, GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLU128,ASN129、MET130 和 GLN141 (根據(jù) IL-1 β 的編號)以及 (b)在以下位置與IL-1 β 相同的氨基酸:ALA1、PR02、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PR057、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150 和 SER152 (根據(jù) IL-1 β 的編號)。
39.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)為IL-1β和IL-1Ra的嵌合體。
40.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì),所述蛋白質(zhì)包含IL-1β的Gln48-Asn53。
41.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與非IL-1β的細胞因子具有至少50%同一I"生。
42.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì),所述蛋白質(zhì)包含在對應于Alal、Pro2、Val3、Arg4和Leu6的位置與IL-1 β相同的殘基。
43.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含在對應于IL-1MSEQID NO:1)的45-61的位置與IL-1 β相同的至少15個殘基。
44.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含在對應于IL-1MSEQID NO:1)的86-95的位置與IL-1 β相同的至少8個殘基。
45.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含在對應于IL-1MSEQID NO:1)的148-153的位置與IL-1 β相同的至少5個殘基。
46.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì)，其中對應于第11-36位和第126-130位(根據(jù)SEQID NO:1)的氨基酸位置大部分與IL-1Ra相同。
47.根據(jù)權利要求38所述的蛋白質(zhì)，其中對應于第9-41位和第121-140位(根據(jù)SEQID NO:1)的氨基酸位置大部分與IL-1Ra相同。
48.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權利要求1-47中任一項所述的蛋白質(zhì)。
49.一種局部用藥物組合物，其包含根據(jù)權利要求1-47中任一項所述的蛋白質(zhì)。
50.一種眼科藥物組合物，其包含根據(jù)權利要求1-47中任一項所述的蛋白質(zhì)。
51.根據(jù)權利要求48所述的藥物組合物，所述藥物組合物為含水的并包含濃度為0.001 -5%的所述蛋白質(zhì)。
52.一種根據(jù)權利要求48所述的組合物用于受試者以調(diào)節(jié)受試者免疫或炎性反應的用途。
53.一種根據(jù)權利要求48所述的組合物用于治療患有全身性自身免疫疾病或處于其風險之中的受試者的用途。
54.一種根據(jù)權利要求48所述的組合物用于治療患有類風濕性關節(jié)炎或處于其風險之中的受試者的用途。
55.一種根據(jù)權利要求48 所述的組合物用于治療患有干眼病或過敏性結(jié)膜炎或處于其風險之中的受試者的用途。
56.一種分離的核酸，其包含編碼根據(jù)權利要求1至47中任一項所述的蛋白質(zhì)的序列。
57.一種分離的核酸載體，其包含編碼根據(jù)權利要求1至47中任一項所述的蛋白質(zhì)的序列，其中所述序列可操作地連接至轉(zhuǎn)錄控制序列。
58.一種重組宿主細胞，其包含編碼根據(jù)權利要求1至47中任一項所述的蛋白質(zhì)的重組核酸。
59.根據(jù)權利要求58所述的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸桿菌宿主細胞。
60.一種制備重組蛋白的方法，所述方法包括 在允許所述重組蛋白表達的條件下培養(yǎng)根據(jù)權利要求58所述的宿主細胞； 從細胞裂解物或細胞培養(yǎng)基中純化所述重組蛋白；以及 配制所述重組蛋白以施用給受試者。
61.一種包含嵌合IL-1家族細胞因子結(jié)構域的分離的蛋白質(zhì)，所述結(jié)構域包含至少兩個長度為至少六個氨基酸并與第一 IL-1家族細胞因子的對應片段具有至少80%同一性的不連續(xù)片段，并在其余的位置包含大部分來自第二 IL-1家族細胞因子的氨基酸。
62.根據(jù)權利要求61所述的蛋白質(zhì)，其中所述不連續(xù)片段根據(jù)IL-Ιβ中此類位置的編號包含第1-6和45-61位、第1-6和86-95位、第45-61和86-95位、第1-6和148-153位、第45-61和148-153位或第86-95和148-153位殘基。
63.根據(jù)權利要求61所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含氨基酸與所述第一ILl家族細胞因子對應片段中的那些氨基酸相同的三個不連續(xù)片段，并且那些片段包含第1-8、42-120 和 141-153 位殘基。
64.根據(jù)權利要求61所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含氨基酸與所述第一ILl家族細胞因子對應片段中的那些氨基酸相同的四個不連續(xù)片段，并且那些片段包含第1-6、45-61,86-95 和 148-153 位殘基。
65.根據(jù)權利要求61所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含氨基酸與所述第一ILl家族細胞因子對應片段中的那些氨基酸相同的三個不連續(xù)片段，并且那些片段包含第1-10、37-125 和 131-153 位殘基。
66.根據(jù)權利要求61所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在其余的位置與所述第二IL-1家族細胞因子相同。
67.根據(jù)權利要求61所述的蛋白質(zhì)，其中所述不連續(xù)片段的邊界的一個或多個位于其中所述第一和第二 IL-1家族細胞因子具有相同氨基酸的位置。
68.根據(jù)權利要求61所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在至少50個位置與所述第一IL-1家族細胞因子相同以及在至少50個位置與所述第二 IL-1家族細胞因子相同。
69.根據(jù)權利要求61所述的蛋白質(zhì)，其中所述第一和第二IL-1家族細胞因子選自IL-1 β、IL-1 α 和 IL-1Ra。
70.根據(jù)權利要求69所述的蛋白質(zhì)，其中所述第一IL-1家族細胞因子為IL-1 β，以及所述第二 IL-1家族細胞因子為IL-1Ra。
全文摘要
本發(fā)明的特征在于非天然存在的細胞因子結(jié)構域，其尤其可用于調(diào)節(jié)響應白介素-1受體I(IL-1RI)的細胞信號轉(zhuǎn)導，用于治療疾病，以及用于檢測細胞受體和/或與細胞受體結(jié)合，以及其他藥劑。示例性細胞因子結(jié)構域可包含來自至少兩個親本細胞因子結(jié)構域的氨基酸殘基，例如來自至少兩個親本細胞因子結(jié)構域的受體結(jié)合特征、表面特征、β鏈和環(huán)。
文檔編號A61P19/02GK103221422SQ201180047508
公開日2013年7月24日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權日2010年7月29日
發(fā)明者T.M.巴恩斯, J.侯, B.M.金 申請人:十一生物治療股份有限公司