專利名稱：具有溶血栓和抗凝血性質(zhì)的蛋白融合構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溶血栓藥物，其包括包含溶血栓蛋白以及血栓調(diào)節(jié)蛋白的4、5、6表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF4、5、6)的嵌合融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白具有纖溶酶原活化活性、凝血酶抑制活性和抗凝蛋白C途徑活化活性。本發(fā)明的融合蛋白具有破碎血栓和預(yù)防在凝塊部位處再閉塞的治療潛力。
背景技術(shù)：
血栓形成(血塊或血栓在血管系統(tǒng)內(nèi)的形成和發(fā)展)盡管當(dāng)發(fā)生在出血過程中時(shí)是一個(gè)挽救生命的過程，但是當(dāng)發(fā)生在任意其它時(shí)間時(shí)可以是危及生命的。血栓可以阻塞血管，并阻止向器官或其它身體部分的血液供給。如果脫離的話，血栓可以變成栓塞物，并阻塞在起始部位遠(yuǎn)端的血管。血栓性病癥現(xiàn)在構(gòu)成世界范圍內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家的主要死亡原因之一。盡管仍然是針對(duì)血栓性循環(huán)病癥的最優(yōu)選急診(“S0S”)藥物，纖溶酶原活化劑蛋白藥物(諸如鏈激酶(SK)、葡萄球菌激酶(SAK)和組織纖溶酶原激活物(tPA))在富裕的國(guó)家中正在慢慢地喪失它們?cè)诩痹\心臟介入(諸如支架和旁路手術(shù))中的優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)榕c它們的應(yīng)用有關(guān)的出血風(fēng)險(xiǎn)，以及經(jīng)常遇到的、由凝血酶活性和/或凝血酶新產(chǎn)生引起的在相同血管損傷部位處的凝塊再形成的問題。因而，迫切需要開發(fā)具有額外特征(諸如凝塊特異性和抗血栓性質(zhì))的更智能的和更有效的溶血栓藥物。血塊形成是級(jí)聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜組合的最終結(jié)果，在所述級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，幾種生化事件造成在損傷部位處的封閉或修復(fù)(Butenas和Mann 2002)?；谘耗碳?jí)聯(lián)的啟動(dòng)，已經(jīng)將途徑分成非固有的和固有的途徑，其中所述非固有的途徑通過組織因子(TF)的暴露而啟動(dòng)，而固有的途徑由因子XII(Hageman因子)、高分子量激肽原(HK)或前激肽釋放酶(prekalIikrain)啟動(dòng)。但是，2個(gè)級(jí)聯(lián)途徑最終匯合在因子Xa產(chǎn)生點(diǎn)，并隨后跟隨共同的凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白產(chǎn)生(Cannon和Tracy 1995)。凝血酶產(chǎn)生是 脊椎動(dòng)物中的血液凝固過程的中樞步驟。在凝血酶產(chǎn)生過程中，少量凝血酶摻入擴(kuò)大中的纖維蛋白凝塊/網(wǎng)絡(luò)中，并且該蛋白酶的催化部位(游離在被吸附的凝血酶中)能夠放大凝塊生長(zhǎng)(Liu,Nossel等人.1979 ；Vali和Scheraga 1988)。凝血酶會(huì)與不同的底物相互作用，并活化幾種凝塊促進(jìn)因子，例如(a)它通過切割它們的同源受體而造成血小板的活化，(b)造成因子V、VIII和XI的反饋活化，(c)造成轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutminase)、因子XIII的活化,和(d)將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。在病理學(xué)狀況下，在凝塊形成并通過鏈間交聯(lián)而穩(wěn)定化以后，它會(huì)阻礙在血管中的正常血流，并導(dǎo)致動(dòng)脈和靜脈的堵塞。針對(duì)由動(dòng)物/人類中的病理性血栓形成引起的循環(huán)病癥(諸如心肌梗塞)的最常見的且優(yōu)選的藥物治療之一是，血栓溶解劑的靜脈內(nèi)輸注(Lijnen和Collen 1988 ；Collen和Lijnen 1990 ;Francis和Marder 1991)?？衫玫娜苎ㄋ幹T如鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)和組織纖溶酶原激活物(tPA)主要通過相同的纖溶酶依賴性的機(jī)理起作用(因?yàn)檫@些是纖溶酶原活化劑)，其中它們切割纖溶酶原的殘基561和562之間的易切斷肽，并將所述纖溶酶原轉(zhuǎn)化成它的蛋白水解活化形式，即纖溶酶。組織纖溶酶原激活物和尿激酶是特異性地識(shí)別人纖溶酶原中的易切斷肽鍵的蛋白酶(直接活化劑)，而鏈激酶和葡萄球菌激酶(它們是蛋白‘輔因子’，而不是蛋白酶，并因而是‘間接’活化劑；參見De Renzo, Boggiano等人.1967 ;Buck，Hummel等人.1968 ;McClintock和Bell 1971)首先與纖溶酶或纖溶酶原形成緊密的1:1復(fù)合物，并且得到的蛋白水解活性的復(fù)合物切割其它‘游離’纖溶酶原分子的易切斷肽鍵，并指數(shù)地產(chǎn)生纖溶酶(WohI, Summaria等人.1978 ；Castellino和Powell1981 ；ffohl, Sinio 等人.1983 ；Davidson, Higgins 等人.1990 的綜述)。在所有目前可得到的凝塊破碎劑(也就是說，纖溶酶原活化劑蛋白藥物)中，鏈激酶表現(xiàn)出最高的溶血栓能力，盡管由于(如SAK)細(xì)菌起源，它具有在少數(shù)患者中引起免疫反應(yīng)的限制。盡管如此，因?yàn)樗ctPA和UK相比相對(duì)較低的成本，它被廣泛地用作提供得起的溶血栓藥。成功的溶血栓治療會(huì)幫助維持正常的血流,并改善大量患者的存活(Verstraete1990)，但是早期再閉塞或血栓重新形成(經(jīng)常在相同部位)已經(jīng)繼續(xù)限制溶血栓藥物的成功應(yīng)用。幾項(xiàng)研究證實(shí)，在多達(dá)30%的經(jīng)過溶血栓治療的患者中發(fā)生早期再閉塞(Ohman，Califf等人.1990)。通過增加血液的高凝性的纖溶酶活性，可以解釋血栓重新形成或早期再閉塞的原因(Eisenberg, Miletich等人.1988);有人提出，纖溶酶活化接觸因子(Ewald和Eisenberg 1995)、因子V (Lee和Mann 1989),還可能活化凝血酶原(Seitz等人，1993)。另一種提出的理由是，凝塊結(jié)合的凝血酶隨后分解出凝血酶，這又產(chǎn)生更多的凝血酶，而纖維蛋白結(jié)合的凝血酶相對(duì)地耐受抗_凝血酶抑制劑(Hogg和Jackson 1989 ；ffeitz, Hudoba等人.1990)； ‘釋放的’凝血酶再局部地活化促凝活性，并開始活化血小板(Kumar，Beguin等人.1994 ；Puri,Kumar等人.1995),由此促進(jìn)導(dǎo)致血栓重新形成的生化事件循環(huán)。因而，在損傷部位處的凝血酶抑制(二者直接地)和在它的促凝活性的‘二級(jí)’水平應(yīng)當(dāng)會(huì)極大地阻礙上述的不希望的事件鏈。如果這樣的性質(zhì)成功地?fù)饺肱c溶血栓藥物相同的分子中，在挽救生命方面的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。纖溶酶原活化劑是特征性地催化纖溶酶原向纖溶酶的酶促轉(zhuǎn)化的蛋白酶家族。TPA通過水解單個(gè)精氨酸-纈氨酸鍵而將纖溶酶原酶促轉(zhuǎn)化為纖溶酶。

組織纖溶酶原激活物(也稱作纖維蛋白激酶、非固有的纖溶酶原活化劑、t-PA或TPA)是一種糖蛋白，且具有約70，000道爾頓(68，000道爾頓)的近似分子量(MW)。它是通過水解單個(gè)精氨酸-纈氨酸鍵而催化前酶纖溶酶原的酶促轉(zhuǎn)化成活性酶纖溶酶的絲氨酸蛋白酶。t-PA的催化部位由氨基酸His-322、Asp-371和Ser-478構(gòu)成。在沒有纖維蛋白存在下，t-PA是較差的纖溶酶原活化劑。氨基端區(qū)域由幾個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，所述結(jié)構(gòu)域與其它蛋白是同源的。這些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域參與該酶的幾種功能，包括結(jié)合纖維蛋白、纖維蛋白-特異性的纖溶酶原活化、結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞受體和快速的體內(nèi)清除。包含氨基酸殘基50-87的一個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域(E結(jié)構(gòu)域)與人表皮生長(zhǎng)因子是同源的，且似乎參與纖維蛋白結(jié)合、纖維蛋白親和力和體內(nèi)清除?？寺×?t-PAcDNA，并隨后在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)。組織纖溶酶原激活物(t-PA)是負(fù)責(zé)特異性地活化與纖維蛋白凝塊相關(guān)的纖溶酶原(即能夠溶解血塊)的哺乳動(dòng)物纖維蛋白溶解系統(tǒng)的組分。組織纖溶酶原激活物介導(dǎo)的凝塊溶解顯示出血漿中增加的纖維蛋白肽-A水平，所述纖維蛋白肽-A是凝塊結(jié)合的凝血酶的直接標(biāo)志物(Weitz, Leslie等人.1998)。組織纖溶酶原激活物和當(dāng)前已知的抗-凝血酶藥物(諸如肝素和水蛭素)的組合經(jīng)常用于藥物治療中，但是該抗-凝血酶僅僅作用于游離的凝血酶，并且由于它們的低親和力，凝塊結(jié)合的凝血酶對(duì)肝素和其它抑制劑是抗性的。此外，這些藥物不會(huì)影響其它凝血酶產(chǎn)生的間接促進(jìn)劑(例如因子V和因子VIII)。因此，需要設(shè)計(jì)新的嵌合蛋白，其活化纖溶酶原同時(shí)抑制凝塊結(jié)合的凝血酶以及凝血酶的間接促進(jìn)劑(諸如因子V和因子VIII)。對(duì)溶血栓后的纖溶酶活性和隨后的凝血酶產(chǎn)生的研究清楚地提示，甚至在已經(jīng)用凝塊破碎劑藥物清除病理性凝塊時(shí)，存在導(dǎo)致凝固途徑的重新活化的有效因子。另外，產(chǎn)生的凝血酶本身是一種有效的凝固途徑活化劑。值得注意的是，凝血酶也執(zhí)行抗凝功能，這是止血系統(tǒng)的“自限制”控制機(jī)制(使得不會(huì)存在遍布于脈管系統(tǒng)中的‘失控’凝固)的一個(gè)優(yōu)美實(shí)例。游離凝血酶與血栓調(diào)節(jié)蛋白(一種細(xì)胞表面蛋白)形成1:1高親和力非共價(jià)復(fù)合物(Kurosawa, Galvin等人.1987)。在形成凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物以后,它的底物特異性從促凝模式重新導(dǎo)向抗凝模式，由此它活化蛋白C抗凝血途徑。因而，盡管單獨(dú)的凝血酶可以活化蛋白C，但是一旦它與血栓調(diào)節(jié)蛋白形成復(fù)合物，它會(huì)使蛋白C活化加速幾乎 1000 倍(Esmon 和 Owen 1981 ；0wen 和 Esmon 1981))。成熟的血栓調(diào)節(jié)蛋白含有負(fù)責(zé)不同功能(即凝血酶抑制和蛋白C活化)的不同結(jié)構(gòu)域，它們位于該大蛋白的表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域中。表皮生長(zhǎng)因子樣(EGF)結(jié)構(gòu)域5和6主要負(fù)責(zé)凝血酶親和力，EGF4、5和6結(jié)構(gòu)域一起活化蛋白C(Kurosawa, Stearns等人.1988 ;Stearns,Kurosawa等人.1989)。已知血栓調(diào)節(jié)蛋白或它的分離的EGF結(jié)構(gòu)域4、5和6活化以蛋白C為中心的抗凝血途徑，并且也直接地抑制凝血酶的活性，但是它們自己不會(huì)溶解纖維蛋白凝塊。為此，血栓溶解劑是必要的。在心臟血栓性疾病中可以彼此獨(dú)立地使用兩類藥劑，但是具有兩類特性的單一藥物(到目前為止尚未得到證實(shí))的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。術(shù)語(yǔ)‘止血’表示在血液/血管系統(tǒng)中的抗凝活性和促凝活性之間的平衡，其中在正常情況下血液組分、特別是血小板不會(huì)與血管的襯里異常地相互作用。在損傷或疾病狀況下，血小板傾向于附著在該損傷部位處，并且因此凝血因子開始積累在該損傷部位處并活化，盡管這是啟動(dòng)在損傷部位處的修復(fù)的應(yīng)答，但是會(huì)導(dǎo)致血液阻塞，由此經(jīng)常導(dǎo)致沉淀性的血栓性危機(jī)。 在血管內(nèi)的血液凝固和凝塊的溶解都是正常止血的必要生理學(xué)過程。在血管內(nèi)的凝塊形成和溶解機(jī)理是在文獻(xiàn)中充分已知的，不同的促凝蛋白(促進(jìn)凝結(jié))和抗凝蛋白的作用現(xiàn)在也得到相當(dāng)好的研究。凝塊形成是復(fù)雜的反應(yīng)集合的結(jié)果，其中凝血酶在啟動(dòng)以及凝固級(jí)聯(lián)加速中起重要作用，最終的結(jié)果以穩(wěn)定的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)的形式出現(xiàn)。每種現(xiàn)代的溶血栓的/纖維蛋白溶解的療法通常還組合抗血栓藥物(諸如阿司匹林、肝素等)，后者是維持凝塊溶解過程中的促凝劑和抗凝劑之間的正常平衡所必需的。在溶解過程中，暫時(shí)釋放的凝血酶啟動(dòng)自產(chǎn)生環(huán)以放大凝塊生長(zhǎng)；有時(shí)這會(huì)導(dǎo)致平衡向凝塊的再形成或促凝劑/凝結(jié)促進(jìn)劑的活化轉(zhuǎn)移。溶血栓藥通過活化循環(huán)系統(tǒng)中固有的纖溶酶原而溶解病理性凝塊。在可利用的且治療上有用的溶血栓藥中，鏈激酶表現(xiàn)出最高的溶血栓潛力，但是因?yàn)槿狈δ龎K特異性，有時(shí)它會(huì)在藥物治療過程中導(dǎo)致出血。該問題相對(duì)更少地與其它溶血栓藥(tPA和SAK)相關(guān)，因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬?duì)增加的纖維蛋白凝塊特異性，但是這些溶血栓藥的其它缺點(diǎn)是，更少的纖維蛋白溶解潛力和更短的體內(nèi)半衰期。所有溶血栓藥具有基本上相同的溶栓機(jī)理(纖溶酶原活化)，但是具有一個(gè)共同的問題，即在溶栓以后，產(chǎn)生的凝血酶經(jīng)常通過由凝血因子Va和因子VIIIa控制的反饋機(jī)制進(jìn)一步放大凝血酶產(chǎn)生。在溶栓過程中，凝塊結(jié)合的凝血酶也被釋放進(jìn)循環(huán)中，其相對(duì)地耐受固有的抗-凝血酶和其它外部提供的凝血酶抑制性藥物。該凝塊結(jié)合的凝血酶(存在于‘原始’損傷附近)也有助于在凝塊/損傷部位附近產(chǎn)生甚至更多的凝血酶，特別是在凝塊的不完全除去以后，這會(huì)導(dǎo)致臨床上嚴(yán)重的早期再閉塞問題。在其它固有的促凝劑的溶解和活化過程中的凝血酶產(chǎn)生，是止血平衡的一個(gè)正常部分?？?凝血酶劑(如肝素、水蛭素和化學(xué)合成的藥物)可以抑制凝血酶，并阻止它的隨后短暫效應(yīng)，如高反應(yīng)性血小板形成過程的抑制、纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化的抑制、以及誘導(dǎo)血液中的高凝性的其它凝結(jié)促進(jìn)活性。但是，值得注意的是，所有這些直接抑制劑作用于短暫地產(chǎn)生的凝血酶，而不作用于那些實(shí)際上加速凝血酶產(chǎn)生并在促凝途徑中起關(guān)鍵作用的因子。因而，這些藥物都不會(huì)象希望的那樣有效地作用于在凝血酶產(chǎn)生和早期再閉塞中起重要作用的凝血因子V和VIII。眾所周知的細(xì) 胞表面分子血栓調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶形成1:1復(fù)合物，并指導(dǎo)它的促凝功能成為有效的抗凝劑，即蛋白C活化劑。活化的蛋白C和蛋白S都會(huì)降解活化的因子 V 和因子 VIII (Esmon 1989)。盡管所有可利用的溶血栓藥不具有凝塊溶解能力，并且它們的機(jī)理在文獻(xiàn)中是比較清楚的，但是在凝塊溶解過程中，凝塊和纖溶酶的殘余物會(huì)導(dǎo)致凝血酶產(chǎn)生；與此同時(shí)，由于這些試劑不會(huì)滅活在凝塊溶解過程中暫時(shí)出現(xiàn)的凝血酶，結(jié)果是，再閉塞是在溶血栓治療之后的常見問題。迄今為止，不可得到這樣的抗-凝血酶藥物:其具有溶血栓性質(zhì)和抗-凝血酶性質(zhì)(特別是促凝活性)的組合，從而滅活主要負(fù)責(zé)血栓重新形成的“真正元兇”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及改進(jìn)的溶血栓藥物的設(shè)計(jì)，所述藥物除了能夠活化纖溶酶原以外，還表現(xiàn)出抑制凝血酶產(chǎn)生的能力。這些雙重性質(zhì)在相同分子中的存在潛在地具有巨大的臨床益處，因?yàn)檫@有助于使溶血栓治療以后的早期再閉塞問題最小化。本發(fā)明公開了策略地設(shè)計(jì)的嵌合多肽，其中將源自血栓調(diào)節(jié)蛋白的、具有抗凝血酶性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域/區(qū)段與不同的溶血栓蛋白融合，使得得到的融合體/嵌合多肽同時(shí)表現(xiàn)出凝塊溶解(溶血栓)性質(zhì)以及抗-凝血酶性質(zhì)。這些新穎的融合構(gòu)建體具有以纖溶酶和/或凝血酶依賴性的方式活化溶血栓系統(tǒng)的能力(這使得所述構(gòu)建體成為凝塊特異性的，因?yàn)槔w維蛋白凝塊富含纖溶酶以及凝血酶，而游離的纖溶酶和凝血酶在循環(huán)中短暫停留，迅速地被絲氨酸蛋白酶抑制蛋白諸如α-2抗纖維蛋白溶酶、抗-凝血酶等滅活)。這些構(gòu)建體也同時(shí)抑制在凝塊溶解過程中釋放的短暫地產(chǎn)生的凝血酶，并且也在血栓性病癥(諸如卒中、心肌梗塞、深靜脈血栓形成等)的情況下使用這些藥劑進(jìn)行藥物治療的過程中啟動(dòng)內(nèi)在的(固有的)抗凝蛋白C途徑。不同于目前可得到的溶血栓藥，本發(fā)明公開了新的溶血栓構(gòu)建體，其能夠靶向凝固級(jí)聯(lián)的因子Va和VIIIa(另外能夠活化纖溶酶依賴性的溶血栓途徑)以及固有地內(nèi)在的抗凝蛋白C途徑；幾種希望的能力在同一藥物分子中的這種組合存在會(huì)提高它們的總效力，使得這些可以溶解病理性血塊，同時(shí)使最可能危及生命的溶血栓后事件之一(即凝結(jié)過程的復(fù)發(fā))最小化。該方案是，設(shè)計(jì)、試驗(yàn)和驗(yàn)證具有抗-凝血酶和溶血栓性質(zhì)的融合蛋白的建立。因?yàn)镋GF4、5、6的固有的凝血酶親和力，EGF4、5、6向溶血栓分子中的成功“功能性”融合，可以潛在地使溶血栓分子靶向富含凝血酶的凝塊。與此同時(shí)，如果所述融合體除了保留2種最初‘獨(dú)立的’親本生物活性(即抗-凝血酶和纖溶酶原活化劑活性)以外，還將前藥性質(zhì)賦予雜合分子使得它優(yōu)先在凝塊附近(而不是全身性地)活化，由于它的靶向作用性質(zhì)，這將是另一個(gè)非常有用的且有利的特征。在本發(fā)明中，通過在相同分子中的有效整合，已經(jīng)成功地功能化具有溶血栓性質(zhì)與凝血酶抑制能力以及蛋白C活化能力的組合的幾種雜合蛋白分子，以便極大地提高目前可得到的溶血栓藥物的效力，并輔助預(yù)防血栓重新形成現(xiàn)象，因?yàn)檎线M(jìn)相同試劑/分子中的所有這些性質(zhì)的存在，將會(huì)在除去各種血栓性病理性綜合征中的纖維蛋白血塊方面提供實(shí)時(shí)的(時(shí)間的)和空間的(原位的)有益作用。在本發(fā)明中 ，已經(jīng)將鏈激酶、組織纖溶酶原活化劑和葡萄球菌激酶與EGF4、5、6融合，以產(chǎn)生具有啟動(dòng)纖溶酶依賴性的溶血栓系統(tǒng)和凝血酶介導(dǎo)的蛋白C抗凝血途徑的性質(zhì)的嵌合分子。此外，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，還實(shí)現(xiàn)了迄今為止尚未報(bào)道的溶栓活性、凝塊特異性活性和抗凝血酶活性的成功整合。在不同的融合構(gòu)建體中，使用在接頭中的不同的優(yōu)選氨基酸殘基，小心地設(shè)計(jì)血栓溶解劑和EGF結(jié)構(gòu)域之間的融合接點(diǎn)，并引入不同的凝血酶和/或纖溶酶可切割位點(diǎn)，由于EGF4、5、6從嵌合體的蛋白水解性釋放和隨后的溶血栓組分活化，所述位點(diǎn)會(huì)造成不同的時(shí)間依賴性的體外纖溶酶原活化動(dòng)力學(xué)。不同的凝血酶可切割位點(diǎn)在溶血栓藥和EGF4、5、6的接點(diǎn)處的存在，允許這二者在富含凝血酶的凝塊附近被局部地停留的酶(凝血酶或纖溶酶)彼此分離；因而，在切割以后，每個(gè)結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地執(zhí)行它的功能。此外，在有些融合構(gòu)建體中，已經(jīng)將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可識(shí)別的交聯(lián)序列導(dǎo)入在嵌合多肽的要害部位處，使得活化的結(jié)構(gòu)域?qū)⒂捎谘恨D(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用而共價(jià)地結(jié)合在上皮組織(其損傷最先導(dǎo)致凝塊產(chǎn)生)中或周圍的凝塊殘余物，并從而在已經(jīng)溶解最初的凝塊以后繼續(xù)長(zhǎng)時(shí)間地提供在纖溶酶原活化和凝血酶抑制方面的局部化效應(yīng)。這將清楚地導(dǎo)致藥物的‘治愈’效應(yīng)，這是一種在目前使用的任何溶血栓蛋白藥物中不可得到的性質(zhì)。


圖1的示意圖描繪了:不同的框架內(nèi)基因融合構(gòu)建體，其中血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域與任一個(gè)編碼鏈激酶、組織纖溶酶原激活物或葡萄球菌激酶的DNA融合，以及編碼結(jié)構(gòu)域間接頭(包括具有三甘氨酸(GGG)或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-識(shí)別信號(hào)(TG)的接頭)以促進(jìn)凝血因子XII1-催化的雜合蛋白與其它組織或纖維蛋白凝塊的共價(jià)交聯(lián)的框架內(nèi)融合序列，以及凝血酶可切割序列(TCS)。圖1A的示意設(shè)計(jì)A代表編碼在SK (鏈激酶)的N-端末端處融合的EGF4、5、6的DNA序列。圖1B的示意設(shè)計(jì)B代表通過適當(dāng)?shù)慕宇^與SK的C-端末端融合的EGF4、5、6,所述接頭含有促進(jìn)柔性的殘基(例如，三甘氨酸段，GGG)。
圖1C的示意設(shè)計(jì)C代表同時(shí)在SK的N和C端處的EGF融合以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別位點(diǎn)/殘基段。圖1D的示意設(shè)計(jì)D代表在SK的C-端末端處融合EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域，其中缺失了SK的5個(gè)氨基酸。圖1E的示意設(shè)計(jì)E代表在SK的N和C端處同時(shí)融合EGF4、5、6，其中凝血酶識(shí)別和可切割序列(TCS)存在于EGF和SK的接點(diǎn)處。圖1F的示意設(shè)計(jì)F代表在SK的N和C端處同時(shí)融合EGF4、5、6，其中凝血酶識(shí)別序列存在于EGF和SK的接點(diǎn)處，且轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別序列存在于EGF的開始部分(N-端末端)處。圖1G的示意設(shè)計(jì)G代表在SK的α和β結(jié)構(gòu)域的接點(diǎn)處融合EGF結(jié)構(gòu)域。圖1H的示意設(shè)計(jì)H代表在SK的β和Y結(jié)構(gòu)域的接點(diǎn)處融合EGF結(jié)構(gòu)域。圖1I的示意設(shè)計(jì)I代表在tPA(組織纖溶酶原激活物)的N和C端處同時(shí)融合EGF結(jié)構(gòu)域。在所有附圖中和這樣的術(shù)語(yǔ)在說明書中出現(xiàn)的任意地方，“egf”表示tPA的EGF-樣結(jié)構(gòu)域，而“EGF456”表示血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域。圖1J的示意設(shè)計(jì)J代表在tPA的C-端末端處融合EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域。圖1K的示意設(shè)計(jì)K代表在tPA的N-端末端處融合EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域。圖1L的示意設(shè)計(jì)L代表在tPA (組織纖溶酶原激活物)的N和C端處融合EGF4、
5、6結(jié)構(gòu)域，其中tPA的固有egf被缺失。圖1M的示意設(shè)計(jì)M代表在tPA的N-端末端處融合EGF4、5、6，其中tPA的固有egf被缺失。圖1N的示意設(shè)計(jì)N代表在tPA的N-端末端處融合EGF4、5、6，其中tPA的固有egf和三環(huán)l(kringle I)被缺失。圖10的示意設(shè)計(jì)O代表在tPA的C-端末端處融合EGF，其中tPA的固有egf被缺失。圖1P的示意設(shè)計(jì)P代表在tPA的C-端末端處融合EGF結(jié)構(gòu)域4、5、6，其中tPA的固有egf和三環(huán)I被缺失。圖1Q的示意設(shè)計(jì)Q代表EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域與tPA的融合，其中tPA的固有egf被EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代。圖1R的示意設(shè)計(jì)R代表EGF與tPA的融合，其中tPA的固有egf和三環(huán)I被EGF4、
5、6結(jié)構(gòu)域替代。
圖1S的示意設(shè)計(jì)S代表在SAK的C-端末端處融合EGF結(jié)構(gòu)域。圖1T的示意設(shè)計(jì)T代表在SAK的N-端末端處融合EGF結(jié)構(gòu)域。圖2.是在不同的融合構(gòu)建體的制備中使用的PCR方法和克隆路線圖的示意圖。圖2A的示意設(shè)計(jì)顯示了在N_EGF_SK融合基因塊的構(gòu)建中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。圖2B的示意設(shè)計(jì)顯示了在SK_EGF融合基因塊的制備中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。圖2C的示意設(shè)計(jì)顯示了在N_EGF_SK_EGF融合基因塊的制備中使用的限制酶切消化和克隆策略。
圖2D的示意設(shè)計(jì)顯示了在結(jié)構(gòu)域間SK_EGF(EGF4、5、6融合在SK的α和β結(jié)構(gòu)域之間)融合基因塊的制備中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。圖2Ε的示意設(shè)計(jì)顯示了在結(jié)構(gòu)域間SK_EGF(即EGF4、5、6融合在SK的β和Y結(jié)構(gòu)域之間)融合基因塊的制備中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。圖2F的示意設(shè)計(jì)顯示了在tPA基因塊的制備中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。圖2G的示意設(shè)計(jì)顯示了在N_EGF_tPA和tPA_EGF融合基因塊的制備中使用的限制酶切消化和克隆策略。圖2H的示意設(shè)計(jì)顯示了在tPA_EGF融合基因塊的制備中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略，其中tPA的固有egf和三環(huán)I結(jié)構(gòu)域被選擇性地缺失。圖21的示意設(shè)計(jì)顯示了在N_EGF_tPA融合基因塊的制備中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略，其中tPA的固有egf和三環(huán)I結(jié)構(gòu)域被缺失。圖2J的示意設(shè)計(jì)顯示了在tPA_EGF融合基因塊的制備中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略，其中tPA的固有egf結(jié)構(gòu)域被EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代。圖2K的示意設(shè)計(jì)顯示了在tPA_EGF融合基因塊的制備中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略，其中tPA的固有egf和三環(huán)I結(jié)構(gòu)域被EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代。圖3.纖溶酶原活化(吸光度405nm)的分光光度計(jì)法掃描顯示了 N-端融合的EGF4、5、6和SK構(gòu)建體對(duì)纖溶酶原活化的延遲，以及在有痕量的纖溶酶存在下的滯后的減少(細(xì)節(jié)參見‘在實(shí)施例中使用的 一般方法’)。應(yīng)當(dāng)指出，天然SK不會(huì)表現(xiàn)出纖溶酶原活化的任何顯著滯后。圖4.通過不同量(60_180nm)的不同融合構(gòu)建體和指示的對(duì)照代表增加的凝血酶凝血時(shí)間測(cè)定。圖5.在有不同的SK和EGF融合構(gòu)建體和指示的適當(dāng)對(duì)照存在下的蛋白C活化譜(細(xì)節(jié)參見‘一般方法’ )O圖6.使用不同的tPA融合構(gòu)建體(等摩爾；2nm)和指示的對(duì)照的凝血時(shí)間測(cè)定。圖7.在有和沒有可溶性纖維蛋白存在下，不同的tPA融合構(gòu)建體以及指示的對(duì)照對(duì)纖溶酶原的活化。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及新的溶血栓融合多肽的設(shè)計(jì)和制備，與目前可得到的可利用形式(即組織纖溶酶原激活物、SK和SAK或它們的衍生物/修飾形式)相比，所述融合多肽表現(xiàn)出不同的功能優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槟壳翱傻玫降男问絻H僅通過纖溶酶原活化而溶解纖維蛋白凝塊，不能預(yù)防溶血栓以后的后果，所述后果在溶血栓治療過程中導(dǎo)致早期再閉塞問題，這主要?dú)w因于凝血酶產(chǎn)生。本發(fā)明公開了使用直接和間接纖溶酶原活化劑制備融合構(gòu)建體的方法，所述纖溶酶原活化劑與血栓調(diào)節(jié)蛋白的第4個(gè)、第5個(gè)和第6個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域融合，所述融合構(gòu)建體保留不僅活化纖溶酶原、而且直接抑制凝血酶的能力，以及保留通過凝血酶介導(dǎo)的抗凝血途徑活化蛋白C的能力。與蛋白的氨基酸序列有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“變體”、“同系物”、“衍生物”、“片段”或“類似物”包括，對(duì)或向所述序列的一個(gè)(或多個(gè))氨基酸的任何置換、變異、修飾、替代、缺失或添加，只要得到的蛋白或(多)肽具有的活性與未修飾的蛋白的活性等效。具體地，術(shù)語(yǔ)“同系物”涵蓋就結(jié)構(gòu)和/或功能而言的同源性。就序列同源性而言，優(yōu)選地，與未修飾的蛋白的序列具有至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少85%同源性。優(yōu)選地,與未修飾的蛋白的序列具有至少90%、更優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少98%同源性。通常，就本發(fā)明的變體、同系物、衍生物、片段或類似物而言，可以產(chǎn)生的氨基酸置換的類型應(yīng)當(dāng)維持氨基酸序列的疏水性/親水性。氨基酸置換可以源自例如1、2或3至10、20或30個(gè)置換，前提條件是，被修飾的序列保留根據(jù)本發(fā)明的作用能力。氨基酸置換可以包括使用非天然存在的類似物，例如以增加治療上施用的多肽的血漿半衰期。例如，可以如下所示產(chǎn)生保守置換。在同一行中的氨基酸可以彼此置換:脂族的、非極性的 GAPILV極性的、不帶電荷的 CSTMNQ極性的、帶電荷的 DEKR芳族的 HFWY如上所指出的，通常通過重組方式，例如如本文所述，和/或通過使用合成方法使用技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)諸如固相合成，制備本發(fā)明的蛋白。本文使用的“缺失”定義為，核苷酸或氨基酸序列的變化，其中分別缺少一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。本文使用的“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列的變化，所述變化已經(jīng)分別導(dǎo)致與天然存在的 蛋白相比一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的添加。本文使用的“置換”源自不同的核苷酸或氨基酸分別對(duì)一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸的替代。本文使用的術(shù)語(yǔ)“4、5和6表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域”或“EGF4、5、6”可以是血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5或6結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)，或者可以表示共價(jià)地鍵合到一起成為肽或肽片段的血栓調(diào)節(jié)蛋白的所有3個(gè)EGF4、5和6結(jié)構(gòu)域。4、5和6表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域具有同源性。本發(fā)明公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含與溶血栓蛋白融合的血栓調(diào)節(jié)蛋白的
4、5和6表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF4、5、6)，所述溶血栓蛋白選自:鏈激酶、組織纖溶酶原激活物、葡萄球菌激酶、尿激酶和它們的衍生物和類似物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域在所述溶血栓蛋白或其衍生物或類似物的N-端、C-端或N和C兩端處與所述溶血栓蛋白或其衍生物或類似物融合。本發(fā)明也公開了遺傳構(gòu)建體的設(shè)計(jì)，所述遺傳構(gòu)建體含有在編碼溶血栓蛋白(SK、tPA或SAK)的N-端末端的部分處與溶血栓蛋白融合的EGF的最少必需抗血栓形成部分，其中翻譯(在得到的‘嵌合的’ ORF中)從EGF的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域開始，繼之以編碼溶血栓多肽合成的部分。因而，成熟的多肽或折疊的蛋白不僅含有2種不同類型的蛋白，而且還具有二者的功能性。這些含有溶血栓蛋白的構(gòu)建體被稱作EGF N-端融合構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，我們已經(jīng)定義了在溶血栓蛋白的C-端側(cè)融合的EGF結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)原理和構(gòu)建方法，其中首先融合編碼相關(guān)部分(溶血栓藥_EGF4、5、6)的寡核苷酸塊，使得翻譯從溶血栓蛋白開始，并在EGF的第6個(gè)結(jié)構(gòu)域處終止，然后在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)寡核苷酸雜合塊，純化雜合體，并試驗(yàn)它的纖溶酶原活化以及凝血酶抑制等。在這里，翻譯的多肽從功能上有活性的溶血栓蛋白開始，且具有在C-端末端處的EGF結(jié)構(gòu)域，因而也具有抗凝血酶和蛋白C活化能力。還已經(jīng)公開了導(dǎo)致功能性多肽的制備的設(shè)計(jì)，其中嵌合多肽最初是無(wú)活性的，但是在被纖溶酶或凝血酶蛋白水解性截短以后獲得它的纖溶酶原活化能力。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種包含鏈激酶的溶血栓蛋白，所述鏈激酶具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入、缺失或截短，且其中所述構(gòu)建體具有纖溶酶原活化活性、凝血酶抑制活性和抗凝蛋白C途徑活化活性。另一個(gè)實(shí)施方案含有制備N和C端融合構(gòu)建體的方法，其中所述溶血栓蛋白同時(shí)含有在溶血栓蛋白的N和C端處的3個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域。在寡核苷酸塊的表達(dá)以及使用確立的基因克隆方法等對(duì)它們的表達(dá)的輔助下設(shè)計(jì)這些構(gòu)建體，其中通過共同的限制位點(diǎn)連接N-端和C-端EGF4、5、6融合構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了蛋白內(nèi)融合體的設(shè)計(jì)，所述蛋白內(nèi)融合體攜帶在溶血栓藥(諸如鏈激酶和組織纖溶酶原激活物)內(nèi)的EGF結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜合/融合構(gòu)建體具有組織纖溶酶原激活物，其中EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代tPA的三環(huán)I結(jié)構(gòu)域。該構(gòu)建體表現(xiàn)出良好的纖溶酶原活性以及抗凝血酶性質(zhì)。另一個(gè)實(shí)施方案公開了 EGF結(jié)構(gòu)域的氧化抗性形式，其中通過確定的定位誘變方法，在前述部分中描述的含有溶血栓藥(SK、tPA和SAK)的N-端、C-端和N與C兩端(同時(shí))融合構(gòu)建體中，用纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺氨基酸殘基替代EGF4、5、6的甲硫氨酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域，它們?nèi)诤显谒鲦溂っ傅摩梁挺?、或β和Y結(jié)構(gòu)域之間，或者融合在鏈激酶衍生物或類似物的α和β、或β和Y結(jié)構(gòu)域之間，其中所述鏈激酶衍生物或類似物包含一個(gè)或多個(gè)突變、添加、插入或截短，且其中所述構(gòu)建體活化纖溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C途徑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種構(gòu)建體，其中EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域與鏈激酶或鏈激酶衍生物或類似物在一個(gè)或多個(gè)選自鏈激酶N-端、鏈激酶C-端、N-和C-鏈激酶兩端的位置處或在鏈激酶的結(jié)構(gòu)域間位置處發(fā)生框架內(nèi)融合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述鏈激酶衍生物跨殘基5-383或5-414。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述鏈激酶衍生物跨殘基16-383。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域在一個(gè)或多個(gè)選自鏈激酶N-端、鏈激酶C-端或N-和C-鏈激酶兩端的位置處發(fā)生框架內(nèi)融合，其中所述EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域的Met 41被纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或0端Met 435被纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或在同時(shí)的N-和C-端融合構(gòu)建體中，Met 41和Met 435獨(dú)立地被纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別序列。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含在EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域與溶血栓蛋白或其衍生物或類似物的接點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)凝血酶可切割序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜合/融合構(gòu)建體包含在EGF4、5、6和它們的氧化抗性形式的接點(diǎn)處的凝血酶可切割位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雜合/融合構(gòu)建體含有EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域被突變，以具有由于甲硫氨酸氧化和因此在它們制備過程中活性喪失的氧化抗性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含在下述位置與組織纖溶酶原激活物(tPA)衍生物、類似物或片段融合的血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域:在tPA衍生物、類似物或片段的N-端處，在tPA衍生物、類似物或片段的C-端處，在tPA衍生物、類似物或片段的兩端處，或在tPA衍生物、類似物或片段內(nèi)部。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域和tPA衍生物、類似物或片段之間的融合體另外包含一個(gè)或多個(gè)接頭片段。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述一個(gè)或多個(gè)接頭片段包含一個(gè)或多個(gè)促進(jìn)所述構(gòu)建體的柔性的氨基酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述一個(gè)或多個(gè)氛基酸選自:Gly、Asn、Pro、Ser> Gin、Arg 和 Lys。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述tPA衍生物、類似物或片段包含一個(gè)或多個(gè)突變、添加、插入或截短，且其中所述tPA衍生物、類似物或片段活化纖溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含與一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域融合的組織纖溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修飾形式，使得tPA的EGF結(jié)構(gòu)域被一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代，且其中所述構(gòu)建體具有抗凝血酶和纖溶酶原活化活性。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含與一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域融合的組織纖溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修飾形式，使得tPA的三環(huán)I和EGF結(jié)構(gòu)域被一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代，且其中所述構(gòu)建體具有抗凝血酶和纖溶酶原活化活性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中在tPA片段的N-端或C-端處的tPA EGF結(jié)構(gòu)域和三環(huán)I結(jié)構(gòu)域被一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含一個(gè)或多個(gè)在tPA片段或其截短或修飾形式和血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域之間的接頭片段，所述接頭片段包含促進(jìn)構(gòu)建體柔性的氨基酸殘基，使得所述構(gòu)建體具有凝血酶抑制、蛋白C活化和纖溶酶原活化能力。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述EGF4、5、6組分的甲硫氨酸41被丙氨酸、纈氨酸或谷氨酰胺替代。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域與葡萄球菌激酶(SAK)的N-端或C-端末端發(fā)生框架內(nèi)融
八
口 ο 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域的甲硫氨酸41被丙氨酸、纈氨酸或谷氨酰胺替代。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含在SAK和EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域區(qū)域之間的凝血酶可切割序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體可溶于水溶液或鹽水溶液中。在本發(fā)明中，在另Iv實(shí)施方案中，由在緊S調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子控制下的質(zhì)粒表達(dá)所述重組嵌合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過重組DNA技術(shù)，在合適的宿主(諸如細(xì)菌、真菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)各種嵌合構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其分泌進(jìn)細(xì)胞外培
養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在原核和真核宿主中表達(dá)組織纖溶酶原激活物和EGF4、5、6融合構(gòu)建體，從所述宿主收獲所述多肽，以獲得純形式的有活性的雜合構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還在真核系統(tǒng)(如動(dòng)物細(xì)胞系、酵母表達(dá)系統(tǒng)和植物細(xì)胞)中表達(dá)含有EGF構(gòu)建體的各種組織纖溶酶原激活物融合體，其中表達(dá)盒整合進(jìn)宿主基因組中，或作為附加體保留在細(xì)胞質(zhì)中。表達(dá)的雜合蛋白可以是糖基化的或未糖基化的，取決于用于表達(dá)的宿主。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種治療哺乳動(dòng)物的血栓形成的方法，所述方法包括:給所述需要治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的嵌合蛋白構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種抑制凝血酶的方法，所述方法包括:使用嵌合蛋白構(gòu)建體。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，公開了一種活化蛋白C的方法，所述方法包括:使用嵌合蛋白構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種提供抗凝血酶和纖溶酶原活化的方法，所述方法包括:使用嵌合蛋白構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種藥物制劑，其包含藥學(xué)有效量的嵌合蛋白構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種在哺乳動(dòng)物中溶栓的方法，所述方法包括:給所述有此需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的嵌合蛋白構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為合適的表達(dá)宿主優(yōu)化所述雜合構(gòu)建體的編碼DNA序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種核酸序列，其編碼上述的嵌合蛋白構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種包含上述核酸序列的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種包含上述載體的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種嵌合蛋白構(gòu)建體，其通過在宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼所述蛋白的核酸序列而制備。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了一種制備嵌合蛋白構(gòu)建體的方法，其中在宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼所述蛋白的核酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中的細(xì)菌是大腸桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中的真核表達(dá)系統(tǒng)是動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中的酵母是巴斯德畢赤酵母。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中的嵌合蛋白構(gòu)建體從宿主細(xì)胞分泌進(jìn)細(xì)胞外培養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述純化的構(gòu)建體可用作治療劑和用于藥物組合物中，所述治療劑和藥物組合物用于治療具有各種血栓性病癥的哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以是人類、嚙齒類動(dòng)物或家養(yǎng)的動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述純化的構(gòu)建體與或不與額外的穩(wěn)定劑和賦形劑一起用作治療劑，以減輕各種循環(huán)病癥。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，將所述純化的構(gòu)建體配制進(jìn)一種或多種藥物組合物中。含有一種或多種純化的構(gòu)建體的藥物組合物可以配制成固體形式(即在管形瓶中冷凍干燥，用于以后在合適的溶液中重構(gòu))或液體形式。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，這些含有純化的構(gòu)建體的組合物構(gòu)成用于溶血栓療法或治療的試劑盒，所述試劑盒可以任選地包括其它組件，諸如:裝有用于重構(gòu)活性成分的溶液的容器，插管，裝有用于靜脈內(nèi)施用的生理漿液的滴注袋，和使用說明書，等。所述藥物組合可以以組合形式(即，其中所有活性成分組合在一個(gè)制劑中)或以單個(gè)形式(即，其中所述 活性成分沒有組合(或沒有全部組成)在一個(gè)制劑中)配制和使用，作為:用于口服給藥的片劑、膠囊劑或酏劑；用于直腸給藥的栓劑；用于注射給藥的無(wú)菌溶液、混懸液；等?？梢哉{(diào)節(jié)給藥劑量和方法以實(shí)現(xiàn)最佳效力，但是取決于諸如下述因素:患者體重、飲食、并行的藥物治療和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到的其它因素。通常，就本發(fā)明的純化的構(gòu)建體(包括用途、方法、藥物組合物和產(chǎn)品)而言，取決于使用的純化的構(gòu)建體的效能，施用0.1-1OOOmg之間的量(作為單次劑量或多次劑量，視需要而定)。優(yōu)選的實(shí)施方案包括為貯存和隨后的施用而制備的藥物組合物，其包含治療有效量的純化的構(gòu)建體或本文所述的純化的構(gòu)建體在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的富集組合物。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑是藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，且描述在例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C0.(A.R.Gennaro 編，1985)中。可以在藥物組合物中提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至矯味劑。例如，可以加入苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸酯作為防腐劑。另外，可以使用抗氧化劑和助懸劑。在體內(nèi)聯(lián)合治療中采用所述純化的構(gòu)建體或它們的藥物組合物或產(chǎn)品時(shí)，可以采用多種劑型以多種方式將所述組合物/產(chǎn)品施用給哺乳動(dòng)物，所述方式包括腸胃外地(例如靜脈內(nèi)地、皮下地、肌肉內(nèi)地、結(jié)腸地、直腸地、鼻地、含服的、透皮地、陰道地或腹膜內(nèi)地)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地明白，要施用的有用體內(nèi)劑量和具體給藥模式將隨治療的哺乳動(dòng)物物種、采用的具體組合物和這些組合物的具體用途而變化。有效劑量水平(也就是實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果所需的劑量水平)的確定，是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。通常，在較低的劑量水平開始使用組合物，逐漸增加劑量水平，直到達(dá)到期望的效果。通常，在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法中，所述純化的構(gòu)建體或藥物組合物的劑量可以隨期望的效果和治療適應(yīng)癥寬泛地變化。通常，所述純化的構(gòu)建體的合適的劑量是約0.1mg至IOOOmg,優(yōu)選地約IOmg至500mg,更優(yōu)選地約IOmg至150mg,最優(yōu)選地約IOmg至120mg。施用優(yōu)選地是腸胃外的，諸如靜脈內(nèi)的。施用也優(yōu)選地是作為單次劑量或多次劑量，視需要而定。施用優(yōu)選地是腸胃外的，諸如靜脈內(nèi)的。施用也優(yōu)選地是作為單次劑量或多次劑量，視需要而定?？梢砸猿Ｒ?guī)形式將注射劑制成液體溶液或混懸液、適用于在注射之前在液體中重構(gòu)為溶液或混懸液的固體形式、或乳劑。合適的賦形劑是，例如，水/鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸等。另外，如果需要的話，可注射的藥物組合物可以含有少量無(wú)毒的輔助物質(zhì)，諸如潤(rùn)濕劑、PH緩沖劑等。如果需要的話，可以利用吸收增強(qiáng)制劑(例如脂質(zhì)體)。就腸胃外施用而言，可以使用根據(jù)本發(fā)明的藥學(xué)活性劑在芝麻油或花生油中或在丙二醇水溶液中的溶液。如果必要的話,可以適當(dāng)?shù)鼐彌_水溶液(優(yōu)選地在pH4至pH9之間)，并首先使液體稀釋劑是等張的。例如，將NIF用于pH為約7的水溶液中。但是，NIF在低至約PH4的水溶液中是穩(wěn)定的。優(yōu)選的“配偶體化合物” t-PA(或其變體)通常用于PH為約5的水溶液中。這些水溶液適用于靜脈內(nèi)注射目的。所述油溶液適用于關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下注射目的。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)，可以容易地在無(wú)菌條件下制備所有這些溶液。應(yīng)當(dāng)指出，可以低壓凍干本發(fā)明的藥物組合物和產(chǎn)品進(jìn)行貯存，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法進(jìn)行重構(gòu)并隨后施用。不論是作為凍干粉劑(Iyophile)還是以其它方式儲(chǔ)存，本發(fā)明的組合中的活性組分可以在冷凍干燥之前或重構(gòu)之后混合到一起(用于以后共同施用)，或單獨(dú)儲(chǔ)存(用于以后同時(shí)、分別或相繼施用)。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，施用是腸胃外的，例如通過靜脈內(nèi)注射，或通過導(dǎo)管插入術(shù)局部地施用，用于在凝塊附近原位施用。可以存在于本發(fā)明提供的藥物組合的組合物中的純化的構(gòu)建體的量，可以在寬范圍內(nèi)變化，但是總是處于治療上有效的量。使用本發(fā)明的藥物組合的組合物的每個(gè)溶血栓治療方案的劑量將取決于眾多因素，包括患者的年齡、狀況、要治療的臨床病癥的嚴(yán)重程度、在每種情況下將要施用的純化的構(gòu)建體的給藥途徑和頻率。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于溶血栓治療的已經(jīng)描述的本發(fā)明的藥物組合或試劑盒。在另一個(gè)額外方面，本發(fā)明也涉及一種治療和溶血栓治療方法，所述方法包括:給患者施用治療上有效量的一種或多種純化的構(gòu)建體。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的組合物特別適合用于治療缺血性心臟病和它的并發(fā)癥、以及缺血性腦卒中、類風(fēng)濕病和其它病狀，在所述其它病狀的發(fā)病機(jī)制中存在炎癥反應(yīng)、組織缺血、由血栓形成造成的血液流變學(xué)和血管微循環(huán)的紊亂。本發(fā)明公開了組織纖溶酶原激活物與血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域的融合構(gòu)建體，其具有含有6個(gè)氨基酸的接頭序列?？梢愿淖兓蛘{(diào)節(jié)該接頭序列長(zhǎng)度和氨基酸序列次序，以進(jìn)一步優(yōu)化兩種性質(zhì)的功能。與具有接頭的構(gòu)建體相比，最初設(shè)計(jì)的沒有接頭序列的構(gòu)建體僅表現(xiàn)出含有優(yōu)化過的接頭的不同構(gòu)建體的蛋白C活性的小部分，大致20-25%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了通過標(biāo)準(zhǔn)基因工程方法來制備編碼非天然融合蛋白的基因塊和它們的變體。此外，蛋白間融合接頭序列優(yōu)選地在EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域與纖溶酶原活化劑組分的接頭部位處含有3個(gè)或更多個(gè)甘氨酸氨基酸殘基，從而為EGF的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域提供必要的柔性，所述第4個(gè)結(jié)構(gòu)域在蛋白C結(jié)合和活化中起關(guān)鍵作用。類似地，當(dāng)它們與tPA的N-端區(qū)域融合時(shí)，將接頭放在EGF的第6個(gè)結(jié)構(gòu)域之后并與其緊鄰，使得它會(huì)促進(jìn)凝血酶結(jié)合。在將EGF4、5、6引入組織纖溶酶原激活物的有序結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域之間的情況下，這特別適用。因而，當(dāng)融合2個(gè)配偶體以保留兩種配偶體蛋白的功能性時(shí)，接頭的作用是顯而易見的。以下述方式選擇接頭序列:其中將一個(gè)帶正電荷的氨基酸(賴氨酸或精氨酸)與Val殘基串聯(lián)，但是在2個(gè)或3個(gè)甘氨酸殘基的前面，使得它可以被在凝塊附近(在溶解過程中，在此處短暫形成凝血酶的機(jī)會(huì)非常高)的纖溶酶切割，并且2個(gè)結(jié)構(gòu)域可以在損傷部位處獨(dú)立地發(fā)揮它們的作用。所述接頭也含有一個(gè)脯氨酸氨基酸，該氨基酸實(shí)際上幫助改變EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域的定向，使得它們可以在結(jié)合凝血酶和活化蛋白C的同時(shí)最佳地工作。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以增加或減少設(shè)計(jì)的構(gòu)建體接頭長(zhǎng)度，以及可以用天然的和非天然的氨基酸改變氨基酸序列，以便影響活化的速率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將凝血酶可切割序列、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別序列和其它血液蛋白酶敏感的部位 引入接頭中，而不影響纖維蛋白溶解功能和抗血栓功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了多種融合多肽和它們的更好變體的表達(dá)和純化方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了多種非天然的多肽，它們表現(xiàn)出溶血栓性質(zhì)和抗凝血酶性質(zhì)以及蛋白C抗凝血性質(zhì)的組合性質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將EGF4、5、6的氧化抗性形式與功能上改進(jìn)的組織纖溶酶原激活物變體融合，所述變體具有與天然tPA (例如DNA SEQ ID 20)相比突變的變異。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將EGF4、5、6的氧化抗性形式與鏈激酶的纖溶酶抗性形式融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將EGF4、5、6的氧化抗性形式與溶血栓蛋白融合，其中一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基是游離的。在另一個(gè)實(shí)施方案中,將表達(dá)的融合多肽用于治療心血管疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的藥物組合物具有表達(dá)的融合多肽和FDA批準(zhǔn)的化學(xué)穩(wěn)定劑如甘露醇、人血清清蛋白(HSA)等和增溶劑。表達(dá)的融合構(gòu)建體可以配制用于給人類靜脈內(nèi)給藥，其可以含有FDA批準(zhǔn)的穩(wěn)定劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGF4、5、6和它的變體可以與尿激酶型纖溶酶原活化劑融
口 ο在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用這樣的蛋白制備不同的EGF融合構(gòu)建體:所述蛋白表現(xiàn)出與SK、tPA和SAK的75-100%同源性，且表現(xiàn)出它們的天然蛋白的50-100%的纖溶
酶原活化潛力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將EGF4、5、6的變體與SK、tPA和SAK融合，其中EGF4、5、6變體與獨(dú)立地表達(dá)的天然EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域相比表現(xiàn)出75-100%同源性/相似性和50-100%抗凝血酶和蛋白C活性。試劑遺傳構(gòu)律體:EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域序列是人血栓調(diào)節(jié)蛋白cDNA的結(jié)構(gòu)域序列，所述cDNA為了在酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的最佳表達(dá)而商業(yè)地定制合成(GeneScriptInc.，美國(guó))。以正確的次序連接合成的基因區(qū)段，并克隆進(jìn)細(xì)菌質(zhì)粒中?；旧贤ㄟ^下述方式的組合，制備血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域(在一個(gè)方面)和溶血栓藥例如SAK、SK或tPA(或它們的衍生物/突變體)之間的融合構(gòu)建體:(a)使用化學(xué)方法進(jìn)行定制基因合成，和(b)使用充分確定的PCR技術(shù)，使用得自適當(dāng)質(zhì)粒的特異性地設(shè)計(jì)的引物，獲得選擇的基因區(qū)段(參見下面的實(shí)施例中使用的方法)，隨后分離PCR制備的基因區(qū)段塊，并使用專門的PCR方法諸如重疊延伸PCR等，將它們?cè)诳蚣軆?nèi)‘融合’。通常，使用具有適當(dāng)?shù)母叱掷m(xù)合成能力的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(得自FermantasInc.或Stratagene Inc.的Pfu DNA聚合酶)或高保真度pfu turbo (Stratagene Inc.)酶,進(jìn)行常規(guī)PCR。通過轉(zhuǎn)化進(jìn)下述的適當(dāng)大腸桿菌菌株中，在基于17 RNA聚合酶啟動(dòng)子的表達(dá)載體pET-23d中克隆/表達(dá)雜合DNA構(gòu)建體:菌株XL-Blue (用于常規(guī)質(zhì)粒亞克隆，沒有伴隨的蛋白表達(dá))，和菌株BL21(DE3)(用于在I7RNA Pol啟動(dòng)子下的蛋白表達(dá))，它們從Novagen Inc.(Madison, WI,美國(guó))獲得，并也在甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(其具有在載體PPIC-9K中的框架內(nèi)a-交配因子信號(hào)序列)下在酵母(巴斯德畢赤酵母)中表達(dá)，并且將GSl 15細(xì)胞用于表達(dá)(InvitrogenLife Technologies, California,美國(guó))。從 New England Biolabs (Beverly,MA)獲得各種限制性內(nèi)切核酸酶、T4 DNA連接酶和其它DNA修飾酶。寡核苷酸引物由加拿大的Biobasic，Inc.供給。使用可從Qiagen GmbH(德國(guó))得到的試劑盒,進(jìn)行DNA純化和得自瓊脂糖凝膠的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的提取。在配有16-毛細(xì)管裝置的Applied Biosystems 3130 xl基因分析儀上，使用突光染料進(jìn)行自動(dòng)化DNA測(cè)序。Glu-纖溶酶原購(gòu)自Roche DiagnosticsGmbH(Penzberg,德國(guó))，或通過親和色譜法(Deutsch和Mertz, 1970)從人血衆(zhòng)中純化。人蛋白C、凝血酶、水蛭素購(gòu)自美國(guó)的Calbiochem,標(biāo)準(zhǔn)的兔血栓調(diào)節(jié)蛋白和重組血栓調(diào)節(jié)蛋白都購(gòu)自美國(guó)的 American Diagnostica Inc.。用 Applied Biosystems 測(cè)序儀 491 型,進(jìn)行N-端氣相氨基酸測(cè)序。尿激酶、EACA、氰基硼氫化鈉和L-賴氨酸購(gòu)自美國(guó)圣路易斯的Sigma Chemical C0.。從 GE-Amersham (Uppsala,瑞典)獲得苯基瓊脂糖 6XL 和 DEAE 瓊脂糖(Fast-Flow)，從Qiagen獲得N1-NTA珠子。所有其它試劑都具有可得到的最高分析等級(jí)。在實(shí)施例中使用的一般方法:1.重組DNA融合方法:通稱作重組DNA技術(shù)的多種方法現(xiàn)在是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。幾種技術(shù)、標(biāo)準(zhǔn)方案和它們的改進(jìn)形式已經(jīng)在基本參考書中進(jìn)行了非常充分的描述，如:Sambrook 等人， Molecular Cloning:A laboratory Manual (第 II 版，ColdSpring Harbor Press, New York., 1989 ；McPherson, M.J., Quirke, P.,和 Taylor, G.R.,[編]PCR:A practical approach.，IRL Press, Oxford.，1991)。但是，在融合構(gòu)建體的設(shè)計(jì)中需要幾處改進(jìn)，其中為特定應(yīng)用引用得自不同公開文獻(xiàn)的不同公開內(nèi)容。在本發(fā)明中，當(dāng)融合2個(gè)基因時(shí),我們依賴于Ho等人(Ho, Hunt等人.1989)以及Mehta和Singh (Mehta和Singh 1999)的稱作重疊延伸PCR的方法。對(duì)于最高達(dá)2Kb的小構(gòu)建體擴(kuò)增而言，使用pfuDNA聚合酶(Fermentas Inc.,美國(guó))，對(duì)于其中為了點(diǎn)突變構(gòu)建而需要高保真度聚合酶反應(yīng)的更長(zhǎng)PCR而言,使用pfu turbo (Stratagene)進(jìn)行6_7Kb長(zhǎng)的片段擴(kuò)增和定位誘變(Wang 和 Malcolm 1999)。2.限制酶切消化和連接:限制酶切消化酶和連接酶得自美國(guó)的New EnglandBiolabs,并根據(jù)生產(chǎn)商的方案使用Fermantas Inc.的‘快速消化劑’限制性酶。關(guān)于幾乎所有嵌合融合體構(gòu)建實(shí)施例，在Xho I (四堿基切割酶)和Not I (六堿基切割酶)消化的載體和插入片段之間進(jìn)行連接，使定向克隆的機(jī)會(huì)最大化。

3.將連接混合物電穿孔進(jìn)大腸桿菌XL IB感受態(tài)細(xì)胞中和含有線性化的插入片段的載體在PPIC-9K中的轉(zhuǎn)化:將反應(yīng)的連接混合物電穿孔進(jìn)XL IB感受態(tài)細(xì)胞中(Sharma和Schimke 1996)。按照說明書,用Qiagen的Midi制備試劑盒制備大量DNA。在Midi制備的最終步驟中，在高鹽濃度中洗脫DNA，在這里我們使用在終濃度為pH5的0.3M醋酸鈉，并使用70%乙醇除去多余的鹽(SambiOok等人，1989)，所述鹽可能干擾消化反應(yīng)。通過該過程，我們得到50-60 μ g DNA，在Bgl II酶的幫助下對(duì)所述DNA進(jìn)行線性化步驟，在消化以后，再次進(jìn)行醋酸鈉和乙醇沉淀步驟，最后將干燥的沉淀物溶解在7-8μ I高壓滅菌的無(wú)鹽水中，這時(shí)得到1-3 μ g/μ I的DNA。在這里，將7-10yg DNA用于轉(zhuǎn)化進(jìn)巴斯德畢赤酵母的His_GSl 15細(xì)胞的電感受態(tài)細(xì)胞中，最后鋪板在最小限量葡萄糖上，這時(shí)僅His+轉(zhuǎn)化體在平板上生長(zhǎng)。以下述方式設(shè)計(jì)質(zhì)粒pPIC-9k:使得通過與AOX I啟動(dòng)子的同源重組，可能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的多拷貝插入(Ramchuran, Mateus等人,2005)。通過用遞增的抗生素濃度監(jiān)測(cè)慶大霉素抗性群體，通過細(xì)菌卡那霉素抗性基因(Tn903)，可以監(jiān)測(cè)多拷貝靶基因插入。畢赤酵母可以耐受0.25mg/ml這樣的慶大霉素抗性,但是0.5mg/ml和4mg/ml分別顯示出1-2拷貝和7-12拷貝插入。慶大霉素抗性與目標(biāo)基因的多插入直接相關(guān)。由于基因劑量效應(yīng)，可以推論，目標(biāo)基因產(chǎn)物的分泌越高，對(duì)應(yīng)著越高的插入數(shù)目(Norden, Agemark等人.2011)。4.融合構(gòu)建體包涵體的表達(dá)、分離和重折疊.在pET 23-d下表達(dá)了一些構(gòu)建體，諸如EGF-SAK和SAK-EGF，其中所述嵌合蛋白以包涵體的形式積累在宿主大腸桿菌BI21-DE 3細(xì)胞中。在形成包涵體的情況下,得到最大量的過表達(dá)的蛋白(Misawa和Kumagai1999 ;Zhang，Xu等人.2009)。將大腸桿菌BL21 DE3細(xì)胞用于生產(chǎn)嵌合的融合蛋白包涵體，其中使用25ml得自過夜培養(yǎng)的BL21 DE3細(xì)胞培養(yǎng)物的LB (Luria Bertani)作為主要接種物，將其轉(zhuǎn)移至500ml LB (繼代培養(yǎng))培養(yǎng)基。一旦OD6tltl達(dá)到0.6-0.8，在ImM IPTg幫助下誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生。誘導(dǎo)以后，將細(xì)胞在搖動(dòng)條件下在40°C保持6小時(shí)。6小時(shí)溫育以后，通過在4°C在6000rpm離心10分鐘，收獲細(xì)胞。最后，用50mM tris、IOOmM NaCl和ImM EDTA溶液洗滌收獲的細(xì)胞，以從細(xì)胞團(tuán)除去培養(yǎng)基組分。洗滌以后，將細(xì)胞懸浮于洗滌溶液中，至最終OD6tltl在35-40之間；在該稀釋度，用基于探頭的超聲破碎器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲處理45分鐘，其中使用30秒開/關(guān)循環(huán)。在溶解循環(huán)結(jié)束以后，通過在12，OOOrpm離心15分鐘，收獲細(xì)胞沉淀物。用 IOOmM NaCl、50mM Tris Cl pH7.4、lmM EDTA、0.1 % TritonX-100 和 2M含脲溶液洗滌得到的沉淀物2次。再次將這些包涵體再懸浮于溶液中，并通過在12000rpm離心15分鐘進(jìn)行收獲。用IOOmM NaCl、50mM Tris Cl pH7.4和ImM EDTA溶液洗滌收獲的沉淀物2次，從而除去Triton X-100。最后，將沉淀物再懸浮于8M脲(在20mM Tris Cl pH7.4中制備)和ImM DTT中保持2小時(shí)。通過在12000rpm離心20分鐘，使溶解在該溶液中的大部分包涵體與沉淀物分離，最終的上清液含有最大部分的嵌合融合蛋白?，F(xiàn)在，對(duì)該蛋白級(jí)分進(jìn)行重折疊，其中將它稀釋至0.2mg/ml，并在下述條件下重折疊:2M脲，氧化型和還原型谷胱甘肽摩爾比為1.5: 0.5，在50mM NaCl、50mM Tris_Cl、2%甘油中，在4°C保持36小時(shí)，進(jìn)行極輕微的攪拌。在該重折疊步驟結(jié)束以后，將所述混合物在20mM Tris Cl pH7.6和50mM脲中透析48小時(shí)，使用疏水和離子交換色譜法，通過串聯(lián)的色譜法純化透析的反應(yīng)混合物。通過DTNB反應(yīng)(Riener，Kada等人.2002)監(jiān)測(cè)二硫鍵形成，所述DTNB反應(yīng)是二硫鍵形成和重折疊的直接指示。最后，對(duì)純化的蛋白進(jìn)行不同的活性測(cè)定。5.用于檢測(cè)纖溶酶原活化的酪蛋白-纖溶酶原覆蓋:在融合構(gòu)建體中，在初步水平，通過該方法篩選纖溶酶原活化，其中在含有15mM NaCl和50mM Tris的水中與1%瓊脂糖一起煮沸5% (w/v)脫脂奶。冷卻后，將約200-400 ii g纖溶酶原加入該混合物中，并覆蓋在含有氨芐西林的LB平板上，所述平板具有要篩選的菌落/克隆(Malke和Ferretti1984)。通過溫育l_2h之間且最多18h的時(shí)段以后的水解帶(由于降解酪蛋白的纖溶酶的形成，從而產(chǎn)生相對(duì)于白色背景的可容易看到的澄清帶)，容易地檢測(cè)具有纖溶酶原活化能力的所有融合的重組蛋白。6.通過檢查纖溶酶原活化譜來篩選最佳生產(chǎn)克隆:在使用慶大霉素抗性的標(biāo)志物選擇含有較高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化體以后，進(jìn)行最佳生產(chǎn)克隆的實(shí)際篩選。在該方法中，在2.5ml BMGY培養(yǎng)基(1%酵母浸出物、2%蛋白胨、IX甘油、IX不含氨基酸的酵母氮源和IOOmM磷酸鉀緩沖液pH5.5)中在30°C培養(yǎng)原代培養(yǎng)物16-18小時(shí)。一旦光密度(OD6J達(dá)至IJ 3-4單位，通過加入7.5ml BMMY培養(yǎng)基(I%酵母浸出物、2%蛋白胨、IX甲醇、IX不含氨基酸的酵母氮源和IOO mM磷酸鉀緩沖液、pH5.5)來誘導(dǎo)培養(yǎng)物。用最終的0.5v/v%甲醇進(jìn)一步誘導(dǎo)這些培養(yǎng)物5天進(jìn)行重組生產(chǎn)，從而在強(qiáng)甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子影響下生成重組融合蛋白。7.酶譜法:通過該方法，檢測(cè)細(xì)胞外分泌的產(chǎn)物和希望的具有纖溶酶原活化能力的目標(biāo)帶，其中在非還原性的樣品緩沖液中跑10-12.5% SDS-page凝膠。結(jié)束以后，通過在
2.5% triton X-100溶液中洗滌，除去多余的十二烷基硫酸鈉。然后，用50mMTris (pH7.4)沖洗該凝膠2-3次。將該洗過的凝膠放在含有脫脂奶、瓊脂糖和纖溶酶原的固體表面(瓊脂凝膠)上。溫育5-7小時(shí)以后，可以看到水解帶的形成，其表明分離的蛋白的纖溶酶原活化能力。8.蛋白質(zhì)印跡技術(shù):在蛋白質(zhì)印跡法幫助下，檢測(cè)目標(biāo)蛋白。通過在6000rpm離心的幫助，分離從巴斯德畢赤酵母細(xì)胞分泌進(jìn)細(xì)胞外培養(yǎng)基中的所有融合構(gòu)建體，并取上清液用于期望的產(chǎn)物鑒別。將上清液原樣直接用于蛋白質(zhì)印跡法，或首先通過5KDa或IOKDa截止范圍濃縮器(Amicon)進(jìn)行濃縮，或進(jìn)行三氯醋酸沉淀、用丙酮洗滌并加載上10-12.5% SDS聚?；０纺z。借助于含有25mM tris、175mM甘氨酸和20%甲醇的轉(zhuǎn)移緩沖液，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。在250mA，在膜上進(jìn)行凝膠印跡35分鐘。將印跡的膜浸在10%脫脂奶中在4°C過夜，或在37°C溫育2小時(shí)。用含有0.1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)一步洗滌該印跡3次，除去多余的脫脂奶。將所述印跡在推薦稀釋浸入第一抗體或polysera中進(jìn)行l(wèi)h，并用含有吐溫-20的PBS洗滌3次。進(jìn)一步，與HRP綴合的第二抗體一起溫育該印跡，隨后用PBS洗滌3次。最后，通過加入DAB (二-氨基聯(lián)苯胺)溶液，使印跡顯影。9.賴氨酸-瓊脂糖色譜法:不同的組織纖溶酶原激活物與EGF4、5、6的融合構(gòu)建體含有三環(huán)結(jié)構(gòu)域，已知所述結(jié)構(gòu)域?qū)嚢彼釟埢挠H和力(McCance, Menhart等人.1994 ；Ye, Rahman等人.2001)。在該方法中，將從巴斯德畢赤酵母發(fā)酵得到的上清液(其具有組織纖溶酶原激活物融合多肽)在磷酸鹽緩沖液PH7.5中透析3-4小時(shí)，并以約
0.5ml/min的緩慢流速加載上用磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡的賴氨酸-瓊脂糖柱(購(gòu)自AmershamBiosciences,Uppasala,瑞典)。加載結(jié)束以后,再用4_5個(gè)床體積的磷酸鹽緩沖液洗漆柱，最后在0.3M ε氨基己酸和IOOmM NaCl溶液中洗脫蛋白(Qiu，Swartz等人.1998)。10.凝血酶親和色譜法:通過以前描述的操作(Salem, Maruyama等人.1984),在溴化氰活化珠子上進(jìn)行凝血酶偶聯(lián)。在這里，最后對(duì)得自不同純化步驟的蛋白進(jìn)行凝血酶親和，其中在50mM Tris Cl pH 7.4中平衡柱，并在50mM Tris Cl pH 7.4中透析，用于以約0.5ml/min的緩慢流速加載；在加載結(jié)束以后，用相同的緩沖液洗滌柱。最后，用遞增的NaCl梯度洗脫蛋白(Salem, Maruyama等人.1984)。然后試驗(yàn)不同的蛋白級(jí)分的蛋白C活化能力。11.疏水相互作用色譜法:通過不同的色譜方法，純化EGF-SK、EGF_tPA和EGF-SAK的不同融合基因構(gòu)建體，其中使用疏水和離子交換色譜法進(jìn)行隨后的不同融合多肽純化(Goyal, Sahoo等人.2007)。在疏水色譜法中，使用苯基瓊脂糖(Amersham Biosciences,Uppasala,瑞典)6%交聯(lián)的珠子(平均粒度為100-300 μ M大小的直徑)進(jìn)行柱制備。借助于螺動(dòng)泵，填充簡(jiǎn)單的ΧΚ16/20柱(Amersham Biosciences, Uppasala,瑞典)，制備大約25ml苯基瓊脂糖床，并用4-5個(gè)床體積的0.3M NaCl和50mM tris平衡，通過透析將在巴斯德畢赤酵母發(fā)酵過程中并行得到的上清液(含有期望的融合構(gòu)建體)維持在與平衡緩沖液相同的緩沖液強(qiáng)度和鹽組合物中。以40ml/hr流速將平衡的上清液加載上填充的柱，并在上清液加載結(jié)束以后，使4-5個(gè)床體積的平衡緩沖液穿過，以除去培養(yǎng)基組分和非特性地結(jié)合的雜質(zhì)，最后在水中洗脫希望的融合多肽。對(duì)洗脫的蛋白進(jìn)行第二輪純化(參見下文)，并關(guān)于纖溶酶原活化、凝血酶抑制和蛋白C活化測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)。12.DEAE(二乙基氨基乙基)離子交換色譜法:在該色譜操作中，將DEAE瓊脂糖 fast flow 裝填進(jìn))(K 16/20 柱(Amersham Biosciences, Uppasala,瑞典)中，并且一般遵循生產(chǎn)商的說明書，其中主要使用20ml溶脹的基質(zhì)進(jìn)行填充。用20mM Tris Cl緩沖液PH7.4平衡該柱，將得自巴斯德畢赤酵母的上清液在20mM Tris Cl緩沖液pH7.4中充分透析以后，加載上經(jīng)過平衡的柱(分批)，或者在通過疏水相互作用色譜法(上面)純化以后，將它的離子強(qiáng)度維持與平衡緩沖液相同，加載上各個(gè)柱。在加載結(jié)束以后，用4-5個(gè)床體積的平衡緩沖液洗滌每個(gè)柱，這有助于除去非特異性地或松散地結(jié)合的雜質(zhì)和多肽。通過將遞增的IM NaCl梯度應(yīng)用于5個(gè)床體積的基質(zhì)上,洗脫蛋白。借助于Bradford方法(Bradford 1976)，進(jìn)行蛋白量化，并與BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比。最后，通過20K Da截止?jié)饪s器(Amicon)，濃縮純化的蛋白 ，并用于各種分析測(cè)定和功能測(cè)定。13.EFG-溶血栓融合構(gòu)建體的纖溶酶原活化測(cè)定:所有嵌合的融合多肽構(gòu)建體含有溶血栓組分(SK、SAK和tPA)，所以通過纖溶酶的產(chǎn)色肽底物的顏色釋放，測(cè)量了這些構(gòu)建體的活化纖溶酶原的能力。在使用2iiM人纖溶酶原、50mM Tris、0.05% BSA和5mM生色底物的條件下，進(jìn)行了鏈激酶和所有融合構(gòu)建體的單階段測(cè)定，并通過分光光度計(jì)法監(jiān)測(cè)隨時(shí)間而變化的生色底物的釋放。它遵循非線性回歸，因此吸光度和時(shí)間2之間的圖遵循直線方程式。鏈激酶立即開始纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)化，且實(shí)際上沒有表現(xiàn)出活化的延遲，但是在一些融合構(gòu)建體的情況下，將纖溶酶原活化成纖溶酶需要延長(zhǎng)的時(shí)間。這指示，痕量的纖溶酶會(huì)形成活性復(fù)合物，因?yàn)槔w溶酶原向纖溶酶的酶原活化(途徑I)是沒有活性的。當(dāng)逐漸加入痕量(納摩爾)的外部纖溶酶會(huì)逐漸減少延遲時(shí)間時(shí)，這得到確認(rèn)。在組織纖溶酶原激活物活化纖溶酶原的情況下，進(jìn)行快速的且簡(jiǎn)單的分光光度測(cè)量方法，其中使用簡(jiǎn)單的生色肽(H-D-Val-Leu-Lys-pNA ;S_2251 ;購(gòu)自Chromogenix Inc.)檢測(cè)通過組織纖溶酶原激活物的作用而形成的纖溶酶(Verhei jen,Mullaart等人.1982)。該方法也用于驗(yàn)證在有纖維蛋白存在下增強(qiáng)的纖溶酶原活化和組織纖溶酶原活化(van Zonneveld, Veerman等人.1986)。在該活化測(cè)定中，在有和沒有可溶性纖維蛋白(購(gòu)自American Diagnostics,美國(guó))存在下，且在沒有纖維蛋白存在下，使用不同量的純化蛋白與2 PM纖溶酶原、0.05MTris Cl ph 7.2、100mM NaCl、0.05%和 0.5mM S-2251 溫育。以 I 分鐘間隔時(shí)間，監(jiān)測(cè)在405的吸光度最多2小時(shí)。14.使用不同的融合構(gòu)建體的凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn):為了觀察在有不同的嵌合構(gòu)建體存在下對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的凝塊形成的影響，制備了具有不同凝血酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用6.6IU的凝血酶從該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到20秒凝血時(shí)間。然后將相同量的凝血酶與遞增濃度的構(gòu)建體一起溫育，以測(cè)量凝血時(shí)間與對(duì)照相比倍增時(shí)的濃度(Lougheed, Bowman等人.1995)。15.不同的融合/嵌合構(gòu)建體對(duì)蛋白C的活化:以劑量依賴性的方式，對(duì)組織纖溶酶原激活物、葡萄球菌激酶和鏈激酶的不同的融合構(gòu)建體進(jìn)行凝血酶介導(dǎo)的蛋白C活化測(cè)定。在該測(cè)定中，在有50mM Tris-Cl、5mM CaC12和0.05% BSA存在下，將不同量的蛋白(在nM范圍內(nèi))與IOnM凝血酶一起在37°C溫育20min。該時(shí)間以后，將0.5 y M蛋白C加入孔中，并在25°C溫育20分鐘。此后，加入0.5mM水蛭素以抑制凝血酶，并繼續(xù)在25°C溫育5分鐘，然后以0.5mM終濃度加入生色底物，并如以前所詳述地(Eisenberg，Miletich等人.1988 ；Ewald 和 Eisenbergl995 ；Lougheed, Bowman 等人.1995 ；Meininger, Hunter 等人.1995 ；Dahlback和Villoutreix2005)，在405nm監(jiān)測(cè)有色的pNA相對(duì)于時(shí)間的釋放。實(shí)施例給出下述實(shí)施例來例證本發(fā)明，因此它們不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1鏈激酶和EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域之間的不同融合基因的制備:(i)在編碼SK的開放讀碼框(ORF)上游的、用于表達(dá)框架內(nèi)融合的EGF結(jié)構(gòu)域的雜合基因構(gòu)建體:使用引物N_EGF_SKFp I和N_EGF_SKRp 2 (引物序列參見表I)，構(gòu)建了雙鏈(ds) DNA塊，其編碼EGF-SK蛋白融合體，其中編碼EGF4、5、6的序列在編碼N-端的SK ORF側(cè)框架內(nèi)融合。Nihalani等人，1998已經(jīng)描述了細(xì)菌表達(dá)載體pET23_d_SK的設(shè)計(jì)和構(gòu)建。它包括:從PBR 322中的 類馬鏈球菌H46A克隆SK基因(Pratap等人，1996)，隨后亞克隆進(jìn)pET-23d中，所述pET-23d是含有得自噬菌體T7主要衣殼蛋白的非常有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)載體(Studier和Moffatt, 1986),并進(jìn)一步修飾該基因的5'末端，以使形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向最小化。從pET-23-d_SK構(gòu)建體表達(dá)的鏈激酶是Met-SK。其它細(xì)節(jié)參見美國(guó)專利號(hào)7，163,817。該構(gòu)建體用作擴(kuò)增SK基因(DNA SEQ ID I和對(duì)應(yīng)的蛋白SEQ ID 113)的模板。
使用與序列ID 2相對(duì)應(yīng)的合成基因(DNA多核苷酸)作為模板，選擇性地?cái)U(kuò)增與EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域(SEQ ID 2和對(duì)應(yīng)的蛋白SEQ ID 111)相對(duì)應(yīng)的雙鏈多核苷酸塊，所述合成基因通過定制DNA合成來制備,并在克隆進(jìn)pET 23-d (Novagen)載體中以后,通過對(duì)序列ID2的自動(dòng)化的DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。引物N_EGF_SK Fpl也含有(關(guān)于引物的詳細(xì)描述，參見表I)在它的5’末端處的Xho I限制位點(diǎn)，使得在PCR以后得到的結(jié)果基因塊可以入塢進(jìn)酵母表達(dá)質(zhì)粒中。引物N_EGF_SK Rp 2含有在5’末端處的序列(除了與EGF4、5、6的第6個(gè)結(jié)構(gòu)域的末端雜交的核苷酸以外)以及與SK基因ORF的5側(cè)對(duì)合的額外核苷酸。PCR循環(huán)條件如下:熱啟動(dòng)，在95°C完全變性5分鐘；共28個(gè)在95°C變性45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸I分鐘的循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘，以完成任何不完全PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。為了擴(kuò)增SK基因塊，使用引物N_EGF_SK Fp3 (上游)和引物N_EGF_SK_Rp 4 (下游引物)(關(guān)于引物的詳細(xì)描述，參見表I)。PCR條件如下:PCR條件:熱啟動(dòng)，在95°C完全變性5分鐘，共28個(gè)在95 °C變性45秒、在45 °C退火45秒、在72 °C延伸3分鐘的循環(huán)，最后在72 °C延伸10分鐘，以完成任何不完全PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。通過凝膠提取純化試劑盒(Qiagen)，從瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化。對(duì)這2種純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行剪接重疊延伸(SOE)PCR(細(xì)節(jié)參見上面的‘在實(shí)施例中使用的一般方法’部分)，以便構(gòu)建鄰接的EGF4、5、6-SK雜合基因構(gòu)建體，其中編碼EGF4、5、6的序列與SK基因編碼序列(以終止子密碼子結(jié)尾)在框架內(nèi)融合。以純化形式從瓊脂糖凝膠中分離出該基因塊，并用Xho I和Not I限制性酶(R.E.酶)消化，連接進(jìn)類似地切割的pET 23-d質(zhì)粒載體中(參考圖1A和圖2A)，然后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XLlB(rec ^和611(1 A_)細(xì)胞中，所述多肽在所述細(xì)胞中并不表達(dá)，盡管質(zhì)粒DNA將會(huì)擴(kuò)增。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行Sanger氏二脫氧測(cè)序方法，以便驗(yàn)證正確地融合的EGF和SK組分的DNA序列(SEQ ID N0.4和對(duì)應(yīng)的蛋白SEQ ID 112)。在該構(gòu)建體中，從瓊脂糖凝膠中分離出Xho I和NotI消化的盒，并‘入塢，進(jìn)pPIC-9K中。在該得到的構(gòu)建體中，將上游EGF4、5、6序列與α -分泌信號(hào)序列以及Kex2加工位點(diǎn)一起放入框架內(nèi)，使得雜合基因構(gòu)建體EG-4、5、6-SK在整合進(jìn)宿主基因組中以后在巴斯德畢赤酵母(菌株GS115)中從位于載體中的醇氧化酶啟動(dòng)子表達(dá)(Norden, Agemark等人.2011)。從該表達(dá)載體表達(dá)的雜合多肽也有效地跨膜運(yùn) 輸(參見下面的實(shí)施例)，并且可以以純的形式從其中分離出。
(ii)構(gòu)建編碼SK_EFG4、5、6的基因構(gòu)建體，其中編碼EGF4、5、6的結(jié)構(gòu)域在SK編碼基因的下游/C-端編碼末端處在框架內(nèi)融合:通過使用SK_EGF Fpl (上游)和SK_EGFRp2 (下游)引物組(引物序列參見表I)，使用pET23-d-SK質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增與SK相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列(DNA SEQ ID I和對(duì)應(yīng)的蛋白SEQ ID 114)(參見‘在實(shí)施例中使用的一般方法’)。引物SK_EGF Fpl含有在它的5’末端處的Xho I限制位點(diǎn)，而SK_EGF Rp2含有在它的5’末端處的最多1149 bp的SK序列，繼之以三甘氨酸(Gly-Gly-Gly)編碼段以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別位點(diǎn)編碼序列，最后以這樣的序列結(jié)尾:所述序列與編碼EGF4、5、6的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域的5’末端重疊。得到的基因塊含有在它的5’末端處的相同的Xho I限制位點(diǎn)，且下游(3’ -末端)含有第4個(gè)結(jié)構(gòu)域的重疊核苷酸序列。在第二個(gè)PCR中，使用SK_EGFFp3和SK_EGF Rp4(引物序列參見表I)引物組，從作為模板的pET23_d_EGF4、5、6 (含有為EGF4、5、6合成的定制基因)擴(kuò)增EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域。引物SK_EGF_Fp3含有SK的下游序列(最多1149bp)，繼之以三甘氨酸密碼子段和朝向它的5’末端的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別位點(diǎn)編碼序列；其它引物(即SK_EGF_Rp4)含有EGF4、5、6的第6個(gè)結(jié)構(gòu)域的末端的部分序列和在它的5’末端處的Not I限制位點(diǎn)。在PCR以后，得到的基因塊2 (通過使用這組引物得到)含有在它的5’末端(上游)處的SK的第1149個(gè)堿基對(duì)，繼之以編碼三甘氨酸的序列和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別位點(diǎn)編碼序列，另一方面，在它的3’末端處，它含有Not I限制位點(diǎn)，以便利克隆進(jìn)pET-23-d載體中。PCR條件如下:在95 °C完全變性5min，然后進(jìn)行28個(gè)在95 °C保持45秒、在45°C將引物退火45秒和在72°C保持Imin的循環(huán)；最后，在72°C延伸lOmin，以完成任何部分長(zhǎng)度PCR產(chǎn)物。
使用QIagen凝膠提取試劑盒，從凝膠純化兩種PCR塊(SK的PCR塊和編碼具有部分重疊序列的EGF4、5、6的PCR塊)。對(duì)這些純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行剪接重疊延伸PCR，以便構(gòu)建鄰接的SK_GGG_轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶_EGF4、5、6雜合基因構(gòu)建體，最后借助于SK_EGF Fpl和SK_EGF Rp4(引物序列參見表I) ‘末端’引物組進(jìn)行擴(kuò)增。然后用Xho I和Not I限制性酶消化最終的PCR產(chǎn)物(參考圖1B和圖2B)。從凝膠純化以后，將最終的消化的并純化的PCR塊連接進(jìn)pET23-d(預(yù)先用Xho I和Not I類似地消化，并經(jīng)過凝膠純化)中。得到的質(zhì)粒稱作pET23-d_SK_GGG_TG_EGF，將其在大腸桿菌XLlB(recA_、end A_)細(xì)胞中擴(kuò)增。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行Sanger氏二-脫氧鏈終止方法,并驗(yàn)證完成的克隆的插入序列(DNA SEQ ID 6和對(duì)應(yīng)的蛋白SEQ ID 114)。使用Xhol和Notl酶，從該質(zhì)粒構(gòu)建體，分離出雜合基因構(gòu)建體，并連接進(jìn)PPIC-9K中，其中上游XhoI位點(diǎn)幫助SK-GGG-TG-EG4、5、6塊的框架內(nèi)入塢進(jìn) 分泌信號(hào)序列(在表達(dá)質(zhì)粒中的雜合基因的上游)中。在它整合進(jìn)宿主基因組中并通過功能篩選來選擇纖溶酶原活化劑-陽(yáng)性克隆以后，在醇氧化酶啟動(dòng)子控制下在巴斯德畢赤酵母(GS 115)中表達(dá)該雜合基因-構(gòu)建體。
(iii)用于將EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域框架內(nèi)插入鏈激酶編碼基因段中的DNA雜合基因的構(gòu)建:還設(shè)計(jì)了 ‘結(jié)構(gòu)域間SK’ -EGF構(gòu)建體的構(gòu)建，其中將EGF4、5、6的序列以翻譯地框架內(nèi)方式散布在SK序列內(nèi)，以得到雜合基因構(gòu)建體，然后使用合適的引物(引物序列參見表I)進(jìn)行制備。將EGF序列插入編碼結(jié)構(gòu)域間柔性區(qū)段的SK基因區(qū)域中(Wang等人，1998;Yadav和Sahni, 2009),也就是 說,一方面,在α和β結(jié)構(gòu)域之間,或者另一方面,在β和Y結(jié)構(gòu)域之間。為此目的，首先采用引物組IDa.Fpl和IDaRp 2(關(guān)于序列細(xì)節(jié)，請(qǐng)參見表I)，進(jìn)行編碼SK的a -結(jié)構(gòu)域的DNA的擴(kuò)增。引物ID a.Fpl含有在它的5’末端處的Xho I限制位點(diǎn)；另一方面，引物ID a Rp 2含有在它的5’末端處的EGF的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域的重疊序列。就該反應(yīng)而言，使用下述PCR條件:熱啟動(dòng)，在95°C完全變性5分鐘，隨后進(jìn)行28個(gè)在95°C變性45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸1.5分鐘的循環(huán)，最后在72°C ‘延伸’ 10分鐘，以完成任何不完全PCR產(chǎn)物。還使用引物組ID EGF Fp3和IDEGF Rp4(關(guān)于這些引物的序列，參見表1)，單獨(dú)地?cái)U(kuò)增了編碼EGF4、5、6的DNA塊。使用該引物組，得到了編碼EGF4、5、6序列的DNA塊，其中朝向5’末端的上游序列與SK的a -結(jié)構(gòu)域的下游序列部分地重疊；同樣，該塊的3’末端含有與SKi3 -結(jié)構(gòu)域的上游序列重疊的序列。使用引物組ID β Fp5和ID Y Rp6 (關(guān)于這些引物的序列，參見表I)，通過PCR得到編碼SK的β和Y結(jié)構(gòu)域的第3個(gè)PCR塊。就該反應(yīng)而言，使用下述PCR條件:熱啟動(dòng)，在95°C完全變性5分鐘，隨后進(jìn)行共28個(gè)在95°C變性45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸1.5分鐘的循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘，以完成任何不完全PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。將ID β Fp5引物設(shè)計(jì)成，使得其5’末端與EGF的第6個(gè)結(jié)構(gòu)域的下游序列同源，而下游引物ID Y Rp6含有終止子密碼子，后者繼之以NotI限制位點(diǎn)。借助于凝膠純化試劑盒(Qiagen)，從瓊脂糖凝膠中純化出所有3個(gè)基因塊，并進(jìn)行一鍋剪接重疊延伸反應(yīng)，以便得到單個(gè)鄰接的基因產(chǎn)物，其中基因區(qū)段的次序如下51(0 46 4、5、6-51(0-51(￥。將所有3種區(qū)段以1:1:1摩爾比加入簡(jiǎn)單的PCR反應(yīng)中，其中在沒有引物存在下進(jìn)行前10個(gè)循環(huán)，并通過加入各自0.6 μ M終濃度的ID a Fpl和ID y Rp6，進(jìn)行接下來的18個(gè)循環(huán)，以便進(jìn)一步擴(kuò)增3-片段SOE中間體。就該反應(yīng)而言，使用下述PCR條件:熱啟動(dòng)，在95°C完全變性5分鐘，隨后(在每個(gè)循環(huán)中)在95°C變性45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸3分鐘，最后在72°C延伸10分鐘，以完成任何不完全PCR產(chǎn)物 。對(duì)最終的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并用Xho I和Not I限制性酶消化(參考圖1G和圖2D)。然后將該雜合基因構(gòu)建體連接進(jìn)pET 23-d載體中，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XLlB(rec八_和611(1 Al感受態(tài)細(xì)胞中，其中所述DNA可以在沒有蛋白表達(dá)下擴(kuò)增(因?yàn)樗拗鞑粫?huì)提供必需的噬菌體-編碼的RNA聚合酶)，使用所謂的二 -脫氧鏈終止方法對(duì)其進(jìn)行Sanger氏自動(dòng)化測(cè)序(DNA SEQ ID 3和對(duì)應(yīng)的蛋白SEQ ID 116)。結(jié)果完全驗(yàn)證了雜合基因構(gòu)建體。此后，通過用Xho I和Not I酶消化它，從pET-23-d結(jié)構(gòu)域間SK_EGF質(zhì)粒中分離出雜合基因盒。然后將該盒連接進(jìn)PPIC-9K中，在α-分泌信號(hào)序列上游且與其在框架內(nèi)，并轉(zhuǎn)化進(jìn)巴斯德畢赤酵母(GS115)中，進(jìn)行克隆，并象以前一樣通過關(guān)于纖溶酶原活化的功能篩選進(jìn)行選擇，在整合進(jìn)宿主基因組中以后，在甲醇誘導(dǎo)以后，在載體的醇氧化酶啟動(dòng)子影響下進(jìn)行表達(dá)，如在方法部分中所述。
(iv)構(gòu)建雜合SK-EGF基因，其中SK組分在兩側(cè)側(cè)接EGF4、5、6編碼結(jié)構(gòu)域:還如下構(gòu)建了另一種構(gòu)建體，其中SK編碼序列在兩側(cè)側(cè)接框架內(nèi)融合的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域:制備pET23-d N_EGF_SK質(zhì)粒構(gòu)建體(參見上面子部分i和ii)，并對(duì)它進(jìn)行Xho I和AflII (在pET23-dN_EGF_SK構(gòu)建體中的獨(dú)特位點(diǎn))消化，還對(duì)pET-23-d_SK_EGF構(gòu)建體進(jìn)行相同的處理，并在瓊脂糖凝膠上分離兩種消化產(chǎn)物。與更大的SK_EGF消化片段連接從N_EGF_SK構(gòu)建體得到的Xho I和Afl-1I段，其結(jié)果得到在pET23-d載體中的N_EGF_SK_EGF (DNA SEQID7和對(duì)應(yīng)的蛋白SEQ ID 115)(參考圖1.C和圖2.C)。通過Xho I和Not I消化，從該質(zhì)粒分離出表達(dá)盒(象以前一樣，首先通過DNA測(cè)序驗(yàn)證該構(gòu)建體)，并連接進(jìn)α -分泌信號(hào)序列的PPIC-9K框架內(nèi)在EGF-SK-EGF雜合盒的上游，象以前一樣，在功能篩選以后(參見下文)，在整合進(jìn)宿主基因組中以后，在醇氧化酶啟動(dòng)子控制下，在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)。
(V)構(gòu)建編HN_EGF_SK、SK EGF和N EGF SK EGF的基因區(qū)段，其含有編碼與EGF4、5、6相對(duì)應(yīng)的氧化抗性多肽區(qū)段的序列:在N_EGF_SK、SK_EGF和N_EGF_SK_EGF多肽中，甲硫氨酸殘基存在于EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域的第41個(gè)氨基酸殘基處，或SK_EGF的第434個(gè)氨基酸殘基處，以及分別在N_EGF_SK_EGF的第41個(gè)和第434個(gè)氨基酸位置處，因?yàn)橐阎狤GF4、5、6結(jié)構(gòu)域部分的氧化傾向性，后者會(huì)阻礙抗凝血酶活性，特別是這些結(jié)構(gòu)域的蛋白C活化功能。因此，牢記這一點(diǎn)，在我們的各種SK-EGF融合/基因融合區(qū)段的設(shè)計(jì)中，我們?cè)诨蛩接美i氨酸/丙氨酸/谷氨酰胺氨基酸殘基替代該甲硫氨酸。象以前一樣，通過使用高保真度酶pfu turbo DNA聚合酶(Stratagene),實(shí)現(xiàn)了該目的，并使用適當(dāng)?shù)囊?Wang和Malcolm 1999)，在不同的模板中引入位點(diǎn)特異性的突變。為了制備這些構(gòu)建體，設(shè)計(jì)了 3組引物，它們?cè)试S在不同的構(gòu)建體中在基因構(gòu)建體的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域/段的原始Met殘基位置處分別摻入纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺。引物組命名如下:
M rep V Fp,和M rep V Rp (關(guān)于引物序列，參見表I)
M rep A Fp,和M rep A Rp (關(guān)于引物序列，參見表I)
M rep Q Fp,和M rep Q Rp (關(guān)于引物序列，參見表I)
在下一步中，使用pET 23-d_N_EGF_SK和pET23_d_SK_EGF質(zhì)粒作為模板，并使用上述的引物組。對(duì)于每組引物，PCR循環(huán)方案如下:在95°C完全變性，然后進(jìn)行28個(gè)在95°C變性45秒、在45°C退火45秒、在68°C延伸7分鐘的循環(huán)，進(jìn)一步在72°C延伸lOmin。用Dpn I限制性酶消化通過該反應(yīng)得到的最終的PCRi夾，所述Dpn I限制性酶切割甲基化的DNA并增加在轉(zhuǎn)化以后獲得陽(yáng)性克隆的可能性。將該P(yáng)CR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XLlBlue細(xì)胞中，并鋪板在含有氨芐西林的LB瓊脂平板上，在37°C溫育16-18h。隨機(jī)挑取幾個(gè)克隆，在含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)成7-10ml培養(yǎng)物。分離質(zhì)粒，并測(cè)序，以驗(yàn)證期望的突變的存在。通過采用該操作，在兩種構(gòu)建體中在基因水平用纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺氨基酸替代甲硫氨酸。通過標(biāo)準(zhǔn)的亞克隆操作，使用這些構(gòu)建體在N_EGF_SK_EGF基因中產(chǎn)生纈氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺突變。最后，將這些突變體轉(zhuǎn)移至PPIC-9K，并在巴斯德畢赤酵母的GS115菌株中檢查它們的表達(dá)(參見‘在實(shí)施例中使用的一般方法’)。
(vi)構(gòu)建Λ SK_EGF構(gòu)建體，其具有含5個(gè)氨基酸缺失的SK的N-端:在該構(gòu)建體中，涉及的最終的目的是，在SK的N-端區(qū)域處除去5個(gè)氨基酸。使用pET 23-d_SK_GGG_TG_EGF(氧化抗性的，其中用纈氨酸替代在EGF4、5、6段中的第41個(gè)met ;參見上文)作為模板，借助于PCR引物Δ SK_EGF Fp I和Δ SK_EGF Rp 2 (關(guān)于這些引物的序列，參見表I)，除去這些編碼5個(gè)氨基酸的核苷酸。引物ASK_EGF Fpl含有Xho I限制位點(diǎn)和在它的5’末端處從第16個(gè)堿基對(duì)開始的SK的重疊序列。ASK_EGF Rp 2含有EGF4、5、6的第6個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列和在它的5’末端處的Not I位點(diǎn)。用于該反應(yīng)的PCR循環(huán)如下:在95°C完全變性5分鐘，隨后進(jìn)行28個(gè)在95°C變性45秒、在55°C退火45秒、在72°C延伸3分鐘的循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘，以結(jié)束不完全PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。對(duì)最終的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠洗脫，并用Xho I和Not I酶消化，連接進(jìn)pET 23-d載體中，并測(cè)序，以驗(yàn)證完整的且正確的開放讀碼框。最后，將ASK_EGF(參考圖1D)盒連接在PPIC-9K中，并通過以前所述的標(biāo)準(zhǔn)化操作檢查它的表達(dá)。
(vii)在氧化抗性的N_EGF_SK和N_EGF_SK_EGF編碼基因塊的接點(diǎn)處框架內(nèi)引入編碼凝血酶可切割位點(diǎn)的DNA序列:從N_EGF_SK的表達(dá)、纖溶酶原活化的純化和動(dòng)力學(xué)分析(其確立了纖溶酶原活化的延遲性質(zhì))顯而易見，不同于天然的/未修飾的SK，該構(gòu)建體可以不直接地活化人纖溶酶原，而是需要預(yù)形成的纖溶酶的存在。這自動(dòng)地在這樣的構(gòu)建體中賦予凝塊特異性的活化的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)轶w內(nèi)凝塊是富含纖溶酶的，而纖溶酶在全身循環(huán)中被快速地滅活。 類似地，纖維蛋白凝塊也是富含凝血酶的；因此，我們?cè)跇?gòu)建體中突變了合適的位點(diǎn)，以使它也是凝血酶可活化的。為此，我們通過凝血酶可切割位點(diǎn)突變了 EGF和SK的結(jié)構(gòu)域間連接區(qū)，其結(jié)果應(yīng)當(dāng)在纖溶酶原活化中產(chǎn)生凝血酶可切割的活化開關(guān)。這可以如下在單階段測(cè)定中監(jiān)測(cè):加入遞增的少量的凝血酶，并觀察(如在前述的類似的纖溶酶富集實(shí)驗(yàn)的情況下)N-端EGF4、5、6融合的SK構(gòu)建體的纖溶酶原活化的滯后的逐漸減少。將凝血酶可切割的因子XI的序列引入在EGF和SK基因構(gòu)建體的接點(diǎn)處。這通過重疊延伸PCR來實(shí)現(xiàn)，其中使用含有重疊序列的接頭引物和編碼凝血酶可切割的氨基酸的核苷酸。在第一個(gè)PCR反應(yīng)中，使用引物N_EGF_TCS Fp I和N_EGF_TCS Rp 2 (關(guān)于這些引物的序列，參見表I)來擴(kuò)增EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域。引物N_EGF_TCS Fp I含有Xho I限制位點(diǎn)和在它的5’末端處的EGF的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列；另一方面，N_EGF_TCS Rp2含有EGF的第6個(gè)結(jié)構(gòu)域序列，繼之以編碼凝血酶可切割位點(diǎn)的序列，繼之以SK的下游部分。PCR條件如下:在95°C變性5分鐘，然后進(jìn)行28個(gè)在95°C變性45秒、在50°C退火45秒、在72°C延伸I分鐘的循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘，以便完成不完全PCR片段。通過該反應(yīng)得到的PCR塊含有在它的5’末端處的Xho I限制位點(diǎn)和編碼凝血酶可切割位點(diǎn)的核苷酸序列以及在3’末端處的SK的重疊部分。在接下來的PCR反應(yīng)中，使用TCS_SK Fp 3和SK Rp 4(關(guān)于這些引物的序列，參見表I)，其中上游引物(TCS_SK Fp 3)按照5’至3’的次序含有第6個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列、EGF4、5、6的重疊部分、編碼凝血酶可切割位點(diǎn)的核苷酸序列以及編碼SK的核苷酸序列；在另一側(cè)，SK Rp 4含有在它的5’末端處的Not I可切割位點(diǎn)。PCR條件如下:在95°C變性5分鐘，然后進(jìn)行28個(gè)在95°C變性45秒、在50°C退火45秒、在72°C延伸I分鐘的循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘，以便完成任何部分長(zhǎng)度子代片段的合成。得到的PCR塊應(yīng)當(dāng)在上游含有第6個(gè)結(jié)構(gòu)域的重疊序列和編碼凝血酶可切割位點(diǎn)的核苷酸，而其在下游應(yīng)當(dāng)含有Not I限制位點(diǎn)。對(duì)兩種PCR塊進(jìn)行凝膠純化，并以1:1摩爾比混合在單鍋反應(yīng)中，并通過末端-引物TCS Fpl和SK Rp6進(jìn)行擴(kuò)增，這得到所需的N_EGF_TCS_SK PCR塊(參考圖1.E) (TCS:凝血酶可切割序列)，對(duì)其進(jìn)行凝膠純化，并用Xho I和Not I酶消化，最后通過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程連接進(jìn)類似地消化的pET23-d中。在大腸桿菌XL Blue中亞克隆以后，驗(yàn)證該構(gòu)建體序列的開放讀碼框。這確立，在所述基因中在EGF4、5、6和SK的接點(diǎn)處建立了具有下述氨基酸序列的因子XI凝血酶可切割位點(diǎn):Ile-Lys-Pro-Arg-1le-Val-Gly。在該序列中，凝血酶特異性導(dǎo)致在精氨酸和異亮氨酸的接點(diǎn)處的切割，使得在凝血酶的作用以后，從SK的N-端末端除去I個(gè)氨基酸，并且，第2個(gè)氨基酸改變成纈氨酸(在天然SK中，N-端殘基是Ile-Ala-Gly-)。此后，將N_EGF_TCS_SK盒連接進(jìn)pPIC_9K中，并在巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行它的表達(dá)。在所述純化的構(gòu)建體的情況下，在用凝血酶處理以后，的確發(fā)現(xiàn)了凝血酶切割，并通過N-端蛋白測(cè)序進(jìn)行了確認(rèn)。
(viii)EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域翻譯地框架內(nèi)融合在SK的β和Y結(jié)構(gòu)域的接點(diǎn)處:為此目的，使用pET23_d_SK作為模板，采用引物IDa ^Fpl和IDa β Rp2 (關(guān)于這些引物的序列，參見表I)，進(jìn)行結(jié)構(gòu) 域的擴(kuò)增。引物ID a PFpl含有在它的5’末端處的Xho I限制位點(diǎn)，另一方面，ID a i3Rp2含有SK的β結(jié)構(gòu)域的下游序列以及EGF4、5、6的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域的部分重疊序列。通過這些引物組得到的PCR塊含有在上游序列處的Xho I限制位點(diǎn)，且在下游含有β -結(jié)構(gòu)域的末端序列和EGF的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域的重疊序列。在下一步中，使用IDE4Fp3和IDE6Rp4(關(guān)于這些引物的序列，參見表I)引物組，分離出編碼EGF4、5、6的per塊2。引物IDE4Fp3含有在它的5’末端處的SK的β -結(jié)構(gòu)域的下游序列，IDE6Rp4含有在它的5’末端處的Y結(jié)構(gòu)域上游重疊序列。通過這些引物組得到的PCR塊2含有在5’末端處的下游β_結(jié)構(gòu)域的重疊序列，其它末端含有Y結(jié)構(gòu)域的上游序列。該擴(kuò)增的PCR條件如下。在95°C完全變性5min，接著進(jìn)行27個(gè)在95°C保持45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸I分鐘的循環(huán)，最后在72 °C延伸10分鐘。在下一步中，使用IDyFp5和IDyRp6(關(guān)于這些引物的序列，參見表I)引物組，分離出SK的Y結(jié)構(gòu)域。如下設(shè)計(jì)引物ID YFp5:其中IDyFp5’的5’末端含有EGF4、5、6的第6個(gè)結(jié)構(gòu)域的同源下游序列，而ID Y Rp6含有終止密碼子和隨后的Not I限制位點(diǎn)。使用下述per方案擴(kuò)增塊3 ;在95°C熱啟動(dòng)5分鐘，進(jìn)行共28個(gè)在95°C變性45秒、在47°C退火45秒和在720°C延伸1.5分鐘的循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘，以完成任何不完全擴(kuò)增產(chǎn)物。通過凝膠提取試劑盒(Qiagen)，對(duì)所有得到的PCR進(jìn)行凝膠純化，并通過A26tl分光光度計(jì)法進(jìn)行定量。在最終的pet反應(yīng)中，對(duì)所有3種基因塊進(jìn)行單鍋剪接重疊延伸反應(yīng)，以便獲得單個(gè)鄰接的基因塊，其中得到的構(gòu)建體的次序如下:SK a -SK β -EGF4、5、6-SK Y，以1:1:1摩爾比將所有3種per產(chǎn)物混合在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，其中在沒有任何引物存在下進(jìn)行前10個(gè)循環(huán)，并通過加入0.6 μ M終濃度的ID α β Fpl和ID y Rp6引物進(jìn)行接下來的18個(gè)循環(huán)，以便擴(kuò)增3種片段中間體完全基因塊。PCR條件如下:在95°C熱啟動(dòng)5分鐘，進(jìn)行共28個(gè)在95°C變性45秒、在45°C退火45秒和在72°C延伸3分鐘的循環(huán)，其中在沒有引物存在下進(jìn)行前10個(gè)循環(huán)，最后在72°C擴(kuò)增10分鐘。最后，得到的基因塊含有在它的5’末端處的Xho I位點(diǎn)和在它的3’末端處的NotI位點(diǎn)。用Xho I和Not I酶消化該基因塊，并克隆至pET 23-d和pPIC 9K。在巴斯德畢赤酵母中檢查它的表達(dá)、純化和表征。該基因塊含有在SK的β和Y結(jié)構(gòu)域之間的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域(DNA SEQ ID 5和對(duì)應(yīng)的蛋白SEQ ID 129 ;參見圖1H和圖2Ε)。
(ix)將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別序列摻入在N_EGF_TCS_SK雜合基因塊(含有甲硫氨酸氧化抗性突變)的N-端編碼末端:為了在EGF-SK構(gòu)建體的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域的開始處或其前面摻入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別序列，設(shè)計(jì)了引物TG_N_EGF_Fp I和AfI IIRp 2 (關(guān)于引物的詳細(xì)序列，參見表I)，其中TG Fpl含有Xho I限制位點(diǎn)和在它的上游區(qū)域處的編碼血液因子XIII轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別氨基酸序列的核苷酸序列，而引物Afl II Rp2含有具有Afl II限制酶切消化位點(diǎn)(SK的第165-170個(gè)核苷酸含有Afl II限制位點(diǎn)，其位于該引物的中央)的區(qū)域的核苷酸序列。從這些引物，我們通過PCR得到了含有下述內(nèi)容的基因塊=Xho I限制位點(diǎn)、編碼轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸和EGF4、5、6的第4個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列以及含有Afl II限制位點(diǎn)的塊的下游部分。從凝膠中提取該基因塊(氧化抗性的，且含有凝血酶可切割序列)。用Xho I和Afl II消化質(zhì)粒pET 23-dN_EGF_TCS_SK和pET 23-d N_E GF_TCS_SK_EGF。其結(jié)果得到Xho I和AfI II基因塊以及得自兩種質(zhì)粒構(gòu)建體的較大和較小部分。將消化的基因塊與構(gòu)建體的較大部分連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XLBlue中，以得到含有TG_N_EGF_TCS_SK和TG_N_EGF_TCS_SK_EGF(參考圖1F)的質(zhì)粒。對(duì)這些測(cè)序，并驗(yàn)證正確的開放讀碼框，即在以前描述的EGF-SK構(gòu)建體的背景下轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶編碼序列的存在。然后將兩種盒連接進(jìn)巴斯德畢赤酵母中，并檢查這些構(gòu)建體的表達(dá)(請(qǐng)參閱’在實(shí)施例中使用的方法’)。
表1.用于不同的EGF4、5、6和鏈激酶基因融合構(gòu)建體制備的引物
序列 SEQ ID Nos.引物名引物序列編號(hào)___^__
權(quán)利要求
1.嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含與溶血栓蛋白融合的血栓調(diào)節(jié)蛋白的4、5和6表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF4、5、6)，所述溶血栓蛋白選自由以下組成的組:鏈激酶、組織纖溶酶原激活物、葡萄球菌激酶、尿激酶和它們的衍生物和類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域與所述溶血栓蛋白或其衍生物或類似物在所述溶血栓蛋白或其衍生物或類似物的N-端、C-端或N和C兩端處融合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述溶血栓蛋白包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入、缺失或截短的鏈激酶，且其中所述構(gòu)建體具有纖溶酶原活化、凝血酶抑制和抗凝蛋白C途徑活化活性。
4.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域融合在所述鏈激酶的α和β或β和Y結(jié)構(gòu)域之間，或者融合在鏈激酶衍生物或類似物的α和β或β和Y結(jié)構(gòu)域之間，其中所述鏈激酶衍生物或類似物包含一個(gè)或多個(gè)突變、添力口、插入或截短，且其中所述構(gòu)建體活化纖溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C途徑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域與鏈激酶或鏈激酶衍生物或類似物在一個(gè)或多個(gè)位置處發(fā)生框架內(nèi)融合，所述位置選自:鏈激酶N-端、鏈激酶C-端、N-和C-鏈激酶兩端、或鏈激酶的結(jié)構(gòu)域間位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述鏈激酶衍生物跨殘基5-383或5-414。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述鏈激酶衍生物跨殘基16-383。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域在一個(gè)或多個(gè)選自鏈激酶N-端、鏈激酶C-端或N-和C-鏈激酶兩端的位置處發(fā)生框架內(nèi)融合，其中所述EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域的Met 41被纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或C-端Met 435被纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或在同時(shí)的N-和C-端融合構(gòu)建體中，Met 41和Met 435獨(dú)立地被纈氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶識(shí)別序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含在EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域與溶血栓蛋白或其衍生物或類似物的接點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)凝血酶可切割序列。
11.治療哺乳動(dòng)物的血栓形成的方法，所述方法包括:給需要治療的所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體。
12.嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域與組織纖溶酶原激活物(tPA)衍生物、類似物或片段在下述位置處融合:在tPA衍生物、類似物或片段的N-端處，在tPA衍生物、類似物或片段的C-端處，在tPA衍生物、類似物或片段的兩端處，或在tPA衍生物、類似物或片段內(nèi)部。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域和tPA衍生物、類似物或片段之間的融合體另外包含一個(gè)或多個(gè)接頭片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述一個(gè)或多個(gè)接頭片段包含一個(gè)或多個(gè)促進(jìn)所述構(gòu)建體的柔性的氨基酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述tPA衍生物、類似物或片段包含一個(gè)或多個(gè)突變、添加、插入或截短，且其中所述tPA衍生物、類似物或片段活化纖溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含與一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域融合的組織纖溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修飾形式，使得tPA的EGF結(jié)構(gòu)域被一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代，且其中所述構(gòu)建體具有抗凝血酶和纖溶酶原活化活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含與一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域融合的組織纖溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修飾形式，使得tPA的三環(huán)域I和EGF結(jié)構(gòu)域被一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代，且其中所述構(gòu)建體具有抗凝血酶和纖溶酶原活化活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述tPAEGF結(jié)構(gòu)域和三環(huán)I結(jié)構(gòu)域在tPA片段的N-端或C-端處被一個(gè)或多個(gè)血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域替代。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含在tPA片段或其截短或修飾形式與血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域之間的一個(gè)或多個(gè)接頭片段，所述接頭片段包含促進(jìn)構(gòu)建體柔性的氨基酸殘基，使得所述構(gòu)建體具有凝血酶抑制、蛋白C活化和纖溶酶原活化能力。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中EGF4、5、6組分的甲硫氨酸41被丙氨酸、纈氨酸或谷氨酰胺替代。
21.嵌合蛋白構(gòu)建體，其包含血栓調(diào)節(jié)蛋白的EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域與葡萄球菌激酶(SAK)的N-端或C-端末端發(fā)生框架內(nèi)融合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域的甲硫氨酸41被丙氨酸、纈氨酸或谷氨酰胺替代。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22中的任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含在SAK和EGF4、5、6結(jié)構(gòu)域區(qū)域之間的凝血酶可切割序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求22-23中的任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其另外包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-10或12-24中的任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體可溶于水溶液或鹽水溶液。
26.抑制凝血酶的方法，所述方法包括:使用根據(jù)權(quán)利要求1-10或12-24中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體。
27.活化蛋白C的方法，所述方法包括:使用根據(jù)權(quán)利要求1-10或12-24中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體。
28.提供抗凝血酶和纖溶酶原活化的方法，所述方法包括:使用根據(jù)權(quán)利要求1-10或12-24中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體。
29.藥物制劑，其包含藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-10或12-24中的任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體。
30.在哺乳動(dòng)物中溶栓的方法，所述方法包括:給有其需要的所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-10或12-24中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體到有其需要的受試者。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-10或12-24中任一項(xiàng)所述的嵌合構(gòu)建體，其通過在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)來制備。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-10或12-24中任一項(xiàng)所述的嵌合構(gòu)建體,其通過在真核系統(tǒng)中表達(dá)來制備。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的嵌合構(gòu)建體，其中所述真核表達(dá)系統(tǒng)選自由動(dòng)物細(xì)胞、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和真菌組成的組。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其分泌進(jìn)細(xì)胞外培養(yǎng)基中。
35.根據(jù)權(quán)利要求13所述的嵌合蛋白構(gòu)建體,其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸選自由Gly、Asn、Pro、Ser、Gin、Arg 和 Lys 組成的組。
36.核酸序列,其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-10、12-25或31-35中的任一項(xiàng)所述的的嵌合蛋白構(gòu)建體。
37.載體，其包含權(quán)利要求36的核酸序列。
38.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求37的載體。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-10、12-25或31-35中的任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白構(gòu)建體，其通過在宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼所述蛋白的核酸序列來制備。
40.制備根據(jù)權(quán)利要求1-10和12-25或31-35中的任一項(xiàng)所述的的嵌合蛋白構(gòu)建體的方法，所述方法包括:在宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼所述蛋白的核酸序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述 的方法，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)系統(tǒng)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌(E.coli)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述真核表達(dá)系統(tǒng)是動(dòng)物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述酵母是巴斯德畢赤酵母。
46.根據(jù)權(quán)利要求40-45中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合蛋白構(gòu)建體從宿主細(xì)胞分泌進(jìn)細(xì)胞外培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有纖溶酶原活化劑性質(zhì)和抗血栓性質(zhì)(包括凝塊特異性作用)的新的雜合蛋白，所述性質(zhì)使得它們非常有利地用于治療涉及纖維蛋白凝塊形成的循環(huán)病癥，所述維蛋白凝塊形成歸因于血管中的基礎(chǔ)組織損傷，導(dǎo)致心肌梗塞、卒中等。也公開了新蛋白和得到它們的方法，所述蛋白通過以纖溶酶或凝血酶依賴性的方式活化纖溶酶原來幫助溶解血塊，并且還通過固有的血液凝固途徑抑制凝血酶的活性和產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A61K39/00GK103179982SQ201180048291
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者尼拉·馬赫什瓦里, 吉里什·薩尼 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)