專利名稱：包含肽和病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的組合物的制作方法
包含肽和病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的組合物本發(fā)明涉及用于治療流感的藥物組合物。在人類中，流感是由流感病毒造成的呼吸道和整個(gè)生物體的嚴(yán)重疾病。流感病毒屬于正粘病毒科，其特征在于以負(fù)鏈取向的分段RNA基因組。與人類有關(guān)的類型是流感-A和-B病毒，其中已知尤其是亞型A是呼吸道的高熱病的病原體。除了獸醫(yī)學(xué)重要性以外，所有流感病毒具有人獸互傳(zoonitic)潛力，即存在從雞或豬轉(zhuǎn)移到人類的可能性。流感作為大流行病周期性地出現(xiàn)，其在大多數(shù)情況下起源于東南亞和中國(guó)，并從這些地方向全世界傳播。流感病毒的大流行與高死亡數(shù)目有關(guān)，不僅涉及老年人，而且涉及青少年。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WH0)，每年的季節(jié)性流感導(dǎo)致全世界約300萬至500萬例嚴(yán)重疾病的發(fā)病病例，其中死亡率為250，000至500，000。最常見的死因是引起肺衰竭的流感性肺炎，但是也可能發(fā)生心血管損傷諸如心肌炎(心肌炎癥)或心包炎(心包囊的炎癥)。其它相對(duì)常見的死因可以是腦或腦膜的炎癥(腦膜腦炎)或其它器官系統(tǒng)(尤其是腎)的損傷。一般而言，潛伏期是4-5天，但也可能更短。該疾病開始于頭痛、發(fā)冷、寒戰(zhàn)和咳嗽的突然發(fā)作。這之后是最高達(dá)4rc的高熱、肌肉疼痛、失去食欲和全身性乏力感。該階段持續(xù)約3天，此后發(fā)熱減退，并且在大多數(shù)情況下從第6天開始回落至正常值，病毒從體內(nèi)消除。咳嗽可能持續(xù)數(shù)周。如果在上述征狀之后發(fā)展成初始病毒性間質(zhì)性(經(jīng)常出血性)肺炎，則出現(xiàn)嚴(yán)重的危及生命的流感。除了虛弱的人以外，它也發(fā)生在大約25%的健康人或以前未受損傷的人中，且可以持續(xù)最多2周。通過肺重量的增加，可以檢測(cè)出這樣的肺炎。肺炎也可能通過細(xì)菌(尤其是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和流感嗜血桿菌)超感染二次產(chǎn)生。這些并發(fā)癥的促進(jìn)因素尤其是，其它肺疾病(例如哮喘)、免疫缺陷、年齡(嬰幼兒和老年人)、糖尿病、 肺損傷、吸煙。因此，具有這些并發(fā)癥的人是疫苗接種的首要目標(biāo)群。流感病毒通過飛沫傳染到達(dá)生物體，并通過HA蛋白結(jié)合在口、鼻和咽粘膜的上皮細(xì)胞上的末端神經(jīng)氨酸殘基上進(jìn)行感染。從這里，它們傳播至下呼吸道?？梢栽诶w毛上皮和在呼吸道的所有區(qū)域的生粘液皮膚層中觀察到細(xì)胞的破壞。如果形成原發(fā)性間質(zhì)性肺炎，病毒會(huì)傳染至肺實(shí)質(zhì)的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)肺泡壁強(qiáng)烈腫脹，肺泡壁的上皮由于細(xì)胞破壞經(jīng)常完全蝕落。通過肺重量的增加，可以檢測(cè)出肺組織的這樣的腫脹。存在著預(yù)防性和治療性處理?？墒褂冕槍?duì)流感一 A和一 B感染的疫苗。這些疫苗是在雞蛋和/或細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的被殺死的病毒。在疫苗接種以后大約2周，疫苗保護(hù)已經(jīng)達(dá)到它的完全功效。但是，由于流感病毒的高變異性，必須每年針對(duì)當(dāng)前流傳的病毒亞型或亞型變體改進(jìn)疫苗。另外使用病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑(扎那米韋、奧司他韋)，它們會(huì)阻止新復(fù)制的病毒顆粒從宿主細(xì)胞脫離。它們優(yōu)選地在流感病毒感染發(fā)生和檢測(cè)出以后不久使用，以便在感染的早期階段抑制所述病毒的傳播(W0 2003/026567 A2)。但是，病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑僅僅干預(yù)病毒的增殖，卻不會(huì)滅活已經(jīng)存在于體內(nèi)的病毒。神經(jīng)氨酸酶抑制劑僅可以有助于將疾病持續(xù)時(shí)間微小地縮短(平均而言，在成人的情況中縮短I天)。本發(fā)明的目標(biāo)是，顯著地增加這樣的病毒增殖抑制劑的治療效果。用本發(fā)明應(yīng)提供改進(jìn)的用于治療流感病毒感染的藥物組合物。因此，本發(fā)明涉及尤其是用于預(yù)防和治療流感的組合物，其包含
-肽，其由7-17個(gè)相鄰的氨基酸組成，且包含六聚體TX1EX2X3E,其中XpX2和X3每個(gè)均可以是天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有TNF-受體-結(jié)合活性，且是環(huán)化的，和-病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑。根據(jù)本發(fā)明現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，如果將如上定義的肽與神經(jīng)氨酸酶抑制劑組合使用，用于治療流感感染，則可以令人驚訝地提高神經(jīng)氨酸酶抑制劑的作用。由此也表明了根據(jù)本發(fā)明的化合物的預(yù)防性用途。已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明在治療由流感病毒導(dǎo)致的肺炎中是特別有效的。根據(jù)本發(fā)明待使用的肽例如由歐洲專利EP I 264 599 BI (或由US 2007/299003A、TO 94/18325 Al或WO 2008/148545 Al)已知，且已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中用于治療水積(肺水腫)，并尤其是用于重吸收這些水積。但是，令人驚奇地，這些肽也適合用于影響經(jīng)由毛細(xì)血管內(nèi)皮進(jìn)入肺上皮中的反向流體流動(dòng)，且因此也可以用于預(yù)防和治療上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性過高(W0 2010/099556 A)。這些肽(其本身是已知的 ，且根據(jù)本發(fā)明與神經(jīng)氨酸酶抑制劑一起使用)不具有TNF-受體-結(jié)合活性(Hribar 等人，Eur.J.Tmmuno1.1999; Elia等人，AJRCCM 2003 ；也參見:下面的實(shí)施例部分)，且是環(huán)化的。這些肽的優(yōu)選變體由7-17個(gè)相鄰的氨基酸組成，且含有六聚體TPEGAE (SEQ ID Nr.4)。但是WO 2010/099556 Al和EP I 264 599 Al靶向肺中的某些病理學(xué)征狀的治療，而非靶向由某種病原體造成的疾病的預(yù)防和治療，而根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用則是完全不同的。正如在本發(fā)明的研究的過程中已經(jīng)證實(shí)的，根據(jù)權(quán)利要求(尤其根據(jù)WO2010/099556 Al)所述的肽以協(xié)同方式促進(jìn)在根據(jù)本發(fā)明的組合制品中的神經(jīng)氨酸酶抑制劑的作用。因而，根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用直接地靶向由于流感病毒引起的感染，而非靶向可能由幾種不同病原體引起的一般征狀(例如在WO 2010/099556 Al或在EP I 264 599 Al中的情況)。盡管在本領(lǐng)域技術(shù)人員看來，顯而易見的是，神經(jīng)氨酸酶抑制劑僅能抑制流感病毒的增殖，但是不會(huì)由此減少已經(jīng)存在的病毒；然而，完全令人驚奇并且沒有為現(xiàn)有技術(shù)所建議的是，神經(jīng)氨酸酶抑制劑和根據(jù)本發(fā)明的肽的組合流感防治的顯著改善。本領(lǐng)域技術(shù)人員在現(xiàn)有技術(shù)中沒有獲得對(duì)該組合的任何建議，相反:
在TO 2003/026567 A2中敘稱，用于治療流感的神經(jīng)氨酸酶抑制劑也適合預(yù)防與流感關(guān)聯(lián)的細(xì)菌感染?；谠撐募?，本領(lǐng)域技術(shù)人員根本不會(huì)認(rèn)識(shí)到給神經(jīng)氨酸酶抑制劑添加改善抗病毒效果或流感治療功效的其它添加劑的任何理由。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含環(huán)化肽，所述環(huán)化肽由選自下述的彼此相繼的氨基酸序列組成:
-QRETPEGAEAKPffY (SEQ ID Nr.5)-PKDTPEGAELKPffY (SEQ ID Nr.6)
-CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID Nr.1)，和 -CGPKDTPEGAELKPffYC (SEQ ID Nr.7)
及其至少7個(gè)氨基酸的片段，所述片段具有六聚體TPEGAE的片段。優(yōu)選地，在所述組合物中的肽包含氨基酸序列CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID Nr.1)，且經(jīng)由C-殘基環(huán)化。因而，該特別優(yōu)選的肽具有下述氨基酸序列(SEQ ID Nr.1) (NH2)Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys (COOH)。該肽也被稱作“AP301”。在此，根據(jù)本發(fā)明的肽的環(huán)化可以如下實(shí)現(xiàn):例如，經(jīng)由在N端和C端處的2個(gè)C-殘基之間的二硫鍵而直接環(huán)化，或者通過經(jīng)由2個(gè)半胱氨酸使所述肽偶聯(lián)在載體物質(zhì)上。在這種情況下，在根據(jù)本發(fā)明的肽中，優(yōu)選在分子的起始處和終點(diǎn)處具有半胱氨酸殘基。也可以使用能實(shí)現(xiàn)肽環(huán)化的其它官能團(tuán)，例如通過酸基團(tuán)與胺或醇導(dǎo)致生酰胺-或酯環(huán)合(在此例如，氨基酸天門冬氨酸和谷氨酸可以與絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或賴氨酸優(yōu)選地進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化)。所述肽的環(huán)化優(yōu)選地通過所述肽的C-殘基之間的二硫鍵(如果存在的話)來實(shí)現(xiàn)。因而，根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選的肽是例如CGQKETPEGAEAKPWYC (SEQ ID Nr.8)、CGQRETPEGAEARPffYC (SEQ ID Nr.9)、CGQRETPEGAEAKPC (SEQ ID Nr.10)、CQRETPEGAEAKPffYC (SEQ ID Nr.11)或 CGQRETPEGAEAKFWYC (SEQ ID Nr.12)。但是，所述環(huán)化還可以通過使所述肽結(jié)合在載體物質(zhì)上來實(shí)現(xiàn)。作為這類環(huán)化的載體物質(zhì)，所有常規(guī)的藥學(xué)上可用的物質(zhì)都是合適的，其能夠例如與半胱氨酸的SH基(或與所述肽的其它天然存在的 或人工引入的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán))共價(jià)結(jié)合，其中常見的載體蛋白諸如鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)、破傷風(fēng)毒素等特別合適。在載體上也可以具有相鄰的雙功能殘基(例如緊鄰胺或醇基的酸基團(tuán))。在該背景下，重要的是“環(huán)化”既包括分子內(nèi)環(huán)合與包括載體(結(jié)合的肽從所述載體伸出(通過肽的N端和C端結(jié)合在所述載體上))的鍵合；由此，這樣環(huán)化的肽呈現(xiàn)環(huán)狀空間結(jié)構(gòu)，且相應(yīng)地被穩(wěn)定化。病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑是已知的，且其本身已經(jīng)在流感的預(yù)防和治療中證實(shí)有效。這樣的病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋(Zanamivir)、奧司他韋(Oseltamivir)、拉尼米韋(Laninamivir)或培拉米韋(Peramivir))會(huì)阻止新復(fù)制的病毒顆粒從宿主細(xì)胞分離。尤其是它們可以在流感病毒感染發(fā)生和檢測(cè)出之后不久在感染早期抑制病毒傳播。但是，這些神經(jīng)氨酸酶抑制劑僅僅干預(yù)病毒的增殖，卻不會(huì)滅活已經(jīng)存在于體內(nèi)的病毒，因而，通常僅可以將疾病持續(xù)時(shí)間微小地縮短(平均而言，在成人的情況中縮短I天)。但是，首要的是，通常不能足夠有效地防治或預(yù)防流感征狀，特別是肺炎，其在大多數(shù)情況下導(dǎo)致特殊的并發(fā)癥。神經(jīng)氨酸酶是對(duì)于流感病毒復(fù)制而言一種重要的酶，且已經(jīng)被描述為負(fù)責(zé)釋放病毒的“分子剪刀”。神經(jīng)氨酸酶抑制劑包含唾液酸的類似物，所述類似物代表一類新的第二代抗病毒齊U，其顯示出對(duì)流感A和B病毒的效力。根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)氨酸酶抑制劑可以是迄今為止所有建議用于此的化合物，如在例如US 2008/0063722 Al中所總結(jié)的物質(zhì)(以及這樣的物質(zhì)的優(yōu)選藥物制劑)。這些物質(zhì)可以抑制A型或B型流感病毒粒子的強(qiáng)毒株的神經(jīng)氨酸酶蛋白的至少一種酶活動(dòng)。這樣的物質(zhì)可以用于預(yù)防和治療流感；但是，與根據(jù)本發(fā)明的上面定義的肽相組合，會(huì)顯著提高該作用。在例如美國(guó)專利號(hào)5，453，533,5, 763，483,5, 952，375,5, 958，973,5, 512，596、5，886，213、5，602, 277、6，410, 594、5，360, 817、5，866，601,6, 340, 702,6, 451，766、6，455，571,6, 593，314,6, 509，359,6, 518，305 和 6，831，096 中描述了可以在本發(fā)明的組合
物中使用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑的例子。已經(jīng)用于人類(或至少處于臨床試驗(yàn)中)且因此特別優(yōu)選的是例如 CS-8958 (RI 18958 ；US 2008/0063722 Al )，扎那米韋(GG167，RELENZA )，培拉米韋(RWJ-270201，BCX-1812),磷酸奧司他韋(Ro64_0796，GS4104),羧酸奧司他韋(Ro64-0802, GS4071)，或奧司他韋(GS4104，達(dá)菲 )。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑的所有有效化學(xué)形式，即作為鹽、外消旋形式、光學(xué)純的形式和/或無鹽形式(也以例如對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體的形式)。優(yōu)選地，病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑是扎那米韋或奧司他韋；這些物質(zhì)是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)特別成功地用于人類的治療中。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含藥學(xué)上可接受的載體，且以適合施用給人類的藥物組合物的形式制備。表述“藥物組合物”表示，包含神經(jīng)氨酸酶抑制劑和如上定義的肽(當(dāng)然，也表示這樣的物質(zhì)的合適的(即不會(huì)彼此負(fù)面干擾的)混合物)的組合物，所述組合物預(yù)防、改善或治愈在本文中所描述的病癥。表述“藥物組合物”具體地表示這樣的組合物:其具有神經(jīng)氨酸酶抑制劑和如上所述的肽，·以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑(兩種表述可以可互換地使用)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體或賦形劑的適當(dāng)實(shí)例是:水、食鹽溶液、磷酸鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、TRIS和檸檬酸鈉或它們的混合物。當(dāng)然，也可以采用林格溶液、葡萄糖溶液或非還原糖的溶液；因此，甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、果糖、麥芽糖、乳糖或葡聚糖、Hank溶液、固定油、油酸乙酯、在食鹽溶液中的5%葡萄糖、改善等張性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)、緩沖劑和防腐劑也適合作為這樣的載體。其它合適的載體包括，其本身不會(huì)誘導(dǎo)抗體(其對(duì)要施用所述組合物的個(gè)體有害)的產(chǎn)生的任何載體，諸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。在配制根據(jù)本發(fā)明的組合物時(shí)，當(dāng)然必須符合有關(guān)的指南(例如(歐洲或美國(guó))藥典)。由此，也可以使要在根據(jù)本發(fā)明的組合物中提供的肽通過直接共價(jià)結(jié)合在這些載體上而環(huán)化。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以(作為藥物)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法來施用，特別優(yōu)選的是，將根據(jù)本發(fā)明待使用的肽或根據(jù)本發(fā)明的組合物施用進(jìn)肺中。雖然流感也在動(dòng)物中起某種作用，并且根據(jù)本發(fā)明的組合物當(dāng)然也可以用于預(yù)防和治療動(dòng)物，但是本發(fā)明的重點(diǎn)是預(yù)防和治療人類，即已經(jīng)被流感感染的人，或處于被該病毒感染的危險(xiǎn)中的人(特別是流感流行病或-大流行病)。優(yōu)選的施用途徑是吸入(經(jīng)由氣霧劑)，也可以是靜脈內(nèi)給藥、滴注、口服給藥或它們的組合。在吸入、腸胃外或口服給藥中，將本發(fā)明的藥物與上面定義的藥學(xué)上可接受的賦形劑相組合配制成劑量單位劑型，如作為溶液、混懸液或乳劑。但是在個(gè)別情況下，劑量和給藥形式當(dāng)然也可以取決于各個(gè)個(gè)體。因此，將在每種情況下需要的有效量施用給需要給藥的個(gè)體。在此，“有效量”應(yīng)當(dāng)理解為這樣的量:其足以有效地實(shí)現(xiàn)預(yù)期的治療或預(yù)防效果，即例如阻止疾病的進(jìn)一步傳播，或有效地治療疾病。在此，在大多數(shù)情況下，以一般患者為出發(fā)點(diǎn)；但是，可以以考慮到給藥形式和患者的年齡、體重、狀況以及疾病的程度和進(jìn)展的方式(例如借助于適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)藥理學(xué)方案)，配制在所述組合物中的組分的實(shí)際有效量。因此，在根據(jù)本發(fā)明的組合物中的藥學(xué)上可接受的載體優(yōu)選選自:水(特別優(yōu)選:注射用水)、食鹽、磷酸鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、TRIS、檸檬酸鈉、林格溶液、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、果糖、麥芽糖、乳糖或葡聚糖、Hank溶液、固定油、油酸乙酯、改善等張性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)、防腐劑、藥學(xué)上可接受的蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。也可以如下提供根據(jù)本發(fā)明的組合物:通過將2種活性組分，即以空間上分開的形式即作為套裝提供神經(jīng)氨酸酶抑制劑和如上所述的肽，所述套裝包含至少一種神經(jīng)氨酸酶抑制劑和肽(各自在單獨(dú)的容器中)。因此，本發(fā)明也涉及一種套裝，其包含至少一種神經(jīng)氨酸酶抑制劑和肽(各自在單獨(dú)的容器中)。由此能夠分開施用(在空間上，但是也在時(shí)間上)所述肽和所述抑制劑，這尤其在下述情況下是優(yōu)選的:如果有關(guān)的患者希望根據(jù)本發(fā)明的2種活性組分以不同給藥途徑。例如，奧司他韋在大多數(shù)情況下口服給藥，而根據(jù)本發(fā)明待使用的肽主要通過吸入來施用。但是，在許多情況下，希望同時(shí)給藥；例如，扎那米韋同樣通過吸入來給藥。當(dāng)然，也可以指明借助于吸入來全身性地提供口服抑制劑。在某些情況下，根據(jù)本發(fā)明待使用的肽可能難于與神經(jīng)氨酸酶抑制劑共混，例如如果靜脈內(nèi)地或口服地施用抑制劑且吸入來施用肽。但是，在許多情況下，所述抑制劑和所述肽可以共同吸入施用，由此所述抑制劑直接地到達(dá)肺中，且可能通過肺進(jìn)入血液中(流感病毒首先存在于肺組織中)。在包含分開的神經(jīng)氨酸酶-和肽組分的這樣的根據(jù)本發(fā)明的套裝中，在本文中所述的特征和所述混合的組合物的優(yōu)選實(shí)施方案當(dāng)然可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)想的所有組合來提供。根據(jù)本發(fā)明的藥物例如可以如此來施用，以至于以lMg/kg至10 mg/kg、更優(yōu)選10Mg/kg至5 mg/kg之間和最優(yōu)選0.1至2 mg/kg之間的劑量來施用本發(fā)明的肽。優(yōu)選地，它作為大丸劑劑量(Bolus-Dosis)來施用。但也可以連續(xù)吸入或輸注或借助于重復(fù)劑量給藥來使用。 特別優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的組合物含有-彼此獨(dú)立地-:
-所述肽，其量為IMg至10 g、優(yōu)選IOMg至I g、尤其是I mg至100 mg,和 -病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑,其量為IMg至10 g、優(yōu)選IOOMg至I g、尤其是I mg至
200 mgo特別優(yōu)選的呈液體形式的根據(jù)本發(fā)明的組合物含有-彼此獨(dú)立地-:
-所述肽，其量為IMg至10 g、優(yōu)選IOMg至I g、尤其是I mg至100 mg,和-病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑,其量為IMg至10 g、優(yōu)選IOOMg至I g、尤其是I mg至200 mg,
并且具有0.5-10 ml的體積、尤其具有1-5 ml的體積。根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選地也可以以干燥形式借助于粉末吸入器來施用?？捎糜诒景l(fā)明的這樣的粉末吸入器的例子描述在美國(guó)專利4，995，385和4，069，819中；已經(jīng)確定的產(chǎn)品是 SPINHALER 、ROTAHALER 、FLOWCAPS 、INHALATOR 、DISKHALER 和 AER0LIZER 。根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選也可以作為氣溶膠借助于液體噴霧器來施用。這樣的液體噴霧器的例子是確定的產(chǎn)品，諸如Aeixmeb 和Pari 。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的組合物的特征在于，所述肽和/或所述病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑存在于可霧化的粉末制劑中或存在于可霧化的流體制劑中。根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選地用于治療和預(yù)防流感病毒A型和B型、尤其是A型的感染。但是原則上，所述組合物也適合預(yù)防或治療由任何可能的可以在動(dòng)物中或在人類中弓I起疾病的流感病毒株的感染。關(guān)于不同流感類型的信息的相關(guān)數(shù)據(jù)庫是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的；具體地，描述了或者甚至測(cè)序了許多分離的A型病毒株。將通過下述實(shí)施例和附圖更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，當(dāng)然，本發(fā)明不限于此。其中:
在

圖1中顯示了在感染A型流感以后第3、5、7和9天或沒有感染(作為對(duì)照)的C57BL/6-小鼠的相對(duì)肺重量；
在圖2中顯示了在感染A型流感感染以后第5、7和9天并用奧司他韋治療、用根據(jù)本發(fā)明的組合物治療和沒有治療(用PBS，作為對(duì)照)的C57BL/6-小鼠的相對(duì)肺重量；
在圖3中顯示了在感染A型流感感染以后第7和9天并用扎那米韋治療、用根據(jù)本發(fā)明的組合物治療和沒有治療(用PBS，作為對(duì)照)的C57BL/6-小鼠的相對(duì)肺重量。
實(shí)施例用本發(fā)明的實(shí)施例在公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)小鼠模型中證實(shí)，通過給已經(jīng)被流感病毒感染的小鼠施用神經(jīng)氨酸酶抑制劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑與合成肽AP301 (SEQ ID Nr.1)的組合，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目標(biāo)。實(shí)施例1
流感病毒感染會(huì)造成肺炎的發(fā)展
用A型流感株(PR8/34)和150 PFU的劑量經(jīng)鼻感染實(shí)驗(yàn)室小鼠(C57BL/6品系，8周齡)。在感染后第3、5、7和9天，分別取出8只小鼠的肺，并確定相對(duì)肺重量，作為肺炎的度量。檢查表明，隨小鼠被流感病毒感染以后的持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)，與對(duì)照肺相比的肺重量增加越多。結(jié)果圖示于圖1中。實(shí)施例2
通過施用神經(jīng)氨酸酶抑制劑或施用神經(jīng)氨酸酶抑制劑和肽AP301的組合來治療肺炎用A型流感株(PR8/34)和150 PFU的劑量經(jīng)鼻感染實(shí)驗(yàn)室小鼠(C57BL/6品系，8周齡)。隨后，試驗(yàn)動(dòng)物分別接受10 mg/kg奧司他韋(神經(jīng)氨酸酶抑制劑)的口服給藥和IOI^g肽AP301/試驗(yàn)動(dòng)物的氣管內(nèi)給藥。在第2和4試驗(yàn)天，重復(fù)所述治療。在感染后第5、7和9天，分別取出30只小鼠的肺，并確定相對(duì)肺重量，作為肺炎的度量。結(jié)果圖示于圖2中。檢查表明，通過測(cè)量肺重量，神經(jīng)氨酸酶抑制劑僅僅產(chǎn)生中度的減輕肺炎的效應(yīng)。但是，如果除了神經(jīng)氨酸酶抑制劑以外還將肽AP301施用給被流感病毒感染的小鼠，會(huì)顯著更大幅度地減輕肺炎。實(shí)施例3 在人全血中先體內(nèi)后體外地評(píng)估AP301肽的促炎性能在人全血中進(jìn)行了關(guān)于AP301肽的先體內(nèi)后體外-安全性藥理學(xué)研究，以確定AP301肽是否會(huì)導(dǎo)致從新鮮全血釋放促炎標(biāo)志物白介素-6 (IL-6)(即APN 301是否會(huì)表現(xiàn)出TNF-特異性的炎癥活性(即TNF-受體-結(jié)合活性))。在本研究中，已經(jīng)使用了新鮮全血，它是公認(rèn)的用于評(píng)估體內(nèi)炎癥應(yīng)答的預(yù)測(cè)模型。方法概要
本研究的目標(biāo)是，確定AP301肽的促炎信號(hào)傳遞能力。在此使用全血培養(yǎng)物，并借助于ELISA定量白介素-6 (IL-6)的分泌，所述白介素-6是促炎刺激的一種非常靈敏的標(biāo)志物。試驗(yàn)體系
試驗(yàn)體系在試驗(yàn)中使用25 ml從5位健康受試者(GP)新鮮米集的肝素化的血液。試駘項(xiàng)目
鑒定:AP301肽(劑量:1 ng/ml至lOl^g/ml ;在溶液中單次施用)
描述:白色粉末，純度96%
全血培養(yǎng)
全血(VB)培養(yǎng)通過將I ml VB吸量進(jìn)24孔板的孔中進(jìn)行。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，包括未刺激的和刺激的對(duì)照-培養(yǎng)。如果可能的話，總是將要研究的物質(zhì)和刺激物以相同的體積用于給定實(shí)驗(yàn)的每個(gè)孔中，所述體積不超過孔中總體積的10%。未刺激的對(duì)照用PBS實(shí)現(xiàn)。同樣用PBS進(jìn)行不同處理的體積調(diào)節(jié)和稀釋?；旌厦總€(gè)孔的內(nèi)容物，并將平板在37°C和5% CO2下溫育24小時(shí)。在溫育后，將每個(gè)孔的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至新鮮的1.5 ml微管中，并在8，000-9，000 x g下離心15分鐘。將每個(gè)樣品的上清液逐個(gè)地分配至2個(gè)1.5 ml微管，并在_20°C保存?zhèn)溆?。白介?6的檢測(cè)
借助于特異性的 ELISA (人 IL-6 ELISA-Set, BD Biosciences,目錄號(hào) 555220)，使用抗-人IL-6抗體作為捕獲抗體，使用生物素化的抗-人IL-6檢測(cè)抗體、抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物作為酶試劑，和使用重組IL-6作為標(biāo)準(zhǔn)品，定量白介素-6。使用Packard FusionReader,在450 nm下進(jìn)行吸光度測(cè)量。數(shù)據(jù)分析
存儲(chǔ)每個(gè)板的結(jié)果，并使用FusionDataAnalysis軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究結(jié)果總結(jié)
本研究的目標(biāo)是，確定肽AP301的促炎信號(hào)傳遞能力。使用了全血培養(yǎng)物，并借助于ELISA定量IL-6的分泌，所述IL-6是促炎刺激的一種非常靈敏的標(biāo)志物。將5位健康受試者的全血樣品保持未刺激(陰性對(duì)照)、用高和低劑量的LPS刺激(陽性對(duì)照)、或者用肽，在從lOPg/ml至I ng/ml.的9種半對(duì)數(shù)稀釋中溫育。結(jié)果顯示在下表中:
表:在添加肽AP301和LPS的情況下，白介素-6從新鮮全血的釋放
AP301肽陽性對(duì)照(LPS)
濃度IL-6的濃度(pg/ml, n = 5)
0(陰性對(duì)照) 小于0.5小于0.5
10mg/ml小于 0.5195.640I mg/ml小于 0.5108.370
3 ng/ml小于 0.534.867
Ing/ml小于0.5未測(cè)定
結(jié)果清楚地揭示，AP301肽在任何試驗(yàn)濃度下都沒有誘導(dǎo)任何可檢測(cè)水平的IL-6分泌。陽性對(duì)照(LPS)導(dǎo)致IL-6分泌的強(qiáng)誘導(dǎo)。討論
已經(jīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來評(píng)估AP301肽是否會(huì)介導(dǎo)促炎級(jí)聯(lián)的誘導(dǎo)。讀出參數(shù)是得自5位健康供體的全血培養(yǎng)物中誘導(dǎo)的IL-6分泌。結(jié)果清楚地表明，AP301肽在供體的培養(yǎng)物中沒有誘導(dǎo)可檢測(cè)水平的IL-6。由此證實(shí)了，AP301肽在選擇的先體內(nèi)后體外模型中沒有誘導(dǎo)促炎癥應(yīng)答，并因而不具有TNF-受體-結(jié)合活性。實(shí)施例4
通過施用神經(jīng)氨酸酶抑制劑(扎那米韋)或施用神經(jīng)氨酸酶抑制劑(扎那米韋)和肽AP301的組合來治療肺炎
用A型流感株(PR8/34)和150 PFU的劑量經(jīng)鼻感染實(shí)驗(yàn)室小鼠(C57BL/6品系，8周齡)。隨后，試驗(yàn)動(dòng)物分別接受1.5 mg/kg扎那米韋(神經(jīng)氨酸酶抑制劑)的鼻給藥和50呢肽AP301/試驗(yàn)動(dòng)物的氣管內(nèi)給藥。在第2和4試驗(yàn)天，重復(fù)所述治療。在感染后第7和9天，分別取出20只小鼠的肺，并確定相對(duì)肺重量，作為肺炎的度量。結(jié)果圖示于圖3中。檢查表明，通過肺重量測(cè)量，神經(jīng)氨酸酶抑制劑(扎那米韋)僅僅產(chǎn)生中度的減輕肺炎的效應(yīng)。但是，如果除了神經(jīng)氨酸酶抑制劑以外還將肽AP301施用給被流感病毒感染的小鼠，會(huì)顯著更大幅度地減輕肺炎。總結(jié)
與神經(jīng)氨酸酶抑制劑相組合的根據(jù)本發(fā)明的肽在流感感染的治療中具有協(xié)同效應(yīng)。在WO 2010/099556 Al中，如所述的，記載了不同肺征狀的治療，其靶向這樣的肺病中的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性過高。根據(jù)WO 2010/099556 Al，證實(shí)了要求保護(hù)的肽非常適合用于預(yù)防和治療這些征狀。盡管根據(jù)WO 2010/099556 Al，還可以治療在流感病毒感染的情況下上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性過高(在該感染形成肺炎的范圍內(nèi))，但是其當(dāng)然沒有建議本發(fā)明。用包含該肽的組合制品一般地治療流感的可能性，是關(guān)于所述肽用于治療-任意的-隨流感出現(xiàn)的征狀的適用性的一種全新的且創(chuàng)造性的教導(dǎo)。通過查看根據(jù)WO 2010/099556 Al的詳述實(shí)驗(yàn)，也得出根本區(qū)別:在W2010/099556 Al的實(shí)施例中，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述肽在肺組織中:
i)影響活性氧的含量，
ii)革蘭氏陽性細(xì)菌毒素“李斯特菌溶血素(Listeriolysin)”和“肺炎鏈球菌溶血素(Pneumolysin)”的作用影響滲透性過高,尤其通過調(diào)節(jié)磷酸化的肌球蛋白輕鏈的含量、白血球的滲入、活化的蛋白激酶C，
iii)影響流感感染以后的體重，
iv)影響流感感染以后的體溫，
V)影響流感感染以后試驗(yàn)動(dòng)物的存活率。但是， 貫穿整個(gè)WO 2010/099556 Al，沒有關(guān)于流感病毒對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的感染會(huì)導(dǎo)致相對(duì)肺重量的改變以及關(guān)于通過施用所述肽來阻止和治療這樣的過程的實(shí)驗(yàn)暗示。尤其僅本發(fā)明證實(shí)，流感病毒對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物肺的感染會(huì)導(dǎo)致相對(duì)肺重量的大幅增加。肺是最重要的器官之一。如果出現(xiàn)相對(duì)肺重量增加，則其與肺功能的損傷有關(guān)，且所述損傷不能由任何其它器官來補(bǔ)償。健康肺的一種特性是，含有盡可能多的空氣填充的空間(肺泡)。在相對(duì)肺重量增加時(shí)，可認(rèn)為，空氣填充的肺泡的比例將嚴(yán)重地下降，并因此限制了肺的功能。因此，相對(duì)肺重量是流感治療的一個(gè)重要因素。因此，借助于非常關(guān)鍵的且有關(guān)的參數(shù)，以包含于本申請(qǐng)中的實(shí)驗(yàn)顯示的結(jié)果令人影響深刻地證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明的組合制品的協(xié)同效應(yīng)。迄今為止從神經(jīng)氨酸酶抑制劑已知，這些抑制劑可抑制流感病毒的增殖。神經(jīng)氨酸酶抑制劑未導(dǎo)致活流感病毒的減少。在現(xiàn)有技術(shù)中迄今為止不能證實(shí)，流感病毒導(dǎo)致相對(duì)肺重量的增加。本發(fā)明才令人驚訝地證實(shí)，在感染流感以后施用神經(jīng)氨酸酶抑制劑會(huì)減輕肺重量的相對(duì)重量增加。另外，本發(fā)明首次證實(shí)，用神經(jīng)氨酸酶抑制劑和根據(jù)WO2010/099556 Al的肽的組合同時(shí)治療被流感病毒感染的試驗(yàn)動(dòng)物導(dǎo)致對(duì)相對(duì)肺重量的明顯且不可預(yù)見的協(xié)同效應(yīng)。盡管神經(jīng)氨酸酶抑制劑將抑制流感病毒增殖，但不會(huì)減少既有的活病毒，但是神經(jīng)氨酸酶抑制劑和根據(jù)本發(fā)明的肽的協(xié)同組合顯而易見地導(dǎo)致流感治療的顯著改善。每種單獨(dú)施用的藥物(神經(jīng)氨酸酶抑制劑和根據(jù)本發(fā)明的肽)自己獨(dú)自均沒有產(chǎn)生本發(fā)明證實(shí)的效果。因此，從在WO 2010/099556 Al中公開的結(jié)果不能以任何方式導(dǎo)致本發(fā)明。序列總結(jié):
SEQ ID Nr.1 CGQRETPEGAEAKPWYCSEQ ID Nr.2 KSPGGQRETPEGAEAKPffYESEQ ID Nr.3 CGQREAPAGAAAKPffYCSEQ ID Nr.4 TPEGAESEQ ID Nr.5 QRETPEGAEAKPffYSEQ ID Nr.6 PKDTPEGAELKPffYSEQ ID Nr.7 CGPKDTPEGAELKPffYCSEQ ID Nr.8 CGQKETPEGAEAKPWYCSEQ ID Nr.9 CGQRETPEGAEARPffYCSEQ ID Nr.10 CGQRETPEGAEAKPC SEQ ID Nr.11 CQRETPEGAEAKPffYCSEQ ID Nr.12 CGQRETPEGAEAKFffYC
權(quán)利要求
1.組合物，其包含 -肽，其由7-17個(gè)相鄰 的氨基酸組成，且包含六聚體TX1EX2X3E,其中XpX2和X3每個(gè)均可以是天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有TNF-受體-結(jié)合活性并且是環(huán)化的，和 -病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述肽由7-17個(gè)相鄰的氨基酸組成，且包含六聚體 TPEGAE。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述環(huán)化肽由選自下述的彼此相繼的氨基酸序列組成:QRETPEGAEAKPWY、PKDTPEGAELKPffY, CGQRETPEGAEAKPffYC, CGPKDTPEGAELKPffYC及其至少7個(gè)氨基酸的片段，所述片段具有六聚體TPEGAE。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述肽包含氨基酸序列CGQRETPEGAEAKPWYC，且經(jīng)由C-殘基環(huán)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述肽通過所述C-殘基之間的二硫鍵環(huán)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑是扎那米韋或奧司他韋。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體，且被制備為適合于施用給人類的藥物組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中的任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體，所述載體選自:水、尤其是注射用水、食鹽、磷酸鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、TRIS、檸檬酸鈉、林格溶液、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、果糖、麥芽糖、乳糖或葡聚糖、Hank溶液、固定油、油酸乙酯、改善等張性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)、防腐劑、藥學(xué)上可接受的蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含-彼此獨(dú)立地- -所述肽，其量為IMg至10 g、優(yōu)選IOMg至I g、尤其是I mg至100 mg,和 -病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑,其量為IMg至10 g、優(yōu)選IOOMg至I g、尤其是I mg至200 mgo
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中的任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物以液體形式存在，且包含-彼此獨(dú)立地- -所述肽，其量為IMg至10 g、優(yōu)選IOMg至I g、尤其是I mg至100 mg,和 -病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑,其量為IMg至10 g、優(yōu)選IOOMg至I g,尤其是I mg至200 mg, 并且以0.5-10 ml的體積、尤其是1-5 ml的體積存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中的任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述肽和/或所述病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑存在于可霧化的粉末制劑中或存在于可霧化的液體制劑中。
12.套裝，其包含下述的，各自提供于彼此分開的容器中的組分: -肽，其由7-17個(gè)相鄰的氨基酸組成，且包含六聚體TXlEX2X3E,其中XpX2和X3每個(gè)均可以是天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有TNF-受體-結(jié)合活性并且是環(huán)化的，和 -病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的套裝，其特征在于，所述各自提供于彼此分開的容器中的組分如在權(quán)利要求1-11中的任一項(xiàng)中所定義。
14.用于預(yù)防和治療流感的組合物，其包含 -肽，其由7-17個(gè)相鄰的氨基酸組成，且包含六聚體TX1EX2X3E,其中XpX2和X3每個(gè)均可以是天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有TNF-受體-結(jié)合活性并且是環(huán)化的，和 -病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑。
15.用于由流感造成的肺炎的組合物，其包含 -肽，其由7-17個(gè)相鄰的氨基酸組成，且包含六聚體TX1EX2X3E,其中XpX2和X3每個(gè)均可以是天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽不具有TNF-受體-結(jié)合活性并且是環(huán)化的，和 -病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑。
16.用于預(yù)防和治療流感的套裝，其包含下述的各自提供于彼此分開的容器中的組 分: -肽，其由7-17個(gè)相鄰的氨基酸組成，且包含六聚體TX1EX2X3E,其中XpX2和X3每個(gè)均可以是天然的或非天然的氨 基酸，其中所述肽不具有TNF-受體-結(jié)合活性并且是環(huán)化的，和 -病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑。
全文摘要
描述了一種組合物，其包含-肽和-病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制劑，所述肽由7-17個(gè)相鄰的氨基酸組成，且包含六聚體TX1EX2X3E，其中X1、X2和X3每個(gè)均可以是天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽是不具有TNF-受體-結(jié)合活性并且是環(huán)化的。
文檔編號(hào)A61P31/16GK103200955SQ201180055463
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者B.菲舍爾, R.盧卡斯, H.菲舍爾 申請(qǐng)人:阿佩普蒂科研究和開發(fā)有限責(zé)任公司