專(zhuān)利名稱(chēng)：病毒疫苗以及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括一種從含有富集的感染性顆粒亞群的病毒制備而獲得的病毒抗原的病毒疫苗，并進(jìn)一步涉及其制備工藝。
背景技術(shù)：
可怕的感染性病毒，如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)，流感病毒，登革熱病毒(DENV)，和口蹄疫病毒(FMDV)，仍然對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物引起嚴(yán)重后果。疫苗被認(rèn)為是用于預(yù)防和治療病毒感染的最有效和經(jīng)濟(jì)的手段。不幸的是，病毒如HIV，流感病毒，DENV, FMDV，包含許多血清型(即亞型)，并進(jìn)行快速的抗原變化；這些使得生產(chǎn)具有亞型間(inter-subtypic)和/或亞型內(nèi)(intra-subtypic)交叉保護(hù)的有效疫苗成為嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。甲型流感病毒造成上個(gè)世紀(jì)流感大流行，并且是引起每年暴發(fā)的流感疫情的病原體。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，流感疫情每年影響約5-15%的全球人口，每年造成3-5百萬(wàn)重癥病人和50萬(wàn)人死亡。世衛(wèi)組織流感情況表211。世界衛(wèi)生組織，日內(nèi)瓦，瑞士(2003年)。甲型流感病毒是正粘病毒家族的成員，具有廣泛的宿主范圍，包括人，馬，狗，鳥(niǎo)和豬。它是一種有包膜的，負(fù)鏈RNA病毒，由一組8個(gè)RNA片段(縮寫(xiě)為PB2，PBL, PA，HA, NP，NA，M和NS)組成，編碼至少10個(gè)病毒蛋白。HA片段編碼血凝素蛋白(HA)。NA片段編碼神經(jīng)氨酸酶(NA)。根據(jù)血清學(xué)分類(lèi)，迄今已經(jīng)確定16個(gè)HA亞型(標(biāo)記為H1-HI6)和9個(gè)NA亞型(標(biāo)記為N1-N9)。目前全球在人群中傳播的甲型流感的亞型包括H1N1，H1N2，和H3N2病毒；H5N1和H9N2在鳥(niǎo)類(lèi)如雞中傳播；H1N1和H3N2病毒在豬群中傳播。目前流感滅活疫苗是三價(jià)的，含15微克來(lái)自兩個(gè)甲型流感(H1N1和H3N2)亞型和一個(gè)B型流感毒株的HA。從他們?cè)?0世紀(jì)40年代引入臨床應(yīng)用，疫苗生產(chǎn)的基本技術(shù)和原則仍然是基本相同的。傳統(tǒng)的智慧都集中在優(yōu)化生產(chǎn)過(guò)程，以生產(chǎn)含有最大量HA蛋白的常規(guī)病毒制備。另外，流感疫苗的標(biāo)準(zhǔn)化完全基于HA含量。隨著同一亞型內(nèi)的傳播病毒和為疫苗選擇的病毒之間的抗原關(guān)聯(lián)變得更遙遠(yuǎn)，疫苗的功效下降。對(duì)流感疫苗而言，世衛(wèi)組織每年兩次選育用于每年的季節(jié)性流感疫苗的三種病毒株。雖然選定的毒株通常與流行株抗原性相近，但是在一些年里，他們的抗原性不相近。因此，有必要生產(chǎn)能產(chǎn)生廣譜保護(hù)免疫力的疫苗。對(duì)于HIV-1，目前已經(jīng)有3千3百萬(wàn)感染者，每一個(gè)藏有很大陣列的HIV-1準(zhǔn)種，這將導(dǎo)致在一個(gè)在人群中同時(shí)接種并傳播的巨大數(shù)字的變種。針對(duì)這個(gè)龐大陣列的潛在感染株來(lái)提供保護(hù)，是一個(gè)在疫苗研制方面的前所未有的挑戰(zhàn)。令人驚訝的是，傳統(tǒng)的化學(xué)滅活或活減毒的疫苗方法沒(méi)有產(chǎn)生廣譜的保護(hù)或安全的HIV-1疫苗。FMDV感染用于食品生產(chǎn)的動(dòng)物，如牛，綿羊，山羊，和豬。FMDV是一個(gè)非包膜病毒，二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑約30nm，在體外極其不穩(wěn)定。病毒滅活疫苗的功效高度依賴于病毒的完整性。140S定量蔗糖密度梯度分析是量化病毒抗原的推薦方法，并在此基礎(chǔ)上，制定疫苗。然而，完全基于140S量制定的口蹄疫病毒疫苗在生產(chǎn)中經(jīng)常失敗。登革熱病毒(DENV)有四個(gè)血清型，引起登革熱。 它是一個(gè)單一的正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科。其基因組約11000個(gè)堿基，編碼三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，衣殼蛋白C，膜蛋白M，包膜蛋白E;七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，NSl，NS2A,NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5。這種病毒的核苷酸替換率達(dá)到6.5X1 O^4每核苷酸每年，類(lèi)似其他RNA病毒的速度。目前沒(méi)有疫苗可用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種疫苗，能夠針對(duì)一種病毒產(chǎn)生至少部分的亞型間(inter-subtypic)或亞型內(nèi)(intra-subtypic)的交叉免疫力。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種疫苗。在一個(gè)實(shí)施例中，該疫苗包括一個(gè)病毒疫苗株的病毒抗原，其中所述病毒抗原來(lái)自病毒疫苗株的一個(gè)病毒制備，其中所述病毒疫苗株的病毒制備包含一個(gè)感染性病毒顆粒亞群，并且所述感染性病毒顆粒亞群表示為在所述病毒制備的總病毒顆粒或總病毒抗原中所占的比例；及其中所述感染性病毒顆粒亞群在所述病毒制備的總病毒顆?；蚩偛《究乖兴嫉谋壤^(guò)一個(gè)預(yù)定閾值；因此，該疫苗提供針對(duì)與疫苗株不同的病毒株的至少部分的亞型間(inter-subtypic)或亞型內(nèi)(intra-subtypic)的交叉免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用于生產(chǎn)疫苗的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括提供一個(gè)病毒疫苗株的病毒制備，其中所述病毒疫苗株的病毒制備含有感染性病毒顆粒亞群，并且所述感染性病毒顆粒亞群表示為在所述病毒制備的總病毒顆?；蚩偛《究乖兴嫉谋壤?；及其中所述感染性病毒顆粒亞群在所述病毒制備的總病毒顆粒或總病毒抗原中所占的比例超過(guò)一個(gè)預(yù)定閾值；從所述病毒制備獲得一個(gè)病毒抗原；和將所述病毒抗原與一種生理上可接受的佐劑混合，制得疫苗，從而該疫苗提供針對(duì)與疫苗株不同的病毒株的至少部分的亞型間(inter-subtypic)或亞型內(nèi)(intra-subtypic)的交叉免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于免疫受試者的疫苗使用，其中所述疫苗針對(duì)一種病毒產(chǎn)生至少部分的亞型間(inter-subtypic)或亞型內(nèi)(intra-subtypic)的交叉免疫力，以預(yù)防或治療病毒感染。
具體實(shí)施方式
`可以通過(guò)引用以下的本發(fā)明的某些實(shí)施例的詳細(xì)描述而更容易地理解本發(fā)明。在本申請(qǐng)中，為了更充分地描述本發(fā)明所涉及領(lǐng)域狀態(tài)，當(dāng)出版物被引用，這些出版物的公開(kāi)內(nèi)容的全部經(jīng)引用而并入本申請(qǐng)。除非另有說(shuō)明，在本發(fā)明的實(shí)踐將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)，核酸化學(xué)和免疫學(xué)的現(xiàn)有技術(shù)，這些是在本領(lǐng)域的技能之內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有完全解釋?zhuān)绶肿涌寺?實(shí)驗(yàn)室說(shuō)明書(shū)，第三版(Sambrook和Russel, 2001年)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(RI Freshmey主編，1987年版);分子生物學(xué)當(dāng)代程序(FM Ausubel等主編，1987年，包括補(bǔ)充至2001年);免疫學(xué)當(dāng)代程序(JE Coligan等主編，1991年);免疫分析手冊(cè)“(D.Wild主編，斯托克頓出版社，紐約，1994年)；免疫學(xué)分析方法(R.MaSSeyefT，WH Albert 和 NA Staines 等主編，Weinheim:VCH VERLAGS GESELLSCHAFT MBH，1993 年)。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，因此病毒制備可以通過(guò)在例如雞胚，體外組織，和培養(yǎng)細(xì)胞中增殖病毒來(lái)生產(chǎn)。例如，流感病毒在雞胚和Vero細(xì)胞中增殖，用于生產(chǎn)流感疫苗；FMDV在BHK-21細(xì)胞中增殖，用于生產(chǎn)FMDV疫苗。根據(jù)目前疫苗生產(chǎn)的教條，用于疫苗生產(chǎn)的流感病毒制備在他們血凝分析上HA效價(jià)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，用于疫苗生產(chǎn)的FMDV制備在其TCID50滴度的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化。HA滴度表示所有病毒粒子亞群的量，不考慮任何特定亞群的比例JCID5tl滴度僅代表感染性病毒顆粒亞群，而不考慮其在所有病毒粒子亞群中的比例。眾所周知，一個(gè)病毒制備包含所有病毒顆粒亞群，例如感染性病毒顆粒的亞群和非感染性病毒顆粒亞群。在追求生產(chǎn)具有針對(duì)亞型間(Inter-subtypic)或亞型內(nèi)(Intra-subtypic)毒株的廣譜免疫力的病毒疫苗中，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，感染性病毒顆粒亞群在一個(gè)病毒制備中的比例是至關(guān)重要的，用于生產(chǎn)能產(chǎn)生廣譜免疫力的疫苗，和進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)感染性病毒顆粒亞群在一個(gè)病毒制備中的比例可以通過(guò)例如優(yōu)化培養(yǎng)條件來(lái)增加。本發(fā)明對(duì)為什么目前流感和FMDV疫苗不誘導(dǎo)亞型內(nèi)(Intra-subtypic)或亞型間(Inter-subtypic)的交叉免疫力，以及為什么沒(méi)有HIV或登革熱疫苗，提供至少部分解釋。更重要的是，本發(fā)明提供了一條原則，用于生產(chǎn)病毒疫苗，其能夠誘導(dǎo)針對(duì)任何病毒感染的廣譜的亞型內(nèi)(Intra-subtypic)或亞型間(Inter-subtypic)的的交叉免疫力。本發(fā)明提供病毒疫苗，其包括一個(gè)得至于感染性病毒顆粒亞群占一個(gè)比例的病毒制備的病毒抗原，其中該比例是高于一個(gè)預(yù)定的值，每種病毒的比例預(yù)定值是特定的。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于制造此種疫苗的方法。在病毒的增殖中，同時(shí)產(chǎn)生感染性和非感染性的病毒顆粒,其中感染性顆粒指這些顆粒，其可以例如在基于細(xì)胞的空斑形成實(shí)驗(yàn)中形成空斑(即，空斑形成顆粒)或?qū)е翪PE或感染宿主時(shí)引起臨床癥狀，非感染性顆粒指不能完成感染性顆粒的感染性功能的顆粒。此外，許多病毒片段和可溶性抗原同樣在病毒增殖過(guò)程中產(chǎn)生。在本發(fā)明原則的最簡(jiǎn)單的應(yīng)用中，測(cè)量病毒制備的兩個(gè)參數(shù)，一個(gè)為感染性病毒顆粒亞群(例如表示為空斑形成單位(PFU)，TCID50，EID50，LD50),另一個(gè)為總病毒顆粒(例如表示為HA滴度)或總病毒抗原(例如表示為ELISA讀數(shù)，Western印跡強(qiáng)度)，然后基于這兩個(gè)參數(shù)來(lái)計(jì)算感染性病毒顆粒亞群在病毒制備中的比例 。在實(shí)踐中，比例可以是任意值，只要當(dāng)多個(gè)病毒制備被比較時(shí)，該值可以被用來(lái)顯示感染性病毒顆粒亞群的比例的差異。這是唯一為了方便起見(jiàn)。如果條件許可，每個(gè)參數(shù)的絕對(duì)值都可以使用。感染性病毒顆粒亞群在病毒備中的比例是受操控的，例如，不同的培養(yǎng)條件，分離和提純。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)疫苗株，不同的接種劑量(例如，同樣原料的不同稀釋度)和不同培養(yǎng)時(shí)間段(比如，接種后24，36，48，72小時(shí))用于病毒增殖，找出在所得病毒原料中產(chǎn)生最佳(例如，最高)感染性顆粒群的劑量和培養(yǎng)時(shí)間段，其中所得到的病毒原料用于制備疫苗或須進(jìn)一步處理(例如，純化，部分裂解)。在另一個(gè)實(shí)施例中，增殖后的病毒原料經(jīng)物理分離(例如，梯度離心法)，以便獲得一小部分的病毒，它包含較高的感染性顆粒群。要注意的是，當(dāng)初步研究已經(jīng)確定在活病毒的病毒庫(kù)被分離下含有較高的感染性顆粒群的部分，物理分離可以在病毒滅活后做，以盡量減少生物危害。在另一個(gè)實(shí)施例中，含有來(lái)自最佳增殖的最佳感染性顆粒群的病毒原料經(jīng)進(jìn)一步的物理分離，使感染性顆粒群進(jìn)一步增加或豐富。顯然，可以在一定程度上提純感染性顆粒的任何過(guò)程都適合用于本發(fā)明。用于本發(fā)明的疫苗和藥物組合物的病毒抗原中的感染性顆粒的富集增強(qiáng)交叉保護(hù)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。在不希望被任何特定理論所約束，本發(fā)明的理由在于:1)在病毒生產(chǎn)中，病毒顆粒由感染性和非感染性顆粒組成，其中感染性顆粒必須包含具有為了成功感染的合適的受體結(jié)合表位的表面抗原，而非感染性顆粒可能會(huì)缺乏這類(lèi)抗原；盡管在任何用于目前疫苗制造的病毒制備中，沒(méi)有感染性顆粒的數(shù)據(jù)可用，我們的實(shí)驗(yàn)表明，從普通增殖條件(即高稀釋度的接種劑量(100-10000稀釋)和長(zhǎng)培養(yǎng)期(48-72小時(shí)))所得到的流感病毒的病毒原料，在總的病毒顆粒中含有低百分比(小于1%)的感染性顆粒；2)—個(gè)特定的病毒的細(xì)胞表面受體全然不發(fā)生變異或很少發(fā)生變異，這意味著，特定病毒例如流感病毒的不同亞型或血清型在其受體結(jié)合分子(即，表面抗原)應(yīng)具有相同或基本相似的受體結(jié)合表位或域；表面抗原上的合適受體結(jié)合表位，更可能被一個(gè)特定病毒之內(nèi)的不同亞型或血清型的感染性顆粒所共享。因此，目前疫苗的交叉保護(hù)的缺乏或無(wú)效可能是針對(duì)特異受體結(jié)合的抗原表位或域 的抗體不足，因?yàn)榇嬖谟诳偛《究乖械男“俜直鹊母腥拘灶w粒上的受體結(jié)合表位或域可能被宿主的免疫系統(tǒng)所忽略。此外，如果增加感染性顆粒的百分比，它期望增加在總病毒抗原中合適受體結(jié)合決定簇或域的存在；當(dāng)合適受體結(jié)合抗原表位或域的數(shù)目達(dá)到一個(gè)點(diǎn)，誘導(dǎo)足夠的針對(duì)受體結(jié)合抗原表位或域的特異抗體反應(yīng)，以便與不同的亞型或血清型作用，導(dǎo)致交叉保護(hù)。用于增加病毒制備中的感染性顆粒的含量的方法包括任何合適的方法。例如，合適病毒制備的選擇可以通過(guò)用不同稀釋度的種子病毒接種雞胚或細(xì)胞，然后培養(yǎng)不同的時(shí)間段，然后測(cè)定總病毒抗原(例如，對(duì)A型流感病毒而言，血凝法或HA蛋白質(zhì)含量)和傳染性顆粒(例如，對(duì)A型流感病毒而言，細(xì)胞空斑法)，然后確定條件來(lái)生產(chǎn)合適病毒制備。另外，有理由相信感染性顆粒在物理上不同于其他顆?；蛘卟煌暾w?；蚩扇苄钥乖?；因此有可能將感染性顆粒與病毒制備的其余部分分離，以獲得用于疫苗的含有感染性顆粒較高量的病毒制備。理想的情況是，感染性顆?？梢蕴禺惖嘏c病毒制備的其余部分分離。例如，感染顆粒的密度可以是特殊的，所以，可以使用梯度超離心以獲得感染性顆粒富集的級(jí)分。顯而易見(jiàn)的是，可以通過(guò)組合兩種或兩種以上的方法來(lái)獲得最佳的病毒制備。如本文所用，“疫苗”指抗原制備，用于在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。疫苗可以有一個(gè)以上的抗原性成分。如本文所用，“非蛋白載體”指不是蛋白質(zhì)的載體，并且可以用于實(shí)現(xiàn)流感矩陣和/或核蛋白的多聚體顯示。“佐劑”是指一種物質(zhì)，其當(dāng)添加到如抗原的免疫性試劑中，在接觸到此混合物的個(gè)體中非特異性地增強(qiáng)或加強(qiáng)對(duì)免疫性試劑的免疫反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“微載體”指的是顆粒組合物，不溶于水，并具有小于約150，120或100微米的大小，更常用的是小于約50-60微米，并且可以小于約10微米或甚至小于約5微米。微載體包括“納米載體”，這是具有的尺寸小于約I微米的，優(yōu)選小于約500nm的，微載體。微載體包括固相顆粒如從生物相容性的天然聚合物，合成聚合物或合成的共聚物形成的顆粒，雖然瓊脂糖或交聯(lián)瓊脂糖形成的微載體可以被包括在或排除出此處微載體的定義，以及其他領(lǐng)域中已知的生物降解材料?！皞€(gè)體”或“受試者”指脊椎動(dòng)物，如禽類(lèi)，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)。哺乳動(dòng)物包括，但不限于，人類(lèi)，非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，運(yùn)動(dòng)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠和大鼠)和寵物。一種物質(zhì)的“有效量”或“足量”指一個(gè)量，足以實(shí)現(xiàn)所希望的生物學(xué)效應(yīng)，如有益的結(jié)果，包括臨床結(jié)果，因此，“有效量”取決于物質(zhì)被應(yīng)用的環(huán)境。在本發(fā)明的范圍中，包含期望抗原的組合物的有效量的一個(gè)例子，是足夠在個(gè)體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量。有效量可以給予一次或多次?！按碳ぁ泵庖邞?yīng)答，如體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，指應(yīng)答的增加，可能來(lái)自引發(fā)和/或增強(qiáng)應(yīng)答。如本文所用，以及在本領(lǐng)域中所熟知，“治療”是一種方法，用于獲得有益的或預(yù)期的結(jié)果，包括臨床結(jié)果。對(duì)于本發(fā)明的目的，有益的或預(yù)期的臨床效果包括，但不限于，改善或緩解一種或多種癥狀，縮小感染程度，穩(wěn)定(即，不惡化)感染狀態(tài)，減輕或改善感染狀態(tài)，并消失(部分或全部)，是否檢測(cè)或檢測(cè)不到?！爸委煛币部梢砸馕吨娱L(zhǎng)存活，相比于如果不接受治療的預(yù)期生存期。根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物的“劑量”，指疫苗組合物在一個(gè)特定的時(shí)間點(diǎn)給藥的量。“劑量”也可以是疫苗組合物的量，通過(guò)使用的緩釋制劑和/或裝置逐漸給藥給動(dòng)物。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，兩個(gè)或更多個(gè)疫苗組合物的劑量在不同的時(shí)間點(diǎn)給予動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明，流感病毒(例如，滅活流感病毒)的“免疫有效量”是流感病毒的量(通常在血細(xì)胞凝集單位或“HA單元”表示),這將在處理過(guò)的動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)后續(xù)的禽流感病毒的毒力株的攻擊的完全或部分免疫力。完全或部分免疫力，可以通過(guò)觀察評(píng)估，定量或定性，在禽流感病毒的毒力株的攻擊后比較在接種疫苗的和未接種疫苗的動(dòng)物上流感病毒感染的臨床癥狀。當(dāng)接種疫苗的動(dòng)物遭受攻擊后，與在未接種疫苗的動(dòng)物遭受類(lèi)似或相同的攻擊后相比，觀察到的流感病毒感染的臨床癥狀被減少，減輕或消除，給予免疫動(dòng)物的流感病毒的量被視為“免疫有效量”?！敖徊姹Ｗo(hù)免疫應(yīng)答”指防止毒株感染，其與用來(lái)引起的應(yīng)答的毒株是不相同的；“交叉保護(hù)免疫應(yīng)答”可能是亞型間(inter-subtypic)或亞型內(nèi)(intra-subtypic)。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有的含義，與本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。確定HA單位方 法在本領(lǐng)域中是已知的。如本文所用，單位被定義為含流感病毒樣品與紅細(xì)胞結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致可見(jiàn)血凝的最高稀釋度的倒數(shù)。病毒包括，但不限于，流感病毒，HIVs, FDMV,登革熱病毒，丙肝病毒，埃博拉病毒，麻疹病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒，或任何病毒，其抗原表位在循環(huán)流行株中持續(xù)改變。這類(lèi)病毒可包括，但不限于，副粘病毒(仙臺(tái)病毒，副流感病毒，腮腺炎，新城疫病毒)，麻疹病毒屬(麻疹病毒，犬瘟熱病毒，牛瘟病毒)；肺病毒(呼吸道合胞病毒，牛呼吸道病毒)；rhabdo病毒(水泡性口炎病毒和狂犬病病毒)。流感病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物的制造方法在本領(lǐng)域中是已知的。病毒可在哺乳動(dòng)物，鳥(niǎo)類(lèi)，或人源細(xì)胞中生長(zhǎng)，如Madin Darby犬腎(MDCK)，Vero細(xì)胞，MDBK, CLDK, EBX或PERC6細(xì)胞。對(duì)于口蹄疫病毒，BHK-21細(xì)胞是合適的。病毒抗原的劑量在0.1和60微克之間，優(yōu)選地在3和30微克之間，和最優(yōu)選地在5和15微克之間。病毒抗原的形式可以是滅活病毒顆粒，分裂病毒抗原，病毒體或純化的抗原。合適佐劑的非限制性例子包括角鯊?fù)楹徒酋徬?或其他動(dòng)物來(lái)源的油)；嵌段共聚物；洗滌劑如Tween-80;奎爾甲，礦物油如DRAKE0L或用Marcol，植物油如花生油；棒桿菌來(lái)源的佐劑，如棒狀桿菌；丙酸dznved佐劑如痤瘡丙酸桿菌,牛分枝桿菌(卡介苗或BCG),白細(xì)胞介素如白細(xì)胞介素2和白介素12，單核因子如白細(xì)胞介素1，腫瘤壞死因子，干擾素如作為Y-干擾素；表面活性物質(zhì)如十六烷基胺，十八烷基胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂，二甲基二甲基溴化銨，N，IV-dicoctadecyl基-N’，N’-雙)2_羥基乙基-丙二胺)，methoxyhexadecylglycerol,和普魯蘭尼克多元醇；多胺如卩比喃,葡聚糖,聚IC的卡波普；肽，如胞壁酰二肽及其衍生物，二甲基甘氨酸，促吞噬素(tuftsin)，油乳劑；及礦物凝膠，如磷酸鋁，氫氧化鋁或明礬；如皂苷-鋁的氫氧化物或奎爾-甲鋁的組合氫氧化脂質(zhì)體；分枝桿菌細(xì)胞壁提取物，合成糖肽類(lèi)，如胞壁酰二肽或其他衍生工具Avridine;脂質(zhì)A衍生物，葡聚糖硫酸酯；DEAE-葡聚糖或磷酸鋁；如CarbopoPEMA羧基聚亞甲基丙烯酸共聚物的乳液如Neocryl A640;牛痘或動(dòng)物的的痘病毒蛋白質(zhì)；子病毒粒子佐劑如霍亂毒素，或它們的混合物。單糖或雙糖的衍生物，具有至少一個(gè)但不超過(guò)N-1個(gè)脂肪酸酯基團(tuán)，選擇地一個(gè)但不超過(guò)N-1個(gè)硫酸酯基團(tuán)，其中N是得到該衍生物的單糖或雙糖的羥基數(shù)目。蔗糖脂肪酸硫酸酯并入亞微米級(jí)的角鯊?fù)榈乃腿橐骸Ｕ崽侵舅崃蛩狨サ膭┝渴窃?.1和40毫克之間。優(yōu)選地，蔗糖 脂肪酸硫酸酯的劑量是在0.5至10毫克之間。最優(yōu)選地，脂肪酸蔗糖硫酸酯的劑量是在0.5和4毫克之間。角鯊?fù)榈膭┝渴窃?.4和160毫克之間。優(yōu)選地，角鯊?fù)榈膭┝渴窃贗和40毫克之間。最優(yōu)選地，角鯊?fù)榈膭┝渴窃?和16毫克之間。本發(fā)明的治療組合物可以配制在被治療的對(duì)象可以容忍的賦形劑。此類(lèi)賦形劑的例子包括水，鹽水，林格氏(Ringer’ s)溶液，葡萄糖溶液，Hank氏溶液，和其它含水生理平衡鹽溶液。賦形劑也可以含有少量的添加劑，如增強(qiáng)等滲性和化學(xué)或生物穩(wěn)定性的物質(zhì)。緩沖液的例子包括磷酸鹽緩沖液，碳酸氫鹽緩沖液和Tris緩沖液，穩(wěn)定劑的例子包括:A1/A2穩(wěn)定劑，來(lái)自鉆石動(dòng)物健康，得梅因，愛(ài)荷華州。在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)，個(gè)體指鳥(niǎo)類(lèi)和/或哺乳動(dòng)物如，但不限于，猿，黑猩猩，猩猩，人類(lèi)，猴子或馴養(yǎng)動(dòng)物(寵物)如狗，貓，豚鼠，倉(cāng)鼠，兔子，雪紹，牛，馬，山羊和綿羊。禽類(lèi)或鳥(niǎo)類(lèi)。這里定義為類(lèi)鳥(niǎo)類(lèi)的任何溫血脊椎動(dòng)物成員，通常具有前肢改裝成的翅膀，鱗片狀的腿，喙和在硬殼雞蛋中孵化后代。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選地鳥(niǎo)類(lèi)都是家養(yǎng)的雞，火雞，鴕鳥(niǎo)，鴨，鵝，天鵝，和康沃爾游戲母雞。更優(yōu)選地是家養(yǎng)的雞和火雞。以有效方式給予治療性組合物的可接受方案包括個(gè)體劑量的大小，劑量的數(shù)量，劑量給藥的頻率，及管理模式。此類(lèi)方案的決定可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員完成，并且例子在此公開(kāi)。管理或管理被定義為引入一種物質(zhì)到個(gè)體的身體，包括口，鼻，眼，直腸，陰道和腸胃外的途徑。組合物可單獨(dú)或與其他藥物組合可以通過(guò)任何給藥途徑給藥，包括，但并不限于，皮下(SQ)，肌肉內(nèi)(IM)，靜脈(IV)，腹腔內(nèi)(IP)，皮內(nèi)(ID)，通過(guò)鼻，眼或口腔粘膜(IN)或口服。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，給予患者的劑量應(yīng)該是在一個(gè)適當(dāng)?shù)臅r(shí)期內(nèi)，足以在患者體內(nèi)引起有益的應(yīng)答。給予試劑的數(shù)量可能取決于受處理者，包括年齡，性別，體重和一般健康狀況，其因素將取決于從業(yè)者的判斷。本發(fā)明的免疫治療組合物可用于預(yù)防性或治療性地免疫動(dòng)物如人類(lèi)。然而，其他動(dòng)物也在考慮之列，最好是脊椎動(dòng)物，包括家養(yǎng)動(dòng)物，如牲畜和伴侶動(dòng)物。該疫苗可與其他的組合共同使用，例如，用減毒疫苗初免，接著用滅活疫苗加強(qiáng)。本發(fā)明涵蓋所有含有抗原，佐劑，和藥物上可接受的載體的藥物組合物。在本發(fā)明中優(yōu)選使用的藥學(xué)上可接受的載體可包括無(wú)菌水溶液，非水溶液，懸浮液，和乳劑。非水溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。含水載體包括水，酒精/水溶液，乳劑或懸浮液，包括生理鹽水和緩沖介質(zhì)。腸外載體包括氯化鈉溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸林格氏或固定油。靜脈載體包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏葡萄糖“，和類(lèi)似物)。防腐劑和其它添加劑也可存在諸如，例如，抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，和惰性氣體等。實(shí)施例提供下面實(shí)施例的唯一目的是顯示本發(fā)明的原則；它們絲毫沒(méi)有打算作為本發(fā)明的限制。1、流感病毒病毒株流感A/swine/Guangdong/01/2002 (H3N2)從中國(guó)南方健康豬中分離。在雞胚胎中的病毒增殖11天齡胚卵用于病毒復(fù)制。卵被接種0.2ml病毒接種液，來(lái)自病毒原料的不同稀釋度。在適當(dāng)?shù)臏囟认聦⒔臃N的卵孵育標(biāo)記時(shí)間期限。孵育期結(jié)束時(shí)，將胚胎通過(guò)冷卻死亡和雞蛋在2-8°C貯存12-60小時(shí)。從冷凍的含胚卵收獲尿囊液。HA實(shí)驗(yàn)和空斑形成實(shí)驗(yàn)HA實(shí)驗(yàn)和空斑形成實(shí)驗(yàn)在本領(lǐng)域中是公知的。雞紅血細(xì)胞被用于HA實(shí)驗(yàn)。MDCK細(xì)胞被用于空斑形成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果總結(jié)于表I。PFU被認(rèn)為作為感染性顆粒的指標(biāo)，其中HA滴度視為總血細(xì)胞凝集素蛋白的一個(gè)指標(biāo)。對(duì)于計(jì)算，一個(gè)HA單元是等于5xl06的病毒粒子(血細(xì)胞凝集粒子(HAP))在當(dāng)前的流感疫苗中，血凝素的含量是用于確定疫苗劑量的唯一指標(biāo)。這里PFU與HA滴度(HAP)的比率被用于選擇病毒原料來(lái)測(cè)試其作為疫苗的有效性。組接種10_6稀釋度，孵育36小時(shí)，產(chǎn)出第二最佳比率(但在24小時(shí)時(shí)，即使該比率是最高的，它有非常低的HA滴度；總抗原太低而不能在實(shí)踐中使用)，而一組接種10_2稀釋度，孵育72小時(shí)，產(chǎn)出最差比率( 但它有最高的HA，那將是最適合于當(dāng)前的程序來(lái)制造流感疫苗)，因此這兩組被用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。表I。
稀釋度孵育時(shí)間 PFUHA (HAP)PFU/HAP
10—2 24 小時(shí) 5.73x10728 (1.28x109)4.40%
1(Γ6 24 小時(shí) 6.3x1050.67 (3.35x106)18%
1(Γ2 36 小時(shí) 3.12x10728 (1.28x109)2 4%
10—6 36 小時(shí) 4.15x10726 (3.2x108)12.9%
1CT2 48 小時(shí) 1.8x10728 (1.28x109)1.4%
1(Γ6 48 小時(shí) 8.5x107210 (5.12x109)1.6%
10'2 72 小時(shí) 5.7x106211 (1.02x1010) 0.05%
10 72 小時(shí) 2 , 23x10729 (2 , 56x109)0.87%血凝素蛋白或病毒蛋白的定量分析SDS PAGE凝膠被用來(lái)量化在病毒制備中的HA蛋白。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)使用病毒特異性血清用于定量。純化首先澄清收獲的尿囊液，中等速度離心(范圍:4000-14000g);然后再用蔗糖密度梯度離心分離；收集35-55%部分用于疫苗制備。疫苗組合物和制備未處理的尿囊液或純化的病毒，由0.1 %福爾馬林滅活，然后與礦物油混合，以制取乳化疫苗。免疫接種:抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)數(shù)據(jù)，HI數(shù)據(jù)10日齡雛雞通過(guò)皮下途徑在頸背部，免疫接種500微升乳化疫苗。攻毒前收集血清。對(duì)于血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)，病毒懸浮液與連續(xù)(2倍)稀釋的血清樣品孵育，血清樣品預(yù)先用cholerafiltrate(從霍亂弧菌培養(yǎng)獲得)。隨后，紅細(xì)胞加入稀釋液中，并溫育后，顯示完全抑制血凝的最大稀釋度定義為HI抗體滴度。攻毒免疫后20天，接種疫苗的雞被H5N1病毒株(30LD5CI)攻擊；攻擊后5天，計(jì)算各組幸存的雞。用10_2稀釋(72小時(shí))且純化的和10_6稀釋(36小時(shí))且無(wú)純化的病毒免疫接種的組對(duì)H5N1攻擊表現(xiàn)為部分保護(hù)(分別為5或7的幸存者)，但用10_2稀釋液(72小時(shí))且無(wú)純化的病毒免疫接種的組對(duì)H5N1攻擊沒(méi)有表現(xiàn)出保護(hù)(O幸存者)。
I1、FMDV病毒選擇一個(gè)口蹄疫病毒株的疫苗株(VS)，因其快速增長(zhǎng)和穩(wěn)定性；兩個(gè)口蹄疫病毒株被選定為攻毒株(CSl和CS2)。VS與CSl的同源性為97.3%，與CS2的同源性為77.3%。所有病毒用常規(guī)條件和程序在BHK-21細(xì)胞中增殖。2、VS根據(jù)不同的稀釋和收獲時(shí)間的TCID5tl, PFU和ELISA結(jié)果
VS工作種毒按照常規(guī)條件和程序在BHK-21細(xì)胞中制備，-80[度]保存。VS工作種毒稀釋100，1000，10，000，和100，000倍，感染朋1(-21細(xì)胞，其中CPE在感染后的時(shí)間為10，12，14，16，18，20和22小時(shí)被記錄，用于計(jì)算TCID50;每個(gè)樣品凍融三次用于PFU滴度和ELISA實(shí)驗(yàn)。CPE，PFU和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在本領(lǐng)域中是公知的。結(jié)果總結(jié)在下面的表2和表3中。TCID5tl和PFU值代表感染病毒顆粒亞群，ELISA效價(jià)代表總病毒顆?；蚩偛《究乖粡亩腥拘圆《绢w粒亞群與總病毒抗原的比例可以表達(dá)為T(mén)CID5tl或PFU與ELISA讀數(shù)的比值。這里要注意的是，這個(gè)比例值是任意的，但它是非常有用的，在揭示哪一個(gè)病毒制備包含更大的感染性病毒顆粒亞群。如果這個(gè)任意的方法被恒定使用，感染性病毒顆粒亞群的比例的一個(gè)預(yù)定義的值可以用來(lái)選擇條件，用于制備用于疫苗生產(chǎn)的病毒制備。另外，病毒制備中的總病毒抗原可以通過(guò)其他方法來(lái)確定，例如，純化總的病毒抗原，病毒抗原的濃度可以通過(guò)任何已知的方法來(lái)確定。表2、VS 的 TCDD5tl 和 ELISA 滴度
權(quán)利要求
1.一種疫苗包括: 一個(gè)病毒的疫苗株的病毒抗原； 其中所述病毒抗原來(lái)自病毒疫苗株的一個(gè)病毒制備； 其中所述病毒疫苗株的病毒制備包含一個(gè)感染性病毒顆粒亞群，并且所述感染性病毒顆粒亞群表示為在所述病毒制備的總病毒顆?；蚩偛《究乖兴嫉谋壤?； 及其中所述感染性病毒顆粒亞群在所述病毒制備的總病毒顆?；蚩偛《究乖兴嫉谋壤^(guò)一個(gè)預(yù)定閾值； 因此，該疫苗提供針對(duì)與疫苗株不同的病毒株的至少部分的亞型間(inter-subtypic)或亞型內(nèi)(intra-subtypic)的交叉免疫應(yīng)答。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗，其特征在于:其中所述病毒能夠感染人類(lèi)和動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述疫苗，其特征在于:其中所述病毒是流感病毒，艾滋病病毒，登革病毒或口蹄疫病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗，其特征在于:其中所述病毒抗原是病毒的表面抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗，其特征在于:其中所述病毒制備是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或雞胚卵或允許所述病毒增殖的合適宿主來(lái)生產(chǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗，其特征在于:其中所述病毒制備中的感染性病毒顆粒亞群是由病毒感染性的實(shí)驗(yàn)包括空斑形成單位實(shí)驗(yàn)(PFU)，組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)，蛋感染劑量(EID50)和致死量(LD50)來(lái)確定，并且總病毒顆粒或總病毒抗原是由病毒總體實(shí)驗(yàn)包括血凝法，ELISA法，蛋白質(zhì)印跡，總蛋白測(cè)定來(lái)確定。`
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗，其特征在于:其中所述感染性病毒顆粒亞群的比例的預(yù)定義的閾值被如此確定:提供一組含有不同感染性病毒顆粒亞群的比例的病毒制備； 制備疫苗，含有從該組的病毒制備獲得的病毒抗原； 用所述制備的疫苗免疫一個(gè)合適的宿主； 用所述病毒的一個(gè)攻毒株攻擊所述免疫的宿主，其中所述攻毒株不同于疫苗病毒株； 及分析攻毒結(jié)果； 其中所述預(yù)定義的閾值定義為提供預(yù)期免疫力的病毒制備的比例值。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗，其特征在于:其中所述病毒抗原包括純化的病毒表面抗原，分裂形式的病毒，該病毒的病毒體，或滅活的全病毒。
9.生產(chǎn)權(quán)利要求1所述疫苗的方法，其特征在于:所述方法包括: 提供一個(gè)病毒疫苗株的一個(gè)病毒制備；其中所述病毒疫苗株的病毒制備包含一個(gè)感染性病毒顆粒亞群，并且所述感染性病毒顆粒亞群表示為在所述病毒制備的總病毒顆?；蚩偛《究乖兴嫉谋壤患捌渲兴龈腥拘圆《绢w粒亞群在所述病毒制備的總病毒顆?；蚩偛《究乖兴嫉谋壤^(guò)一個(gè)預(yù)定閾值； 從所述病毒制備獲得所述病毒抗原； 使所述病毒抗原與生理上可接受的佐劑混合而制備疫苗； 因此，該疫苗提供針對(duì)與疫苗株不同的病毒株的至少部分的亞型間(inter-subtypic)或亞型內(nèi)(intra-subtypic)的交叉免疫應(yīng)答。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述生產(chǎn)疫苗的方法，其特征在于:其中所述病毒能夠感染人類(lèi)和動(dòng)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述生產(chǎn)疫苗方法，其特征在于:其中所述病毒是流感病毒，艾滋病病毒，登革病毒或口蹄疫病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述生產(chǎn)疫苗方法，其特征在于:其中所述病毒抗原是病毒的表面抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述生產(chǎn)疫苗方法，其特征在于:其中所述病毒制備是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或雞胚卵或允許所述病毒增殖的合適宿主來(lái)生產(chǎn)。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述生產(chǎn)疫苗方法，其特征在于:其中所述病毒制備中的感染性病毒顆粒亞群是由病毒感染性的實(shí)驗(yàn)包括空斑形成單位實(shí)驗(yàn)(PFU)，組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)，蛋感染劑量(EID50)和致死量(LD50)來(lái)確定，并且總病毒顆?；蚩偛《究乖怯刹《究傮w實(shí)驗(yàn)包括血凝法，ELISA法，蛋白質(zhì)印跡，總蛋白測(cè)定來(lái)確定。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述生產(chǎn)疫苗方法，其特征在于:其中所述感染性病毒顆粒亞群的比例的預(yù)定義的閾值被如此確定: 提供一組含有不同感染性病毒顆粒亞群的比例的病毒制備； 制備疫苗，含有從該組的病毒制備獲得的病毒抗原； 用所述制備的疫苗免疫一個(gè)合適的宿主； 用所述病毒的一個(gè)攻毒株攻擊所述免疫的宿主，其中所述攻毒株不同于疫苗病毒株； 及分析攻毒結(jié)果； 其中所述預(yù)定義的閾值定義為提供預(yù)期免疫力的病毒制備的比例值。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述生產(chǎn)疫苗方法，其特征在于:其中所述病毒抗原包括純化的病毒表面抗原，分裂形式的病毒，該病毒的病毒體，或滅活的全病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述疫苗的用途為免疫一個(gè)主體，其中所述疫苗預(yù)防或治療病毒感染。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述用途，其中所述主體是一個(gè)人或動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種針對(duì)病毒感染的疫苗。示例性的疫苗包括一個(gè)病毒疫苗株的病毒抗原；其中所述病毒抗原來(lái)自病毒疫苗株的一種病毒制備；其中所述病毒疫苗株的病毒制備包含一個(gè)感染性病毒顆粒的亞群，并且所述感染性病毒顆粒的亞群由其所占所述病毒制備的總的病毒顆粒或病毒抗原總量中的比例來(lái)表示；并且其中所述感染性病毒顆粒的亞群在所述病毒制備的總的病毒顆?；虿《究乖偭恐械谋壤^(guò)一個(gè)預(yù)定的閾值；因此，該疫苗提供至少部分亞型間(inter-subtypic)或亞型內(nèi)(intra-subtypic)針對(duì)與疫苗株不同的病毒株的交叉免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61P31/16GK103209707SQ201180052183
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月30日
發(fā)明者喬治·劉 申請(qǐng)人:喬治·劉