專利名稱：用于治療創(chuàng)傷的方法和包括富組蛋白5環(huán)狀類似物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及創(chuàng)傷治療，更確切地，涉及使用富組蛋白環(huán)狀類似物來(lái)治療創(chuàng)傷。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷的愈合需要復(fù)雜的生物學(xué)與分子事件良好的協(xié)調(diào)整合，包括細(xì)胞遷移，細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積。對(duì)炎癥介質(zhì)，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，以及對(duì)機(jī)械應(yīng)力的的細(xì)胞應(yīng)答必須是適當(dāng)而精確的。這些基礎(chǔ)過(guò)程與那些引導(dǎo)性的胚胎發(fā)生，組織與器官的再生，甚至是腫瘤形成，都是相似的。然而，在成年人的創(chuàng)傷和這些其他系統(tǒng)之間還是有確切的區(qū)別存在。在容易愈合以及并無(wú)潛在的病理生理缺陷(嚴(yán)重創(chuàng)傷)的皮膚創(chuàng)面的情況下，主要的進(jìn)化動(dòng)力已經(jīng)達(dá)到使用最少的能量快速修復(fù)的能力。因此，這些創(chuàng)傷通過(guò)疤痕愈合而非再生。在預(yù)先存在病理生理異常(慢性創(chuàng)傷，例如糖尿病潰瘍)的創(chuàng)傷中，進(jìn)化適應(yīng)很可能還沒(méi)有產(chǎn)生，造成了愈合受到影響的結(jié)果。成纖維細(xì)胞/角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)是創(chuàng)傷愈合的一個(gè)實(shí)例。在成纖維細(xì)胞/角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)(分別為56%和38%)研究的處理組和對(duì)照組中，與已報(bào)道過(guò)的皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)相比，12周的愈合率較高，即使用成纖維細(xì)胞/角質(zhì)形成細(xì)胞的處理出現(xiàn)了邊緣效應(yīng)。關(guān)于皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，某研究曾報(bào)道過(guò)當(dāng)最高劑量與生理鹽水濕潤(rùn)的紗布相比，每周應(yīng)用皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)促進(jìn)了足底非缺血性潰瘍?cè)?2周內(nèi)的愈合，然而另一研究發(fā)現(xiàn)處理組與安慰劑組之間并無(wú)區(qū)別。除了創(chuàng)傷愈合效果指征，與對(duì)照組的18%相比，處理組中的愈合率僅有30%。因此，從投入的成本來(lái)說(shuō)，這個(gè)方法缺少顯著的效果。
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皮膚移植也可以在創(chuàng)傷治療中應(yīng)用。在相關(guān)方面，網(wǎng)狀自體皮片移植與傳統(tǒng)的皮片移植的比較似乎指示在兩種方法之間并沒(méi)有很大區(qū)別。在本領(lǐng)域中生長(zhǎng)因子創(chuàng)傷治療也很普遍，其包括基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)以及表皮生長(zhǎng)因子(EGF)治療。EGF已顯示出在實(shí)驗(yàn)性創(chuàng)傷中促進(jìn)了表皮生長(zhǎng)。兩個(gè)研究報(bào)道了當(dāng)與安慰劑組相比較時(shí)，顯著更高的潰瘍(主要為足部)愈合速率；然而，另一較不魯棒的，在腿部潰瘍的病人中的研究報(bào)道了相反的結(jié)果。生長(zhǎng)因子治療因此顯示出較大的無(wú)效性和昂貴性。鑒于以上，開(kāi)發(fā)治療創(chuàng)傷的有效方法是很有價(jià)值的。發(fā)明簡(jiǎn)述富組蛋白5環(huán)狀類似物現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)具有愈合創(chuàng)傷的屬性。因此，本發(fā)明一方面提供了治療哺乳動(dòng)物中的創(chuàng)傷的方法，包括對(duì)創(chuàng)傷給予治療有效量的富組蛋白5環(huán)狀類似物及其功能相同的衍生物。本發(fā)明的另一方面提供了用于創(chuàng)傷治療的組合物，包括與藥物可接受的載體結(jié)合的富組蛋白5環(huán)狀類似物及其功能相同的衍生物。本發(fā)明的又一方面提供了制品，包括包裝和包含富組蛋白5環(huán)狀類似物及其功能相同的衍生物的組合物。所述包裝上貼有標(biāo)簽以指示所述組合物適于治療創(chuàng)傷。本發(fā)明的另一方面提供富組蛋白5環(huán)狀類似物或一種與其功能相同的衍生物，用于制造用于治療創(chuàng)傷的藥物。通過(guò)以下詳細(xì)描述，權(quán)利要求和附圖，本發(fā)明的上述與其他方面，特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)更加清楚。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了富組蛋白5及其環(huán)狀類似物的氨基酸序列；圖2A為在測(cè)量嚴(yán)重程度的6個(gè)不同參數(shù)(創(chuàng)面面積，肉芽組織，炎癥，礦化作用，痂形成，以及創(chuàng)面深度)下，通 過(guò)O (無(wú)表現(xiàn))，1 (輕微)，2 (中度)，以及3 (嚴(yán)重)的計(jì)分系統(tǒng)，描述使用不同的環(huán)狀富組蛋白治療的愈合過(guò)程的表格。圖2B圖示了使用環(huán)狀富組蛋白療法治療創(chuàng)傷使其愈合的結(jié)果。圖3圖示了在人類原代細(xì)胞培養(yǎng)中，與酮康唑的毒性相比，環(huán)狀富組蛋白類似物缺乏毒性；以及圖4圖示了比較環(huán)狀富組蛋白類似物與多鏈絲霉素的創(chuàng)傷愈合活性。具體描述本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物中的創(chuàng)傷的方法。此方法包括對(duì)創(chuàng)傷給予治療有效量的環(huán)狀富組蛋白5類似物或其功能相同的衍生物。富組蛋白5是具有以下氨基酸序列,DSHAKRHHGYKRFHEKHHSHRGYMSEQ ID No:1)的抗菌肽。環(huán)狀富組蛋白5類似物是富組蛋白5的環(huán)化形式，例如在富組蛋白5內(nèi)部相距約5到14個(gè)氨基酸殘基的殘基之間成內(nèi)部鍵，導(dǎo)致富組蛋白5的環(huán)化。在富組蛋白5內(nèi)部的氨基酸殘基可以被一個(gè)或多個(gè)適于導(dǎo)致其環(huán)化的殘基替換(例如，用可環(huán)化的氨基酸殘基如賴氨酸，谷氨酸或者半胱氨酸殘基替換)來(lái)提供可通過(guò)這些殘基容易地環(huán)化的富組蛋白5類似物。因此，適合的富組蛋白5類似物顯示出與富組蛋白5的高度序列同源性，例如，至少約90-95%的序列同源性。這種類似物的一個(gè)實(shí)例是DSHAKRHH￡YKRFHEKHHSHR￡Y(SEQID No:2)0應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，其他合適的環(huán)狀類似物可能在富組蛋白5序列內(nèi)部的不同位點(diǎn)包括可環(huán)化殘基。圖1中示出了其他合適位點(diǎn)。功能相同的衍生物也包括在內(nèi)，其中包括具有合適的替換來(lái)包含可環(huán)化的氨基酸殘基的富組蛋白5的剪切后的版本，以及在其任意一端包含附加的末端氨基酸的衍生物。術(shù)語(yǔ)“功能相同的”指保持了環(huán)化富組蛋白5的治療創(chuàng)傷的活性的衍生物。術(shù)語(yǔ)“衍生物”也包括在活性位點(diǎn)上(例如游離羧基或者氨基基團(tuán)或者其他側(cè)鏈基團(tuán))的修飾?？蛇M(jìn)行這些修飾以賦予富組蛋白類似物或衍生物需要的性質(zhì)，例如增加的穩(wěn)定性，或提高的細(xì)胞攝取。在一實(shí)施方案中，環(huán)狀富組蛋白類似物包括序列RHHGYKRFHEKHHSHRGY(SEQ ID N0.25)，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基被選自谷氨酸、賴氨酸、半胱氨酸和含巰基氨基酸的氨基酸替換以允許環(huán)化。富組蛋白5環(huán)狀類似物的制備在美國(guó)專利第6，555，650號(hào)被描述，其內(nèi)容都以引用的方式并入本文中，并通常包含了肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方法，及之后提供環(huán)狀類似物的環(huán)化反應(yīng)。富組蛋白5或其變體經(jīng)由修飾來(lái)并入可環(huán)化的氨基酸殘基，例如，適于形成環(huán)化的富組蛋白類似物的殘基，如賴氨酸，谷氨酸與/或半胱氨酸，這些殘基合適地分布，例如相距約5至14個(gè)氨基酸殘基來(lái)形成環(huán)化的長(zhǎng)約7至16個(gè)氨基酸殘基的環(huán)。然后環(huán)狀類似物可被制備。環(huán)化反應(yīng)可包括賴氨酸殘基的游離氨基基團(tuán)與谷氨酸殘基的游離羧基基團(tuán)的反應(yīng)，來(lái)形成內(nèi)酰胺(酰胺)鏈，導(dǎo)致環(huán)的形成。然而，天然存在于富組蛋白5的16號(hào)位的谷氨酸殘基，應(yīng)優(yōu)選地保持完整并在環(huán)化中不被使用，因?yàn)槠湓诮K產(chǎn)物的活性中起作用。據(jù)此，優(yōu)選引入谷氨酸作為替換氨基酸基團(tuán)，用于與賴氨酸反應(yīng)的目的，以通過(guò)酰胺基團(tuán)形成環(huán)狀類似物。參與環(huán)化反應(yīng)的賴氨酸也可作為替換基團(tuán)被引入，或者可選地，天然存在于富組蛋白內(nèi)部的賴氨酸也可以使用。形成環(huán)化的富組蛋白類似物的環(huán)化作用可以通過(guò)富組蛋白內(nèi)部半胱氨酸殘基的反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，或天存在于富組蛋白內(nèi)部或通過(guò)替換引入。富組蛋白肽鏈中的半胱氨酸殘基易反應(yīng)形成二硫鍵，賦予必要的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。盡管鍵在化學(xué)上是可逆的，它們足夠穩(wěn)定以達(dá)到本發(fā)明中的化合物的標(biāo)準(zhǔn)。作為半胱氨酸的備選物，其他含巰基的氨基酸，例如同型半胱氨酸或者青霉胺，也可以作為替換氨基酸使用。根據(jù)本發(fā)明，具有兩個(gè)二硫鍵或者一個(gè)二硫鍵和一個(gè)內(nèi)酰胺鍵的二環(huán)類似物也可被制備并使用，以及頭尾相連的環(huán)化的類似物。環(huán)化可通過(guò)其他化學(xué)的手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)硫醚鍵。包含半胱氨酸替換物以及通過(guò)二硫基團(tuán)環(huán)化的肽可以通過(guò)游離線性肽在具有半胱氨酸選擇性保護(hù)的碳酸氫銨溶液(例如0.1M)中的空氣氧化制備。內(nèi)酰胺環(huán)化的肽可以通過(guò)以下來(lái)制備:在溫和的條件下，在肽段仍然連接在樹(shù)脂上并且其他側(cè)鏈仍然被保護(hù)的同時(shí)，通過(guò)Pd(O)催化劑選擇性去除Aloc/Allyl Lys和Glu側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。這樣使用(苯并三唑氧基)-三(二甲胺基)磷-六氟磷酸鹽(pyBOPO與HOBt為偶聯(lián)劑，或者用其他常見(jiàn)偶聯(lián)劑)在側(cè)鏈之間可以形成酰胺鍵。環(huán)狀富組蛋白5類似物及其衍生物有用于治療哺乳動(dòng)物中的創(chuàng)傷。本文使用的術(shù)語(yǔ)“創(chuàng)傷”指皮膚的任何損傷，包括開(kāi)放性與封閉性創(chuàng)傷二者，例如切口，裂傷，擦傷，刺傷，穿透性創(chuàng)傷，鈍器外力損傷引起的創(chuàng)傷，燒傷，以及粘膜表面創(chuàng)傷例如口腔，眼睛和陰道表面，以及包括皮膚潰瘍，例如壓力性，動(dòng)脈，靜脈和糖尿病潰瘍?cè)趦?nèi)的慢性傷口。創(chuàng)傷有可能或可能不會(huì)由微生物感染引起，或者有可能或可能不會(huì)特征為微生物的存在。本文使用的與創(chuàng)傷相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“治療”指使創(chuàng)傷改善或者愈合。創(chuàng)傷愈合可在以下參數(shù)的基礎(chǔ)上檢測(cè)，例如創(chuàng)面面積，肉芽組織，炎癥，礦化作用，痂形成，以及創(chuàng)面深度，因此通過(guò)一個(gè)或多個(gè)這些參數(shù)中的進(jìn)展程度，包括創(chuàng)傷閉合程度，而顯而易見(jiàn)。因此，這些參數(shù)中的一個(gè)或多個(gè)的進(jìn)展的至少約10%，或創(chuàng)傷閉合的至少約10%，指示創(chuàng)傷愈合。也可以確定這些參數(shù)的視覺(jué)觀察到的累積分?jǐn)?shù)(其中O為健康，I為輕微，2為中等，3為嚴(yán)重)從而確定創(chuàng)傷的愈合。因此，創(chuàng)傷中這些參數(shù)的累積分?jǐn)?shù)的降低指示創(chuàng)傷愈合，例如累計(jì)分?jǐn)?shù)降低約10%，優(yōu)選20%和更優(yōu)選的30%或更高，指示創(chuàng)傷愈合。本文使用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”包括人類與非人類哺乳動(dòng)物兩者。對(duì)哺乳動(dòng)物給予治療有效的劑量的環(huán)狀富組蛋白5類似物或衍生物來(lái)治療創(chuàng)傷。本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效的”劑量指治療給定創(chuàng)傷有效而不導(dǎo)致不可接受的有害副作用的劑量。術(shù)語(yǔ)“給予”指向接受者提供環(huán)狀富組蛋白劑量的任意合適的方式，所述方式依賴于如下所述的所用的給藥形式。例如，如下文所詳述的，所述藥劑可以通過(guò)口服，注射，經(jīng)粘膜和局部方式給予。因此，本方法的治療有效劑量為每kg體重0.0lmg至約lOOmg，例如，約0.05mg/千克至約50mg/千克。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的，所述富組蛋白5環(huán)化類似物或衍生物的有效劑量根據(jù)待治療患者的癥狀，年齡，體重，待治療創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度和形成原因，使用的富組蛋白類似 物，以及給藥方式而變化。本發(fā)明的富組蛋白5類似物或衍生物可通過(guò)單次劑量或者分次劑量給藥。
在創(chuàng)傷的治療中，可單獨(dú)或者以與藥物可接受的佐劑或載體結(jié)合的組合物的形式給予所述環(huán)狀富組蛋白5類似物或衍生物。表述“藥物可接受的”指在藥學(xué)領(lǐng)域使用是可接受的，即沒(méi)有不可接受的毒性或不適合對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行給藥的性質(zhì)。藥物可接受的佐劑實(shí)例包括但不限于，稀釋劑，賦形劑等?？蓞⒖肌癛emington’s:The Science and Practice ofPharmacy (雷明頓:藥劑學(xué)科學(xué)與實(shí)踐)〃，21st Ed., Lippincott ffilliams&ffilkins, 2005,作為一般藥物制劑的指南。佐劑選擇依賴于擬采用的給予所述組合物的方式。在本發(fā)明一實(shí)施方案中，將所述化合物配置為通過(guò)輸注方式或者通過(guò)皮下或靜脈注射給藥，并且因此以無(wú)菌和無(wú)熱原的并任選地被緩沖或等滲的水溶液使用。因此，所述化合物可在蒸餾水中或者更優(yōu)選地，在生理鹽水中，磷酸鹽緩沖生理鹽水或5%葡萄糖溶液中被給藥。制備用于通過(guò)片劑，膠囊，錠劑，水或非水液體中的溶液或懸浮液，水包油或者油包水乳液，酏劑，或糖漿來(lái)口服給藥的組合物，使用的佐劑包括糖類，例如乳糖，葡萄糖與蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉與馬鈴薯淀粉；纖維素與其衍生物，包括羥甲基纖維素鈉，乙基纖維素和醋酸纖維素；西黃芪膠粉；麥芽；明膠；滑石粉；硬脂酸；硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油如花生油，棉籽油，芝麻油，橄欖油和玉米油；多元醇，如丙二醇，甘油，山梨醇，甘露糖醇和聚乙二醇；瓊脂；藻酸；水；等滲生理鹽水和磷酸鹽緩沖溶液。也可存在濕潤(rùn)劑，潤(rùn)滑劑如月桂基硫酸鈉，穩(wěn)定齊U，制錠劑，崩解劑，抗氧化劑，防腐劑，著色劑與調(diào)味劑。在另一實(shí)施方案中，所述環(huán)狀類似物可被配制為用于局部施用的霜?jiǎng)?，洗劑或軟膏。?duì)于這種局部施用，所述環(huán)狀類似物與合適的基質(zhì)如甘油三酯基質(zhì)結(jié)合。這些霜?jiǎng)?，洗劑和軟膏還可包含表面活性劑和其他化妝品用添加劑例如柔膚水等以及香水。也可使用合適的推進(jìn)劑佐劑制備用于例如鼻腔給藥的氣霧制劑。本發(fā)明組合物也可作為丸劑，藥糖劑，或貼劑給藥。還包括粘膜給藥的組合物，包括口服，鼻內(nèi)，直腸或陰道給藥以治療這些區(qū)域的創(chuàng)傷。這些組合物通常包括一種或多種合適的非刺激性賦形劑或載體，包括例如可可脂，聚乙二醇，栓劑蠟，水楊酸鹽或其他合適的載體。不管所述組合 物是如何被給藥的，也可將例如有助于延長(zhǎng)所述組合物保質(zhì)期的其他佐劑加入到所述組合物中。在特定實(shí)施方案中，與可吸收的水凝膠材料，例如凍干膠原預(yù)混合的環(huán)狀富組蛋白5類似物或衍生物可在創(chuàng)傷處被局部施用。富組蛋白類似物也可被附加于聚合物或者其他基質(zhì)，例如適用于直接施用在創(chuàng)面上的膠布或者聚合物網(wǎng)狀物。通過(guò)生物工程改造的表達(dá)能愈合創(chuàng)傷的富組蛋白5類似物或衍生物的皮膚成纖維細(xì)胞/角質(zhì)形成細(xì)胞也可以應(yīng)用于創(chuàng)傷。合適的基質(zhì)或聚合物網(wǎng)狀物，例如人造或非人造的皮片，可任選地用選擇的富組蛋白5類似物或衍生物進(jìn)行注入來(lái)施用在創(chuàng)傷處以允許富組蛋白5類似物或衍生物緩慢釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)在一段時(shí)期內(nèi)對(duì)創(chuàng)傷的持續(xù)治療。在另一方面，所述的富組蛋白5環(huán)狀類似物或衍生物可與一種或多種其他治療劑結(jié)合，給予需要?jiǎng)?chuàng)傷治療的哺乳動(dòng)物，所述其他治療劑包括例如，創(chuàng)傷愈合因子例如生長(zhǎng)因子，例如表皮生長(zhǎng)因子，bFCF，PDGF ;血小板，皮膚成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞。在此方面，環(huán)狀富組蛋白5類似物或衍生物可被單獨(dú)地在獨(dú)立的劑型中或在組合的劑型中一起，被給予接受創(chuàng)傷治療的哺乳動(dòng)物中。所述的愈合創(chuàng)傷的富組蛋白5類似物或衍生物可進(jìn)一步在組合療法中使用，例如，其中激光療法在創(chuàng)傷位點(diǎn)應(yīng)用，與多次的環(huán)狀富組蛋白肽應(yīng)用一起促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。本發(fā)明的又一方面提供了制品，包括包裝和包含富組蛋白5環(huán)狀類似物或其功能相同的衍生物的組合物。所述包裝上貼有標(biāo)簽以指示所述組合物適于治療創(chuàng)傷。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或者可通過(guò)使用不超過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)確定本文所述的具體實(shí)施方案的許多等價(jià)方式。盡管已經(jīng)討論了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，然而上述說(shuō)明是為了闡釋而非限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在閱讀本說(shuō)明書的基礎(chǔ)上清楚地理解本發(fā)明的許多變化方案。本發(fā)明的全部范圍應(yīng)依照本權(quán)利要求及其全部等價(jià)范圍，以及本說(shuō)明書與這些變化方案而確定。后面的權(quán)利要求意欲包括這些等價(jià)方式。以下具體實(shí)施例是為了描述本發(fā)明的實(shí)施方案，而不應(yīng)被認(rèn)為是限制。實(shí)施例1-DB2121治療創(chuàng)傷的活性材料與方法:DB2121為在機(jī)構(gòu)內(nèi)使用肽合成器與建立的方法合成的富組蛋白5的環(huán)狀衍生物。DB2121被確認(rèn)為環(huán)狀肽(如圖1所示)，質(zhì)量為2558.23g/mol，具有N-RHHCYKRKFHEKHHCHRGY-C的氨基酸序列?；衔锸褂肏PLC純化以達(dá)到至少95%的純度并凍干。然后將20毫克的DB2121重懸浮在IOmM的Tris_Cl，pH7.2，在4° C空氣氧化過(guò)夜，然后作為原液在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用。確切的質(zhì)量通過(guò)直接注入通過(guò)MassLynX4.0軟件操作的Micromass ES1-Qtof Quattro 微質(zhì)譜儀來(lái)確定。酮康唑購(gòu)自 Sigma Chemical C0. BALB/c小鼠由 Charles River 提供,在大學(xué)動(dòng)物護(hù)理設(shè)施(Universities’Animal Care Facility)飼養(yǎng)。首先至少使小鼠適應(yīng)環(huán)境48小時(shí)，以實(shí)驗(yàn)之前確認(rèn)其健康。戊巴比妥，Euthanyl，丁丙諾啡和氯已定購(gòu)自Sigma Chemical C0.。所有對(duì)動(dòng)物實(shí)施的步驟均通過(guò)西安大略大學(xué)的動(dòng)物飼養(yǎng)與使用委員會(huì)(Animal Care and Use Committee at the University of WesternOntario)的許可。BALB/c小鼠在手術(shù)的當(dāng)天稱重并用異氟醚氣體麻醉(通過(guò)放置在一個(gè)密閉容器中，以I升/分鐘給予氧氣和4%異氟醚)。麻醉完畢將小鼠轉(zhuǎn)移至機(jī)構(gòu)內(nèi)的鼻面罩系統(tǒng)并為手術(shù)保持I升/分鐘的氧氣和4%異氟醚。通過(guò)剃除背部和胸部表面的毛制備小鼠。剃除區(qū)域使用氯已定肥皂和乙醇清潔。腹膜內(nèi)注射一次濃度為0.05mg/kg的叔丁啡來(lái)控制疼痛。然后用6mm的圓形活檢穿·孔器進(jìn)行手術(shù)，所述手術(shù)由在背部和胸部區(qū)域兩處皮膚缺損組成。位于尾部的皮膚缺陷注入了 25微升無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)。位于顱部的創(chuàng)傷注入了 25微升不同濃度的受試物(在無(wú)菌PBS中的10mg/kg, lmg/kg,或0.lmg/kg的DB2121或無(wú)菌PBS中的10mg/kg酮康唑)。創(chuàng)面保持暴露，小鼠允許休息恢復(fù)15分鐘。然后，小鼠轉(zhuǎn)移回單獨(dú)的籠內(nèi)并且保持充足的食物和水，保持7天。在第7天，將Balb/c小鼠處死，提取血液，供后續(xù)分析。然后使用手術(shù)刀切除皮膚傷口，并立即放在室溫福爾馬林中固定。經(jīng)過(guò)48小時(shí)的固定期，使用既定的程序，用不同濃度的PBS/乙醇洗滌組織樣品，放置在組織學(xué)檢查室，并最終在石蠟中過(guò)夜包埋。將包埋的皮膚組織切片，厚度為5 μ m，并放置在顯微鏡玻片上。所有的玻片最后使用蘇木精/伊紅染色，并在室溫下儲(chǔ)存。使用視覺(jué)上的評(píng)分系統(tǒng)來(lái)衡量創(chuàng)傷愈合過(guò)程的進(jìn)展，它具有6種不同的參數(shù)，即損傷大小，肉芽組織，炎癥，礦化作用，痂形成，損傷深度。將每個(gè)參數(shù)的得分在單獨(dú)的部分記錄為兩份，根據(jù)等級(jí)為O (健康)，1 (輕微)，2 (中度)，3 (重度)。正如在圖2A中顯示的，隨后將每個(gè)處理的每個(gè)參數(shù)的分?jǐn)?shù)相加，這個(gè)最后的總數(shù)被稱為累積分?jǐn)?shù)，低的累積分?jǐn)?shù)意味著組織被認(rèn)為基本上愈合，而高的分?jǐn)?shù)意味著創(chuàng)傷仍然處于不同嚴(yán)重程度的愈合過(guò)程中。計(jì)算每次處理的累積分?jǐn)?shù)的所觀察到的平均值和標(biāo)準(zhǔn)平均值，并繪制在條形圖上(圖2B)。采用單因素方差分析(每個(gè)處理組與對(duì)照組)使用Tukey方法的確定結(jié)果的顯著性。至少p〈0.05的置信區(qū)間被認(rèn)為是顯著的。圖2A/B顯示的結(jié)果表明，在每個(gè)被測(cè)濃度，DB2121顯著地促進(jìn)了傷口愈合過(guò)程(**P〈0.01 ;_Ρ〈0.001)，在 DB2121 濃度為 lmg/kg 時(shí)累積得分低至 9.2+/-2.56，(生理鹽水對(duì)照組的累積得分為24.9+/-1.28)。組織學(xué)的直接觀察清楚地顯示了由對(duì)皮膚缺損引入DB2121而改善的傷口愈合過(guò)程。7天后，對(duì)照組的創(chuàng)傷顯示出炎癥，仍然包含焦痂(痂)組織，具有不完全的表皮，最終出現(xiàn)不均勻分布深色的肉芽組織；創(chuàng)傷的所有標(biāo)志位于創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的早期階段。然而，DB2121對(duì)皮膚缺陷的治療導(dǎo)致了改善的愈合，通過(guò)覆蓋整個(gè)創(chuàng)傷寬度的完全形成的表皮，不明顯的焦痂組織，減輕的紅腫，以及缺少炎癥細(xì)胞和深色肉芽組織說(shuō)明。進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)來(lái)比較DB2121與對(duì)創(chuàng)傷愈合有貢獻(xiàn)的已有產(chǎn)物多鏈絲霉素的創(chuàng)傷愈合活性。如圖4所示，DB2121的創(chuàng)傷愈合活性與多鏈絲霉素相當(dāng)。實(shí)施例2-DB2121的毒性

還在人類細(xì)胞中進(jìn)行了 DB2121的毒性研究。依照Min et al.2004.NatBiotechnol22:717-23中所述的方法，使用原代人類新生兒包皮上皮細(xì)胞檢測(cè)DB2121的毒性，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式并入本文中。簡(jiǎn)言之，當(dāng)所述細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將(A) 50 μ M DB2121、Β)50μΜ富組蛋白Η5、(C) 50 μ M酮康唑或(D) DMSO加入所述培養(yǎng)基中。在加入化合物后18和36小時(shí)，用相差顯微鏡在20倍的放大倍數(shù)下對(duì)所述包皮上皮細(xì)胞成像。圖像分析后，立即通過(guò)SDS-PAGE凝膠提取、分離蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡并檢測(cè)磷酸化和非磷酸化的ERK1、2以監(jiān)測(cè)所述包皮角化細(xì)胞的細(xì)胞鋪展/遷移和/或增殖。所述實(shí)驗(yàn)重復(fù)二次。前述處理之后，除用酮康唑處理以外，人類原代細(xì)胞顯示形態(tài)學(xué)正常。酮康唑?qū)Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞的毒性是已知的。然后研究這些表型是否在分子水平上有所反映。將所述原代細(xì)胞裂解并監(jiān)測(cè)稱為磷酸化ERK1、2的增殖標(biāo)志物。與對(duì)照相比，在用酮康唑處理的細(xì)胞中可觀察到ERK1，2活化的明顯抑制。相反，與對(duì)照相比，在用DB2121處理的細(xì)胞中活化的ERK1，2未被抑制。兩種研究都表明DB2121在50 μ M的工作濃度下對(duì)人類原代細(xì)胞是無(wú)毒的。為測(cè)定DB2121的無(wú)毒性濃度范圍，將多種濃度的DB2121和作為對(duì)照的50 μ M的酮康唑或DMSO分別加入原代人類包皮上皮細(xì)胞培養(yǎng)物中。在加入后0、36和72小時(shí)，從培養(yǎng)皿中取出所述上皮細(xì)胞并測(cè)定存活細(xì)胞數(shù)。所述試驗(yàn)重復(fù)三次。在第72小時(shí)時(shí)，用相差顯微鏡在20倍放大倍數(shù)下對(duì)暴露于各種化合物的包皮上皮細(xì)胞成像。為進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法將所述上皮細(xì)胞染色以監(jiān)測(cè)細(xì)胞存活率。圖3中表明這些結(jié)果顯示與酮康唑相比，DB2121在原代培養(yǎng)細(xì)胞中具有極低的毒性和良好的毒性特征。此外，當(dāng)通過(guò)腹膜內(nèi)途徑注射時(shí)，小鼠能夠耐受15mg/kg濃度的DB2121。當(dāng)對(duì)成年大鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)注射時(shí)，最高達(dá)且包括1.5mg/kg的濃度是無(wú)害的。實(shí)施例3-DB2121的穩(wěn)定性質(zhì)譜測(cè)定顯示DB2121環(huán)狀類似物可在人類唾液中可體外穩(wěn)定至少72小時(shí)。將所述環(huán)狀類似物在I μ M濃度和37° C溫度下在人類唾液中體外孵育。在從O到72小時(shí)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取1.0 μ I的等分試樣直接注射到Micromass Quattro Micro質(zhì)譜儀中。收集總計(jì)3分鐘的數(shù)據(jù)。然后用Mass Lynx4.0Analysis軟件處理所述數(shù)據(jù)。以活性形式存在的環(huán)狀類似物的預(yù)期平均質(zhì)量為2557.93。顯示環(huán)狀富組蛋白類似物在人類唾液中可存在高達(dá)至少72小時(shí)的孵育。對(duì)應(yīng)于環(huán)狀富組蛋白類似物的在約I質(zhì)量單位的可接受誤差范圍內(nèi)的峰值為在O小時(shí)2556.95、在24小時(shí)2557.65和在72小時(shí)2557.10 。
權(quán)利要求
1.治療哺乳動(dòng)物的創(chuàng)傷的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予治療有效量的富組蛋白5環(huán)狀類似物或其功能上相同的衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述環(huán)狀類似物包括序列RHHGYKRFHEKHHSHRGY(SEQID N0.25)，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基被選自半胱氨酸、谷氨酸、賴氨酸和含巰基氨基酸的氨基酸替換以允許所述富組蛋白環(huán)化。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述環(huán)狀類似物具有選自以下的氨基酸序列:DSHAKRHHCYKRFHEKHHSHRCY,RHHCYKRKFHEKHHSHRCY, RHHCYKRKFHEKHHSHRGC,RHHCYKRKFHEKHHSHCGY, RHHCYKRKFHEKHHSCRGY, RHHCYKRKFHEKHHCHRGY, RHHCYKRKFHEKHCSHRGY,RHHCYKRKFHEKCHSHRGY, RHHGCKRKFHEKHHSHCGY,RHHGYKRKCHEKHHCHRGY, RHHGYKRCFHEKHHCHRGY,RHHGYKCKFHEKHHCHRGY, RHHGYCRKFHEKHHCHRGY,RHHGCKRKFFIEKHHCHRGY, RHHGYKCKFHEKHHSCRGY,RHHCYKRKFHEKHHCHRGY, RHHCYKRKFHEKHHCHRG,RHHCYKRKFHEKHHCHR, RHHCYKRKFHEKHHCH,RHHCYKRKFHEKHHC, (D)RHHCYKRKFHEKHHCHRG(D) Y,RHHCYKRKFHEKHHCHRGY-NH2 和RHHCffKRKFHEKHHCHRGY。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述環(huán)狀類似物中的一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基被選自谷氨酸、賴氨酸和其他含巰基氨基酸的氨基酸替換以允許環(huán)化。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述環(huán)狀類似物是用富組蛋白5制備的，其中所述富組蛋白氨基酸的至少一個(gè)被選自谷氨酸、賴氨酸、半胱氨酸和其他含巰基氨基酸的氨基酸替換以允許環(huán)化。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述創(chuàng)傷為選自以下的皮膚損傷:切口，裂傷，擦傷，刺傷，穿透性創(chuàng)傷，鈍器外力損傷引起的創(chuàng)傷，燒傷，粘膜創(chuàng)傷，壓力性潰瘍，動(dòng)脈潰瘍，靜脈潰瘍和糖尿病潰瘍。
7.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述類似物以每kg體重約0.0lmg至約IOOmg的劑量給予。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述類似物與選自以下的其他治療劑一起給予:表皮生長(zhǎng)因子，bFCF，TOGF，血小板，皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述類似物與基質(zhì)混合或附加于基質(zhì)給予，所述基質(zhì)選自:水凝膠，聚合物，皮膚成纖維細(xì)胞/角質(zhì)形成細(xì)胞以及人造或非人造的皮片。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述類似物與激光療法組合對(duì)創(chuàng)傷給予。
11.適用于創(chuàng)傷治療的組合物，包括富組蛋白5環(huán)狀類似物或其功能上相同的衍生物和至少一種藥物可接受的載體。
12.如權(quán)利要求11所定義的組合物，其中所述環(huán)狀類似物包括序列RHHGYKRFHEKHHSHRGY(SEQ ID N0.25)，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基被選自半胱氨酸、谷氨酸、賴氨酸和含巰基氨基酸的氨基酸替換以允許所述富組蛋白環(huán)化。
13.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述環(huán)狀類似物具有選自以下的氨基酸序列:DSHAKRHHCYKRFHEKHHSHRCY,RHHCYKRKFHEKHHSHRCY, RHHCYKRKFHEKHHSHRGC,RHHCYKRKFHEKHHSHCGY, RHHCYKRKFHEKHHSCRGY,RHHCYKRKFHEKHHCHRGY, RHHCYKRKFHEKHCSHRGY,RHHCYKRKFHEKCHSHRGY, RHHGCKRKFHEKHHSHCGY,RHHGYKRKCHEKHHCHRGY, RHHGYKRCFHEKHHCHRGY,RHHGYKCKFHEKHHCHRGY, RHHGYCRKFHEKHHCHRGY,RHHGCKRKFFIEKHHCHRGY, RHHGYKCKFHEKHHSCRGY,RHHCYKRKFHEKHHCHRGY, RHHCYKRKFHEKHHCHRG,RHHCYKRKFHEKH HCHR, RHHCYKRKFHEKHHCH,RHHCYKRKFHEKHHC, (D)RHHCYKRKFHEKHHCHRG(D) Y,RHHCYKRKFHEKHHCHRGY-NH2 和RHHCffKRKFHEKHHCHRGY。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述環(huán)狀類似物中的一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基被選自谷氨酸、賴氨酸和其他含巰基氨基酸的氨基酸替換以允許環(huán)化。
15.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述環(huán)狀類似物是用富組蛋白5制備的，其中所述富組蛋白氨基酸的至少一個(gè)被選自谷氨酸、賴氨酸、半胱氨酸和其他含巰基氨基酸的氨基酸替換以允許環(huán)化。
16.如權(quán)利要求11所述的組合物，其與選自以下的其他治療劑結(jié)合:表皮生長(zhǎng)因子，bFCF, PDGF,血小板，皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述類似物與基質(zhì)混合或附加于基質(zhì)，所述基質(zhì)選自水凝膠，聚合物，皮膚成纖維細(xì)胞/角質(zhì)形成細(xì)胞以及人造或非人造的皮片。
18.制品，包括包裝和包含富組蛋白5環(huán)狀類似物的組合物，其中所述包裝貼有標(biāo)簽以指示所述組合物適于治療哺乳動(dòng)物的創(chuàng)傷。
19.如權(quán)利要求18所定義的制品，其中所述環(huán)狀類似物包括序列RHHGYKRFHEKHHSHRGY(SEQ ID N0.25)，其中一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基被選自半胱氨酸、谷氨酸、賴氨酸和含巰基氨基酸的氨基酸替換以允許所述富組蛋白環(huán)化。
20.如權(quán)利要求19所述的制品，其中所述環(huán)狀類似物具有選自以下的氨基酸序列:DSHAKRHHCYKRFHEKHHSHRCY,RHHCYKRKFHEKHHSHRCY, RHHCYKRKFHEKHHSHRGC,RHHCYKRKFHEKHHSHCGY, RHHCYKRKFHEKHHSCRGY,RHHCYKRKFHEKHHCHRGY, RHHCYKRKFHEKHCSHRGY,RHHCYKRKFHEKCHSHRGY, RHHGCKRKFHEKHHSHCGY,RHHGYKRKCHEKHHCHRGY, RHHGYKRCFHEKHHCHRGY,RHHGYKCKFHEKHHCHRGY, RHHGYCRKFHEKHHCHRGY,RHHGCKRKFFIEKHHCHRGY, RHHGYKCKFHEKHHSCRGY,RHHCYKRKFHEKHHCHRGY, RHHCYKRKFHEKHHCHRG,RHHCYKRKFHEKHHCHR, RHHCYKRKFHEKHHCH,RHHCYKRKFHEKHHC, (D)RHHCYKRKFHEKHHCHRG(D)Y, RHHCYKRKFHEKHHCHRGY-NH2 和 RHHCWKRKFHEKHHCHRGY。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療創(chuàng)傷的組合物和方法。組合物包括富組蛋白(5)環(huán)狀類似物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK103249426SQ201180057165
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者吉萊斯·安德烈·拉喬伊, 格雷格·約翰·亞當(dāng)斯·維爾克 申請(qǐng)人:西安大略大學(xué)