專利名稱：作為疫苗載體的多孔可降解聚電解質(zhì)微球的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥工藝學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在近十年間，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，生物藥物的發(fā)展已經(jīng)迅速展開。在預(yù)防性和治療性兩種情況下，對(duì)于包括傳染性疾病和癌癥在內(nèi)的廣泛疾病，尋求經(jīng)設(shè)計(jì)用來引發(fā)(prime)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的合成疫苗。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的引發(fā)需要誘發(fā)T細(xì)胞和B細(xì)胞兩者的應(yīng)答，這通過兩種不同的途徑觸發(fā)。當(dāng)細(xì)胞中間物樹突狀細(xì)胞內(nèi)化蛋白質(zhì)，將該抗原蛋白水解成短肽并將這些肽呈遞給T細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的裂縫時(shí)，T細(xì)胞活化發(fā)生。另一方面，B細(xì)胞可經(jīng)由其B細(xì)胞受體(膜束縛的IgM或IgG分子)與蛋白抗原直接結(jié)合。同時(shí)引發(fā)細(xì)胞和體液應(yīng)答需要抗原的雙釋放:在一部分因不與聚電解質(zhì)結(jié)合而自由時(shí)立即釋放；和在一部分被結(jié)合時(shí)緩慢釋放。有效刺激適應(yīng)性免疫的兩條途徑(both arms)的合成疫苗的設(shè)計(jì)仍然是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。具體地講，引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答(特別是可以識(shí)別并清除侵染或惡性細(xì)胞的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL))的當(dāng)前疫苗接種策略的失敗，被認(rèn)為是主要障礙之一。樹突狀細(xì)胞和巨卩遼細(xì)胞具有通過稱為交叉呈遞(cross-presentation)的過程將外源(細(xì)胞外)蛋白質(zhì)呈遞在MHC I類分子上的獨(dú)特能力[1、2]。對(duì)于蛋白抗原，當(dāng)以可溶性形式給予時(shí)，交叉呈遞并不有效，且通常只有在使用高濃度的外源蛋白時(shí)才觀察到。相比之下，已經(jīng)表明通過吞噬作用攝取的整體完整的微生物(或吸附到膠乳顆粒上的純化的蛋白抗原)可非常有效地引發(fā)遞送的抗原的交叉呈遞；隨后將這些抗原加工并在MHC I類分子上呈遞給天然⑶8+ T細(xì)胞[1、3、4]。照此，對(duì)于免疫系統(tǒng)對(duì)包封的微生物或微?？乖倪M(jìn)化上工程改造的應(yīng)答的認(rèn)識(shí)已產(chǎn)生通向生物制劑(biologies)藥物遞送系統(tǒng)的有前景的方法。已經(jīng)將聚合多層膠囊[5-10]調(diào)制為用于將抗原遞送到樹突狀細(xì)胞的載體。這些膠囊如下制備:通過靜電相互作用[13-15]或氫鍵鍵合[16]將聚合物交替沉積(所謂的疊層(Layer-by-Layer)技術(shù)或 LbL) [11、12]到犧牲性模板(sacrificial template)上,接著使?fàn)奚阅０宸纸?，產(chǎn)生中空膠囊，從而允許在非變性條件下進(jìn)行有效的抗原包封。一些論文[17-24]已經(jīng)證實(shí)了聚電解質(zhì)微膠囊作為至樹突狀細(xì)胞的抗原遞送溶媒的潛在性。雖然這些微粒載體具有激發(fā)有效細(xì)胞免疫的能力，但它們的臨床和工業(yè)應(yīng)用仍然受到源于其生產(chǎn)的實(shí)際問題的阻礙。一個(gè)主要的缺點(diǎn)是低抗原包封效率，然而非常希望使抗原在載體中的裝載量最大化，以便在合理的疫苗劑量下引發(fā)強(qiáng)免疫性。另一缺點(diǎn)在于使用化學(xué)溶劑和物理應(yīng)力，這負(fù)面地影響抗原穩(wěn)定性，增加在載體內(nèi)合成和儲(chǔ)存期間蛋白抗原變性和破壞的風(fēng)險(xiǎn)。值得提醒的是大多數(shù)蛋白質(zhì)和抗原對(duì)高加工溫度不穩(wěn)定。另一關(guān)鍵因素是需要具有增加的孔隙度的載體以允許蛋白酶浸潤(rùn)到微膠囊中且隨后進(jìn)行蛋白水解加工。生產(chǎn)這些微粒載體包括復(fù)雜且勞動(dòng)密集的多步過程，這使得它們對(duì)于工業(yè)應(yīng)用也無吸引力。在這些微粒載體的制備期間使毒性的或藥學(xué)上不可接受的化學(xué)品或處理劑的使用減至最少也是隨后臨床應(yīng)用的主要負(fù)擔(dān)的原因。噴霧干燥是在制藥工業(yè)中用于混配呈顆粒形式藥物的廣泛使用的技術(shù)。然而，當(dāng)所產(chǎn)生的顆粒在水中混合，例如以便通過注射給予到體內(nèi)時(shí)，其典型行為是聚集以產(chǎn)生凝塊或者溶解以使大多數(shù)藥物呈可溶形式，這些現(xiàn)象在目前情況下是不希望有的。另外，不可預(yù)測(cè)在噴霧干燥之后顆粒組分的無定形或晶體狀態(tài)是否仍然相同。就顆粒穩(wěn)定性而言，特別是在作為混懸液加工時(shí)，這種狀態(tài)形式具有極大的重要性。重要的是，對(duì)于生物藥物制齊U，優(yōu)選使用無定形態(tài)的多元醇，因?yàn)榕c其結(jié)晶或水合形式相比，它們賦予更高的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。針對(duì)這些偏見和需求，本發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噴霧干燥多元醇與聚電解質(zhì)復(fù)合物的水性混合物時(shí)，所述多元醇轉(zhuǎn)變到其無定形形式。在單獨(dú)噴霧干燥該多元醇時(shí)或在冷凍干燥多元醇與聚電解質(zhì)復(fù)合物的混合物時(shí)，沒有觀察到這種現(xiàn)象。同樣值得注意地是，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噴霧干燥多元醇、聚電解質(zhì)復(fù)合物和生物藥物的水性混合物時(shí)，所獲得的固體顆粒當(dāng)在生理溶液中重構(gòu)以便腸胃外給予時(shí)仍然穩(wěn)定。更有利地是，當(dāng)與通過LbL技術(shù)制備的顆粒相比較時(shí)，該噴霧干燥法呈現(xiàn)出增強(qiáng)的包封效率。更加有利地是，在噴霧干燥獲得的固體顆粒內(nèi)的無定形多元醇賦予生物藥物改善的穩(wěn)定性。更加值得注意地是，本發(fā)明人證明了通過改變顆粒組成，可獲得雙藥物釋放。在將干燥粉末(即，噴霧干燥的聚電解質(zhì)微球)再分散時(shí)，一部分藥物保留在聚電解質(zhì)構(gòu)架內(nèi)(即，仍然穩(wěn)定地包封在微球內(nèi))，而另一部分藥物立即釋放到周圍介質(zhì)中。該特征對(duì)于誘發(fā)體液(抗體介導(dǎo)的)免疫應(yīng)答具有重要性，對(duì)于該目的，完整的藥物應(yīng)到達(dá)B細(xì)胞，或經(jīng)由通過淋巴系統(tǒng)的被動(dòng)引流或經(jīng)由樹突狀細(xì)胞(DC)運(yùn)輸。因?yàn)榘庠诰垭娊赓|(zhì)微球內(nèi)的藥物一旦被DC內(nèi)化則很可能被加工(即，裂解成肽片段)，所以DC將完整的藥物(在聚電解質(zhì)微球形式下被內(nèi)化)傳給B細(xì)胞是不大可能的。因此，含有包封和可溶性藥物兩者的制劑除了應(yīng)能夠用包 封藥物靶向DC外，還應(yīng)能夠用完整的可溶性藥物靶向B細(xì)胞。EP2135601 (Capsulution Nanoscience AG)涉及使藥物的無定形形式穩(wěn)定化的藥物制劑。具體地講，其涉及包含海綿樣載體基質(zhì)、特別是聚電解質(zhì)復(fù)合物或多孔顆粒的藥物組合物。EP2135601的教導(dǎo)沒有公開有利的無定形多元醇，也沒有公開具有本發(fā)明的增強(qiáng)免疫原性的雙釋放球形制劑。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供用于生物藥物的藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供具有受控雙釋放的用于生物藥物的藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供可細(xì)胞外遞送生物藥物的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供可遞送生物藥物到吞噬細(xì)胞、特別是樹突狀細(xì)胞的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供可引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供可增強(qiáng)免疫原性應(yīng)答的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供可增強(qiáng)抗原呈遞、特別是可促進(jìn)對(duì)CD8+ T細(xì)胞的MHC-1介導(dǎo)的交叉呈遞的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供可在生物藥物到達(dá)樹突狀細(xì)胞之前保護(hù)生物藥物以免降解的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供具有合適的生物利用度的生物藥物遞送系統(tǒng)。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供具有最佳化學(xué)和物理穩(wěn)定性的生物藥物遞送系統(tǒng)。具體地講，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供在提取出無定形多元醇(起犧牲性組分(sacrificialcomponent)的作用)之后仍然穩(wěn)定而沒有生物藥物的顯著滲漏的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供在用生理溶液重構(gòu)之后仍然穩(wěn)定的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)還在于提供具有改善的生物藥物穩(wěn)定性的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供具有增強(qiáng)的包封效率、從而使昂貴藥物和聚電解質(zhì)的浪費(fèi)減至最少的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供如下生物藥物遞送系統(tǒng)，其可在一步法或兩步法中制備，避免復(fù)雜且勞動(dòng)密集的多步過程，從而便于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供對(duì)于其制備避免了作為勞動(dòng)密集的多步過程的靜電疊層(ELbL)組裝方法的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供可以在不使用有機(jī)溶劑或最少量使用有機(jī)溶劑的情況下制備的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供其制備有利于環(huán)境(environment-friendly)的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供包含具有最小的或可接受的毒性或具有低免疫原性的藥學(xué)上可接受的賦形劑的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供包含藥學(xué)上可接受的通用賦形劑例如聚電解質(zhì)復(fù)合物的生物藥物遞送系統(tǒng)，所述賦形劑的體內(nèi)降解速率可通過其結(jié)構(gòu)變化調(diào)節(jié)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于 提供避免非聚合化學(xué)交聯(lián)劑的生物藥物遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供以顆粒形式的生物藥物遞送系統(tǒng)，其呈現(xiàn)出顆粒的靜電電勢(shì)增加，這對(duì)于最佳懸浮穩(wěn)定性是受關(guān)注的。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供呈現(xiàn)出增加表面積的生物藥物遞送系統(tǒng)，所述系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比較，其在每毫克犧牲性組分捕獲更多藥物方面更有效，所述現(xiàn)有技術(shù)的方法由以下組成:i)物理吸附一吸附藥物到預(yù)成型的犧牲性組分上；或ii)共沉淀一通過犧牲性微粒捕獲藥物；i)和ii)各自隨后是聚電解質(zhì)LbL組裝。該增加的表面積允許增加的藥物負(fù)載量和負(fù)載效率，且其尤其由可通過噴霧干燥法獲得的微粒實(shí)現(xiàn)，其呈現(xiàn)出非常致密的組分網(wǎng)絡(luò)和在提取出犧牲性組分(即，無定形多元醇)之后形成的納米尺寸的孔。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及包含聚電解質(zhì)復(fù)合物和多元醇的組合物，其特征在于所述多元醇呈無定形形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述組合物還包含一種或多種藥物，其中各藥物具有至少1000道爾頓的分子量。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述組合物呈顆粒形式或?yàn)榉勰?。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本文呈現(xiàn)的實(shí)施方案中的任一個(gè)的組合物的混懸液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混懸液顯示出雙藥物釋放。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中的任一個(gè)的組合物和制藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含藥學(xué)上有效量的一種或多種藥物。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)本文呈現(xiàn)的實(shí)施方案中的任一個(gè)的組合物的方法，所述方法包括:
a)制備總固體濃度為約0.1-10%的包含多元醇、聚電解質(zhì)復(fù)合物和任選一種或多種藥物的水性進(jìn)料；
b)噴霧干燥在步驟a)中制備的水性進(jìn)料；和
c)任選用合適的復(fù)合劑(complexingagent)提取所述多元醇。本發(fā)明還涉及可根據(jù)前段方法獲得的顆粒。附圖簡(jiǎn)述


圖1.通過噴霧干燥抗原(三角形)、聚電解質(zhì)(弧形)和甘露糖醇(盤形)的混合物接著通過再分散在水中提取出甘露糖醇而將抗原包封到多孔聚電解質(zhì)微球中的示意圖。圖2.在用水提取甘露糖醇之前(A)和之后(B)在噴霧干燥的甘露糖醇/DS/0VA/PlARG微球的不同放大倍數(shù)(zoom)下的掃描電子顯微術(shù)圖像。圖3.噴霧干燥的固體甘露糖醇/DS/0VAA\ARG微球使用綠色熒光OVA的共焦顯微術(shù)圖像。(A)熒光通道、(B)傳輸通道和(C)在綠色熒光與傳輸通道之間的重疊圖。圖4.用負(fù)載OVA的甘露糖醇/DS/0VAAVVRG微球孵育的骨髓樹突狀細(xì)胞的共焦顯微術(shù)圖像。圖5.純甘露糖醇、甘露糖醇/DS/0VAA\ARG的物理混合物和噴霧干燥的甘露糖醇/DS/0VA/PlARG微球的 X射線衍射圖。圖6.(A)通過在溶液中游離的辣根過氧化物酶(HRP)，甘露糖醇、聚電解質(zhì)和HRP的水性分散體和再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的噴霧干燥的微粒使2，2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)轉(zhuǎn)化的相對(duì)酶活性的定量。(B)顯示在加入H2O2之后在噴霧干燥的微球內(nèi)Amplex Red轉(zhuǎn)化成試齒靈(resorufin)(紅色突光物)的共焦顯微術(shù)圖像。圖7.由(A) HRP/DSAVVRG (因此沒有甘露糖醇)和(B) HRP/甘露糖醇(其沒有聚電解質(zhì)DSA\ARG)組成的噴霧干燥的微粒的掃描電子顯微術(shù)圖像。圖8.與甘露糖醇共同噴霧干燥的HRP的X射線粉末衍射圖。在沒有聚電解質(zhì)DS/PlARG的情況下，甘露糖醇明顯仍然是結(jié)晶。圖9.評(píng)價(jià)樹突狀細(xì)胞對(duì)噴霧干燥的聚電解質(zhì)微球的細(xì)胞攝取。(A-B)用負(fù)載有alexa488綴合的卵清蛋白(綠色熒光物)的噴霧干燥的聚電解質(zhì)微球孵育的樹突狀細(xì)胞的共焦顯微術(shù)圖像。在A行中，細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)用CellTracker Red (紅色熒光物)染色。在B行中，細(xì)胞內(nèi)酸性小泡(吞噬體、內(nèi)體、溶酶體)用LysoTracker Red (紅色熒光物)染色。在兩種情形下，細(xì)胞核用Hoechst (藍(lán)色熒光物)染色。第I列顯示在藍(lán)色通道、綠色通道和紅色通道之間的重疊圖，第2列顯示在藍(lán)色通道、綠色通道、紅色通道和DIC(微分干涉相差)通道之間的重疊圖，且第3列顯示DIC通道。(C) (C1-C2)在孵育4小時(shí)之后和(C3-C4)在孵育24小時(shí)之后由樹突狀細(xì)胞內(nèi)化的噴霧干燥的聚電解質(zhì)微球的透射電子顯微術(shù)圖像。圖10.通過對(duì)用可溶性0VA、包封在PLGA微球中的0VA、包封在中空LbL膠囊中的OVA和包封在噴霧干燥的聚電解質(zhì)微球中的OVA孵育的25-D1.16 mAb染色的DC的FACS分析測(cè)量的SIINFEKL OVA-⑶8肽的交叉呈遞。實(shí)驗(yàn)一式三份運(yùn)行。用于制造LbL膠囊的聚合物與用于噴霧干燥的聚電解質(zhì)微球的聚合物相同(即，硫酸葡聚糖和聚-L-精氨酸)。圖11.分別用可溶性O(shè)VA (sOVA)和在噴霧干燥的微粒中配制的OVA (0VA顆粒)接種的小鼠的抗體滴度和T細(xì)胞誘導(dǎo)(ELISP0T)。圖12.在干燥的粉末(即，噴霧干燥的聚電解質(zhì)微球)再分散后由本發(fā)明的不同制劑顯示出的雙抗原釋放，其中一部分抗原保留在聚電解質(zhì)構(gòu)架內(nèi)(即，仍然穩(wěn)定地包封在微球內(nèi))，而另一部分釋放到周圍介質(zhì)中。甘露糖醇/聚陰離子/聚陽離子/抗原(使用OVA作為模型抗原)的比率顯示在各圖A-D上。圖13.(A)在水中重構(gòu)后噴霧干燥的微粒的尺寸分布。(B)噴霧干燥的微粒的掃描電子顯微術(shù)圖像。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及包含聚電解質(zhì)復(fù)合物和多元醇的組合物，其特征在于所述多元醇呈無定形形式。術(shù)語“聚電解質(zhì)復(fù)合物”是指由攜帶相反符號(hào)的電荷的大分子構(gòu)成的中性聚合物-聚合物復(fù)合物，所述電荷引起大分子因靜電相互作用而結(jié)合在一起。所述復(fù)合物通常由相反電荷的聚電解質(zhì)例如陰離子聚電解質(zhì)或聚陰離子與陽離子聚電解質(zhì)或聚陽離子的靜電相互作用形成。所述聚電解質(zhì)復(fù)合物優(yōu)選包含i)聚陰離子或在高于等電點(diǎn)的pH下具有總體負(fù)電荷的兩性電解質(zhì)和ii)聚陽離子 或在低于等電點(diǎn)的PH下具有總體正電荷的兩性電解質(zhì)。聚電解質(zhì)為其重復(fù)單元或重復(fù)單元中的至少一個(gè)帶有電解質(zhì)基團(tuán)的聚合物。電解質(zhì)為在適當(dāng)介質(zhì)(例如，水)中解離成相反電荷的離子的任何物質(zhì)。聚合物為由通過共價(jià)化學(xué)鍵連接的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的大分子。存在雜聚物(包含兩種或更多種結(jié)構(gòu)單元)和均聚物(僅包含一種結(jié)構(gòu)單元)。聚電解質(zhì)可含有帶負(fù)電荷的基團(tuán)和帶正電荷的基團(tuán)。這些電解質(zhì)被稱作兩性電解質(zhì)。技術(shù)人員了解兩性化合物在水溶液中的凈電荷取決于其等電點(diǎn)和溶液的pH。聚陽離子或陽離子聚電解質(zhì)具有總體正電荷且包含具有凈正電荷的結(jié)構(gòu)單元，而聚陰離子或陰離子聚電解質(zhì)具有總體負(fù)電荷且包含具有凈負(fù)電荷的結(jié)構(gòu)單元。聚電解質(zhì)也可被視為包含多酸和多堿。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述聚電解質(zhì)復(fù)合物包含陰離子聚電解質(zhì)和陽離子聚電解質(zhì)，其各自獨(dú)立地選自多糖和多氨基酸。所述聚陰離子或陰離子聚電解質(zhì)優(yōu)選選自木聚糖多硫酸鹽；硫酸葡聚糖；聚(氨基酸)，例如聚天冬氨酸或聚谷氨酸；多糖多硫酸鹽，例如淀粉水解產(chǎn)物、菊糖、羥乙基淀粉的硫酸鹽；多糖多磺酸鹽；多糖多磷酸鹽；羧甲基纖維素；明膠B ;膠原；HAS (人血清白蛋白)或其他白蛋白；肝素；硫酸軟骨素；透明質(zhì)酸；Eudragit S ;核酸(例如，DNA、RNA、LNA或PNA)和多磷酸鹽。更優(yōu)選所述聚陰離子或陰離子聚電解質(zhì)為硫酸葡聚糖或肝素。這些電解質(zhì)為市售的。所述聚陽離子或陽離子聚電解質(zhì)優(yōu)選選自聚-L-精氨酸、聚-L-組氨酸、富含精氨酸的組蛋白、聚-L-賴氨酸、聚-α，β-(2-二甲氨基乙基)-D, L-天冬酰胺(aspartamide)、殼聚糖、賴氨酸十八烷基酯、氨化葡聚糖、氨化環(huán)糊精、氨化纖維素醚、魚精蛋白(硫酸鹽)、明膠A、Eudragit E、HAS (人血清白蛋白)或其他白蛋白、酪蛋白、三甲基-殼聚糖(也稱作季銨化殼聚糖)和氨化果膠。更優(yōu)選所述聚陽離子或陽離子聚電解質(zhì)為聚-L-精氨酸或魚精蛋白。這些電解質(zhì)為市售的。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述聚電解質(zhì)復(fù)合物選自硫酸葡聚糖和聚-L-精氨酸的組合；硫酸葡聚糖和魚精蛋白的組合；及肝素和魚精蛋白的組合。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，在聚電解質(zhì)復(fù)合物中聚陰離子與聚陽離子的比率范圍可為2:1 (w/w)-l:2 (w/w)(即，2份量的聚陰離子相對(duì)I份量的聚陽離子至I份量的聚陰離子相對(duì)2份量的聚陽離子)，優(yōu)選為1.5:1-1:1.5，更優(yōu)選為1:1-1:0.5，甚至更優(yōu)選為 1:1-1:0.2。所述聚電解質(zhì)復(fù)合物可另外包含無機(jī)或有機(jī)離子或鹽，例如氯化鈉和消泡劑，例如聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯醇和非復(fù)合聚合物。術(shù)語“多元醇”是指具有多個(gè)羥基的化合物，且包括糖(還原糖和非還原糖)、糖醇和糖酸?！斑€原糖”為含有可還原金屬離子或與賴氨酸和在蛋白質(zhì)中的其他氨基酸共價(jià)反應(yīng)的半縮醛基的糖。“非還原糖”為不具有還原糖的這些性質(zhì)的糖。對(duì)于本發(fā)明來講，合適的多元醇的實(shí)例包括甘露糖醇、阿糖醇、海藻糖、山梨糖醇、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇(isomalt)、乳糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、甘油、乳糖醇、丙二醇、聚乙二醇、肌醇、蔗糖及其混合物。優(yōu)選的多元醇為藥學(xué)上可接受的多元醇。這些多元醇為市售的。甘露糖醇以三種結(jié)晶的多晶型存在:α、β和δ (參見，例如Burger，A.，Henc,J.Rollinger, J., ffeissnicht, A., Stottner, H.J.Pharm Sci, 89, 457, (2000)),且也發(fā)現(xiàn)其作為半水化物和呈無定形形式。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)在噴霧干燥聚電解質(zhì)復(fù)合物和甘露糖醇的混合物之后其呈無定形態(tài)。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，相對(duì)于藥物來講，多元醇的量為藥物量的20-40倍(w/w)。優(yōu)選在該實(shí)施方案內(nèi)，所述多元醇為甘露糖醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述組合物還包含一種或多種藥物，其中各藥物具有至少1000道爾頓的分子量。照此，將與聚電解質(zhì)復(fù)合物和一種或多種藥物組合的多元醇直接噴霧干燥，形成截留藥物和多元醇的聚電解質(zhì)構(gòu)架?？稍诒景l(fā)明的組合物中配制且分子量各自至少為1000道爾頓的藥物通常為生物藥物。術(shù)語“生物藥物”或“生物制劑(biologies)”是指通常通過生物學(xué)方法或測(cè)定獲得的有機(jī)源的復(fù)合藥物物質(zhì)、制劑或劑。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述一種或多種藥物選自氨基酸、肽和蛋白質(zhì)；抗體；生物因子，例如抗原、凝血因子抑制劑、凝血因子、趨化因子、炎癥介體、細(xì)胞間信號(hào)肽和蛋白質(zhì)、信息素、生物色素、生物毒素；酶和輔酶；激素、激素代替物和激素拮抗劑；大分子物質(zhì)，例如膠束、多蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚合物；核酸、核酸前體、反義元件、核苷酸、核苷；抗毒素，例如抗蛇毒素、白喉抗毒素和破傷風(fēng)抗毒素；免疫血清，例如抗淋巴細(xì)胞血清；尿促性素；花蜜；溶鏈菌素(picibanil);疫苗，包括且不限于阿爾茨海默病(Alzheimer)疫苗、細(xì)菌疫苗、癌癥疫苗、真 菌疫苗、原生動(dòng)物疫苗、類毒素、減毒疫苗、組合疫苗、避孕疫苗、滅活疫苗、標(biāo)記疫苗(marker vaccine)、病毒疫苗；以及佐劑、Toll樣受體(TLR)配體、模式識(shí)別受體配體、細(xì)胞因子等。優(yōu)選所述一種或多種藥物選自氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗原、核酸、核酸前體、反義元件、核苷酸、核苷、抗毒素、疫苗和佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其包含:
-無定形多元醇，
-聚電解質(zhì)復(fù)合物，和
-一種或多種藥物，其各自具有至少1000道爾頓的分子量；
其中所述無定形多元醇為無定形甘露糖醇，所述聚電解質(zhì)復(fù)合物由硫酸葡聚糖和聚-L-精氨酸構(gòu)成，且所述一種或多種藥物為抗原，例如卵清蛋白。在另一實(shí)施方案中，在前一段的組合物中，所述無定形多元醇已經(jīng)被提取出來，從而產(chǎn)生多孔組合物，其中該提取用水或任何水溶液或分散體進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，所述無定形多元醇的提取在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，聚電解質(zhì)復(fù)合物、無定形多元醇和任選一種或多種藥物均勻地分配。術(shù)語“均勻地分配”是指組分在組合物的任何給定區(qū)域上彼此以基本恒定的比率存在。所述組合物可含有組分濃度較高或較低的區(qū)域，但其各自與其他組分的比率應(yīng)該基本不變。術(shù)語“組分”是指聚電解質(zhì)復(fù)合物、無定形多元醇和任選一種或多種藥物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，聚電解質(zhì)復(fù)合物、無定形多元醇和一種或多種藥物均勻地分配。在另一實(shí)施方案中，聚電解質(zhì)復(fù)合物和無定形多元醇均勻地分配。在本發(fā)明的 組合物呈顆粒形式的情形下，該“組合物的任何給定區(qū)域”是指顆粒的內(nèi)部區(qū)域和外表面，所述顆粒為多孔的或無孔的。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，無定形多元醇、聚電解質(zhì)復(fù)合物和一種或多種藥物以約1000/100/1至約1/100/1000的比率(分別w/w/w)、更優(yōu)選以約100/10/1至約1/10/100的比率、甚至更優(yōu)選以約50/10/1至約1/10/50的比率存在。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述比率為約200:50:5或100:50:5o在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述組合物呈顆粒形式或?yàn)榉勰?。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述組合物呈顆粒形式或?yàn)榉勰?，且?dāng)以混懸液提供時(shí)顯示出雙藥物釋放。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述組合物顯示出雙藥物釋放。術(shù)語“粉末”是指兩個(gè)或更多個(gè)顆粒。這些顆粒在振蕩或傾斜時(shí)通常自由流動(dòng)，但也可能在可接受的程度內(nèi)經(jīng)歷一定的團(tuán)聚以形成粒狀材料。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述顆粒具有IOOnm-1OOMm的平均直徑。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述顆粒具有IOOnm-1OMm
的平均直徑。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，所述顆粒具有l(wèi)Mm-lOMm、優(yōu)選I μ m-5Mm的平均直徑。與顆粒有關(guān)且可與短語“平均粒度”和“均值粒度”互換使用的術(shù)語“平均直徑”是指當(dāng)通過諸如動(dòng)態(tài)光散射或激光衍射等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)量時(shí)給定粉末的至少50%或更多、例如至少60%、70%、80%、90%的顆粒的粒度。當(dāng)顆粒的形狀不是球形時(shí)，術(shù)語“平均直徑”也指顆粒的較大尺寸。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，IOOnm-1OOMm的平均直徑意指當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)量時(shí)至少50%的粉末顆粒具有約IOOnm-約IOOMm的粒度。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本文提供的實(shí)施方案中的任一個(gè)的組合物的混懸液。優(yōu)選所述混懸液包含呈顆粒形式或呈粉末形式的本發(fā)明的組合物中的任一種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述混懸液具有雙藥物釋放性質(zhì)。術(shù)語“混懸液”是指遍布可為固體、液體或氣體的外相的固體內(nèi)相的分散體?；鞈乙嚎蔀閱畏稚⒒蚨喾稚⒌摹Ｔ摲稚⒔?jīng)由機(jī)械攪拌任選利用某些賦形劑或助懸劑如潤(rùn)濕劑、絮凝劑、分散劑、膠凝劑等發(fā)生。所述固體內(nèi)相為本發(fā)明的組合物中的任一種。當(dāng)所述組合物分散在固體外相中時(shí)，所獲得的混懸液也被稱為粉末，該后一術(shù)語與上文關(guān)于本發(fā)明的顆粒定義的“粉末”不同。當(dāng)所述組合物分散在液體外相中時(shí)，所獲得的混懸液被稱為混懸液或膠體或膠態(tài)體系。當(dāng)所述組合物分散在氣體外相中時(shí)，所獲得的混懸液也被稱為氣溶膠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混懸液包含呈顆粒形式或作為粉末的組合物，其中充當(dāng)犧牲性組分的無定形多元醇已經(jīng)被提取出。包含在混懸液中的所述組合物的一個(gè)實(shí)例為呈顆粒形式或作為粉末的組合物，其中無定形多元醇的提取用諸如水或任何水溶液等復(fù)合劑進(jìn)行，從而產(chǎn)生多孔粉末。一個(gè)實(shí)例為包含在混懸液中的呈顆粒形式或作為粉末的組合物，其中所述多元醇存在于混懸液的外部水相。照此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及包含聚電解質(zhì)復(fù)合物和一種或多種藥物的多孔組合物。在一個(gè)涉及在前一句的組合物的實(shí)施方案中，聚電解質(zhì)復(fù)合物、一種或多種藥物和孔均勻地分配。所述孔是 提取無定形多元醇的結(jié)果。術(shù)語“犧牲性組分”，也稱作“犧牲性模板”，和本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何其他同義術(shù)語是指可在形成本發(fā)明的組合物之后被提取出的材料或其部分。有趣的是，該犧牲性組分的隨后提取產(chǎn)生具有互連孔網(wǎng)絡(luò)的多孔微球，正如在海棉狀或珊瑚結(jié)構(gòu)中見到的那些。該特定的多孔結(jié)構(gòu)允許容易地獲取藥物且在由樹突狀細(xì)胞內(nèi)化之后加工。在本發(fā)明中，如在上文中定義，所述犧牲性組分為無定形多元醇或多元醇(若存在于溶液中)?？蔀橄?、排出或去除過程的犧牲性組分、S卩(無定形)多元醇的提取可使用如本領(lǐng)域的技術(shù)人員常規(guī)使用的化學(xué)、電學(xué)或其他方法及其組合來進(jìn)行。提取犧牲性組分的化學(xué)方法的實(shí)例包括加入復(fù)合劑、還原劑、氧化劑、水解劑等。術(shù)語“復(fù)合劑”是指與本發(fā)明的犧牲性組分、即無定形多元醇或若在溶液中如所指的多元醇選擇性地結(jié)合或復(fù)合的任何材料。所述復(fù)合劑可為生物分子，例如肽或抗體；或化學(xué)試劑，例如磷鎢酸(PTA)，其可呈鹽形式，例如磷鎢酸鈉。復(fù)合劑可以單獨(dú)或組合使用。例如，生物復(fù)合劑可以與化學(xué)復(fù)合劑聯(lián)合使用，例如使用肽和化學(xué)試劑。在另一實(shí)施例中，相同類別的兩種復(fù)合劑可以一起使用，例如磷鎢酸(及其鹽)與三氯乙酸的混合物。所形成的復(fù)合物必須提供從組合物的剩余部分中分離復(fù)合物的一些手段，例如將復(fù)合劑固定到表面上。例如，復(fù)合劑與期需的犧牲性組分結(jié)合，形成比重比單獨(dú)的復(fù)合劑或犧牲性組分高的復(fù)合劑/犧牲性組分復(fù)合物(agent/sacrificial component complex)。因此,復(fù)合劑/犧牲性組分復(fù)合物可以經(jīng)由重力分離開，其任選通過使用離心分離來補(bǔ)充。在一個(gè)涉及本發(fā)明的組合物中的任一種的實(shí)施方案中，其中所述犧牲性組分為甘露糖醇或無定形甘露糖醇，所述犧牲性組分用選自水、生理溶液、水溶液或分散體等的合適復(fù)合劑提取。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混懸液包含呈顆粒形式或作為粉末的組合物，其中充當(dāng)犧牲性組分的無定形多元醇還沒有被提取出。包含在混懸液中的所述組合物的一個(gè)實(shí)例為呈顆粒形式或作為粉末的組合物，其中所述多元醇為無定形甘露糖醇。無定形甘露糖醇的提取在顆?；蚍勰┙o予體內(nèi)稍后進(jìn)行，且身體本身的生理水分充當(dāng)提取劑，從而原位(即在體內(nèi))產(chǎn)生多孔顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含無定形甘露糖醇、聚電解質(zhì)復(fù)合物和一種或多種藥物的顆?；蚍勰腋≡诜撬酝庀嘀?，且將該混懸液給予體內(nèi)，其中生理水分將原位提取甘露糖醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混懸液當(dāng)以顆粒形式或作為粉末的組合物給予體內(nèi)時(shí)在體內(nèi)形成，且體內(nèi)的生理水溶液充當(dāng)外相。在另一實(shí)施方案中，所述混懸液在混懸液的臨時(shí)制備中恰在給予體內(nèi)之前在以顆粒形式或作為粉末的組合物與充當(dāng)外相的生理水溶液混合時(shí)開始形成。本發(fā)明還涉及水性進(jìn)料，其包含:
-多元醇；
-聚電解質(zhì)復(fù)合物，和·
-任選一種或多種具有至少1000道爾頓的分子量的藥物；
其總固體濃度為約0.1-10%。優(yōu)選所述總固體濃度為0.1-5%，更優(yōu)選為0.5-2%，更優(yōu)選為約1%。術(shù)語“水性進(jìn)料”是指含水的任何混合物。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)本文呈現(xiàn)的實(shí)施方案中的任一個(gè)的組合物的方法，所述方法包括:
a)制備總固體濃度為約0.1-10%的如上定義的水性進(jìn)料；
b)噴霧干燥在步驟a)中制備的水性進(jìn)料。本發(fā)明還涉及可根據(jù)前一段的方法獲得的顆粒。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)本文呈現(xiàn)的實(shí)施方案中的任一個(gè)的組合物的方法，所述方法包括:
a)制備總固體濃度為約0.1-10%的如上定義的水性進(jìn)料；
b)噴霧干燥在步驟a)中制備的水性進(jìn)料；和
c)任選用合適的復(fù)合劑提取多元醇。本發(fā)明還涉及可根據(jù)前一段的方法獲得的顆粒。如果已經(jīng)方便地提取出了多元醇，該顆粒則將是多孔的。在噴霧干燥技術(shù)中，本發(fā)明的實(shí)施方案中的任一個(gè)的水性進(jìn)料經(jīng)由噴霧干燥器的噴嘴噴霧，其中來自所得液滴的水性溶劑通常在高溫下被蒸發(fā)。噴霧干燥在常規(guī)噴霧干燥設(shè)備中進(jìn)行，噴霧干燥設(shè)備包括噴霧干燥室、將進(jìn)料混合物以液滴形式引入噴霧干燥室的霧化裝置、經(jīng)由入口流入噴霧干燥室的加熱的干燥氣體源，和加熱的干燥氣體的出口。干燥空氣可為任何氣體。優(yōu)選氣體為空氣、壓縮空氣或惰性氣體例如氮?dú)狻⒏缓獨(dú)獾臍怏w或氬氣。在噴霧干燥室的氣體入口處干燥氣體的溫度可為約25°C -約300°C或約
600C -約 250 0C ο所述噴霧干燥設(shè)備還包括收集生成的固體藥物粉末的裝置。所述霧化裝置可為旋轉(zhuǎn)霧化器、氣動(dòng)噴嘴、超聲波噴嘴或優(yōu)選高壓噴嘴。合適的旋轉(zhuǎn)霧化器包括具有自高壓壓縮空氣源例如6巴壓縮空氣源操作的空氣潤(rùn)輪驅(qū)動(dòng)(air turbine drive)的那些旋轉(zhuǎn)霧化器,所述空氣潤(rùn)輪驅(qū)動(dòng)供應(yīng)動(dòng)力給霧化輪以使進(jìn)料混合物霧化。霧化輪可為葉片式的。優(yōu)選旋轉(zhuǎn)霧化器位于噴霧干燥室的上部，例如在室頂，以使得所生成的液滴干燥并落到室的下部。旋轉(zhuǎn)霧化器產(chǎn)生其尺寸取決于輪圓周速度的液滴。合適的氣動(dòng)噴嘴(包括二流體噴嘴)包括位于噴霧干燥室的上部，例如在室頂，且以所謂的“順流模式”操作的那些氣動(dòng)噴嘴。進(jìn)料混合物和霧化氣體單獨(dú)通到噴嘴頭中，在此發(fā)生霧化。通過氣動(dòng)噴嘴生成的液滴的尺寸取決于操作參數(shù)。也可使用以所謂的“逆流模式”操作的二流體噴嘴。這些噴嘴以與順流模式的二流體噴嘴類似的方式操作，不同之處在于它們位于干燥室的下部且向上噴霧液滴。

合適的超聲波霧化器噴嘴將低粘度液體轉(zhuǎn)化成特細(xì)的噴霧。隨著液體經(jīng)由探針的中心泵送，液體從振動(dòng)尖端被機(jī)械粉碎成液滴。這些液滴在用低頻探針的情況下較大，而在用高頻探針的情況下較小。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選霧化器類型為高壓噴嘴，其中在壓力下泵送液體進(jìn)料到噴嘴中。壓力能轉(zhuǎn)化成動(dòng)能，且進(jìn)料作為易于崩解成噴霧的高速膜從噴嘴口流出，因?yàn)樵撃な遣环€(wěn)定的。使用鏇潤(rùn)插件(swirl insert)或鏇潤(rùn)室使進(jìn)料在噴嘴內(nèi)旋轉(zhuǎn),產(chǎn)生從噴嘴口出來的錐形噴霧模式。漩渦插件、漩渦室和孔口尺寸以及壓力變化對(duì)進(jìn)料速率和噴霧特性給予控制。通過高壓噴嘴生成的液滴的尺寸取決于操作參數(shù)。合適的霧化裝置可根據(jù)所要的液滴尺寸選擇，所要液滴尺寸取決于許多因素，例如進(jìn)料混合物的粘度和溫度、所要流速和泵送進(jìn)料混合物可接受的最大壓力、現(xiàn)有的液滴尺寸。在選擇霧化裝置以使得對(duì)于具有特定粘度的進(jìn)料混合物獲得所要的平均液滴尺寸之后，將混合物以特定的流速導(dǎo)入噴霧干燥室。在一個(gè)涉及本發(fā)明的方法中的任一種的實(shí)施方案中，所述噴霧干燥在具有約0.l-10mm、例如約0.7mm、1.4mm或2mm的平均直徑的噴嘴的噴霧干燥器中進(jìn)行。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他噴霧干燥技術(shù)可容易地應(yīng)用在本發(fā)明中。例如，可使用納米噴霧干燥，其中干燥氣體經(jīng)由加熱器進(jìn)入系統(tǒng)。一種新型的加熱器系統(tǒng)允許層流氣流。噴霧頭將具有窄尺寸分布的細(xì)小液滴噴霧到干燥室中。將液滴干燥且變成固體顆粒。固體顆粒在靜電顆粒收集器中分離。將排出氣體過濾且送到通風(fēng)櫥或環(huán)境中。入口溫度通過溫度傳感器控制。其他噴霧干燥技術(shù)例如包括單分散噴霧干燥技術(shù)，其中常規(guī)噴霧干燥與micro sieve 噴嘴技術(shù)組合以生成良好限定的功能性微顆粒和納米顆粒。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中的任一個(gè)的組合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含藥學(xué)上有效量的一種或多種藥物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含呈顆粒形式或作為粉末的本發(fā)明的組合物和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述藥物組合物包含藥學(xué)上有效量的一種或多種藥物。 在一個(gè)涉及本發(fā)明的藥物組合物中的任一種的實(shí)施方案中,所述藥物組合物經(jīng)由以下方式給予:選自經(jīng)肺、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、病灶內(nèi)(intralesional)、心室內(nèi)的腸胃外途徑、通過脊椎注射、通過骨內(nèi)輸注或經(jīng)皮途徑。本發(fā)明的藥物組合物也可經(jīng)陰莖海綿體內(nèi)、心肌內(nèi)、外膜、瘤內(nèi)、在腦內(nèi)部分、在傷口部位、在緊密關(guān)節(jié)腔中或在人類或動(dòng)物的體腔中給予。腸胃外制劑可采用諸如在油性或水性溶媒中的混懸液等形式，且可含有配制劑例如PH調(diào)節(jié)劑、復(fù)合劑、等滲劑、助懸劑、穩(wěn)定劑或分散劑。一般來講，在本發(fā)明的制劑中可使用通常用于靜脈內(nèi)注射的那些賦形劑，只要所述制劑呈現(xiàn)適當(dāng)?shù)恼扯?、減小的注射體積和可接受的PH范圍即可。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知用一定量的活性成分制備各種藥物組合物的方法。對(duì)于制備藥物組合物的方法的實(shí)例，參見The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams & Wilkins,第 21 版，2006。優(yōu)選所述藥物組合物以以粉末形式呈現(xiàn)，用于稍后在使用前用合適溶媒例如無菌無熱原的水構(gòu)造。臨時(shí)單位劑型通過混合本發(fā)明組合物(優(yōu)選呈顆粒形式或作為粉末或作為其混懸液)與無菌溶媒來制備。或者，可將組合物懸浮以便于注射和殺菌，然后填充到合適的小瓶或安瓿并密封。有利地，將賦形劑例如局部麻醉防腐劑和緩沖劑溶解在溶媒中。在組合物中可包括表面活性劑或濕潤(rùn)劑以便于組合物的均勻分配。注射用制劑可以單位劑型呈現(xiàn)在例如安瓿或多劑量容器中。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)安瓿包含呈顆粒形式或作為粉末的本發(fā)明組合物，且另一安瓿包含溶媒。在另一實(shí)施方案中，一個(gè)安瓿包含準(zhǔn)備用于經(jīng)肺遞送或準(zhǔn)備用于注射的呈顆粒形式或作為粉末的本發(fā)明組合物的混懸液。對(duì)于經(jīng)皮(例如，局 部)給予，制備稀的無菌水性或部分水性溶液(通常以約
0.1%-5%的濃度)，其他方面類似于以上腸胃外溶液。預(yù)防或治療醫(yī)學(xué)病況所需要的在本發(fā)明組合物內(nèi)的化合物的治療有效劑量由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟悉的臨床前和臨床方法容易地確定。所述化合物或其藥上可接受的鹽的給予劑量取決于個(gè)別病例且按照慣例，其將適合使個(gè)別病例的狀況達(dá)到最佳效果。因此，其當(dāng)然取決于給予頻率和在各病例中對(duì)于治療或預(yù)防采用的化合物的效力和作用持續(xù)時(shí)間，而且取決于疾病和癥狀的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及欲治療的受試者的性另|J、年齡、體重、共同給藥(co-medication)和個(gè)體應(yīng)答性和該療法是急性還是預(yù)防性。在制劑中存在的藥物的百分?jǐn)?shù)也是一個(gè)因素。劑量可隨體重變化而適應(yīng)修改和在兒科應(yīng)用中適應(yīng)修改。本發(fā)明還涉及在細(xì)胞外藥物遞送中使用的本發(fā)明藥物組合物中的任一種。本發(fā)明還涉及在將一種或多種藥物遞送到吞噬細(xì)胞中使用的本發(fā)明藥物組合物中的任一種。術(shù)語“吞噬細(xì)胞”是指樹突狀細(xì)胞，包括郎格罕氏細(xì)胞(Langerhans cells);巨噬細(xì)胞，例如上皮樣細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、異物巨細(xì)胞、郎罕氏巨細(xì)胞(Langhans giant cells)、組織細(xì)胞、枯氏細(xì)胞(KupfTer cells)、肺泡巨噬細(xì)胞、腹膜巨噬細(xì)胞；單核細(xì)胞，包括活化的殺傷性單核細(xì)胞；和中性粒細(xì)胞。本發(fā)明還涉及在以下疾病的治療中使用的本發(fā)明藥物組合物中的任一種:過敏和免疫相關(guān)疾病、皮膚病學(xué)疾病、心臟病、內(nèi)分泌疾病、代謝疾病、血液學(xué)疾病、胃腸疾病、結(jié)腸直腸病、傳染性疾病、癌癥、腎病、肺相關(guān)疾病、風(fēng)濕病學(xué)疾病、神經(jīng)學(xué)疾病、骨病、矯形外科疾病、眼科疾病、耳鼻喉科相關(guān)疾病、泌尿?qū)W疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥物組合物中的任一種用于治療免疫相關(guān)疾病、傳染性疾病、代謝疾病和癌癥。以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1:固體微球的合成
硫酸葡聚糖(DEXS ；IOkDa)、聚-L-精氨酸(PlARG, IOOkDa)、卵清蛋白(OVA ；VII級(jí))和甘露糖醇自 Sigma-Aldrich 獲得。0VA_alexa488 和 LysoTracker Red 自 Invitrogen 獲得。在實(shí)驗(yàn)中使用的所有水都是Mill1-Q級(jí)。將甘露糖醇與硫酸葡聚糖(DS)和卵清蛋白(0VA ;在本研究中，作為模型抗原使用)在攪拌下在水中以40/4/1/5的比率以1%的總固體濃度混合。詳細(xì)地講，將200mg甘露糖醇、20mg DS和5mg OVA溶解于20ml水中。隨后將PJRG溶解于5ml水中且逐滴加到攪拌的甘露糖醇/DS/0VA溶液中，以允許在PJRG與分別地DS和OVA之間的靜電復(fù)合。

隨后，使 用B290實(shí)驗(yàn)臺(tái)噴霧干燥器將該混合物噴霧干燥且作為干燥粉末收集。將該混合物進(jìn)料到在噴霧干燥器頂上的二流體噴嘴(直徑:0.7mm)中。另外，該噴霧干燥器在35mVh的順流空氣流中操作，其中入口干燥空氣溫度為130°C且出口干燥空氣溫度為65°C。這些顆粒在該實(shí)施例中將被進(jìn)一步稱為固體微球。實(shí)施例2:顆粒表征
固體微球的形態(tài)(圖2A)和在水中提取出甘露糖醇之后獲得的多孔微球的形態(tài)(圖2B)通過掃描電子顯微術(shù)(SEM)顯現(xiàn)。最重要地，如將在下文通過共焦顯微術(shù)更詳細(xì)地提出，噴霧干燥的微球在再懸浮于水性介質(zhì)中時(shí)仍然穩(wěn)定且不會(huì)分解成初始的起始組分。作為對(duì)照，我們還噴霧干燥了甘露糖醇和OVA的混合物且在加入水時(shí)可以觀察到微粒立即溶解(數(shù)據(jù)沒有示出)，這表明需要DSA\ARG聚電解質(zhì)復(fù)合物構(gòu)架來獲得穩(wěn)定的微球。在水中提取出甘露糖醇引起形成很可能經(jīng)由靜電和疏水性相互作用的組合以及聚合物與蛋白質(zhì)鏈之間的物理纏結(jié)而穩(wěn)定的多孔微球。使用共焦顯微術(shù)來顯現(xiàn)處于水合狀態(tài)的微球。共焦顯微術(shù)圖像記錄在Leica SP5AOBS共焦顯微鏡上。出于顯現(xiàn)的目的，將綠色熒光0VA-alexa488與天然OVA以50:1的比率混合。在圖3中的共焦顯微照片證實(shí)微球在水性介質(zhì)中仍然穩(wěn)定。重要地，當(dāng)考慮圖3A的綠色熒光通道時(shí)，可以觀察到綠色熒光0VA-alexa488保留在多孔微球的聚電解質(zhì)構(gòu)架內(nèi)，而不是自發(fā)釋放到周圍水性介質(zhì)中。實(shí)施例3:包封效率的測(cè)定
包封效率的量化通過使干燥的固體微球分別再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS ;pH 7.4)中來測(cè)定。隨后，將微球離心且測(cè)定在上清液中的OVA濃度。當(dāng)將包封效率定義為在再懸浮后保留在微球內(nèi)的蛋白質(zhì)的量相對(duì)于在干燥微球中的蛋白質(zhì)的量時(shí)，觀察到在再懸浮于PBS后100± 1%的包封效率。該數(shù)值意味著，在再懸浮于PBS后，在從微球中提取甘露糖醇后沒有可檢測(cè)量的OVA從多孔微球釋放。進(jìn)入多孔聚電解質(zhì)球的100%的包封效率顯著高于先前將OVA包封到中空聚電解質(zhì)多層膠囊的約50%的包封效率[17]。在此情形下，OVA通過與氯化鈣和碳酸鈉混合而共同沉淀到碳酸鈣微粒中。在用硫酸葡聚糖和聚-L-精氨酸LbL交替涂布這些微粒且隨后溶解CaCO3微粒之后，由于經(jīng)由聚電解質(zhì)膜擴(kuò)散而損失約50%的 0VA。實(shí)施例4:樹突狀細(xì)胞攝取評(píng)價(jià)
因?yàn)槟康氖鞘褂枚嗫拙垭娊赓|(zhì)微球作為抗原載體用于疫苗接種目的，所以重要的是評(píng)價(jià)這些多孔微球是否能夠遞送其有效負(fù)載到樹突狀細(xì)胞。雌性C57BL/6小鼠從Janvier購(gòu)買且飼養(yǎng)在微隔離單元的無特異病原體的設(shè)施中。樹突狀細(xì)胞使用改進(jìn)的Inaba方案產(chǎn)生。將2_6個(gè)月的C57BL/6小鼠處死且自其股骨和脛骨中抽出(flush)骨髓。在用ACK裂解緩沖液(BioWhittaker)裂解紅細(xì)胞之后，分別使用Gr_l (Pharmingen)和B220 (Pharmingen)抗體及低毒性兔補(bǔ)體(CedarlaneLaboratories Ltd.)消耗粒細(xì)胞和B細(xì)胞。將細(xì)胞在 175cm2 Falcon管(Becton Dickinson)中在含有10ng/mL IL-4和10ng/mL GM-CSF (兩者都得自P印rotech)的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基(含有5%無LPS的FCS、1%青霉素/鏈霉素、1% L-谷氨酰胺和50μπιβ -巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基)中以2 χ IO5細(xì)胞/ml的密度接種。在培養(yǎng)2天之后和再次在培養(yǎng)4天之后，將非粘附細(xì)胞離心，且重懸于新鮮培養(yǎng)基中并重新鋪板到相同的falcons中。在第6天，將非粘附細(xì)胞除去且加入含有10ng/mL GM-CSF和5ng/mL IL-4的新鮮培養(yǎng)基。在培養(yǎng)的第8天，收集非粘附細(xì)胞且用于實(shí)驗(yàn)。將分化的鼠樹突狀細(xì)胞用負(fù)載0VA-alexa488的多孔微球孵育，接著進(jìn)行共焦顯微術(shù)成像。為了判別微球是否已被樹突狀細(xì)胞內(nèi)化，將細(xì)胞核藍(lán)色熒光物用H0ECHST復(fù)染且將細(xì)胞內(nèi)酸性小泡用LysoTracker染色。作為兩種綠色熒光微球，在同一共焦平面中細(xì)胞核和酸性小泡可見且微球明顯位于細(xì)胞膜的邊界內(nèi)，這可以毫不含糊地推斷出微球已被樹突狀細(xì)胞有效地內(nèi)化且位于細(xì)胞內(nèi)酸性小泡中。實(shí)施例5:評(píng)價(jià)噴霧干燥的甘露糖醇的結(jié)晶度
使用X射線衍射來評(píng)價(jià)相應(yīng)甘露糖醇、甘露糖醇/0VA/DS /PlARG的物理混合物和噴霧干燥的甘露糖醇/0VA/DSA\ARG微球的結(jié)晶度。圖5明顯地說明且證明，在噴霧干燥之后，甘露糖醇以無定形形式獲得。這對(duì)于增強(qiáng)蛋白質(zhì)在噴霧干燥的微粒中的穩(wěn)定性是重要的?？傊?，在此證明了將抗原包封到多孔可降解的聚電解質(zhì)微球中的簡(jiǎn)易方法。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可能在包括最少的過程步驟以及使昂貴抗原和聚電解質(zhì)的浪費(fèi)減至最少的高包封效率下大規(guī)模的生產(chǎn)微球。此外，甘露糖醇保持處于無定形形式，這對(duì)于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性尤其重要。實(shí)施例6:具有卵清蛋白的微粒的制備
水性分散體(1% w/w) 如下制備:在攪拌下混合甘露糖醇、硫酸葡聚糖(DS)和蛋白質(zhì)(例如，卵清蛋白(OVA)作為模型抗原)，接著逐滴加入聚-L-精氨酸(PJRG)以允許在DS、OVA和PlARG之間的靜電復(fù)合。甘露糖醇與0VA、DS和PlARG的比率(w/w)選擇為40:1:4:5。隨后，使用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的噴霧干燥器將該混合物噴霧干燥且作為干燥物收集。在加入水時(shí)，甘露糖醇容易地溶解且穩(wěn)定的微粒仍然由包封共同噴霧干燥的蛋白質(zhì)的聚電解質(zhì)構(gòu)架組成。 實(shí)施例7:噴霧干燥的聚電解質(zhì)微球保持包封蛋白質(zhì)的生物活性
對(duì)于在藥物遞送中應(yīng)用來講，保持包封在聚電解質(zhì)構(gòu)架內(nèi)的蛋白質(zhì)的生物活性極其重要。因此，我們包封了一種酶，即酶辣根過氧化物酶(HRP)而不是抗原并且比較由溶液中游離HRP酶引起的酶催化活性(即，底物轉(zhuǎn)化率)與由水性甘露糖醇/DS/HRPA\ARG分散體產(chǎn)生和由負(fù)載HRP的噴霧干燥的微粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化率。這通過追蹤由于HRP導(dǎo)致的底物ABTS (2，2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)的轉(zhuǎn)化所致的在403nm下UV-VIS吸光度的增加來進(jìn)行:
權(quán)利要求
1.組合物，其包含聚電解質(zhì)復(fù)合物和多元醇，其特征在于所述多元醇呈無定形形式。
2.權(quán)利要求1的組合物,其還包含一種或多種藥物,其中各藥物具有至少1000道爾頓的分子量。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚電解質(zhì)復(fù)合物、所述無定形多元醇和任選所述一種或多種藥物均勻地分配。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚電解質(zhì)復(fù)合物包含陰離子聚電解質(zhì)和陽離子聚電解質(zhì)，其各自獨(dú)立地選自多糖和聚氨基酸。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述多元醇選自甘露糖醇、阿糖醇、海藻糖、山梨糖醇、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、甘油、乳糖醇、丙二醇、聚乙二醇、肌醇、蔗糖及其混合物。
6.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述一種或多種藥物選自氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗原、核酸、核酸前體、反義元件、核苷酸、核苷、抗毒素、疫苗和佐劑。
7.權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的組合物，其中所述無定形多元醇、所述聚電解質(zhì)復(fù)合物和所述藥物以約1000/100/1至約1/100/1000范圍的比率(分別w/w/w)存在。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物呈顆粒形式或?yàn)榉勰?br> 9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述顆粒具有IOOnm-1OOMm的平均直徑。
10.混懸液，其包含權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)的呈顆粒形式的組合物。
11.權(quán)利要求10的混懸液，其中所述混懸液具有雙藥物釋放性質(zhì)。`
12.藥物組合物，其包含權(quán)利要求2-11中任一項(xiàng)的組合物和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述藥物組合物包含藥學(xué)上有效量的所述一種或多種藥物。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述藥物組合物經(jīng)由腸胃外途徑給予。
14.權(quán)利要求12-13中任一項(xiàng)的藥物組合物，其用于細(xì)胞外藥物遞送。
15.權(quán)利要求12-13中任一項(xiàng)的藥物組合物，其用于將一種或多種藥物遞送到吞噬細(xì)胞。
16.權(quán)利要求12-13中任一項(xiàng)的藥物組合物，其用于治療免疫相關(guān)疾病、傳染性疾病、代謝疾病和癌癥。
17.用于制備權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的組合物的方法，所述方法包括: a)制備總固體濃度為約0.1-10%的權(quán)利要求1或2的組合物的水性進(jìn)料， b)噴霧干燥在步驟a)中制備的水性進(jìn)料。
18.顆粒，其可根據(jù)權(quán)利要求17的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含聚電解質(zhì)復(fù)合物和多元醇的組合物，其特征在于所述多元醇呈無定形形式。任選所述組合物還包含一種或多種藥物，其中各藥物具有至少1000道爾頓的分子量。所述組合物可通過噴霧干燥獲得。所述組合物可以顆粒形式制備或作為顆粒的混懸液制備。還提供了用于細(xì)胞外藥物遞送的藥物組合物。還提供了顯示出受控的雙藥物釋放的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61K47/26GK103200933SQ201180051160
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者J.P.雷蒙, B.德格斯特, S.德科克爾, J.格羅滕, C.弗瓦埃特 申請(qǐng)人:根特大學(xué)