專利名稱：重組流感病毒血凝素(ha)抗原蛋白和含其的疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組流感病毒血凝素蛋白和包含重組血凝素蛋白的疫苗。
背景技術：
甲型流感病毒造成上個世紀流感大流行，并且是引起每年暴發(fā)的流感疫情的病原體。據世界衛(wèi)生組織估計，流感疫情每年影響約5-15%的全球人口，每年造成3-500萬重癥病人和50萬人死亡。世衛(wèi)組織流感情況表211。世界衛(wèi)生組織，日內瓦，瑞士(2003年)。甲型流感病毒是正粘病毒家族的成員，具有廣泛的寄主范圍，包括人，馬，狗，鳥和豬。它是一種有包膜的，負鏈RNA病毒，由一組8個RNA片段(縮寫為PB2，PBL, PA，HA, NP，NA，M和NS)組成，編碼至少10個病毒蛋白。HA片段編碼血凝素蛋白(HA)。NA片段編碼神經氨酸酶(NA)。根據血清學分類，迄今已經確定16個HA亞型(標記為H1-HI6)和9個NA亞型(標記為N1-N9)。目前全球在人群中傳播的甲型流感的亞型包括H1N1，H1N2，和H3N2病毒；H5N1和H9N2在鳥類如雞中傳播；H1N1和H3N2病毒在豬群中傳播。目前流感滅活疫苗是三價的，含15微克來自兩個甲型流感(H1N1和H3N2)亞型和一個B型流感毒株的HA。從他們在20世紀40年代引入臨床應用，疫苗生產的基本技術和原則仍然是基本相同的。傳統(tǒng)的智慧都集中在優(yōu)化生產過程，以生產含有最大量HA蛋白的常規(guī)的病毒制備。另外，流感疫苗的標準化完全基于HA含量。隨著同一亞型內的傳播病毒和為疫苗選擇的病毒之間的抗原關聯變得更遙遠，疫苗的功效下降。流感病毒經歷兩種類型的抗原變異，“抗原漂移(antigenic drift)”和“抗原移位(antigenic shift)”?？乖剖切碌牧鞲胁《局甑某掷m(xù)發(fā)生的部分原因，通過在HA和NA基因的突變而與他們的祖先不同。變化的量可能是細微或顯著的?？乖儺惖牡诙愋褪恰翱乖莆弧薄．攦煞N不同的流感病毒共感染同一宿主，交換完整基因組片段時，遺傳移位可能發(fā)生。這可能會導致“重組”病毒，具有一個全新的基因組成，因此具有新特性。在一個病毒亞型直接跨越物種屏障的而沒有在中間宿主重組的情況下，遺傳變異也可能發(fā)生。流感病毒的抗原變異成為每年的流感疫情的發(fā)生和不定期的流行病的主要基礎，使疫苗成分需要不斷的進化。對流感疫苗而言，世衛(wèi)組織現在每年兩次選擇三種病毒株，用于包含在季節(jié)性流感疫苗。雖然選定的毒株通常與流行株的抗原性接近，但是在一些年，他們卻不接近。此外，在近幾年H5N1型禽流感病毒和豬HlNl病毒引起了流感大流行的擔憂。因此，有需要擁有會產生廣譜的保護免疫力的疫苗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個方面提供了重組HA抗原蛋白。在一個實施例中，該重組HA抗原蛋白包括含主要抗原性表位的胞外域，和長螺旋(LH);其中所述長螺旋中存在至少一個選自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)的 2-半胱氨酸微域，，其X代表任意氨基酸；由此，當該重組HA抗原蛋白形成三聚體，所述在LH中的兩個半胱氨酸形成串聯二硫鍵帶，共價地使該三聚體收緊。
在另一個實施例中，所述重組HA抗原蛋白進一步包括近膜螺旋(MPH)，跨膜區(qū)(TMD);和胞質區(qū)(CPD)，其中所述LH，MPH，或TMD中存在至少一個選自CxxC (SEQ ID NO:3)，CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)2 的-半胱氨酸微域，，并且如果 CxxxC(SEQ ID N04)在TMD存在，其中CFLLC被排除，由此，當所述重組HA抗原蛋白形成三聚體，在LH，MPH，或TMD中的兩個半胱氨酸形成串聯二硫鍵帶，共價地使該三聚體收緊。在另一個實施例中，重組HA抗原蛋白中的CPD或TMD來自一個HA蛋白，與提供胞外域和LH的HA蛋白是不一樣的。在另一個實施例中，重組HA抗原蛋白的TMD或CPD是人工合成肽或來自在其自然構象時形成三聚體的非HA蛋白。在另一個實施例中，重組HA抗原蛋白是由DNA序列所編碼的，該DNA序列被克隆到一個的體內表達載體；使重組HA表達載體被用作針對流感病毒感染的DNA疫苗。在另一個實施例中，重組HA抗原蛋白被用作針對流感病毒感染的疫苗。本發(fā)明的另一個方面提供了病毒樣顆粒。在一個實施例中，所述病毒樣顆粒包括重組HA抗原蛋白，其中所述重組HA抗原蛋白包括含有主要抗原表位的胞外域；長螺旋(LH);近膜螺旋(MPH)，跨膜區(qū)(TMD);和胞質區(qū)(0 0);其中所述1^，10^，或了1 中存在至少一個選自 CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID N0:5)的 2-半胱氨酸微域，，其X代表任意氨基酸；并且如果CxxxCXSEQ ID N04)在TMD存在，其中CFLLC被排除；由此，當所述重組HA抗原蛋白形成三聚體，在LH，MPH，或TMD中的兩個半胱氨酸形成串聯二硫鍵帶，共價地使該三聚體收緊。在病毒樣顆粒的另一個實施例中，所述CPD或TMD來自一個HA蛋白，與提供胞外域和LH的HA蛋白是不一樣的。
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在病毒樣顆粒的另一個實施例中，所述TMD或CPD是人工合成肽或來自在其自然構象時形成三聚體的非HA蛋白。在病毒樣顆粒的另一個實施例中，所述病毒樣顆粒被用作針對流感病毒感染的疫苗。本發(fā)明的另一個方面提供了重組流感病毒，在一個實施例中，所述重組流感病毒包括重組HA抗原蛋白，其中所述重組HA抗原蛋白包括含有主要抗原表位的胞外域；長螺旋(LH);近膜螺旋(MPH)，跨膜區(qū)(TMD);和胞質區(qū)(CPD);其中所述LH，MPH，或TMD中存在至少一個選自 CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其X代表任意氨基酸；并且如果CxxxC (SEQ ID N04)在TMD存在，其中CFLLC被排除；由此，當所述重組HA抗原蛋白形成三聚體，在LH，MPH，或TMD中的兩個半胱氨酸形成串聯二硫鍵帶，共價地使該三聚體收緊。在重組流感病毒的另一個實施例中，所述CPD或TMD來自一個HA蛋白，與提供胞外結構域和LH的HA蛋白是不一樣的。在重組流感病毒的另一個實施例中，所述TMD或CPD是人工合成肽或來自在其自然構象時形成三聚體的非HA蛋白質。在另一個實施例中，所述重組流感病毒被用作針對流感病毒感染的疫苗。在進一步的實施例中，該疫苗是由減毒的重組流感病毒組成。在又一實施例中，該疫苗是由滅活病毒顆粒組成，來自所述重組流感病毒的病毒制備。
本發(fā)明的目標和優(yōu)點從下面的詳細描述的優(yōu)選實施例與附圖中變得顯而易見。


根據本發(fā)明的優(yōu)選實施例現在將參照附圖加以描述，其中相同的參考標號表示相同的元件。圖1是HA蛋白的一個功能域的域框圖，其中標記的為有關功能域。
具體實施例方式可以通過引用以下的本發(fā)明的某些實施例的詳細描述而更容易地理解本發(fā)明。在本申請中，為了更充分地描述本發(fā)明所涉及領域狀態(tài)，當出版物被引用，這些出版物的公開內容的全部經引用而并入本申請。除非另有說明，在本發(fā)明的實踐將采用分子生物學(包括重組技術)，微生物學，細胞生物學，生物化學，核酸化學和免疫學的現有技術，這些是在本領域的技能之內。這些技術在文獻中已有完全解釋，如分子克隆:實驗室說明書，第三版(Sambrook和Russel, 2001年)；動物細胞培養(yǎng)(RI Freshmey主編，1987年版);分子生物學當代程序(FM Ausubel等主編，1987年，包括補充至2001年)；免疫學當代程序(JE Coligan等主編，1991年);免疫分析手冊“(D.Wild主編，斯托克頓出版社，紐約，1994年)；免疫學分析方法(R.MaSSeyefT，WH Albert 和 NA Staines 等主編，Weinheim:VCH VERLAGS GESELLSCHAFT MBH，1993 年)。流感病毒的表面有兩種抗原，血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)，其中HA被認為是主要抗原。HA具有16個亞型(H1-HI6)，它們的編碼序列和氨基酸序列是多種多樣的。在這里，一個示例性的HA (H3)，示于SEQ ID NO:1 (編碼序列)和SEQ ID N02 (氨基酸序列)，其中示于SEQ ID N02 的氨基酸序列包含17個氨基酸的信號肽，因此，所有下面的描述所采用的編號系統(tǒng)中，氨基酸18被編號為I。HA最初翻譯成一個單分子HAO，然后HO由蛋白酶裂解成HAl區(qū)(氨基酸1-328)和HA2 (329-549)，其中HAl和HA2由一個鏈間二硫鍵而共價相連。HAl包含了大部分的，如果不是全部的，抗原表位，HA2包含融合肽，長螺旋(LH)(氨基酸405-458)，近膜螺旋(MPH)(氨基酸 492-511)，跨膜區(qū)(TMD) (AA512-538)和胞質區(qū)(CPD) (AA539-549)。在 HA 分子上的功能域圖如圖1所示，其中只標注相關結構域包括HA1，LH, MPH, TMD, CPD的標記。雖然它們的DNA序列各不相同，但是其結構有著相似的域。HA具有三聚體結構，像纖突樣突出在病毒表面。普遍認為，LH, MPHJP TMD負責HA三聚體結構的形成和穩(wěn)定。另外，LH參與形成穩(wěn)定三聚體的三重鏈盤繞的線圈；它可以解釋為什么在被刪除跨膜和胞質區(qū)后，HA保持其三聚體構象。應當注意的是，盡管裂解對病毒感染是關鍵的，但是HAl和HA2可以作為一個沒有裂解的單一的多肽，被用作疫苗中的抗原或其他功能。以往的研究表明，從自然感染的患者或免疫小鼠得到的單克隆抗體，可以與不同亞型的流感病毒交叉反應；例如，從一個免疫了季節(jié)性流感疫苗的人得到的單克隆抗體能與HI，H5和H9交叉反應。大部分的交叉反應的單克隆抗體是針對HA的莖干區(qū)的，但在2011年，臨時申請?zhí)峤缓?，一個單克隆抗體顯示結合到HA的受體結合區(qū)域。所有這些研究提示，三聚體HA確實包含一些抗原表位，被大部分甚至是所有A型流感病毒所共享；不幸的是，通過用目前季節(jié)性疫苗免疫或自然感染所產生的針對共享的抗原表位的交叉反應抗體太低，不能針對抗原變異株提供任何有意義的保護，更遑論大流行毒株。如果流感疫苗能夠誘導足夠的針對共享抗原表位的交叉反應抗體，它會提供針對亞型間的(inter-subtypic)或亞型內的(intra-subtypic)的變異株的交叉保護(通用疫苗)。然而，面臨的挑戰(zhàn)是我們如何可以操縱(即HA抗原)來實現這一目標。本發(fā)明假設，在免疫或感染的主體中的交叉反應抗體的缺乏可能是在目前的疫苗中或感染過程中，只有較少的共享抗原表位存在；更進一步地，在目前疫苗中存在較少共享抗原表位的原因是，自然HA結構，特別是Hl，H5和H9，沒有提供足夠的穩(wěn)定性，來維持共享抗原表位。因此，如果HA結構的穩(wěn)定性可以提高，合理的期望是共享抗原表位的存在的增加。然而，面臨的挑戰(zhàn)是如何穩(wěn)定HA結構。在我們的日常生活中，一束平行的材料如竹子和干草被腰帶收緊?，F在的問題是HA是否包含任何并行結構束，進一步是如果此結構束是存在的，任何腰帶是否可以引入到HA的并行結構束。對于第一個問題，本發(fā)明分析如上所述的HA結構。HA2包含至少三個螺旋(S卩，LH，MPH和TMD);多肽螺旋具有圓柱形的構象，因此，在LH，MPH和TMD的每一個螺旋在HA三聚體內形成三個平行螺旋的束；它提供了物理基礎，用于引入一個或多個腰帶，共價地連接所有三個HA單體。對于第二個問題，本發(fā)明記得，兩個多肽之間可以形成由兩個半胱氨酸形成的二硫鍵(S-S);例如，HAl和HA2通過二硫鍵共價連接，IgG是一個由多個肽間的二硫鍵連接的同型二聚體。然而，一個半胱氨酸出現在HA三聚體中三個單體的每一個單體的對應的位置上，將允許形成一個二硫鍵，但剩下一個自由的SH基團。更關鍵的是，沒有環(huán)形腰帶圍繞三個HA單體形成。為了形成一個環(huán)形腰帶，本發(fā)明探討它是否可行的去引入一對半胱氨酸到每一單體，因此在三個單體之間形成串聯的三個二硫鍵。如已知的，在一個螺旋中的每匝包含3.6個氨基酸，其中的間距(每匝前進)是0.54nm，而上升(每個氨基酸殘基前進)是0.15nm。對于一個由兩個半胱氨酸形成的二硫鍵，中心之間的距離是0.849nm(2 個 c-c 鍵(每鍵 0.154nm)，l 個 c-s 鍵(每鍵 0.17nm)，和一個 s_s 鍵(0.201nm))。0.849nm的距離大約是1.57倍間距或5.66個氨基酸；這意味著，如果兩個半胱氨酸沒有由4個以上的氨基酸隔開，二硫鍵可以在兩個螺旋之間形成。本發(fā)明發(fā)現，引入至少一對半胱氨酸到HA的LH，MPH和/或TMD能增加交叉反應的免疫應答；做出的引入是基于這樣的假定，半胱氨酸對可能圍繞三聚體的HA 結構形成二硫鍵帶，更緊地抓住HA三聚體。盡管由于缺乏手段，穩(wěn)定性的改變并沒有被實際測量，但是增加交叉反應免疫應答的最終結果證明了這個假定的正確性。本發(fā)明提供了引入至少一對半胱氨酸到HA的螺旋區(qū)域(LH，MPH和TMD)，形成三個 2-半胱氨酸微域之一((CxxC (SEQ ID NO:3) ;CxxxC (SEQ ID NO:4) ;CxxxxC (SEQID NO:5)，使在三個單體之間形成一個串聯二硫鍵帶，其中在微域的’X’是任何氨基酸，只要他們不打破螺旋結構，優(yōu)選地在人工創(chuàng)造的微域中是A，L，M，F，E，Q，H，K和R。說明性地，三種單體之間的三個二硫鍵(單體I有ICl和1C2，單體2有2C1和2C2，單體3有3C1和3C2)是1C1-2C2，2C1-3C2，和3C1-1C2。此串聯二硫鍵帶緊緊地把三個單體抓在一起，形成一個高度穩(wěn)定的三聚體。此發(fā)現是具有重要的意義，因為任何由HA代表的三聚體蛋白質可被改變，以包括至少一個2-半胱氨酸微域，因此三聚體結構通過共價鍵帶被穩(wěn)定。當此類HA以重組蛋白，VLP或病毒的形式作為抗原被用于疫苗，該疫苗將誘導增強的亞型內的(intra-subtypic)或亞型間的(inter-subtypic)免疫應答。這是令人驚訝地注意至IJ，在NCBI的蛋白數據庫中搜索任何2-半胱氨酸微域的存在發(fā)現一個2-半胱氨酸微域(CFLLC)，屬于 CxxxC (SEQ ID NO:4)，出現在 H3HA 的 TMD。H1-H5 和 H7-H16 不包含任何2-半胱氨酸微域。保守的H1-HI6的TMD的氨基酸序列由SEQ ID N06-21分別代表，并總結在表I中，其中半胱氨酸被突出顯示。表I。H1-H16的TM和CP域的示例性序列

權利要求
1.重組血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:包括: 含有主要抗原表位的胞外域；和 長螺旋(LH);其中在所述LH中存在至少一個選自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQID NO:4)或CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸； 從而當所述重組HA抗原蛋白形成三聚體，在LH中兩個半胱氨酸形成一個串聯二硫鍵帶，共價鍵地收緊三聚體。
2.如權利要求1所述重組血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:進一步包括:近膜螺旋(MPH);跨膜區(qū)(TMD);和胞質區(qū)(CPD);所述LH，MPH或TMD中存在至少一個選自CxxC(SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ ID NO:4)或 CxxxxC (SEQ ID NO:5)的 2-半胱氨酸微域，并且其中如果CxxxC (SEQ ID NO:4)是呈現在TMD中，CFLLC被排除；從而當重組HA抗原蛋白形成三聚體，在LH，MPH或TMD中的兩個半胱氨酸形成一個串聯二硫鍵帶，共價鍵地收緊三聚體。
3.根據權利要求2所述重組血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述TMD或CPD是來自和提供胞外域和LH的HA蛋白不一樣的HA蛋白。
4.根據權利要求2所述重組血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或來自在其自然構象時形成三聚體的非HA蛋白質。
5.根據權利要求1所述重組血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述重組HA抗原蛋白是被DNA序列所編碼的，該DNA序列被克隆到一個體內表達載體；因此重組HA表達載體被用作針對流感病毒感染的DNA疫苗。
6.根據權利要求2所述重組血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述重組HA抗原蛋白是被DNA序列所編碼的，該DNA序列被克隆到一個體內表達載體；因此重組HA表達載體被用作針對流感病毒感染的DNA疫苗。
7.根據權利要求1所述重組血凝素(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述重組HA抗原蛋白被用于針對流感病毒感染的疫苗。
8.根據權利要求2所述重組血凝集(HA)抗原蛋白，其特征在于:其中所述重組HA抗原蛋白被用于針對流感病毒感染的疫苗。
9.病毒樣顆粒，其特征在于:其包括: 重組血凝素(HA)抗原蛋白，其中所述重組HA抗原蛋白包括: 含有主要抗原表位的胞外域；長螺旋(LH); 近膜螺旋(MPH); 跨膜區(qū)(TMD);和 胞質區(qū)(CPD); 其中在所述LH，MPH或TMD中存在至少一個選自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ IDNO:4)或CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸；并且其中如果CxxxC (SEQ ID NO:4)是呈現在TMD中，CFLLC被排除; 從而當所述重組HA抗原蛋白形成三聚體，在LH，MPH或TMD中的兩個半胱氨酸形成一個串聯二硫鍵帶，共價鍵地收緊三聚體。
10.根據權利要求9所述病毒樣顆粒，其特征在于:其中所述TMD或CPD來自和提供胞外域和LH的HA蛋白不一樣的HA蛋白。
11.根據權利要求9所述病毒樣顆粒，其特征在于:其中所述TMD或(PD是人工合成的肽或來自在其自然構象時形成三聚體的非HA蛋白質。
12.根據權利要求9所述病毒樣顆粒，其特征在于:其中所述病毒樣顆粒用于針對流感病毒感染的疫苗。
13.重組流感病毒，其特征在于:包括: 重組血凝素(HA)抗原蛋白，其中所述重組HA抗原蛋白包括: 含有主要的抗原表位的胞外域；長螺旋(LH); 近膜螺旋(MPH); 跨膜區(qū)(TMD);和 胞質區(qū)(CPD); 其中在所述LH，MPH或TMD中存在至少一個選自CxxC (SEQ ID NO:3), CxxxC (SEQ IDNO:4)或CxxxxC (SEQ ID NO:5)的2-半胱氨酸微域，其中x表示任意氨基酸；并且其中如果CxxxC (SEQ ID NO:4)是要呈現在TMD中，CFLLC被排除; 從而當所述重組HA抗原蛋白形成三聚體，在LH，MPH或TMD中的兩個半胱氨酸形成一個串聯二硫鍵帶，共價鍵地收緊三聚體。
14.根據權利要求13所述重組流感病毒，其特征在于:其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或來自在其自然構象時形成三聚體的非HA蛋白質。
15.根據權利要 求13所述重組流感病毒，其特征在于:其中所述TMD或CPD是人工合成的肽或來自在其自然構象時形成三聚體的非HA蛋白質。
16.根據權利要求13所述重組流感病毒，其特征在于:其中所述重組流感病毒用于針對流感病毒感染的疫苗。
17.根據權利要求16所述重組流感病毒，其特征在于:其中所述疫苗減毒重組流感病毒。
18.根據權利要求16所述重組流感病毒，其特征在于:其中所述疫苗包括來自所述重組流感病毒的病毒制備的滅活病毒顆粒。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組的血凝素抗原蛋白，病毒樣顆粒和重組流感病毒。本發(fā)明進一步提供了一種疫苗，它含有重組血凝素抗原蛋白質，病毒樣顆?；蛑亟M流感病毒。
文檔編號A61P31/16GK103209990SQ201180052182
公開日2013年7月17日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權日2010年10月30日
發(fā)明者劉大才 申請人:劉大才