專利名稱：人單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人單克隆抗體分子。具體而言，它涉及針對人CD81的人抗體分子和含有該分子作為有效成分的藥物組合物。
背景技術(shù)：
腸是消化和吸收對生物的生命活動(dòng)必需的養(yǎng)分和水的器官。同時(shí)，它們也是具有用于逐出外來物質(zhì)(如病原體)的免疫防御性能并且通過以充分平衡的方式控制相反性質(zhì)而維持生命的器官。然而已知當(dāng)這些功能的平衡變得反常時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞而引起多種腸病。特別地，炎性腸病(縮寫為IBD)(其患者數(shù)目近年來已經(jīng)增加)與消化器官中的異常如腹痛、腹瀉、粘血便等相關(guān)，并且就其病變狀態(tài)而言，劃分成潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎。
潰瘍性結(jié)腸炎是主要顯示限于大腸的彌散性腸粘膜炎癥的疾病，其中反復(fù)炎癥導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)作，通常是需要手術(shù)的，并造成排便頻率增加、糞便泄露及囊炎(pouchitis)發(fā)作的術(shù)后問題。節(jié)段性回腸炎是一種疾病，其顯示從小腸擴(kuò)展至大腸的病變和從粘膜下層開始的強(qiáng)烈非連續(xù)的全部層炎癥，其中反復(fù)炎癥導(dǎo)致需要手術(shù)的腸并發(fā)癥(狹窄、瘺、膿腫)(非專利文獻(xiàn)I)。
近年來，已經(jīng)已知抗TNF-a抗體作為節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎的治療劑有效(非專利文獻(xiàn)2)。另外，已經(jīng)報(bào)道抗a 4整聯(lián)蛋白抗體那他珠單抗(Natalizumab)作為節(jié)段性回腸炎的治療藥有效(非專利文獻(xiàn)3)。然而，在包括抗體的現(xiàn)有療法，40-60%的IBD患者仍沒有接受具有令人滿意的醫(yī)學(xué)治療。因而，開發(fā)有效治療藥已經(jīng)成為醫(yī)療護(hù)理中的迫切要求(非專利文獻(xiàn)4)。
CD81是一種在廣泛類型細(xì)胞中表達(dá)的26kDa細(xì)胞表面分子。它具有下述活性:通過與B細(xì)胞中的⑶21、⑶19 和Leul3形成復(fù)合體降低B細(xì)胞活化的閾值。在T細(xì)胞中，它與⑶4和⑶8締合以轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激信號至細(xì)胞中?？紤]到這些因素，認(rèn)為⑶81在針對異源抗原的免疫反應(yīng)中具有顯著作用。另外，它在生理和功能上參與多種整聯(lián)蛋白以激活B細(xì)胞中的VLA-4 ( a 4 @ I整聯(lián)蛋白)或胸腺細(xì)胞中的LFA_1 ( a L @ 2整聯(lián)蛋白)。
作為與CD81相關(guān)的疾病，丙型肝炎是已知的(非專利文獻(xiàn)5)。
近年來，已經(jīng)報(bào)道抗⑶81抗體用于IBD的治療(專利文獻(xiàn)I)。IBD與T細(xì)胞遷移相關(guān)(非專利文獻(xiàn)3、6和7)。作為與T細(xì)胞遷移相關(guān)的其他疾病，多發(fā)性硬化和牛皮癬是已知的(非專利文獻(xiàn)3、8和9)。
具體而言，已經(jīng)報(bào)道，患有IBD (如節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎)的患者的腸粘膜層T細(xì)胞或外周血T細(xì)胞高度表達(dá)趨化因子受體CXCR4并且顯示出針對趨化因子CXCL12的強(qiáng)烈趨化應(yīng)答(非專利文獻(xiàn)6)，并且通過向IBD模型(硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型)施用CXCR4抑制劑治愈結(jié)腸炎(非專利文獻(xiàn)7)，以及通過抑制T細(xì)胞遷移治療IBD的抗a 4整聯(lián)蛋白抗體那他珠單 抗已經(jīng)被批準(zhǔn)作為醫(yī)藥品(非專利文獻(xiàn)3)。
也已經(jīng)報(bào)道，T細(xì)胞遷移對于多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型(實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)小鼠)的病理學(xué)是重要的(非專利文獻(xiàn)8)。認(rèn)為那他珠單抗在EAE小鼠中通過阻斷α4整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的循環(huán)T細(xì)胞與血腦屏障黏附發(fā)揮其治療功效(非專利文獻(xiàn)3)。那他珠單抗也有效用于多發(fā)性硬化的治療。
另外，已經(jīng)報(bào)道，T細(xì)胞大量地在牛皮癬皮膚中積累并且抑制T細(xì)胞遷移的抗LFA-1抗體依法珠單抗(商品名=Raptiva)有效用于牛皮癬的治療(非專利文獻(xiàn)9)。
當(dāng)需要向人類臨床應(yīng)用抗CD81抗體時(shí)，出現(xiàn)基于物種差異的各種問題。例如，向人施用小鼠抗體可能受血清半壽期短、無法觸發(fā)某些類型的人類效應(yīng)子功能和誘導(dǎo)針對小鼠抗體的不利人免疫反應(yīng)(“人抗小鼠抗體”(HAMA)反應(yīng))限制([非專利文獻(xiàn)10和11)。另夕卜，甚至抗TNFa抗體(英利昔單抗(Remicade))(其是通過將嚙齒類抗體可變(V)區(qū)與人抗體恒定(C)區(qū)結(jié)合所獲得的嵌合分子)可能誘導(dǎo)人抗嵌合抗體(HACA)并引起輸注反應(yīng)或藥物功效喪失(非專利文獻(xiàn)12)。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn) 1:W02005/021792
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) I Jnflamm.Bowel.Dis.，8，244-250，2002 非專利文獻(xiàn) 2:N.Engl.J.Med.，353，2462-2476，2005 非專利文獻(xiàn) 3:J.Clin.1nvest.，118，825-826，2008 非專利文獻(xiàn) 4:J.Clin.Gastroenterol.，41，799-809，2007 非專利文獻(xiàn) 5:Science, 282，938-941，1998 非專利文獻(xiàn) 6 Jnflamm.Bowel Dis.，16 (4)，583-592，2010 非專利文獻(xiàn) 7:J.Pharmacol.Exp.Ther.，327 (2)，383-392，2008 非專利文獻(xiàn) 8:J.Neuroimmuno1.，60，17-28，1995
非專利文獻(xiàn) 9:Expert Opinion on Biological Therapy, 3 (2), 361-370, 2003非專利文獻(xiàn) 10:Blood, 62，988-995，1983非專利文獻(xiàn) 11:Cancer Res.，45，879-885，1985
非專利文獻(xiàn) 12:Current Gastroenterology Reports, 5(6)，501-505，2003發(fā)明概述
本發(fā)明待解決的技術(shù)問題
在這樣的情況下，需要可以用作醫(yī)藥品的抗⑶81抗體。然而，這種抗體是未知的，并且因此，由本發(fā)明待解決的技術(shù)問題是提供可用做人用醫(yī)藥品的抗CD81抗體。
解決技術(shù)問題的手段
在嘗試解決上述問題時(shí)，發(fā)明人已經(jīng)通過噬菌體文庫方法從人互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)文庫制備了完全人抗⑶81抗體、評價(jià)與這些抗體結(jié)合的人⑶81區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)與⑶81的某些區(qū)域結(jié)合的抗體對人體顯示優(yōu)越的功效以及高度安全性，這導(dǎo)致本發(fā)明的完成。本發(fā)明提供針對人CD81的人單克隆抗體。另外，發(fā)明人獲得了所述抗CD81抗體抑制T細(xì)胞遷移的新研究結(jié)果，這揭示本發(fā)明的抗體可用于預(yù)防、改善或治療炎性腸病(如節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)和與T細(xì)胞遷移相關(guān)的疾病(如多發(fā)性硬化和牛皮癬)。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體不僅能夠只與表達(dá)CD81的癌細(xì)胞結(jié)合，還具有細(xì)胞毒效應(yīng)，這歸因于該抗體對與之結(jié)合的癌細(xì)胞的補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)，并且因此也可用于預(yù)防、緩解或治療由表達(dá)⑶81的癌細(xì)胞引起的癌癥，包括血液癌癥(也稱為血液的癌癥、血癌、血液癌)。
因而，本發(fā)明如下?？谷刷?1抗體，所述抗體能夠結(jié)合由SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中氨基酸編號80至175的氨基酸序列組成的肽區(qū)域。[I]的抗體，其中所述肽區(qū)域由氨基酸編號113至175的氨基酸序列組成。[I]或[2]的抗體，其中所述抗體對選自以下(I)至(13)的至少一種人⑶81變體的結(jié)合親和力小于對具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的人CD81的結(jié)合親和力的40%，
(1)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號127處的酪氨酸以苯丙氨酸或色氨酸替換的CD81變體；
(2)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號130處的丙氨酸以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體；
(3)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號135處的纈氨酸以丙氨酸或亮氨酸替換的CD81變體；
(4)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號137處的天冬氨酸以丙氨酸或谷氨酸替換的CD81變體；
(5)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號143處的丙氨酸以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體；
(6)具有SEQID N O:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號151處的組氨酸以丙氨酸或精氨酸替換的CD81變體；
(7)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號154處的亮氨酸以丙氨酸或異亮氨酸替換的CD81變體；
(8)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號158處的甘氨酸以丙氨酸或絲氨酸替換的CD81變體；
(9)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號164處的丙氨酸以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體；
(10)具有SEQID N0:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號168處的絲氨酸以丙氨酸或蘇氨酸替換的CD81變體；
(11)具有SEQID N0:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號169處的纈氨酸以丙氨酸或亮氨酸替換的CD81變體；
(12)具有SEQID N0:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號170處的亮氨酸以丙氨酸或異亮氨酸替換的CD81變體；和
(13)具有SEQID N0:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號172處的天冬酰胺以丙氨酸或谷氨酰胺替換的CD81變體。[I]至[3]中任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體對以上確定的人CD81變體(9)和(11)中每一種人CD81變體的結(jié)合親和力小于對具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人CD81的結(jié)合親和力的40%?？贵w，其具有與[I]至[4]中任一項(xiàng)的抗體等同的結(jié)合特性，或者與[I]至[4]中任一項(xiàng)的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的人⑶81。
抗體，其與[I]至[4]中任一項(xiàng)的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID NO:22中所示氨基
酸序列的人CD81并且具有T細(xì)胞遷移的抑制作用。抗人⑶81抗體，其包含在以下組I至24的任一個(gè)組中所述的全部6個(gè)⑶R:
組I
(a-1)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-Ι)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-Ι)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-Ι)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-Ι)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-Ι)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的⑶R 組2
(a-2)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-2)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-2)包含SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列的CDR，
(d-2)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-2)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-2)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組3
(a-3)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-3)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-3)包含SEQ ID NO:40中所示氨基酸序列的CDR，
(d-3)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-3)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-3)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組4
(a-4)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-4)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-4)包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的CDR3，
(d-4)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-4)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-4)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組5
(a-5)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-5)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-5)包含SEQ ID NO:46中所示氨基酸序列的CDR6，
(d-5)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-5)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-5)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組6(a-6)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-6)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-6)包含SEQ ID NO:49中所示氨基酸序列的CDR，(d-6)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-6)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-6)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組7
(a-7)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-7)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-7)包含SEQ ID NO:52中所示氨基酸序列的CDR，(d-7)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-7)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-7)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組8
(a-8)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-8)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-8)包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的CDR，(d-8)包含SEQ ID N O: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-8)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-8)包含SEQ ID NO:55中所示氨基酸序列的CDR組9
(a-9)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-9)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-9)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-9)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-9)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-9)包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR組10
(a-10)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-10)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-10)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-10)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-10)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-10)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組11
(a-11)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-11)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-11)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-11)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-11)包含SEQ ID NO:69中所示氨基酸序列的⑶R，和(f-11)包含SEQ ID NO:70中所示氨基酸序列的CDR，
組12
(a-12)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-12)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-12)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-12)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-12)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-12)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR，
組13
(a-13)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-13)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-13)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-13)包含SEQ ID NO:77中所示氨基酸序列的⑶R，(e-13)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-13)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組14
(a-14)包含SEQ ID NO:80中所示氨基酸序列的CDR，(b-14)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-14)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-14)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-14)包含SEQ ID NO:81中所示氨基酸序列的CDR，和(f-14)包含SEQ ID NO:6中所·示氨基酸序列的CDR組15
(a-15)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-15)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-15)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-15)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-15)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-15)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組16
(a-16)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-16)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-16)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR，(d-16)包含SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-16)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-16)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組17
(a-17)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-17)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-17)包含SEQ ID NO:52中所示氨基酸序列的CDR，(d-17)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-17)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-17)包含SEQ ID NO:93中所示氨基酸序列的CDR，組18
(a-18)包含SEQ ID NO:98中所示氨基酸序列的CDR，(b-18)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-18)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-18)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-18)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-18)包含SEQ ID NO:99中所示氨基酸序列的CDR，組19
(a-19)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-19)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-19)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-19)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-19)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-19)包含SEQ ID NO:99中所示氨基酸序列的CDR，組20
(a-20)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-20)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-20)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR，(d-20)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-20)包含SEQ ID NO:5中 所示氨基酸序列的CDR，和(f-20)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR，
組21
(a-21)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-21)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-21)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-21)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-21)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-21)包含SEQ ID NO:55中所示氨基酸序列的CDR，組22
(a-22)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-22)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-22)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-22)包含SEQ ID NO: 110中所示氨基酸序列的CDR，(e-22)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-22)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組23
(a-23)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-23)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-23)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-23)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-23)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-23)包含SEQ ID NO: 115中所示氨基酸序列的CDR 組24
(a-24)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-24)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-24)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR，
(d-24)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-24)包含SEQ ID NO: 120中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-24)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR。[7]的抗體，其包含在以下組25至48的任一個(gè)組中所述的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的組合。
組25
(g-1)包含以上確定的CDR(a-l)至(c-Ι)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-Ι)包含以上確定的⑶R(d-l)至(f-Ι)的重鏈可變區(qū)，
組26
(g-2)包含以上確定的CDR(a-2)至(c_2)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-2)包含以上確定的CDR(d-2)至(f-2)的重鏈可變區(qū)，
組27
(g-3)包含以上確定的CDR(a-3)至(c_3)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-3)包含以上確定的CDR(d-3)至(f-3)的重鏈可變區(qū)，
組28
(g-4)包含以上確定的CDR(a-4)至(c_4)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-4)包含以上確定的CDR(d-4)至(f-4)的重鏈可變區(qū)，
組29
(g-5)包含以上確定的CDR(a-5)至(c_5)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-5)包含以上確定的CDR(d-5)至(f-5)的重鏈可變區(qū)，
組30
(g-6)包含以上確定的CDR(a-6)至(c_6)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-6)包含以上確定的CDR(d-6)至(f-6)的重鏈可變區(qū)，
組31
(g-7)包含以上確定的CDR(a-7)至(c_7)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-7)包含以上確定的CDR(d-7)至(f-7)的重鏈可變區(qū)，
組32(g-8)包含以上確定的CDR(a-8)至(c_8)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-8)包含以上確定的CDR(d-8)至(f_8)的重鏈可變區(qū)，
組33
(g-9)包含以上確定的CDR(a-9)至(c_9)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-9)包含以上確定的CDR(d-9)至(f_9)的重鏈可變區(qū)，
組34
(g-10)包含以上確定的⑶R(a-10)至(c-10)的輕鏈可變區(qū)；和(h-10)包含以上確定的CDR(d-lO)至(f-10)的重鏈可變區(qū)，
組35
(g-11)包含以上確定的CDR(a-ll)至(c-11)的輕鏈可變區(qū)；和(h-11)包含以上確定的⑶R(d-ll)至(f-11)的重鏈可變區(qū)，
組36
(g-12)包含以上確定的⑶R(a-12)至(c-12)的輕鏈可變區(qū)；和(h-12)包含以上確定m CDR(d-12)至(f-12)的重鏈可變區(qū)，
組37 (g-13)包含以上確定的CDR(a-13)至(c_13)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-13)包含以上確定的⑶R(d-13)至(f-13)的重鏈可變區(qū)，
組38
(g-14)包含以上確定的CDR(a-14)至(c_14)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-14)包含以上確定的⑶R(d-14)至(f-14)的重鏈可變區(qū)，
組39
(g-15)包含以上確定的CDR(a-15)至(c_15)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-15)包含以上確定的⑶R(d-15)至(f-15)的重鏈可變區(qū)，
組40
(g-16)包含以上確定的CDR(a-16)至(c_16)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-16)包含以上確定的⑶R(d-16)至(f-16)的重鏈可變區(qū)，
組41
(g-17)包含以上確定的CDR(a-17)至(c_17)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-17)包含以上確定的⑶R(d-17)至(f-17)的重鏈可變區(qū)，
組42
(g-18)包含以上確定的CDR(a-18)至(c_18)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-18)包含以上確定的⑶R(d-18)至(f-18)的重鏈可變區(qū)，
組43
(g-19)包含以上確定的CDR(a-19)至(c_19)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-19)包含以上確定的⑶R(d-19)至(f-19)的重鏈可變區(qū)，
組44
(g-20)包含以上確定的CDR(a-20)至(c_20)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-20)包含以上確定的CDR(d-20)至(f-20)的重鏈可變區(qū)，
組45(g-21)包含以上確定的⑶R(a-21)至(c-21)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-21)包含以上確定的CDR(d-21)至(f_21)的重鏈可變區(qū)，
組46
(g-22)包含以上確定的CDR(a-22)至(c_22)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-22)包含以上確定的CDR(d-22)至(f_22)的重鏈可變區(qū)，
組47
(g-23)包含以上確定的CDR(a-23)至(c_23)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-23)包含以上確定的CDR(d-23)至(f-23)的重鏈可變區(qū)，
組48
(g-24)包含以上確定的CDR (a-24)至(c_24)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-24)包含以上確定的CDR(d-24)至(f-24)的重鏈可變區(qū)。[8]的抗體，其包含在以下組49至72的任一個(gè)組中所述的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的組合。
組49
(1-Ι)包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-Ι)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組50
(1-2)包含SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-2)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組51
(1-3)包含SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-3)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組52
(1-4)包含SEQ ID NO:44中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-4)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組53
(1-5)包含SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-5)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組54
(1-6)包含SEQ ID NO:50中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-6)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組55
(1-7)包含SEQ ID NO:53中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-7)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組56
(1-8)包含SEQ ID NO:56中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-8)包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組57
(1-9)包含SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-9)包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組58
(1- Ο)包含SEQ IDNO:67中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-ΙΟ)包含SEQ IDNO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組59
(1-11)包含SEQ IDNO:71中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-11)包含SEQ IDNO:72中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組60
(1-12)包含SEQ IDNO:75中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-12)包含SEQ IDNO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組61
(1-13)包含SEQ IDNO:8中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-13)包含SEQ IDNO:78中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組62
(1-14)包含SEQ IDNO:82中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-14)包含SEQ IDNO:83中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組63
(1-15)包含SEQ IDNO:86中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-15)包含SEQ IDNO:87中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組64
(1-16)包含SEQ IDNO:91中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-16)包含SEQ IDNO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組65
(1-17)包含SEQ IDNO:94中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-17)包含SEQ IDNO:95中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組66 (1-18)包含SEQ IDNO: 100中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-18)包含SEQ IDNO: 101中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組67
(1-19)包含SEQ IDNO: 104中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-19)包含SEQ IDNO: 101中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組68
(1-20)包含SEQ IDNO: 106中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-20)包含SEQ IDNO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組69
(1-21)包含SEQ IDNO: 108中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和
(j-21)包含SEQ IDNO:57中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組70
(1-22)包含SEQ IDNO: 111中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-22)包含SEQ ID NO: 112中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組71
(1-23)包含SEQ ID NO: 116中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-23)包含SEQ ID NO: 117中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，
組72
(1-24)包含SEQ ID NO: 121中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-24)包含SEQ ID NO: 122中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。[8]或[9]的抗體，其包含在以下組73至96的任一個(gè)組中所述的輕鏈和重鏈的組合:
組73
(k-1)包含SEQ ID NO:26中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-1)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組74
(k-2)包含SEQ ID NO:39中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-2)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組75
(k-3)包含SEQ ID NO:42中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-3)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組76
(k-4)包含SEQ ID NO:45中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-4)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組77
(k-5)包含SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-5)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組78
(k-6)包含SEQ ID N0:51中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-6)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組79
(k-7)包含SEQ ID NO:54中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-7)包含SE Q ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組80
(k-8)包含SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-8)包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的重鏈，
組81
(k-9)包含SEQ ID NO:64中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-9)包含SEQ ID NO:65中所不氨基酸序列的重鏈，
組82
(k-10)包含SEQ ID NO:68中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-10)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，組83
(k-11)包含SEQID NO:73中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-11)包含SEQID NO:74中所示氨基酸序列的重鏈，
組84
(k-12)包含SEQID NO:76中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-12)包含SEQID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組85
(k-13)包含SEQID NO:26中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-13)包含SEQID NO:79中所示氨基酸序列的重鏈，
組86
(k-14)包含SEQID NO:84中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-14)包含SEQID NO:85中所示氨基酸序列的重鏈，
組87
(k-15)包含SEQID NO:88中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-15)包含SEQID NO:89中所示氨基酸序列的重鏈，
組88
(k-16)包含SEQID NO:92中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-16)包含SEQID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組89
(k-17)包含SEQID NO:96中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-17)包含SEQID NO:97中所示氨基酸序列的重鏈，
組90
(k-18)包含SEQID NO: 102中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-18)包含SEQID NO: 103中所示氨基酸序列的重鏈，
組91
(k-19)包含SEQID NO: 105中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-19)包含SEQID NO: 103中所示氨基酸序列的重鏈，
組92
(k-20)包含SEQID NO: 107中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-20)包含SEQID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，
組93
(k-21)包含SEQID NO: 109中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-21)包含SEQID NO:59中所示氨基酸序列的重鏈，
組94
(k-22)包含SEQID NO: 113中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-22)包含SEQID NO: 114中所示氨基酸序列的重鏈，
組95
(k-23)包含SEQID NO: 118中所示氨基酸序列的輕鏈；和
(1-23)包含SEQID NO: 119中所示氨基酸序列的重鏈，組96
(k-24)包含SEQ ID NO: 123中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-24)包含SEQ ID NO: 124中所示氨基酸序列的重鏈?？贵w，其與[7]至[10]中任一項(xiàng)的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人⑶81。[11]的抗體，其具有T細(xì)胞遷移的抑制作用?？谷刷?1抗體，其中所述抗體包含在[7]的組I至24任一組中所述的一個(gè)或多個(gè)⑶R并且與包含在所述組中所述的全部6個(gè)⑶R的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人CD81。抗人⑶81抗體，其中所述抗體與[7]的任一種抗體具有90%序列同源性并且與所述抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的人⑶81?？谷刷?1抗體，其包含:
(a-25)包含SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的CDR ；
(b-25)包含SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的CDR ；
(c-25)包含SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的CDR ；
(d-25)包含SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的CDR ；
(e-25)包含SEQ ID NO: 15中所 示氨基酸序列的CDR ;和 (f-25)包含SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的CDR。[15]的抗體，其包含:
(g-25)包含以上確定的CDR(a-25)至(c_25)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-25)包含以上確定的CDR(d-25)至(f-25)的重鏈可變區(qū)。[16]的抗體，其包含:
(1-25)包含SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-25)包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。[16]或[17]的抗體，其包含:
(k-25)包含SEQ ID NO:30中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-25)包含SEQ ID NO:32中所示氨基酸序列的重鏈。抗體，其與[15]至[18]中任一項(xiàng)的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID NO: 22中所示氨基酸序列的人⑶81。[19]的抗體，其具有T細(xì)胞遷移的抑制作用。抗人⑶81抗體，其中所述抗體包含在[15]中的一個(gè)或多個(gè)⑶R并且與包含在中描述的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的人⑶81?？谷薈D81抗體，其中所述抗體與[15]中所述的抗體具有90%序列同源性并且與所述抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的人⑶81。[I]至[6]、[11]至[14]和[19]至[22]中任一項(xiàng)的抗體，其是人源化抗體或人抗體。[7]至[10]和[15]至[18]中任一項(xiàng)的抗體，其是人源化抗體或人抗體。包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼[I]至[24]中任一項(xiàng)的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
以下兩種多核苷酸的組合，所述多核苷酸包含編碼[I]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一項(xiàng)的抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含編碼[I]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一項(xiàng)的抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。以下兩種多核苷酸的組合，所述多核苷酸包含編碼[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一項(xiàng)的抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含編碼[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一項(xiàng)的抗體的相應(yīng)輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼[I]至[24]中任一項(xiàng)的抗體的重鏈和輕鏈。以下兩種多核苷酸的組合，所述多核苷酸包含編碼[I]至[6]、[11]至[14]和至[23]中任一項(xiàng)的抗體的重鏈的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含編碼[I]至[6]、至[14]和[19]至[23]中任一項(xiàng)的抗體的輕鏈的核苷酸序列。以下兩種多核苷酸的組合，所述多核苷酸包含編碼[7]至[10]、[15]至[18]和中任一項(xiàng)的抗體的重鏈的核苷酸序列,和所述多核苷酸包含編碼[7]至[10]、[15]至和[24]中任一項(xiàng)的抗體的相應(yīng)輕鏈的核苷酸序列。表達(dá)載體，其包含[25]或[28]的多核苷酸。重組細(xì)胞，用[31]的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。用以下兩種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含含有編碼[I]至[6]、至[14]和[19]至[23]中任一項(xiàng) 的抗體的重鏈的核苷酸序列的多核苷酸，和所述表達(dá)載體包含含有編碼[I]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一項(xiàng)的抗體的輕鏈的核苷酸序列的多核苷酸。用以下兩種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含含有編碼[7]至[10]、至[18]和[24]中任一項(xiàng)的抗體的重鏈的核苷酸序列的多核苷酸，和所述表達(dá)載體包含含有編碼[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一項(xiàng)所述的抗體的相應(yīng)輕鏈的核苷酸序列的多核苷酸。產(chǎn)生抗人⑶81抗體的方法，包括培養(yǎng)[32]至[34]中任一項(xiàng)的重組細(xì)胞，和從獲得的培養(yǎng)上清回收抗體。藥物組合物，其包含[I]至[24]中任一項(xiàng)所述的抗體。用于預(yù)防、改善或治療選自炎性腸病、多發(fā)性硬化、牛皮癬和血液癌癥的疾病的藥齊U，其包含[I]至[24]中任一項(xiàng)的抗體。[I]至[3]中任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體對以上確定的人CD81變體(3)、(4)、
(8)、(11)和(12)中每一種的結(jié)合親和力小于對具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人⑶81的結(jié)合親和力的40%。[I]至[3]中任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體對以上確定的人⑶81變體(3)、(4)、
(6)和⑶至(13)中每一種的結(jié)合親和力小于對具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的人⑶81的結(jié)合親和力的40%。[I]至[3]中任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體對以上確定的人⑶81變體⑴至(5)、
(7)、(8)、(11)和(12)中每一種的結(jié)合親和力小于對具有SEQID N0:22中所示氨基酸序列的人CD81的結(jié)合親和力的40%。
發(fā)明的效果本發(fā)明可以提供針對人CD81的人單克隆抗體，其具有對人的優(yōu)越藥物功效和低免疫原性。由于發(fā)明人獲得了新研究結(jié)果:所述抗CD81抗體抑制T細(xì)胞遷移并且還對癌細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒效應(yīng)，因此本發(fā)明的抗體也可用于預(yù)防、改善或治療炎性疾病(包括炎性腸病)和與T細(xì)胞遷移相關(guān)的疾病(包括自身免疫疾病，如多發(fā)性硬化和牛皮癬)，以及由表達(dá)CD81的癌細(xì)胞引起的癌癥(包括血液癌癥)。
實(shí)施方案的描述
在本說明書中，遵循IUPAC-1UB的定義[IUPAC-1UB生物學(xué)命名委員會(huì)名，Eur.J.Biochem.，138:9 (1984)]、“用于準(zhǔn)備含有核苷酸序列或氨基酸序列的說明書等的指南(Guideline for preparing specification and the like containing nucleotidesequence or amino acid sequence) ”(日本專利局編輯)和本領(lǐng)域中所用的常規(guī)標(biāo)記，使用縮寫的標(biāo)示表示如氨基酸，(多)肽，(多)核苷酸等。
本文中，“基因”或“DNA”以這樣的含義使用，從而它不僅包括雙鏈DNA，還包括相應(yīng)單鏈DNA、構(gòu)成雙鏈DNA的有義鏈和反義鏈。它不特別地受其長度限制。因而，除非另外說明，否則本說明書中的基因(DNA)包括雙鏈DNA(包括人基因組DNA)、單鏈DNA(正鏈)(包括cDNA)、具有與所述正鏈互補(bǔ)的序列的單鏈DNA(互補(bǔ)鏈)、及它們的片段。
本文中，術(shù)語“⑶81基因”意指由SEQ ID N0:21顯示的人⑶81基因(DNA)或其天然存在的突變體或多態(tài)性變體(除了作為突變或多態(tài)性的結(jié)果，編碼下文所述的突變體蛋白
(I)至(13)中任一種的那些變體之外)。這類突變體或多態(tài)性變體包括例如在從NCBI可獲得的SNP數(shù)據(jù)庫中登記的那些。
這里，術(shù)語“⑶81蛋白”或簡單地“⑶81”意指由SEQ ID NO:22顯示的人CD81蛋白，或由上文提到的天然存在突變體DNA或多態(tài)性變體DNA編碼的蛋白質(zhì)。
本文中所用的“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或能夠與其抗原結(jié)合的其部分如Fab片段或從Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
這里，術(shù)語“表位”是與抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，它包括抗原上能夠與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體或B細(xì)胞受體特異性結(jié)合的任何位點(diǎn)。抗原決定簇包括化學(xué)活躍的分子表面基團(tuán)，如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，并且在某些實(shí)施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)性特征，和/或特定的電荷特征。在某些實(shí)施方案中，可以提到當(dāng)抗體優(yōu)先地識別蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中其靶抗原時(shí)，稱作這種抗體與其抗原特異性結(jié)
入
口 ο
抗體的結(jié)構(gòu)
抗體分子的基本結(jié)構(gòu)由全部類別共有并且由具有50000至70000分子量的重鏈和具有20000 至 30000 分子量的輕鏈組成(Immunology 第 4 版，1.Roitt, J.Brostoff, D.Male 編著，Mosby-Year Book, 1996)。重鏈通常由包含約440個(gè)氨基酸的多肽鏈組成；重鏈在每個(gè)不同類別中具有特征性結(jié)構(gòu)并且稱作Y、μ、α、δ和ε鏈，對應(yīng)于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE0另外，IgG作為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4出現(xiàn)并且相應(yīng)的鏈分別稱作Y 1、Y 2、Y 3和Y 4。輕鏈通常由包含約220個(gè)氨基酸的多肽鏈組成；兩個(gè)型L型和K型是已知的并且分別稱作λ鏈和Κ鏈。就抗體分子基本結(jié)構(gòu)的肽構(gòu)型而言，兩條同源重鏈和兩條同源輕鏈通過二硫鍵(S-S鍵)和非共價(jià)鍵鍵結(jié)，并且分子量是150000至190000。兩個(gè)種類的輕鏈能夠與任何重鏈配對。每個(gè)抗體分子總是由兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈組成。重鏈中存在4個(gè)分子內(nèi)S-S鍵(ii鏈和e鏈的5個(gè)鍵)和輕鏈中存在2個(gè)分子內(nèi)S-S鍵；每100至110個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)環(huán)，并且這種立體結(jié)構(gòu)在各環(huán)之間是類似的，并且稱作結(jié)構(gòu)單元或結(jié)構(gòu)域。對于重鏈和輕鏈，位于N末端處的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是不定的，甚至在來自相同動(dòng)物物種的相同類(亞類)的制備物中也是如此，并且這種結(jié)構(gòu)域稱作可變區(qū)(V區(qū))(重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域稱作Vh并且輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域稱作。在其C端側(cè)的氨基酸序列在每個(gè)類或亞類中是幾乎恒定的，并且稱作恒定區(qū)(C區(qū)域)(這些結(jié)構(gòu)域分別表述為 Ch1、Ch2、Ch3 和 C)。
抗體的抗原決定位點(diǎn)由Vh和 '組成，并且結(jié)合特異性取決于這個(gè)位點(diǎn)的氨基酸序列。在另一方面，生物學(xué)活性如(與互補(bǔ)物或多種細(xì)胞的結(jié)合作用)反映多種Ig類別之間C區(qū)域結(jié)構(gòu)的差異。輕鏈和重鏈的可變區(qū)的變異性已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾乎限于在兩條鏈中存在的3個(gè)小的高變區(qū)內(nèi)，并且這些區(qū)域稱作互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)。常使用幾種編號系統(tǒng)用于確定⑶R。Kabat定義基于序列變異性，并且Chothia定義基于結(jié)構(gòu)性環(huán)區(qū)域的位置。AbM定義是Kabat方案和Chothia方案之間的折衷。輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的 CDR 根據(jù) Kabat、Chothia 或 AbM 算法(Martin 等人,(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:9268-9272 ；Martin 等人，(1991)Methods Enzymol.203:121-153 ；Pedersen 等人，(I"2) Immunomethodsl:126 ；和 Rees 等人，(I"6)引自 Sternberg M.J.E.(編著)，Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford,第 141-172 頁)進(jìn)行界定。
在002-A07抗體的情況下，重鏈可變區(qū)中的⑶R由SEQ ID NO: 10所顯示的氨基酸序列的氨基酸編號29-42 (CDRl-H)、49-67 (CDR2-H)和97-108 (CDR3-H)處的殘基界定，并且輕鏈可變區(qū)中的⑶R由SEQ ID NO: 8所顯示的氨基酸序列的氨基酸編號22-36 (OTRl-L)、52-58 (⑶R2-L)和90-101 (⑶R3-L)處的殘基界定。在005-C01抗體的情況下，重鏈可變區(qū)中的CDR由SEQ ID N0:2 0所顯示的氨基酸序列的氨基酸編號29-42(CDRl-H)、49-67 (CDR2-H)和97-102 (⑶R3-H)處的殘基界定，并且輕鏈可變區(qū)中的⑶R由SEQ ID NO: 18所顯示的氨基酸序列的氨基酸編號22-35 (CDRl-L)、51_57 (CDR2-L)和89-99 (CDR3-L)處的殘基界定。
除可變區(qū)的CDR之外的部分稱作框架區(qū)(FR)，是相對恒定的?？蚣軈^(qū)采用P折疊構(gòu)象，并且CDR可以形成連接P折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR由框架區(qū)以其三維結(jié)構(gòu)維持并且與來自另一條鏈的CDR —起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。
抗體的結(jié)合測定法
抗體結(jié)合可以通過任何已知測定法，如直接和間接夾心測定法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫沉淀測定法證實(shí)(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRCPress, Inc., 1987,第147-158頁)。在本發(fā)明中，例如通過以下方法，可以測量抗人⑶81單克隆抗體與人CD81多肽或與在表面呈遞該多肽的細(xì)胞的結(jié)合。
作為常見方法，例舉一種方法，其包括將人CD81多肽(抗原)吸附到固相上，用不參與后續(xù)抗原-抗體反應(yīng)或酶反應(yīng)的蛋白質(zhì)(例如，脫脂乳、白蛋白等)封閉該固相，使人抗人CD81單克隆抗體(測試抗體)與固相接觸并孵育，通過B/F分離移除未反應(yīng)的抗體，并且向固相添加與測試抗體(例如，抗人IgG等)特異性反應(yīng)的標(biāo)記第二抗體以確定固相上標(biāo)記物的量。作為固相，例如，可以使用不溶性多糖如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素、合成樹脂如塑料、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅氧烷(例如，管、微量平板等)或玻璃(珠、管等)。表達(dá)人CD81多肽的細(xì)胞的膜部分可以用作待吸附到固相上的抗原，如下文描述的試驗(yàn)例7(2)中顯示。作為用于固定的手段，可以將抗原重組地表達(dá)為具有肽(例如，His-標(biāo)簽、GST、MBP等)的融合蛋白，所述肽能夠與固相(N1-、谷胱甘肽-、麥芽糖載體等)結(jié)合并且與固相親和結(jié)合，如試驗(yàn)例7(2)中顯示。作為標(biāo)記物質(zhì)，可以使用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。作為放射性同位素的實(shí)例，可以提到[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。作為酶的實(shí)例，優(yōu)選具有高比活性的穩(wěn)定酶；例如，可以提到半乳糖苷酶、葡糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等。作為熒光物質(zhì)的實(shí)例，可以提到熒光胺、異硫氰酸熒光素等。作為發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例，可以提到魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精(Iucigenin)等。
在夾心方法中，固定的抗人CD81抗體(其與人CD81在與本發(fā)明抗體結(jié)合的位點(diǎn)不同的位點(diǎn)處結(jié)合)與人CD81多肽(抗原)反應(yīng)，并且還與抗人CD81單克隆抗體(測試抗體)反應(yīng)。在通過B/F分離移除未反應(yīng)的抗體后，添加與測試抗體(例如，抗人IgG等)特異性反應(yīng)的標(biāo)記第二抗體以確定標(biāo)記物在固相上的量。標(biāo)記物質(zhì)和固相可以與上文提到的相同。
為檢驗(yàn)抗人CD81單克隆抗體與表達(dá)人CD81多肽的活細(xì)胞的結(jié)合，可以使用流式細(xì)胞術(shù)。簡而言之，(在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下培育的)表達(dá)人⑶81的細(xì)胞可以在例如含有0.1%BSA的PBS中與抗人CD81抗體(測試抗體)混合并在37° C孵育I小時(shí)。在洗滌后，使細(xì)胞在與測試抗體反應(yīng) 相同的條件下同熒光標(biāo)記的(如熒光素或藻紅蛋白(PE))標(biāo)記的第二抗體(例如，抗人IgG抗體)反應(yīng)。使用光散射特性和側(cè)向散射特性以便對單個(gè)細(xì)胞設(shè)門，可以通過流式細(xì)胞儀分析樣品。例如，當(dāng)擁有比使用非特異性抗體(例如，人IgG)時(shí)更大的熒光強(qiáng)度的細(xì)胞的百分比是90%或更高、優(yōu)選地是95%或更高、更優(yōu)選地是97%或更高時(shí)，可以證實(shí)測試抗體與抗原特異性結(jié)合。除流式細(xì)胞術(shù)測定法之外或取而代之，可以使用利用熒光顯微術(shù)的備選測定法。細(xì)胞可以完全如上文所述那樣染色并且由熒光顯微術(shù)檢驗(yàn)。這種方法允許各個(gè)細(xì)胞的可視化。
競爭性測足
競爭性測定法如競爭性ELISA可以用來確定抗人CD81抗體的結(jié)合常數(shù)(Ka)或鑒定與已經(jīng)獲得的本發(fā)明抗體(已知抗體)競爭地結(jié)合人⑶81的另一種本發(fā)明抗體。通過以下方式實(shí)施競爭性測定法:通過在上文提到的使用抗原固定化固相的結(jié)合測定法中，將游離抗原或已知抗體添加至固相和測試抗體的反應(yīng)體系中而實(shí)施。例如，使給定濃度的測試抗體溶液和其中向這種測試抗體溶液添加了多種濃度抗原的混合物分別與抗原固定的固相接觸并且孵育，并且測量相應(yīng)固相上的標(biāo)記物的量?？梢曰谙鄳?yīng)抗原濃度的測量值，將結(jié)合常數(shù)計(jì)算為顯示斯卡查德分析結(jié)果的圖的斜率。在另一方面，可以通過以下方式鑒定與本發(fā)明抗體競爭地結(jié)合人CD81的抗體:使標(biāo)記的已知抗體(本發(fā)明的抗體)和多種濃度的測試抗體與抗原固定的固相反應(yīng)，并且選擇以劑量依賴性方式減少固相上標(biāo)記物的量的測試抗體。
本發(fā)明的抗體
本發(fā)明的抗體是一種能夠與肽區(qū)域結(jié)合的抗人CD81抗體，所述肽區(qū)域由SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列中氨基酸編號80至175、優(yōu)選地113至175的氨基酸序列組成，或者是一種與所抗人⑶81抗體競爭地結(jié)合人⑶81的抗體，所述人⑶81由SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列組成。SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列是人CD81蛋白的報(bào)道的氨基酸序列(EMBO J.，20:12-18，2001)并且 NCBI 數(shù)據(jù)庫中登記為 Refseq ID:NP_004347。下文，由這種氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)也稱作“天然存在的人CD81”、“野生型CD81”或“野生型人CD81”。
本發(fā)明是基于以下研究結(jié)果:識別上文作為表位提到的肽區(qū)域的抗人CD81抗體產(chǎn)生治療作用如抑制T細(xì)胞遷移，而無副作用或副作用少。
本發(fā)明的抗體可以是任何單克隆抗體，只要它與上文提到的野生型人CD81的特定肽區(qū)域結(jié)合，或與結(jié)合這種肽區(qū)域的抗體競爭性地結(jié)合野生型人CD81。
表位分析
可以根據(jù)多種已知的方法實(shí)施表位分析(Epitope Mapping Protocols/第2版，MikeSchutkowski,Ulrich Reineke, Ann N Y Acad Sc1.2010Jan; 1183:267-87)。針對抗體的更詳細(xì)表位分析可以通過結(jié)合抑制測定法、同源物掃描法和/或丙氨酸掃描法進(jìn)行(例如，見JP2009-159948A, Science, 244:1081-1085(1989))。
丙氨酸掃描法是一種通過以下方式確定人CD81的每個(gè)氨基酸殘基對于與其抗體結(jié)合是否為必需的方法:制備突變體，其中野生型人CD81的每個(gè)氨基酸殘基以丙氨酸替換，并且檢測抗體在針對CD81突變體和針對野生型人CD81的結(jié)合活性方面的差異。
同源物掃描法是一種通過將野生型人CD81多肽的至少一個(gè)氨基酸殘基替換為其他同源氨基酸，確定可以插入、替換或缺失哪個(gè)氨基酸殘基而不對活性造成不利影響的方法。在這種方法中，將人CD81多肽的氨基酸序列與已知的同源蛋白質(zhì)分子的那些氨基酸序列比較，并且使得在具有高度同源性的區(qū)域內(nèi)部產(chǎn)生的氨基酸變化的數(shù)目最小化(ProteinScience, (2005)，14，2405)。
在本發(fā)明中實(shí)施的同源物掃 描法和丙氨酸掃描法誘變(見試驗(yàn)例8和9等)已經(jīng)揭示，用其他氨基酸替換在上文提到的肽區(qū)域內(nèi)的特定氨基酸殘基明顯降低抗人CD81抗體對人⑶81突變體的結(jié)合親和力。這些研究結(jié)果顯示，替換的氨基酸殘基主要對該抗體與野生型人CD81的結(jié)合作出貢獻(xiàn)。
因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中的，本發(fā)明抗體的特征在于當(dāng)其針對上述野生型人CD81的結(jié)合親和力是100%時(shí)，其針對選自以下(I)至(13)的至少一種CD81變體的結(jié)合親和力小于40%:
(1)其中野生型人CD81的第127位酪氨酸(Y)以苯丙氨酸或色氨酸替換的CD81變體(Y127F 或 Y127W)；
(2)其中野生型人CD81的第130位丙氨酸(A)以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體(A130T 或 A130V)；
(3)其中野生型人CD81的第135位纈氨酸(V)以丙氨酸或亮氨酸替換的CD81變體(V135A 或 V135L)；
(4)其中野生型人CD81的第137位天冬氨酸(D)以丙氨酸或谷氨酸替換的CD81變體(D137A 或 D137E)；
(5)其中野生型人CD81的第143位丙氨酸(A)以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體(A143T 或 A143V)；
(6)其中野生型人CD81的第151位組氨酸(H)以丙氨酸或精氨酸替換的CD81變體(H151A 或 H151R)；(7)其中野生型人CD81的第154位亮氨酸(L)以丙氨酸或異亮氨酸替換的CD81變體(L154A 或 L154I)；
(8)其中野生型人CD81的第158位甘氨酸(G)以丙氨酸或絲亮氨酸替換的CD81變體(G158A 或 G158S)；
(9)其中野生型人CD81的第164位丙氨酸(A)以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體(A164T 或 A164V)；
(10)其中野生型人CD81的第168位絲氨酸(S)以丙氨酸或蘇亮氨酸替換的CD81變體(S168A 或 S168T)；
(11)其中野生型人CD81的第169位纈氨酸(V)以丙氨酸或亮氨酸替換的CD81變體(V169A 或 V169L)；
(12)其中野生型人CD81的第170位亮氨酸(L)以丙氨酸或異亮氨酸替換的CD81變體(L170A 或 L170I)；
(13)其中野生型人CD81的第172位天冬酰胺(N)以丙氨酸或谷氨酰胺替換的CD81變體(N172A 或 N172Q)；
其中將待替換的氨基酸殘基的位置確定為SEQ ID NO:22中所顯示的氨基酸序列的氨基酸編號。
這里，可以通過以下試驗(yàn)例的描述或已知方法產(chǎn)生上述⑶81變體，例如將造成氨基酸替換的合適核苷酸變化導(dǎo)入編碼野生型人CD81多肽的DNA中或化學(xué)地合成所需的變體多肽。在此描述的人⑶81多肽的突變可以通過例如美國專利號5，364，934中所顯示的技術(shù)或指南涉及保守或非保守突變形成( 例如，見本發(fā)明的試驗(yàn)例8和9)。
可以通過上文描述的多種結(jié)合測定法確定抗體針對野生型或突變?nèi)薈D81的結(jié)合親和力。本發(fā)明抗體針對野生型人⑶81的結(jié)合常數(shù)(Ka)是至少IxlO7M'優(yōu)選地IxlO8M'更優(yōu)選地IxlO9M'甚至更優(yōu)選地IxIOkiM'可以通過上文描述的競爭性測定法或其他熟知方法如表面等離子體共振法(SPR)確定抗體的結(jié)合常數(shù)。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是這樣的抗體，其針對上文人CD81變體(9)和(11)中每一者的結(jié)合親和力小于針對野生型人CD81的結(jié)合親和力的40%。本發(fā)明的抗體也是這樣的抗體，其針對上文人CD81變體(3)、(4)、(9)和(11)中每一者的結(jié)合親和力小于針對野生型人CD81的結(jié)合親和力的40%，針對上文人CD81變體(3)、(4)、(9)、(10)和(11)中每一者的結(jié)合親和力小于40%，針對上文人CD81變體(3)、(4)、(8)、(9)、(10)和(11)中每一者的結(jié)合親和力小于40%，或者針對上文人⑶81變體(3)、(4)、(6)、⑶、(9)、(10)、(11)和
(12)中每一者的結(jié)合親和力小于40%。在下文(i)中詳述擁有結(jié)合特征的一系列抗體。在包含屬于組I (其代表在下文(i)中描述的本發(fā)明實(shí)施方案的具體模式)的全部6個(gè)CDR的抗體情況下，針對人CD81變體(3)、(4)、(6)和⑶至(13)中每一者的結(jié)合親和力小于40%。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是這樣的抗體，其針對上文人CD81變體(I)至(5)、(7)、(8)、(11)和(12)中每一者的結(jié)合親和力小于針對野生型人CD81的結(jié)合親和力的40%。在下文(ii)中詳述擁有結(jié)合特征的一系列抗體。由這種抗體和在下文(i)中所述的實(shí)施方案的具體模式中的前述抗體(其結(jié)合親和力小于針對野生型人CD81的結(jié)合親和力的40%)共有的人CD81變體分別是上文的人CD81變體(3)、(4)、(8)、(11)和(12)。本發(fā)明也提供與上文描述的任何本發(fā)明抗體競爭地結(jié)合野生型人CD81的抗體。這種抗體可以與野生型人CD81抗體在下述區(qū)域內(nèi)結(jié)合，所述區(qū)域含有在SEQ ID N0:22中所示的氨基酸序列中氨基酸編號80-175的氨基酸區(qū)域外部的氨基酸，只要它對T細(xì)胞遷移具有抑制作用和/或?qū)Ρ磉_(dá)CD81的癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng)。盡管合乎需要的是，對T細(xì)胞遷移的抑制作用和對表達(dá)⑶81的癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性應(yīng)當(dāng)?shù)韧?例如，0.5-2倍)在SEQ IDNO:22中所示的氨基酸序列中氨基酸編號80-175或113-175的氨基酸區(qū)域內(nèi)與野生型人CD81結(jié)合的抗體的那些作用和活性，但是活性的程度可以是不同的，只要這種抗體對人的炎性腸病、多發(fā)性硬化、牛皮癬或血液癌癥產(chǎn)生預(yù)防、緩解或治療作用。可以通過上文描述的競爭性測定法檢測抗體與其抗原的“競爭性結(jié)合”。
(i)一個(gè)具體實(shí)施方案
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的抗體，當(dāng)所述抗體對野生型人CD81的結(jié)合親和力是100%時(shí)，它針對(9)和(11)中描述的每種人CD81變體具有小于40%的結(jié)合親和力。
具有上文提到的結(jié)合特性的抗體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是:
組I
(a-1)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-1)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-1)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-1)包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-1)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-1)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的⑶R 組2
(a-2)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-2)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-2)包含SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列的CDR，
(d-2)包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-2)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-2)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組3
(a-3)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-3)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-3)包含SEQ ID NO:40中所示氨基酸序列的CDR，
(d-3)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-3)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-3)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組4
(a-4)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-4)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-4)包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的CDR3，
(d-4)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-4)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-4)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組5
(a-5)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-5)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-5)包含SEQ ID NO:46中所示氨基酸序列的CDR6，(d-5)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-5)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-5)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組6
(a-6)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-6)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-6)包含SEQ ID NO:49中所示氨基酸序列的CDR，(d-6)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-6)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-6)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組7
(a-7)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-7)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-7)包含SEQ ID NO:52中所示氨基酸序列的CDR，(d-7)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-7)包含SEQ ID NO :5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-7)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組8
(a-8)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-8)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-8)包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的CDR，(d-8)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-8)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-8)包含SEQ ID NO:55中所示氨基酸序列的CDR組9
(a-9)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-9)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-9)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-9)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-9)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-9)包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR組10
(a-ΙΟ)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-10)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-10)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-10)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-10)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-10)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組11
(a-11)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-11)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-11)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-11)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-11)包含SEQ ID NO:69中所示氨基酸序列的⑶R，和(f-11)包含SEQ ID NO:70中所示氨基酸序列的CDR，
組12
(a-12)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-12)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-12)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-12)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-12)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-12)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR，
組13
(a-13)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-13)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-13)包含SEQ ID NO :3中所示氨基酸序列的CDR，(d-13)包含SEQ ID NO:77中所示氨基酸序列的⑶R，(e-13)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-13)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組14
(a-14)包含SEQ ID NO:80中所示氨基酸序列的CDR，(b-14)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-14)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-14)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-14)包含SEQ ID NO:81中所示氨基酸序列的CDR，和(f-14)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組15
(a-15)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-15)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-15)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-15)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-15)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-15)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組16
(a-16)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-16)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-16)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR，(d-16)包含SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-16)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-16)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組17
(a-17)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-17)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-17)包含SEQ ID NO:52中所示氨基酸序列的CDR，(d-17)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-17)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-17)包含SEQ ID NO:93中所示氨基酸序列的CDR，組18
(a-18)包含SEQ ID NO:98中所示氨基酸序列的CDR，(b-18)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-18)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-18)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-18)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-18)包含SEQ ID NO:99中所示氨基酸序列的CDR，組19
(a-19)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-19)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-19)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-19)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-19)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-19)包含SEQ ID NO:99中所示氨基酸序列的CDR，組20
(a-20)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-20)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-20)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR，(d-20)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-20)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-20)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR，
組21
(a-21)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-21)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-21)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-21)包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-21)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-21)包含SEQ ID NO:55中所示氨基酸序列的CDR，
組22
(a-22)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-22)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-22)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-22)包含SEQ ID NO: 110中所示氨基酸序列的CDR，
(e-22)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-22)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組23
(a-23)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-23)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-23)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-23)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-23)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-23)包含SEQ ID NO: 115中所示氨基酸序列的CDR 組24
(a-24)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-24)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-24)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR，
(d-24)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-24)包含SEQ ID NO: 120中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-24)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR:
或
(2)包含以上(a-X)至(f-X)的CDR的抗體(X是I至24 ;這同樣適用于下文)，其中將一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選一個(gè)至幾個(gè)(例如，1、2、3、4或5個(gè))氨基酸殘基在從(a-X)至(f_X)中所顯示的氨基酸序列中選出的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4、5或6個(gè))氨基酸序列中替換和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中該抗體具有與任一種上述抗體等同的結(jié)合特性或與任一種上述抗體競爭性地結(jié)合野生型人CD81。即，“等同的結(jié)合特性”意指至少結(jié)合由野生型人⑶81多肽的第80位至第175位或第113位至第175位氨基酸殘基組成的肽區(qū)域，優(yōu)選地當(dāng)其針對野生型人CD81的結(jié)合親和力是100%時(shí)，其還以小于40%的結(jié)合親和力與選自上文提到的(I)至(13)中的至少一種人CD81變體(更優(yōu)選地變體(9)和(11))結(jié)合。
以上抗體(2)可以通過公眾已知的方法獲得，例如，通過以下方式獲得:用編碼以上抗體(I)的可變區(qū)的堿基序列的載體作為模板進(jìn)行PCR來廣泛導(dǎo)入突變以便產(chǎn)生噬菌體展示突變抗體文庫，以針對人CD81的結(jié)合活性或針對以上抗體(I)的競爭性結(jié)合作用篩選該文庫并且進(jìn)行淘選?？梢酝ㄟ^上文描述的多種結(jié)合測定法和競爭性測定法確定抗體的結(jié)合特性和競爭性結(jié)合作用。作為測定法的結(jié)果，當(dāng)證實(shí)了測試抗體的“等同的結(jié)合特性”或“競爭性結(jié)合”后，可以通過下文詳細(xì)描述的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)測試治療作用。
具有上文提到的結(jié)合特性的抗體的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)例是包含以下區(qū)域的抗體:
(1)包含以上確定的⑶R(a-X)至(c-X)的輕鏈可變區(qū)和包含以上確定的⑶R(d-X)至(f-X)的重鏈可變區(qū)；或
(2)以上(I)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中將一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選一個(gè)至幾個(gè)(例如，
1、2、3、4或5個(gè))氨基酸殘基在從(a-X)至(f_X)中所顯示的氨基酸序列中選出的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4、5或6個(gè))氨基酸序列中替換和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中該抗體具有與任一種上述抗體等同的結(jié)合特性或與任一種上述抗體競爭性地結(jié)合野生型人⑶81。這里，“等同的結(jié)合特性”意指與上文相同。
更優(yōu)選地，在上文提到的抗體中，⑶R(a-X)、(b-X)和(c-X)以這種順序從輕鏈的N末端起存在。即，CDR (a-X)、(b-X)和(c-X)分別對應(yīng)于輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3。類似地，CDR(d-X)、(e-X)和(f-X)以這種順序從重鏈的N末端起存在。即，CDR(d-X)、(e_X)和(f_X)分別對應(yīng)于重鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3。
具有上文提到的結(jié)合特性的抗體的一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)例是包含以下區(qū)域的抗體:
(1)包含(i_X)中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含(j_X)中所顯示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或
(2)以上(I)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中將一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選地I至20個(gè)、更優(yōu)選地I至10個(gè)、甚至更優(yōu)選地一個(gè)至幾個(gè)(例如，1、2、3、4或5個(gè))氨基酸殘基在從(1-X)和(j_X)中的一者或者二者所顯示的氨基酸序列中選出的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸序列中替換和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中該抗體具有與任一種上述抗體等同的結(jié)合特性或與任一種上述抗體競爭性地結(jié)合野生型人CD81。這里，“等同的結(jié)合特性”意指與上文相同。
具有上文提到的結(jié)合特性的抗體的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是這樣的抗體，所述抗體與包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體所結(jié)合的表位相同或基本上相同的野生型人CD81表位結(jié)合，其中所述輕鏈可變區(qū)包含(1-X)中所顯示的氨基酸序列并且所述重鏈可變區(qū)包含(j-X)中所顯示的氨基酸序列。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)例是這樣的抗體，所述抗體與包含輕鏈和重鏈的抗體所結(jié)合的表位相同或基本上相同的野生型人CD81表位結(jié)合，其中所述輕鏈包含(k-X)中所顯示的氨基酸序列并且所述重鏈包含(1-X)中所顯示的氨基酸序列。
在此，“基本上相同的表位”意指與具有上述特定輕鏈(可變區(qū))序列和重鏈(可變區(qū))序列的抗體所識別的表位不同但以立體方式重疊的表位。識別“基本上相同的表位”的抗體與具有上述特定輕鏈(可變區(qū))序列和重鏈(可變區(qū))序列的抗體競爭地與野生型人CD81結(jié)合
最廣泛使用和快速的用于確定兩種抗體是否與相同表位或立體重疊表位結(jié)合的方法是競爭測定法，所述競爭測定法可以按眾多不同模式設(shè)置，使用標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體。通常，將抗原固定在基板上；并且使用放射性同位素或酶標(biāo)記物測量未標(biāo)記抗體阻斷標(biāo)記抗體結(jié)合的能力。
本發(fā)明的抗體也可以是包含選自屬于以上組I至24任一組中的6個(gè)⑶R中至少一個(gè)⑶R的抗體，所述抗體與包含全部這六個(gè)⑶R的抗體競爭性地結(jié)合野生型人⑶81。
另外，本發(fā)明的抗體可以是這樣的抗體，所述抗體與包含屬于以上組I至24任一組的全部六個(gè)CDR的抗體的輕鏈和重鏈的氨基酸序列擁有80%或更大，優(yōu)選地90%或更大，更優(yōu)選地95%或更大的同源性并且與這種抗體競爭性地結(jié)合野生型人⑶81。如本文中提到的氨基酸序列同源性可以使用NCBI BLAST (國家生物技術(shù)信息中心基本局部比對搜索工具)的Blastp程序在以下條件下(期望值=10 ;允許空位；矩陣=BLOSUM62 ;過濾=關(guān)閉)計(jì)算。( )另一個(gè)具體實(shí)施方案
另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的抗體，當(dāng)所述抗體對野生型人CD81的結(jié)合親和力是100%時(shí)，它針對(I)至(5)、(7)、(8)、(11)和(12)中描述的每種人CD81變體具有小于40%的結(jié)合親和力。
具有上文提到的結(jié)合特性的抗體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是:
(1)一種抗體，其包含:
(a-25)包含SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的CDR ；
(b-25)包含SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的CDR ；
(c-25)包含SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的CDR ；
(d-25)包含SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的CDR ；
(e-25)包含SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的CDR ;和 (f-25)包含SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的CDR，或者
(2)包含以上(a-25)至(f- 25)的CDR的抗體，其中將一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選一個(gè)至幾個(gè)(例如，1、2、3、4或5個(gè))氨基酸殘基在從SEQ ID NOs: 11至16中所顯示的氨基酸序列中選出的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4、5或6個(gè))氨基酸序列中替換和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中該抗體具有與任一種上述抗體等同的結(jié)合特性或與任一種上述抗體競爭性地結(jié)合野生型人⑶81。這里，“等同的結(jié)合特性”意指與上文相同。
可以通過上文描述的多種結(jié)合測定法和競爭性測定法確定抗體的結(jié)合特性和競爭性結(jié)合。作為測定法的結(jié)果，當(dāng)證實(shí)了測試抗體的“等同的結(jié)合特性”或“競爭性結(jié)合”后，則可以通過下文詳細(xì)描述的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)測試治療作用。
具有上文提到的結(jié)合特性的抗體的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)例是包含以下區(qū)域的抗體:
(1)包含以上確定的⑶R(a-25)至(c-25)的輕鏈可變區(qū)和包含以上確定的⑶R(d_25)至(f-25)的重鏈可變區(qū)；或
(2)以上(I)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中將一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選一個(gè)至幾個(gè)(例如，1、2、3、4或5個(gè))氨基酸殘基在從SEQ ID NOs: 11至16中所顯示的氨基酸序列中選出的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4、5或6個(gè))氨基酸序列中替換和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中該抗體具有與任一種上述抗體等同的結(jié)合特性或與任一種上述抗體競爭性地結(jié)合野生型人⑶81。這里，“等同的結(jié)合特性”意指與上文相同。
更優(yōu)選地，在上文提到的抗體中，⑶R (a-25)、(b-25)和(c-25)以這種順序從輕鏈的N末端起存在。即，CDR (a-25)、(b-25)和(c_25)分別對應(yīng)于輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3。類似地，CDR (d-25)、(e-25)和(f-25)以這種順序從重鏈的N末端起存在。即，CDR (d-25),(e-25)和(f-25)分別對應(yīng)于重鏈的CDR1、CDR2和CDR3。
具有上文提到的結(jié)合特性的抗體的一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)例是包含以下區(qū)域的抗體:(1)包含SEQID NO: 18中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:20中所顯示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或
(2)以上(I)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其中將一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選地I至20個(gè)、更優(yōu)選地I至10個(gè)、甚至更優(yōu)選地一個(gè)至幾個(gè)(例如，1、2、3、4或5個(gè))氨基酸殘基在從SEQ IDNOs: 18和20中所顯示的氨基酸序列中選出的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸序列中替換和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中該抗體具有與任一種上述抗體等同的結(jié)合特性或與任一種上述抗體競爭性地結(jié)合野生型人⑶81。這里，“等同的結(jié)合特性”意指與上文相同。
具有上文提到的結(jié)合特性的抗體的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是這樣的抗體，所述抗體與包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體所結(jié)合的表位相同或基本上相同的野生型人CD81表位結(jié)合，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 18中所顯示的氨基酸序列并且所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:20中所顯示的氨基酸序列。一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)例是這樣的抗體，所述抗體與包含輕鏈和重鏈的抗體所結(jié)合的表位相同或基本上相同的野生型人CD81表位結(jié)合，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO:30中所顯示的氨基酸序列并且所述重鏈包含SEQ ID N0:32中所顯示的氨基酸序列。在此，“基本上相同的表位”意思同上文。
本發(fā)明的抗體也可以是這樣的抗體，所述抗體包含選自6個(gè)CDR(a-25)至(f-25)中的至少一個(gè)⑶R并且與包含全部這六個(gè)⑶R的抗體競爭性地結(jié)合野生型人⑶81。
另外，本發(fā)明的抗體可以是這樣的抗體，所述抗體與包含全部六個(gè)CDR(a-25)至(f-25)的抗體的輕鏈和重鏈的氨基酸序列擁有80%或更大，優(yōu)選地90%或更大，更優(yōu)選地95%或更大的同源性并且與這種抗體競爭性地結(jié)合野生型人⑶81。在此，可以按與上文相同的方法計(jì)算氨基酸同源性。
(I)抗體的產(chǎn)生
本發(fā)明的抗體可以是任何單克隆抗體，只要它與上文提到的野生型人CD81的特定肽區(qū)域結(jié)合。雖然抗體的同種型不受限制，但 是它優(yōu)選地是IgG、IgM或IgA，特別優(yōu)選地是IgG。另外，抗體的分子類型不受限制，除完整抗體分子之外，抗體可以例如是片段，如Fab、Fab’或F (ab’)2、基因修飾的綴合物分子如scFv、scFv_Fc、小抗體(minibody)或雙抗體(diabody)，或用某種分子(例如，具有穩(wěn)定作用的分子如聚乙二醇(PEG)等)修飾的其衍生物。
由于將本發(fā)明的抗體用作以人作為其施用對象的醫(yī)藥品，所以本發(fā)明中的所用抗體是向人施用時(shí)已經(jīng)降低了顯示抗原性風(fēng)險(xiǎn)的抗體；具體而言，該抗體是(完全)人抗體、人源化抗體、非人(例如，小鼠、大鼠、兔)_人嵌合抗體等，特別優(yōu)選地是人抗體?？梢愿鶕?jù)下文描述的方法通過基因工程技術(shù)制備人源化抗體和嵌合抗體。雖然(完全)人抗體也可以從人-人(或人-小鼠)雜交瘤產(chǎn)生，但是為了以低成本穩(wěn)定供應(yīng)大量抗體，合乎需要的是使用如下文描述的噬菌體展示法或產(chǎn)生人抗體的動(dòng)物(例如，小鼠)產(chǎn)生它。
(II)本發(fā)明抗體的產(chǎn)生方法
本發(fā)明的抗體可以通過以下實(shí)施例中描述的方法或已知方法產(chǎn)生。
(i)抗原的制備
制備本發(fā)明抗體的所用抗原可以是野生型人CD81蛋白或其部分肽、具有一種或多種與其相同的抗原決定簇的(合成)肽(下文中，這些有時(shí)簡稱為本發(fā)明的抗原)。
例如通過以下方式產(chǎn)生野生型人CD81蛋白或其部分肽:(a)通過公眾已知的方法或其改良方法從人組織或人細(xì)胞制備這種蛋白或其部分肽，b)使用肽合成儀等通過公眾已知的肽合成方法化學(xué)合成這種蛋白或其部分肽，(C)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體包含編碼野生型人CD81蛋白或其部分肽的DNA，或(d)以編碼野生型人CD81或其部分肽的核酸作為模板使用無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，生物化學(xué)合成這種蛋白質(zhì)或其部分肽。
(iia)使用噬菌體展示人抗體文庫制備人抗體
可以通過卩遼菌體展示法產(chǎn)生人抗體(Hoogenboom和Winter, J.Mol.Biol.，227:381 (1991) ；Marks 等人，J.Mol.Biol.，222:581 (1991) ；Cole 等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,第 77 頁(1985)和 Boermer 等人，J.1mmunol.，147(1):86-95(1991))。
制備噬菌體展示人抗體文庫的方法包括但不限于例如下文描述的方法。
雖然所用噬菌體不受限制，但是通常情況下優(yōu)選地使用絲狀噬菌體(Ff噬菌體)。作為在噬菌體表面上呈遞外來蛋白質(zhì)的方法，可以提到一種方法，所述方法包括將外來蛋白質(zhì)作為與任何外殼蛋白g3p和g6p至g9p的融合蛋白表達(dá)并呈遞在外殼蛋白上；并且經(jīng)常使用一種方法，所述方法包括將這種外來蛋白質(zhì)與g3p或g8p的N端側(cè)融合。作為噬菌體展示載體，可以提到I) 一種載體，其中將外來基因以具有噬菌體基因組外殼蛋白基因的融合基因形式導(dǎo)入，以允許在噬菌體表面上待呈遞的全部外殼蛋白作為具有外來蛋白質(zhì)的融合蛋白呈遞，2) —種載體，其中編碼融合蛋白的基因與野生型外殼蛋白基因分開地插入以允許融合蛋白和野生型外殼蛋白同時(shí)表達(dá)，和3)具有噬菌粒載體(其攜帶編碼融合蛋白的基因)的大腸桿菌(E.coli)用具有野生型外殼蛋白基因的輔助噬菌體感染，以產(chǎn)生同時(shí)表達(dá)所述融合蛋白和野生型外殼蛋白的噬菌體粒子等。然而，類型2)或3)的噬菌體展示載體用于抗體文庫的制備，因?yàn)樵贗)的情況下，當(dāng)大的外來蛋白質(zhì)融合時(shí)感染能力喪失。
作為具體載體，可以提到由 Holt 等人(Curr.0pin.Biotechnol., 11:445-449, 2000)描述的那些作為實(shí)例。例如，pCESl (見J.Biol.Chem.，274:18218-18230, 1999)是表達(dá)Fab的噬菌粒載體，其中在一個(gè)乳糖啟動(dòng) 子的控制下配置了 g3p信號肽下游的編碼K L鏈恒定區(qū)的DNA和g3p信號肽下游的編碼CH3的DNA、介于His標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽和琥珀終止密碼子(TAG)之間的g3p編碼序列。將這種載體導(dǎo)入具有琥珀突變的大腸桿菌時(shí)，F(xiàn)ab呈遞到g3p外殼蛋白上，但是當(dāng)它在沒有琥珀突變的HB2151菌株等中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生可溶性Fab抗體。作為表達(dá)scFv的噬菌粒載體，例如，使用pHENl (J.Mol.Biol., 222:581-597, 1991)等。
另外，作為輔助噬菌體的實(shí)例，可以提到M13-K07、VCSM13等。
并且作為另一種噬菌體展示載體，可以提到一種載體，其中將所述載體設(shè)計(jì)成包含編碼半胱氨酸密碼子的DNA序列與抗體基因的3’末端和外殼蛋白基因的5’末端的每一者連接，以便同時(shí)和獨(dú)立(不以融合蛋白形式)表達(dá)這兩個(gè)基因并且通過導(dǎo)入的半胱氨酸殘基之間的S-S鍵,將抗體呈遞到卩遼菌體表面的外殼蛋白上(Morphosys公司CysDisplay 技術(shù))等。
作為人抗體文庫種類，可以提到天然/未免疫的文庫、合成文庫、免疫文庫等。
天然/未免疫的文庫是通過RT-PCR獲得由正常人具有的Vh基因和 '基因并且將它們隨機(jī)克隆入上述噬菌體展示載體而獲得的文庫。通常，使用源自正常人的外周血淋巴細(xì)胞、骨髓、扁桃體等的mRNA等作為模板。將通過以下方式制備的文庫特別稱作天然文庫:選擇性擴(kuò)增其中不發(fā)生歸因于抗原敏化的類別轉(zhuǎn)換的源自IgM的mRNA，以避免如臨床史所引起的V基因偏離。代表性地，可以提到劍橋抗體技術(shù)文庫(見J.Mol.Biol.，222:581-597，1991 ；Nat.Biotechnol., 14:309-314，1996)、醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)文庫(見 Annu.Rev.Tmmuno1., 12:433-455，1994)、Dyax Corp.文庫(見 J.Biol.Chem., 1999 (上文)；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 14:7969-7974, 2000)等。
通過選擇人B細(xì)胞中有功能的特定抗體基因并且將V基因區(qū)段中的一部分抗原結(jié)合區(qū)域(例如，CDR3等)替換為編碼適宜長度的隨機(jī)氨基酸序列的DNA以構(gòu)建文庫，獲得合成文庫。認(rèn)為這種文庫在抗體表達(dá)效率和穩(wěn)定性方面是優(yōu)異的，因?yàn)閺囊婚_始，文庫就可以用Vh和'基因的組合構(gòu)建，這產(chǎn)生有功能的scFv和Fab。代表性地，可以提到Morphosys AG 的 HuCAL 文庫(見 J.Mol.Biol., 296:57-86，2000)、BioInvent 文庫(見 Nat.Biotechnol., 18:852, 2000)、Crucell 文庫(見 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:3938, 1995 ；J.1mmunol.Methods, 272:219-233，2003)等。
通過以下方式獲得免疫文庫:按照與上述天然/未免疫的文庫文庫相同的方式，從采集自針對靶抗原的血液抗體滴度升高的人(如患有癌癥、自身免疫性疾病、傳染病等的患者或接種受體)中的淋巴細(xì)胞或從通過上述體外免疫方法用靶抗原人工免疫的人淋巴細(xì)胞等制備mRNA，并且通過RT-PCR擴(kuò)增Vh和\基因，以便構(gòu)建文庫。有可能甚至從這類文庫獲得相對小尺寸的所需抗體，因?yàn)樵陂_始時(shí)在文庫中已經(jīng)含有所需的抗體基因。
通過噬菌體展示法針對靶抗原選擇抗體的過程稱作淘選。具體而言，例如，通過以下重復(fù)一系列操作約3至5次濃縮呈遞抗原特異性抗體的噬菌體:使抗原固定的載體和噬菌體文庫彼此接觸，洗除未結(jié)合的噬菌體，此后從載體洗脫結(jié)合的噬菌體，并且將這種噬菌體感染大腸桿菌以增殖該噬菌體。作為用于固定抗原的載體，可以提到在通常的抗原-抗體反應(yīng)或親和層析中使用的多種載體，例如不溶性多糖如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素、合成樹脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅或包含玻璃、金屬等的微量平板、管、膜、柱、珠等和表面等離子體共振(SPR)傳感芯片等。對于抗原固定，可以使用物理吸附，和使用化學(xué)鍵的方法也是可接受，其中所述化學(xué)鍵用來使蛋白質(zhì)或酶等不溶化和固定。例如，優(yōu)選地使用生物素_(鏈霉)抗生物素蛋白系統(tǒng)等 。為洗滌未結(jié)合的噬菌體，可以使用封閉液如BSA溶液(I次或2次)、包含表面活性劑如吐溫的PBS (3次至5次)等。也存在提及優(yōu)選使用檸檬酸鹽緩沖液(PH5)等用于洗滌的報(bào)道。為洗脫特定噬菌體，通常使用酸(例如，0.1M鹽酸等)；用特異性蛋白酶切割(例如，可以在抗體基因和外殼蛋白基因之間的連接位點(diǎn)導(dǎo)入編碼胰蛋白酶切割位點(diǎn)的基因序列)。在這種情況下，大腸桿菌感染和增殖是可能的，即便全部外殼蛋白以融合蛋白形式表達(dá)，因?yàn)橐吧屯鈿さ鞍壮蔬f在洗脫的噬菌體的表面上)，所以采用可溶性抗原的競爭性洗脫或通過還原S-S鍵洗脫(例如，在前述CysDisplay 中，在進(jìn)行淘選后，可以通過使用合適的還原劑使抗體和外殼蛋白解離而收集抗原特異性噬菌體)也是可能的。當(dāng)用酸洗脫時(shí)，洗脫物用Tris等中和，并且隨后將洗脫的噬菌體感染培養(yǎng)的大腸桿菌；此后通過常規(guī)方法收集噬菌體。
在通過淘選法濃縮呈遞抗原特異性抗體的噬菌體后，將噬菌體感染大腸桿菌并且將細(xì)胞接種到平板上以進(jìn)行細(xì)胞克隆。再從每個(gè)克隆收集噬菌體，并且通過上述的抗體滴度測定法(例如，ELISA、RIA等)或使用FACS或SPR的測量，證實(shí)抗原結(jié)合活性。
可以通過以下方式從呈遞抗原特異性抗體的所選擇噬菌體克隆中分離和純化抗體，例如，當(dāng)使用在抗體基因和外殼蛋白基因的接頭位點(diǎn)處并入琥珀終止密碼子的載體作為噬菌體展示載體時(shí)，使噬菌體感染不具有琥珀突變的大腸桿菌(例如，HB2151菌株)以產(chǎn)生并在周質(zhì)或培養(yǎng)基中分泌可溶性抗體分子，用溶菌酶等溶解細(xì)胞壁，收集胞外級分，并且使用于上述相同的純化技術(shù)純化。只要已經(jīng)事先導(dǎo)入His標(biāo)簽或c-myc標(biāo)簽，可以使用固定的金屬親和層析(IMAC)方法、抗c-myc抗體柱等容易地純化抗體。在淘選中使用特異性蛋白酶切割時(shí)，通過這種蛋白酶的作用從噬菌體表面分離抗體分子，從而可以通過進(jìn)行與上文所提到的相同純化操作來純化所需的抗體。
使用包含所述肽區(qū)域的多肽，通過上文提到的結(jié)合測定法證實(shí)如此獲得的人抗體(例如，scFv.Fab)針對野生型人⑶81的表位區(qū)域的親和力和親合力。
(iib)使用產(chǎn)生人抗體的動(dòng)物制備人抗體
如果將有功能的人Ig基因?qū)肫渲幸呀?jīng)敲除(KO)內(nèi)源免疫球蛋白(Ig)基因的非人溫血?jiǎng)游锊⑶疫@種動(dòng)物用抗原免疫,則產(chǎn)生人抗體,而不產(chǎn)生這種動(dòng)物衍生的抗體。因此，如果使用已經(jīng)對其建立產(chǎn)生雜交瘤技術(shù)的動(dòng)物如小鼠，則可以通過與用來制備小鼠單克隆抗體的常規(guī)方法相同的方法，獲得完全的人單克隆抗體。即，可以通過使用產(chǎn)生人抗體的小鼠生成人單克隆抗體(見Immunol.Today，17:391-397，1996)，其中通過使用常規(guī)轉(zhuǎn)基因(Tg)技術(shù)用人Ig H鏈和L鏈微型基因轉(zhuǎn)染的小鼠與其中已經(jīng)使用常規(guī)KO技術(shù)使內(nèi)源性小鼠Ig基因失活的小鼠交配，獲得產(chǎn)生人抗體的小鼠，從而產(chǎn)生人單克隆抗體(W093/12227、W092/03918, W094/02602, W094/25585, W096/34096 和 TO96/33735)。
培養(yǎng)通過從產(chǎn)生人抗體的小鼠獲得的產(chǎn)生抗人CD81抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合所獲得的雜交瘤，并且可以從培養(yǎng)上清液回收并且通過常規(guī)方法純化抗人CD81抗體。使用包含所述肽區(qū)域的多肽，通過上文提到的結(jié)合測定法證實(shí)如此獲得的人抗體針對野生型人CD81的表位區(qū)域的親和力和親合力。
(lie)嵌合抗體的制備
如本文所用，“嵌合抗 體”意指其中H鏈可變區(qū)和L鏈可變區(qū)~11和')的序列源自非人動(dòng)物物種并且其中恒定區(qū)序列(C1^PCJ源自人的抗體。可變區(qū)的序列優(yōu)選地源自例如允許容易制備雜交瘤的動(dòng)物物種，如小鼠、大鼠、兔等。
作為制備嵌合抗體的方法的實(shí)例，可以提到美國專利號6，331，415中描述的方法或其部分改良方法等。
用獲得的嵌合H鏈和嵌合L鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。作為宿主細(xì)胞，除上述的小鼠骨髓瘤細(xì)胞之外，可以提到動(dòng)物細(xì)胞，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、猴衍生的C0S-7細(xì)胞、Veix)細(xì)胞、大鼠衍生的GHS細(xì)胞等。對于轉(zhuǎn)化，可以使用適用于動(dòng)物細(xì)胞的任何方法，其中優(yōu)選電穿孔方法等。可以通過以下方式分離嵌合單克隆抗體:在對其合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞持續(xù)給定時(shí)間并且隨后按照與上述相同的方式收集培養(yǎng)上清液和純化嵌合單克隆抗體。備選地，也可能從使用動(dòng)物如牛、山羊或禽的生殖系細(xì)胞作為宿主細(xì)胞通過常規(guī)方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳或蛋中容易地和大量獲得嵌合單克隆抗體，其中已經(jīng)建立用于所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)并且已經(jīng)編纂作為家養(yǎng)動(dòng)物(家禽)大量增殖的訣竅。另夕卜，也可能從轉(zhuǎn)基因植物的種子、葉等中大量獲得嵌合單克隆抗體，其中以植物如谷物、稻、小麥、大豆或煙草的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，通過使用向原生質(zhì)體中微量注射和電穿孔、粒子槍法和用于完整細(xì)胞的T1-載體法等產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物，其中已經(jīng)建立用于所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，并且大量培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物作為主要作物。(iii)人源化抗體
如本文所用，“人源化抗體”意指一種抗體，其中在除互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)之外的可變區(qū)[即，恒定區(qū)和可變區(qū)中的框架區(qū)(FR)]中存在的全部區(qū)域的序列均源自人，并且其中僅CDR的序列源自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種。其他哺乳動(dòng)物物種優(yōu)選地是其中可以容易地進(jìn)行雜交瘤產(chǎn)生的動(dòng)物物種，例如，小鼠、大鼠、兔等。
作為制備人源化抗體的方法的實(shí)例，可以提到美國專利號5，225，539、5，585，089、5，693，761和5，693，762、EP239400、W092/19759中描述的方法或其部分改良方法等。具體而言，按照與上述嵌合抗體相同的方式分離編碼源自非人哺乳動(dòng)物物種(例如，小鼠)的％和Vl的DNA,在此后,使用自動(dòng)化DNA測序儀(例如，由Applied Biosystems公司等制造)通過常規(guī)方法進(jìn)行測序后并且使用已知的抗體序列數(shù)據(jù)庫分析所獲得的核苷酸序列或從中推導(dǎo)的氨基酸序列[例如，Kabat數(shù)據(jù)庫(見Kabat等人，“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”，NIH編輯，美國健康與人類服務(wù)部，公共衛(wèi)生服務(wù)，第5版，1991)等]以確定兩條鏈的CDR和FR。設(shè)計(jì)一個(gè)核苷酸序列，其中編碼具有與測定FR序列相似的FR序列的人抗體L鏈和H鏈的核苷酸序列的CDR編碼區(qū)用編碼另一個(gè)動(dòng)物物種的CDR的測定核苷酸序列替換，并且將這個(gè)核苷酸序列分成約20至40個(gè)堿基的片段，并且將互補(bǔ)于這個(gè)核苷酸序列的序列分成約20至40個(gè)堿基的片段，從而這些片段可選地與前述片段重疊?？梢酝ㄟ^以下方式構(gòu)建編碼具有人衍生的FR和源自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種的CDR的Vh和\的DNA:使用DNA合成儀合成各個(gè)片段并且將它們根據(jù)常規(guī)方法雜交和連接。為了更快和更高效地將源自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種的⑶R轉(zhuǎn)移至人衍生的V1^P '中，優(yōu)選的是使用基于PCR的位點(diǎn)定向誘變。作為這種方法的實(shí)例，可以提到JP-A-5-227970等中描述的順序CDR移植方法。
應(yīng)當(dāng)指出在通過如上文所 述的方法制備人源化抗體時(shí)，如果僅將CDR的氨基酸序列移植至模板人抗體FR，則與原始非人抗體相比，抗原結(jié)合活性有時(shí)可能下降。在這種情況下，在⑶R周圍組合地移植一些FR氨基酸是有效的。待移植的非人抗體FR氨基酸可以是對維持每個(gè)CDR的立體結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基；可以通過使用計(jì)算機(jī)的立體結(jié)構(gòu)評估推導(dǎo)這種氣基酸殘基。
可以通過將如此獲得的編碼Vh和\的DNA與編碼人衍生的Ch和Q的DNA分別連接并將連接產(chǎn)物導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，獲得產(chǎn)生人源化抗體的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/植物。
在不使用CDR移植(其中將小鼠CDR移植入人抗體可變區(qū))情況下制備人源化抗體的備選方法例如是這樣的方法，所述方法包括基于抗體之間保守結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性確定哪個(gè)是在非人可變區(qū)中可以替換的氨基酸殘基。這種方法可以例如在如EP0571613B1、US5, 766，886、US5，770，196、US5，821，123、US5，869，619 中所述那樣實(shí)施。如果存在關(guān)于原始非人抗體的Vh和 '中每一者的氨基酸序列信息，則使用這種方法制備人源化抗體可以容易地通過利用例如Xoma公司所提供的合同抗體制備服務(wù)進(jìn)行。
如同嵌合抗體，可以通過使用基因工程技術(shù)，將人源化抗體改變成scFv、scFv_Fc、小抗體、dsFv、Fv等；并且它們可以通過使用合適的啟動(dòng)子在微生物如大腸桿菌或酵母中產(chǎn)生。
使用包含肽區(qū)域的多肽，通過上文提到的結(jié)合測定法證實(shí)如此獲得的人源化抗體針對野生型人CD81的表位區(qū)域的親和力和親合力。
(III)抗體的優(yōu)化可以輕易地制備上文提到的本發(fā)明的抗人CD81抗體以包含多種變化、替換、插入和缺失。例如，為了使抗體的表達(dá)水平最大化，可以優(yōu)化抗體基因的核苷酸序列，從而匹配用于抗體表達(dá)的細(xì)胞的密碼子選擇頻率。增強(qiáng)抗體穩(wěn)定性的額外修飾包括如下文描述的修飾IgG4以用脯氨酸替換鉸鏈區(qū)中殘基228處的絲氨酸。就其他修飾而言，可以提到如需要用來優(yōu)化抗體與藥物綴合時(shí)的效率的替換。例如，抗體可以在其羧基末端進(jìn)行修飾以包括用于藥物連接的氨基酸，例如，可以添加一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基?？梢孕揎椇愣▍^(qū)以導(dǎo)入用于結(jié)合糖或其他部分的位點(diǎn)。
使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)，包括位點(diǎn)定向誘變或重組克隆，可以產(chǎn)生本發(fā)明的抗CD81抗體的突變體。
一個(gè)特別優(yōu)選的替換變體類型涉及替換親本抗體(例如，人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，經(jīng)選擇用于進(jìn)一步研發(fā)的所得變體相對于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改善的生物學(xué)特性。用于產(chǎn)生此類替換性變體的便利方式涉及使用噬菌體展示的親和力成熟法。簡而言之，將幾個(gè)高變區(qū)突變以便在每個(gè)位點(diǎn)處產(chǎn)生全部可能的氨基酸替換。如此產(chǎn)生的抗體變體被展示為與噬菌體上絲狀噬菌體M13的外殼蛋白g3p融合的蛋白質(zhì)。隨后如本文中所公開那樣，對噬菌體展示的變體篩選它們的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可以進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定明顯有助于抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基。一旦產(chǎn)生此類變體，將這組變體進(jìn)行如本文中所述的篩選，并且可以選擇在一種或多種相關(guān)測定法中具有優(yōu)異特性的抗體用于進(jìn)一步研發(fā)。通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備編碼抗人⑶81抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括，但不限于從天然來源中分離(在天然存在的氨基酸序列變體情況下)或通過寡核苷酸介導(dǎo)(或位點(diǎn)定向)的誘變、PCR誘變和盒誘變早先制備的抗人CD81抗體變體或非變體形式而制備。
優(yōu)選的親和力成熟的抗體具有比制備成熟抗體的起始抗體大5倍、更優(yōu)選地10倍、甚至更優(yōu)選地20或30倍的親和力。
IgG4突變
將IgG4抗體施用至人或一 些動(dòng)物時(shí)，已經(jīng)觀察到IgG4抗體的血清濃度因與內(nèi)源性IgG4轉(zhuǎn)換而降低的現(xiàn)象。已經(jīng)已知的這種IgG4轉(zhuǎn)換受殘基228處Ser至Pro的點(diǎn)突變抑制(Mol.1mmunol.30, 105, 1993, Protein Sc1.6, 407, 1997, Mol Tmmunol.38, I, 2001, NatBiotechnol.27, 767, 2009)。
(IV)證實(shí)抗體的治療作用
本發(fā)明的抗體對T淋巴細(xì)胞遷移具有抑制作用。使用廣泛已知的用于淋巴細(xì)胞功能的評價(jià)系統(tǒng)檢測這種作用。例如，通過以下方式評價(jià)對T淋巴細(xì)胞遷移的影響:在細(xì)胞因子(例如，PHA, IL-2、TNF-Q、IL-22、IL-7和VIP)存在的情況下，將培養(yǎng)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)與測試抗體接觸，刺激PBMC的移行(例如，通過添加趨化因子，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I (SDF-1 ;也稱作CXCL12)，并且確定對移行的抑制(見例如，Blood2009年8月13日；114(7):1366-1373)。具體而言，可以使用下文描述的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。
作為淋巴細(xì)胞，可以使用建立的細(xì)胞系如Jurkat細(xì)胞(克隆E6-1，ATCC編號TIB-152)和源自人外周血的細(xì)胞。人外周血衍生細(xì)胞是可商業(yè)獲得的(KAC C0., Ltd.等)。備選地，也可以通過使用Ficoll/Paque密度梯度離心根據(jù)The Journal ofImmunology, 147，2251 (1991)，從健康人的外周血中分離含有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞部分制備人外周血衍生細(xì)胞。
細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
可以使用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)評價(jià)抗體或其功能性片段抑制其抗原涉及細(xì)胞遷移的功能的能力。通常，通過以下方式進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):通過屏障(例如，內(nèi)皮、濾器)分開適宜的細(xì)胞如白細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞)和趨化因子并且監(jiān)測這些細(xì)胞向該屏障或跨過該屏障的移行。例如，可以通過以下方式檢驗(yàn)測試抗體對細(xì)胞遷移的抑制作用:添加含有趨化因子如SDF-1的培養(yǎng)基至96孔移行平板的孔(第一室)，將具有由細(xì)胞可透過性微孔膜組成的底表面(第二室)的跨孔(transwell)放置到該孔上，添加測試抗體和細(xì)胞，測量細(xì)胞從第二室至第一室的移行并且將移行程度與不存在抗體或存在非特異性抗體時(shí)的移行程度比較(Immunol.1nvest.17:625-677 (1988))
(V)重組抗體的產(chǎn)生
任何產(chǎn)生系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生本發(fā)明中所用的抗體。用于產(chǎn)生抗體的產(chǎn)生系統(tǒng)包括體外和體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)。體外產(chǎn)生系統(tǒng)包括使用真核細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)和使用原核細(xì)胞的那些。
可以按已知的方法表達(dá)并且獲得如上文所述那樣構(gòu)建的抗體基因。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的情況下，可以使用這樣的DNA或含有所述DNA的載體完成表達(dá)，其中常用的可用啟動(dòng)子、待表達(dá)的抗體基因和在其3’下游的多聚A信號已經(jīng)功能性連接。啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的實(shí)例包括人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。
額外地，作為可以用于表達(dá)本發(fā)明中使用的抗體的啟動(dòng)子，有病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子如逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猴病毒40(SV40)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子如人延伸因子I a (hEFl a )。
例如，當(dāng)使用SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，可以通過Mulligan等人(Mulligan, R.C.等人，Nature (1979) 277，108-114)的方法輕易地完成表達(dá)，或當(dāng)使用ShEFla啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，可以通過 Mizushima 等人(Mizushima, S.和 Nagata, S.Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322)的方法輕易地完成表達(dá)。
在大腸桿菌的情況下，可以通過功能性連接常用的可用啟動(dòng)子、用于抗體分泌的號序列和待表達(dá)的抗體基因，隨后表達(dá)之，實(shí)施表達(dá)。作為啟動(dòng)子，例如，可以提到IacZ啟動(dòng)子和araB啟動(dòng)子。當(dāng)使用IacZ啟動(dòng)子時(shí)，可以使用Ward等人(Ward, E.S.等 A , Nature (1989) 341, 544-546 ；ffard, E.S.等 A , FASEB J.(1992)6, 2422-2427)的方法，或當(dāng)使用araB啟動(dòng)子時(shí)，可以使用Better等人(Better, M.等人，Science (1988) 240，1041-1043)的方法。
作為用于抗體分泌的信號序列，當(dāng)在大腸桿菌周質(zhì)中產(chǎn)生時(shí)，可以使用PelB信號序列(Lei, S.P.等人，J.Bacteriol.(1987) 169,4379-4383)。在分離周質(zhì)中產(chǎn)生的抗體后，使抗體的結(jié)構(gòu)在使用之前適當(dāng)?shù)卦僬郫B(見例如，W096/30394)。
作為復(fù)制起點(diǎn)，可以使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的那些。另外，為了擴(kuò)增宿主細(xì)胞系統(tǒng)中的基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體可以包含氨基糖甙類轉(zhuǎn)移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標(biāo)記。
當(dāng)使用真核細(xì)胞時(shí)，存在采用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。已知的動(dòng)物細(xì)胞包括(I)哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、和VeiO細(xì)胞，(2)兩棲類細(xì)胞如非洲爪蟾卵母細(xì)胞，或(3)昆蟲細(xì)胞如sf9、sf21和Tn5。已知的植物細(xì)胞包括,例如,源自煙草(Nicotiana tabacum)的經(jīng)歷過愈傷組織培養(yǎng)的那些。已知的真菌細(xì)胞包括酵母如酵母屬(Saccharomyces),更具體地是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),或絲狀真菌如曲霉屬(Aspergillus),更具體地是黑曲霉(Aspergillus niger)。
當(dāng)使用原核細(xì)胞時(shí)，存在采用細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。已知的細(xì)菌細(xì)胞包括大腸桿菌和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。
通過借助轉(zhuǎn)化將所需抗體基因?qū)脒@些細(xì)胞中并且在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可以獲得抗體。培養(yǎng)按已知的方法實(shí)施。例如，作為培養(yǎng)基，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640和MDM，并且可以組合使用血清補(bǔ)充物如胎牛血清(FCS)。此外，可以通過將其中已經(jīng)導(dǎo)入抗體基因的細(xì)胞植入動(dòng)物的腹腔等在體內(nèi)產(chǎn)生抗體。
作為體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)，可以提到采用動(dòng)物的那些和采用植物的那些。當(dāng)使用動(dòng)物時(shí)，存在采用哺乳動(dòng)物和昆蟲的產(chǎn)生系統(tǒng)。
作為哺乳動(dòng)物，可以使 用山羊、豬、綿羊、小鼠和牛(Vicki Glaser, SPECTRUMBiotechnology Applications, 1993)。另外，作為昆蟲，可以使用蠶。
當(dāng)使用植物時(shí)，例如，可以使用煙草。
將抗體基因?qū)脒@些動(dòng)物或植物中，并且在這類動(dòng)物或植物中產(chǎn)生抗體并且回收。例如，將抗體基因插入編碼在乳中內(nèi)在產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(如山羊酪蛋白)的基因的中部以制備融合基因。將含有其中已經(jīng)插入抗體基因的融合基因的DNA片段注射至山羊胚中，并且將這種胚導(dǎo)入至雌山羊中。從轉(zhuǎn)基因山羊或其后代產(chǎn)生的乳獲得所需抗體，其中所述轉(zhuǎn)基因山羊由已經(jīng)接受這種胚的山羊生產(chǎn)。為了增加含有由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的所需抗體的乳的量，根據(jù)需要，可以向轉(zhuǎn)基因山羊給予激素。(Ebert，K.M.等人，Mo/Technology(1994) 12，699-702)。
當(dāng)使用蠶時(shí)，將已經(jīng)插入所需抗體基因的桿狀病毒感染蠶，并且可以從所述蠶的體液獲得所需的抗體(Maeda, S.等人，Nature (1985) 315，592-594)。另外，當(dāng)使用煙草時(shí)，將所需的抗體基因插入用于植物的表達(dá)載體中，例如PM0N530，并且隨后將該載體導(dǎo)入細(xì)菌如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中。隨后將細(xì)菌感染煙草如普通煙草(Nicotiana tabacum)以從煙草的葉獲得所需的抗體(Julian, K._C.Ma等人，Eur.J.1mmunol.(1994)24，131-138)。
當(dāng)抗體在體外或體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)中產(chǎn)生時(shí)，如上文所述，編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA可以分別整合入表達(dá)載體中并且同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主，或者編碼H鏈和L鏈的DNA可以整合入單個(gè)表達(dá)載體中并且宿主用所述載體轉(zhuǎn)化(見國際專利申請W094-11523)。
本發(fā)明中使用的抗體可以是抗體片段或其修飾形式，只要它們能夠用于本發(fā)明即可。例如，作為抗體的片段，可以提到Fab、F(ab’)2、Fv或其中H鏈和L鏈的Fv經(jīng)合適接頭連接的單鏈Fv(ScFv)。具體而言，抗體用酶(例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)處理，以產(chǎn)生抗體片段，或構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，并且隨后將該基因?qū)氡磉_(dá)載體中，所述表達(dá)載體在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)(見例如，Co, M.S.等人，J.1mmunol.(1994) 152, 2968-2976 ；Better, Μ.和 Horwitz, A.Η., Methods in Enzymology(1989) 178,476-496, Plueckthun, A.和 Skerra, A.，Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1986) 121, 652-663 ；Rousseaux, J.等人，Methods inEnzymology (1986) 121，663-669 ；Bird, R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
可以通過連接抗體H鏈的V區(qū)和抗體L鏈的V區(qū)獲得scFv。在scFv中，H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)優(yōu)選地通過接頭、優(yōu)選地通過肽接頭連接(Huston, J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(1988) 85，5879-5883)。scFv中H鏈的V區(qū)和L鏈的V區(qū)可以源自上述抗體的任一種。作為用于連接V區(qū)的肽接頭,可以使用包含例如12-19個(gè)氨基酸殘基的任何單鏈肽。
可以通過以下方式獲得編碼scFv的DNA:使用編碼以上抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA和編碼以上抗體的L鏈或L鏈V區(qū)的DNA作為模板，采用針對兩個(gè)末端的引物對，通過用PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼上述序列中目的氨基酸序列的DNA部分，并且進(jìn)一步組合旨在將編碼肽接頭部分的DNA與在其兩端分別連接H鏈和L鏈的特定引物對進(jìn)行擴(kuò)增。
一旦構(gòu)建了編碼scFv的DNA，可以通過常規(guī)方法獲得含有這些DNA的表達(dá)載體和用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主，并且可以使用所產(chǎn)生的宿主，通過常規(guī)方法獲得scFv。
這些抗體片段可以通過以與上文所提到的相似方式獲得其基因，并且通過允許該基因在宿主中表達(dá)來產(chǎn)生。如本申請的權(quán)利要求中使用的“抗體”包括這些抗體片段。
作為修飾的抗體，可以使用與多種分子例如聚乙二醇(PEG)連接的抗體。如本申請的權(quán)利要求中使用的“抗體”包括這些修飾的抗體?？梢酝ㄟ^化學(xué)修飾獲得的抗體，從而獲得這些修飾的抗體。本領(lǐng)域中已經(jīng)建立了這些方法。
可以從宿主細(xì)胞的內(nèi)部或外部分離如上所述產(chǎn)生和表達(dá)的抗體，并隨后可以純化至均一?？梢酝ㄟ^親和層析完成用于本發(fā)明中的抗體的分離和純化。作為用于這類親和層析的柱子，可以提到蛋白A柱和蛋白G柱。用于蛋白A柱的載體的實(shí)例是Hyper D、POROS和Sepharose F.F等。備選地，可以不受限制地使用常規(guī)用于蛋白質(zhì)的分離和純化方法。根據(jù)需要，可以通過組合上述親和層析之外的層析、`過濾、超濾、脫鹽、透析等完成用于本發(fā)明中的抗體的分離和純化。層析包括例如離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾等。這些層析法可以適用于HPLC(高效液相色譜)。備選地，可以使用反相HPLC。
可以通過測量吸光度或通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等確定以上獲得的抗體的濃度。因此，當(dāng)使用吸光度測量時(shí)，用于本發(fā)明中的抗體或含有這種抗體的樣品適當(dāng)?shù)赜肞BS (-)稀釋并且隨后在280nm測量吸光度，隨后使用lmg/ml的吸收系數(shù)是1.350D來計(jì)算。當(dāng)使用ELISA方法時(shí)，如下實(shí)施測量。即，在pH9.6的0.1M重碳酸鹽緩沖液中稀釋至I U g/ml的IOOii I山羊抗人IgG(由TAGO制造)添加至96孔板(由Nunc制造)并且在4° C孵育過夜以固定抗體。
在封閉后，添加IOOiU適當(dāng)稀釋的本發(fā)明使用的每種抗體或含有這種抗體的樣品或添加100 ill人IgG (由CAPPEL制造)作為標(biāo)準(zhǔn)物，并且在室溫孵育I小時(shí)。在洗滌后，添加100 u 15000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG抗體(由BIO SOURCE制造)并且在室溫孵育I小時(shí)。在洗滌后，將底物溶液添加并孵育，隨后使用3550型微量平板讀數(shù)儀(由Bio-Rad制造)在405nm測量吸光度以計(jì)算目的抗體的濃度。
(VI)含有本發(fā)明抗體的藥物組合物
本發(fā)明也提供用于預(yù)防和/或治療炎性腸病(IBD)、多發(fā)性硬化、牛皮癬或血液癌癥的藥物。術(shù)語“治療”不僅包括完全治愈，還包括改善癥狀。已知CD81在IBD患者中過量表達(dá)并且抗⑶81抗體用于預(yù)防、緩解或治療IBD。這里，“炎性腸病(IBD) ”意指包括潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎的疾病。
由于發(fā)明人獲得了所述抗CD81抗體抑制T細(xì)胞遷移的新研究結(jié)果，所以本發(fā)明的抗體也可用于預(yù)防、改善或治療與T細(xì)胞遷移相關(guān)的疾病如多發(fā)性硬化和牛皮癬。
由于本發(fā)明的抗體不增強(qiáng)細(xì)胞因子(如白介素-2)從T細(xì)胞產(chǎn)生，含有這種抗體的藥物組合物不造成因細(xì)胞因子過量產(chǎn)生所致的不良副作用?？梢酝ㄟ^已知方法確定對淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，例如使用ELISA定量在多種條件下培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子或治療后淋巴細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法，如Nature Immunology,第8卷，第9期，2007年9月，942中所述。
本發(fā)明人闡明了本發(fā)明抗體對源自血液癌癥患者的癌細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，并且發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體可用作針對血液癌癥的預(yù)防性藥、緩解藥或治療藥。根據(jù)WHO分類法，將血液癌癥劃分成白血病、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和骨髓增生異常綜合征。將白血病進(jìn)一步劃分成急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴性白血病。將惡性淋巴瘤劃分成霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
急性髓性白血病是最流行類型的成人白血病。雖然急性淋巴性白血病相對流行兒童中，但是它也在成人中以某個(gè)發(fā)生率發(fā)生。慢性髓性白血病是治療成績近年來大幅改善的疾病。慢性淋巴性白血病是在歐洲和美國相對流行的白血病類型，但是在日本較不流行。在惡性淋巴瘤中，非霍奇金淋巴瘤包括成人T細(xì)胞淋巴瘤、淋巴母細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤等。MALT淋巴瘤和濾泡淋巴瘤是進(jìn)展如此緩慢從而在許多年期間沒有主要進(jìn)展的低惡性度腫瘤。相反，Burkitt淋巴瘤、淋巴母細(xì)胞淋巴瘤和成人T細(xì)胞淋巴瘤是按周加重的極端惡性的腫瘤。介于之間的其他類型是外周T細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤和套細(xì)胞淋巴瘤。這些腫瘤按月進(jìn)展。多發(fā)性骨髓瘤是處于來自B淋巴細(xì)胞成熟以產(chǎn)生免疫球蛋白的漿細(xì)胞階段的腫瘤類型。骨髓增生異常綜合征是總稱為以骨髓干細(xì)胞的形態(tài)和功能反常為特征的一類疾病。
用于血液癌癥的可用治療包括化療法、放療法、分子打IE治療和與造血干細(xì)胞移植組合的高劑量化療法。盡管小兒急性淋巴性白血病是可治療的，長期存活率為80%，但是成人急性淋巴性白血病具有15-35%的低的長期存活率，盡管在60-80%的患者中實(shí)現(xiàn)完全緩解。由于Gleevec (甲磺酸伊馬替尼)的出現(xiàn)，慢性淋巴性白血病的治療成績已經(jīng)改善。在低惡性或中度惡性的霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中改進(jìn)的治療成績已經(jīng)是明顯的。同時(shí)，在成人T細(xì)胞淋巴瘤中，多種療法不能產(chǎn)生改進(jìn)的治療成績，中位數(shù)存活時(shí)間是約I年(IGAKU NO AYUMI，第212卷，第5期，第461-466頁，2005年)。淋巴母細(xì)胞淋巴瘤是劃歸為高惡性非霍奇金淋巴瘤的一組疾病。對于Burkitt淋巴瘤，已經(jīng)通過短時(shí)間大劑量化療改進(jìn)預(yù)后；2年存活率目前是約70%或更高,從而顯示改進(jìn)的治療成績(Magrath, 1.等人，J.Clin.0ncol.，14:925-943，1996 ;Mead，G.M.等人，Ann.0ncol.，13:1264-1274，2002)；然而，3年存活率仍低至49%,從而需要進(jìn)一步改善治療成績(Thomas D.A.等人，J.Clin.0ncol., 17:2461-2470, 1999)。在彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤中，采用抗CD20抗體(利妥昔單抗)和CHOP療法(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松龍)的聯(lián)合療法正在變成標(biāo)準(zhǔn)療法，對處于進(jìn)展階段的低風(fēng)險(xiǎn)年輕患者具有改進(jìn)的治療成績。然而，對處于進(jìn)展階段的高風(fēng)險(xiǎn)年輕患者，沒有優(yōu)于CHOP療法的療法可用。關(guān)于多發(fā)性骨髓瘤的治療，抗癌藥或多或少地有效，但是這種疾病是高度惡性的，從而治療不如白血病和淋巴瘤那樣有效。就骨髓增生異常綜合征而言，5年至10年存活率是約30-40%。期望進(jìn)一步改善治療功效的高惡性的血液癌癥包括急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、淋巴母細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、成人T細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征等。
如上文所述，對于中度至高度惡性的血液癌癥，沒有治療功效令人滿意的治療方法或藥物；對于新治療方法和藥物存在需求。發(fā)現(xiàn)抗CD81抗體(其作為血液癌癥治療藥物的潛力迄今不清楚)基于它們的補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性，對缺少治療功效的一些類型的血液癌癥(即Jurkat細(xì)胞(源自急性淋巴性白血病患者的癌細(xì)胞系)和Ramos細(xì)胞(源自Burkitt淋巴瘤患者的癌細(xì)胞系)具有細(xì)胞毒效應(yīng)。抗CD81抗體對癌細(xì)胞顯示細(xì)胞毒效應(yīng)的研究結(jié)果是迄今未知的。
因而，本發(fā)明也提供以本發(fā)明抗體作為有效成分的用于血液癌癥的預(yù)防劑、改善劑或治療劑，優(yōu)選地用于高度惡性的血液癌癥的預(yù)防劑、改善劑或治療劑。
本發(fā)明不僅適用于血液癌癥，還適用于任何類型表達(dá)CD81的癌細(xì)胞。因此，以本發(fā)明抗體作為有效成分的藥物有效作為由表達(dá)CD81的癌細(xì)胞引起的癌癥的預(yù)防劑、改善劑或治療劑。
含有抗CD81抗體作為有效成分的藥劑本身作為通過已知的制藥方法配制的藥劑施用。例如，它可以按采用水或其他可藥用液體的無菌溶液或者懸液的注射液形式使用。另夕卜，考慮將它與藥學(xué)可接受的載體或介質(zhì)，如無菌水、生理鹽水溶液、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、運(yùn)載體(vehicle)和防腐劑合適地組合，一般地通過以制藥實(shí)施所要求的單位用量形式混合而制劑化。調(diào)節(jié)有效成分在這些制劑中的量，以獲得規(guī)定范圍內(nèi)的合適體積。
用于注射的無菌組合物可以使用運(yùn)載體如注射用蒸餾水根據(jù)常規(guī)配制法配制。用于注射的水溶液的實(shí)例包括含 有葡萄糖和其他輔料(如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉)的生理鹽水溶液和等滲溶液?？梢越M合地使用適宜的增溶劑，例如，醇如乙醇、多元醇如丙二醇或聚乙二醇、非離子表面活性劑如聚山梨醇酯80 或HC0-50。
油的實(shí)例包括芝麻油和大豆油，并且可以將苯甲酸芐酯或芐醇組合地使用作為增溶齊U?？梢耘渲迫刖彌_劑如磷酸鹽緩沖液或乙酸鈉緩沖液、無痛化劑(soothing agent)如鹽酸普魯卡因、穩(wěn)定劑如芐醇、酚和抗氧化劑。如此形成的注射液通常填充于適宜的安瓿中。
對于含有抗CD81抗體作為有效成分的藥劑，口服施用和腸胃外施用均是可能的。優(yōu)選腸胃外施用。其具體實(shí)例包括注射劑型、經(jīng)鼻劑型、經(jīng)肺劑型、經(jīng)皮劑型等。對于注射劑型的實(shí)例，可以通過靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射等實(shí)施全身性或局部施用。
可以根據(jù)患者的年齡和癥狀恰當(dāng)?shù)剡x擇施用量。例如，可以選擇一次施用每千克體重0.0OOlmg至IOOOmg范圍內(nèi)的劑量。備選地,可以選擇每位患者0.001至IOOOOOmg范圍內(nèi)的劑量。然而，本發(fā)明的治療劑不受這些劑量限制。
通過參考下文實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制性的。
實(shí)施例實(shí)施例1人CD81抗體的制備
(1)人抗人CD81抗體片段的選擇
使用人⑶81蛋白和與⑶81具有同源性的人⑶9蛋白或表達(dá)人⑶81的和不表達(dá)人 CD81 的細(xì)胞，對完整的人抗體文庫 n-CoDeR(Nature Biotechnol.18:852-856，2000 ；W098/32845)篩選與人CD81的特異性結(jié)合，以獲得與人CD81特異性結(jié)合的人抗體片段(scFv)。首先，使用鏈霉抗生物素蛋白標(biāo)記的磁珠，在競爭性CD9蛋白存在的情況下回收與生物素化的CD81蛋白結(jié)合的噬菌體。洗去未結(jié)合的噬菌體并且通過胰蛋白酶處理洗脫結(jié)合的曬菌體。實(shí)施淘選3次,并且將選擇的曬菌體文庫在大腸桿菌中表達(dá)為抗體片段。使用FMAT (熒光測量微體積分析技術(shù))篩選與表達(dá)CD81的細(xì)胞結(jié)合但是與不表達(dá)CD81的細(xì)胞不結(jié)合的抗體片段。通過以下方式進(jìn)行FMAT:向固定在384孔培養(yǎng)平板的各孔上的細(xì)胞添加抗體片段并且使用熒光標(biāo)記的抗scFv抗體檢測其結(jié)合。作為篩選的結(jié)果，選出兩種人CD81特異性人抗體片段。通過測序測定這些片段的核苷酸序列(scFV-002-A07:SEQ IDN0:33,scFv-005-C01:SEQ ID NO:35)和推導(dǎo)的氨基酸序列(scFv-002_A07:SEQ ID NO:34,scFv-005-C01:SEQ ID NO:36)。
(2)抗人CD81抗體的產(chǎn)生
使用以上⑴所獲得的片段的序列信息，通過已知的方法(NatBiotechnol.，18，852-856，2000)制備抗人 CD81 抗體基因(重鏈可變區(qū)(Vh): SEQ IDN0:9(002-A07) ；SEQ ID NO: 19 (005-C01)和輕鏈可變區(qū)(Vl): SEQ ID NO: 7 (002-A07) ；SEQID NO: 17 (005-C01))，使用具有BsmI和NheI識別位點(diǎn)的一組引物，通過PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增的片段用BsmI和NheI消化并亞克隆至pCEP4(Invitrogen)衍生的載體中。在重鏈表達(dá)載體中，插入其中第228位Ser以Pro (S228P)取代的突變?nèi)薡 4鏈的基因組區(qū)域，并且在輕鏈表達(dá)載體中，插入人λ鏈 的基因組區(qū)域。使用FuGene6 (Roche)根據(jù)制造商的操作方案，將如此構(gòu)建的重鏈及輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293-EBNA細(xì)胞(ATCC-CRL-10852)中，并且將細(xì)胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)6日后，從培養(yǎng)上清液純化IgG4抗體。簡而言之，將培養(yǎng)溶液離心并且使上清液經(jīng)歷蛋白A層析。將純化的物質(zhì)針對IOmM NaP緩沖液(0.15M NaCl,pH6.5)透析。如此獲得的002-A07IgG4抗體具有由SEQ ID NO:28中所顯示的氨基酸序列組成的重鏈和由SEQ ID NO:26中所顯示的氨基酸序列組成的輕鏈。如此獲得的005_C01IgG4抗體具有由SEQ ID NO:32中所顯示的氨基酸序列組成的重鏈和由SEQ ID N0:30中所顯示的氨基酸序列組成的輕鏈。
試驗(yàn)例I抗CD81抗體對表達(dá)CD81的細(xì)胞的結(jié)合活性
(1)細(xì)胞制備
基于已知信息(JOURNAL OF VIROLOGY.，79，4316-4328，2005)，使用 Jurkat E6.1 細(xì)胞和人PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)作為表達(dá)人CD81的細(xì)胞以證實(shí)在實(shí)施例1中獲得的本發(fā)明抗體與表達(dá)人⑶81的細(xì)胞的結(jié)合。Jurkat E6.1細(xì)胞從歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)(目錄號88042803)購買。人PBMC從KAC C0.，Ltd.(KAC)購買。通過離心(4，000轉(zhuǎn)/分鐘，3分鐘，4° C)收集這些細(xì)胞并且將它們懸浮于FACS染色緩沖液(磷酸鹽緩沖液、0.09%疊氮鈉、1%牛血清白蛋白(BSA:Hyclone Laboratories))中。使用臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞的數(shù)目并且將IO6個(gè)細(xì)胞/100 μ I添加于微量離心管中。
(2)細(xì)胞染色向以上(I)中制備的細(xì)胞添加實(shí)施例1中制備的抗人⑶81抗體(002-A07或005-C01)或作為對照的人IgG4 (Acris) (0.lug),并且將細(xì)胞在4° C孵育20分鐘。用FACS染色緩沖液洗漆細(xì)胞后，將PE (藻紅蛋白)標(biāo)記的抗人IgG4抗體(Beckman coulter ；0.05 u g)添加至細(xì)胞并且在4° C孵育15分鐘。用FACS染色緩沖液洗滌2次后，將細(xì)胞離心(4，000轉(zhuǎn)/分鐘，3分鐘，4° C)，移除上清液并且將沉淀的細(xì)胞用BD Cytefix/Cyt印erm緩沖液(BD Biosciences)固定。在洗滌后，將緩沖液更換成PBS (NACALAITESQUE，Inc.)。使用FACSCalibur (BD Biosciences),通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗人⑶81抗體與細(xì)胞的結(jié)合率,并且將這種結(jié)合率計(jì)算為下述細(xì)胞的百分比，所述細(xì)胞具有比使用對照IgG4時(shí)所觀察的熒光強(qiáng)度更大的源自PE的熒光強(qiáng)度。在表I中顯示結(jié)果。002-A07和005-C01強(qiáng)烈地與JurkatE6.1細(xì)胞和人PBMC結(jié)合。
表I抗人⑶81抗體與Jurkat細(xì)胞和人PBMC的結(jié)合
權(quán)利要求
1.抗人CD81抗體，所述抗體能夠結(jié)合由SEQID NO:22所示的氨基酸序列中氨基酸編號80至175的氨基酸序列組成的肽區(qū)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述肽區(qū)域由氨基酸編號113至175的氨基酸序列組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中所述抗體對選自以下(I)至(13)的至少一種人CD81變體的結(jié)合親和力小于對具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人CD81的結(jié)合親和力的40%， (1)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號127處的酪氨酸以苯丙氨酸或色氨酸替換的CD81變體； (2)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號130處的丙氨酸以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體； (3)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號135處的纈氨酸以丙氨酸或亮氨酸替換的CD81變體； (4)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號137處的天冬氨酸以丙氨酸或谷氨酸替換的CD81變體； (5)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號143處的丙氨酸以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體； (6)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號151處的組氨酸以丙氨酸或精氨酸替換的CD81變體； (7)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號154處的亮氨酸以丙氨酸或異亮氨酸替換的CD81變體； (8)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號158處的甘氨酸以丙氨酸或絲氨酸替換的CD81變體； (9)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號164處的丙氨酸以蘇氨酸或纈氨酸替換的CD81變體； (10)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號168處的絲氨酸以丙氨酸或蘇氨酸替換的CD81變體； (11)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號169處的纈氨酸以丙氨酸或亮氨酸替換的CD81變體； (12)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號170處的亮氨酸以丙氨酸或異亮氨酸替換的CD81變體；和 (13)具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸編號172處的天冬酰胺以丙氨酸或谷氨酰胺替換的CD81變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體對以上確定的人CD81變體(9)和(11)中每一種人CD81變體的結(jié)合親和力小于對具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人⑶81的結(jié)合親和力的40%。
5.抗體，其具有與權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的抗體等同的結(jié)合特性，或者與權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人⑶81。
6.抗體，其與 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的抗體競爭地結(jié)合具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的人CD81并且具有T細(xì)胞遷移的抑制作用。
7.抗人⑶81抗體，其包含在以下組I至24的任一個(gè)組中所述的全部6個(gè)⑶R: 組I (a-1)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR， (b-Ι)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR， (c-Ι)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR， (d-Ι)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR， (e-Ι)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-Ι)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的⑶R 組2 (a-2)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR， (b-2)包含SEQ ID NO:2中所示氨 基酸序列的CDR， (c-2)包含SEQ ID NO:37中所示氨基酸序列的CDR， (d-2)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR， (e-2)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-2)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組3 (a-3)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR， (b-3)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR， (c-3)包含SEQ ID NO:40中所示氨基酸序列的CDR， (d-3)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR， (e-3)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-3)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組4 (a-4)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR， (b-4)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR， (c-4)包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的CDR3， (d-4)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR， (e-4)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-4)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組5 (a-5)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR， (b-5)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR， (c-5)包含SEQ ID NO:46中所示氨基酸序列的CDR6， (d-5)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR， (e-5)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-5)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR 組6 (a-6)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-6)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-6)包含SEQ ID NO:49中所示氨基酸序列的CDR，(d-6)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-6)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-6)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組7(a-7)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-7)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-7)包含SEQ ID NO:52中所示氨基酸序列的CDR，(d-7)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-7)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-7)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組8(a-8)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-8)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-8)包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的CDR，(d-8)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-8)包含SEQ ID NO:5中 所示氨基酸序列的CDR，和(f-8)包含SEQ ID NO:55中所示氨基酸序列的CDR組9(a-9)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-9)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-9)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-9)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-9)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-9)包含SEQ ID NO:61中所示氨基酸序列的CDR組10(a-ΙΟ)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-ΙΟ)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-10)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-ΙΟ)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-ΙΟ)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-ΙΟ)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組11(a-11)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-11)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-11)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-11)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-ΙΙ)包含SEQ ID NO:69中所示氨基酸序列的⑶R，和(f-11)包含SEQ ID NO:70中所示氨基酸序列的CDR，組12(a-12)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-12)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-12)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-12)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-12)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-12)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR，組13(a-13)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-13)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-13)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-13)包含SEQ ID NO:77中所示氨基酸序列的⑶R，(e-13)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-13)包含SEQ I D NO:6中所示氨基酸序列的CDR組14(a-14)包含SEQ ID NO:80中所示氨基酸序列的CDR，(b-14)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-14)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-14)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-14)包含SEQ ID NO:81中所示氨基酸序列的CDR，和(f-14)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組15(a-15)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-15)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-15)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-15)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-15)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-15)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組16(a-16)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-16)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-16)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR，(d-16)包含SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-16)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-16)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組17(a-17)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-17)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-17)包含SEQ ID NO:52中所示氨基酸序列的CDR，(d-17)包含SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-17)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-17)包含SEQ ID NO:93中所示氨基酸序列的CDR，組18(a-18)包含SEQ ID NO:98中所示氨基酸序列的CDR，(b-18)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-18)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-18)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-18)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-18)包含SEQ ID NO:99中所示氨基酸序列的CDR，組19(a-19)包含SEQ ID NO:60中所示氨基酸序列的CDR，(b-19)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-19)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-19)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的⑶R，(e-19)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-19)包含SEQ ID NO:99中所示氨基酸序列的CDR，組20(a-20)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-20)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-20)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR， (d-20)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-20)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-20)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR，組21(a-21)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-21)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-21)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR，(d-21)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR，(e-21)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-21)包含SEQ ID NO:55中所示氨基酸序列的CDR，組22(a-22)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR，(b-22)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR，(c-22)包含SEQ ID NO:66中所示氨基酸序列的CDR，(d-22)包含SEQ ID NO: 110中所示氨基酸序列的CDR，(e-22)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和(f-22)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR組23(a-23)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR， (b-23)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR， (c-23)包含SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的CDR， (d-23)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR， (e-23)包含SEQ ID NO:5中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-23)包含SEQ ID NO: 115中所示氨基酸序列的CDR 組24 (a-24)包含SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的CDR， (b-24)包含SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的CDR， (c-24)包含SEQ ID NO:90中所示氨基酸序列的CDR， (d-24)包含SEQ ID NO: 4中所示氨基酸序列的CDR， (e-24)包含SEQ ID NO: 120中所示氨基酸序列的CDR，和 (f-24)包含SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的CDR。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體，其包含在以下組25至48的任一個(gè)組中所述的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的組合， 組25 (g-1)包含以上確定的CDR(a-l)至(c-Ι)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-Ι)包含以上確定的⑶R(d-l)至(f-Ι)的重鏈可變區(qū)， 組26 (g-2)包含以上確定的CDR(a-2)至(c_2)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-2)包含以上確定的CDR(d-2)至(f-2)的重鏈可變區(qū)， 組27 (g-3)包含以上確定的CDR(a-3)至(c_3)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-3)包含以上確定的CDR(d-3)至(f-3)的重鏈可變區(qū)， 組28 (g-4)包含以上確定的CDR(a-4)至(c_4)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-4)包含以上確定的CDR(d-4)至(f-4)的重鏈可變區(qū)， 組29 (g-5)包含以上確定的CDR(a-5)至(c_5)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-5)包含以上確定的CDR(d-5)至(f-5)的重鏈可變區(qū)， 組30 (g-6)包含以上確定的CDR(a-6)至(c_6)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-6)包含以上確定的CDR(d-6)至(f-6)的重鏈可變區(qū)， 組31 (g-7)包含以上確定的CDR(a-7)至(c_7)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-7)包含以上確定的CDR(d-7)至(f-7)的重鏈可變區(qū)， 組32 (g-8)包含以上確定的CDR(a-8)至(c_8)的輕鏈可變區(qū)；和(h-8)包含以上確定的CDR(d-8)至(f_8)的重鏈可變區(qū)，組33(g-9)包含以上確定的CDR(a-9)至(c_9)的輕鏈可變區(qū)；和(h-9)包含以上確定的CDR(d-9)至(f_9)的重鏈可變區(qū)，組34(g-10)包含以上確定的CDR(a-lO)至(c-10)的輕鏈可變區(qū)；和(h-10)包含以上確定的⑶R(d-10)至(f-10)的重鏈可變區(qū)，組35(g-11)包含以上確定的CDR(a-ll)至(c-11)的輕鏈可變區(qū)；和(h-11)包含以上確定的⑶R(d-ll)至(f-11)的重鏈可變區(qū)，組36(g-12)包含以上確定的CDR(a-12)至(c_12)的輕鏈可變區(qū)；和(h-12)包含以上確定的⑶R(d-12)至(f-12)的重鏈可變區(qū)，組37(g-13)包含以上確定的CDR(a-13)至(c_13)的輕鏈可變區(qū)；和(h-13)包含以上確定的⑶R(d-13)至(f-13)的重鏈可變區(qū)，組38`(g-14)包含以上確定的CDR(a-14)至(c_14)的輕鏈可變區(qū)；和(h-14)包含以上確定的⑶R(d-14)至(f-14)的重鏈可變區(qū)，組39(g-15)包含以上確定的CDR(a-15)至(c_15)的輕鏈可變區(qū)；和(h-15)包含以上確定的⑶R(d-15)至(f-15)的重鏈可變區(qū)，組40(g-16)包含以上確定的CDR(a-16)至(c_16)的輕鏈可變區(qū)；和(h-16)包含以上確定的⑶R(d-16)至(f-16)的重鏈可變區(qū)，組41(g-17)包含以上確定的CDR(a-17)至(c_17)的輕鏈可變區(qū)；和(h-17)包含以上確定的⑶R(d-17)至(f-17)的重鏈可變區(qū)，組42(g-18)包含以上確定的CDR(a-18)至(c_18)的輕鏈可變區(qū)；和(h-18)包含以上確定的⑶R(d-18)至(f-18)的重鏈可變區(qū)，組43(g-19)包含以上確定的CDR(a-19)至(c_19)的輕鏈可變區(qū)；和(h-19)包含以上確定的⑶R(d-19)至(f-19)的重鏈可變區(qū)，組44(g-20)包含以上確定的CDR(a-20)至(c_20)的輕鏈可變區(qū)；和(h-20)包含以上確定的CDR(d-20)至(f_20)的重鏈可變區(qū)，組45(g-21)包含以上確定的⑶R(a-21)至(c-21)的輕鏈可變區(qū)；和(h-21)包含以上確定的CDR(d-21)至(f_21)的重鏈可變區(qū)， 組46 (g-22)包含以上確定的CDR(a-22)至(c_22)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-22)包含以上確定的CDR(d-22)至(f_22)的重鏈可變區(qū)， 組47 (g-23)包含以上確定的CDR(a-23)至(c_23)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-23)包含以上確定的CDR(d-23)至(f_23)的重鏈可變區(qū)， 組48 (g-24)包含以上確定的CDR (a-24)至(c_24)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-24)包含以上確定的CDR(d-24)至(f_24)的重鏈可變區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8述的抗體，其包含在以下組49至72的任一個(gè)組中所述的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的組合， 組49 (1-Ι)包含SEQ ID NO:8中所示 氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-Ι)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組50 (1-2)包含SEQ ID NO:38中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-2)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組51 (1-3)包含SEQ ID NO:41中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-3)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組52 (1-4)包含SEQ ID NO:44中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-4)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組53 (1-5)包含SEQ ID NO:47中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-5)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組54 (1-6)包含SEQ ID NO:50中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-6)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組55 (1-7)包含SEQ ID NO:53中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-7)包含SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組56 (1-8)包含SEQ ID NO:56中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-8)包含SEQ ID NO:57中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組57 (1-9)包含SEQ ID NO:62中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-9)包含SEQ ID NO:63中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組58(1-10)包含SEQ IDNO:67中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-10)包含SEQ IDNO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組59(1-11)包含SEQ IDNO:71中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-11)包含SEQ IDNO:72中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組60(1-12)包含SEQ IDNO:75中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-12)包含SEQ IDNO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組61(1-13)包含SEQ IDNO:8中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-13)包含SEQ IDNO:78中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組62 (1-14)包含SEQ IDNO:82中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-14)包含SEQ IDNO:83中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組63(1-15)包含SEQ IDNO:86中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-15)包含SEQ IDNO:87中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組64(1-16)包含SEQ IDNO:91中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-16)包含SEQ IDNO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組65(1-17)包含SEQ IDNO:94中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-17)包含SEQ IDNO:95中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組66(1-18)包含SEQ IDNO: 100中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-18)包含SEQ IDNO: 101中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組67(1-19)包含SEQ IDNO: 104中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-19)包含SEQ IDNO: 101中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組68(1-20)包含SEQ IDNO: 106中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-20)包含SEQ IDNO: 10中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組69(1-21)包含SEQ IDNO: 108中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-21)包含SEQ IDNO:57中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組70(1-22)包含SEQ IDNO: 111中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和(j-22)包含SEQ IDNO: 112中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，組71 (1-23)包含SEQ ID NO: 116中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-23)包含SEQ ID NO: 117中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)， 組72 (1-24)包含SEQ ID NO: 121中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-24)包含SEQ ID NO: 122中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的抗體，其包含在以下組73至96的任一個(gè)組中所述的輕鏈和重鏈的組合: 組73 (k-Ι)包含SEQ ID NO:26中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-1)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈， 組74 (k-2)包含SEQ ID NO:39中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-2)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈， 組75 (k-3)包含SEQ ID NO:42中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-3)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈， 組76 (k-4)包含SEQ ID NO:45中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-4)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈， 組77 (k-5)包含SEQ ID NO:48中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-5)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈， 組78 (k-6)包含SEQ ID NO:51中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-6)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈， 組79 (k-7)包含SEQ ID NO:54中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-7)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈， 組80 (k-8)包含SEQ ID NO:58中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-8)包含SEQ ID NO:59中所示氨基酸序列的重鏈， 組81 (k-9)包含SEQ ID NO:64中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-9)包含SEQ ID NO:65中所不氨基酸序列的重鏈， 組82 (k-ΙΟ)包含SEQ ID NO:68中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-10)包含SEQ ID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，組83(k-11)包含SEQID NO:73中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-11)包含SEQID NO:74中所示氨基酸序列的重鏈，組84(k-12)包含SEQID NO:76中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-12)包含SEQID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，組85(k-13)包含SEQID NO:26中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-13)包含SEQID NO:79中所示氨基酸序列的重鏈，組86(k-14)包含SEQID NO:84中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-14)包含SEQID NO:85中所示氨基酸序列的重鏈，組87(k-15)包含SEQID NO:88中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-15)包含SEQID NO:89中所示氨基酸序列的重鏈，組88 (k-16)包含SEQID NO:92中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-16)包含SEQID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，組89(k-17)包含SEQID NO:96中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-17)包含SEQID NO:97中所示氨基酸序列的重鏈，組90 (k-18)包含SEQID NO: 102中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-18)包含SEQID NO: 103中所示氨基酸序列的重鏈，組91(k-19)包含SEQID NO: 105中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-19)包含SEQID NO: 103中所示氨基酸序列的重鏈，組92(k-20)包含SEQID NO: 107中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-20)包含SEQID NO:28中所示氨基酸序列的重鏈，組93(k-21)包含SEQID NO: 109中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-21)包含SEQID NO:59中所示氨基酸序列的重鏈，組94(k-22)包含SEQID NO: 113中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-22)包含SEQID NO: 114中所示氨基酸序列的重鏈，組95(k-23)包含SEQID NO: 118中所示氨基酸序列的輕鏈；和(1-23)包含SEQID NO: 119中所示氨基酸序列的重鏈，組96(k-24)包含SEQ ID NO: 123中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-24)包含SEQ ID NO: 124中所示氨基酸序列的重鏈。
11.抗體，其與權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)所述的抗體競爭地結(jié)合具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體，其具有T細(xì)胞遷移的抑制作用。
13.抗人⑶81抗體，其中所述抗體包含在權(quán)利要求7的組I至24任一組中所述的一個(gè)或多個(gè)⑶R并且與包含在所述組中所述的全部6個(gè)CDR的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ IDNO:22中所示氨基酸序列的人⑶81。
14.抗人CD81抗體，其中所述抗體與權(quán)利要求7所述的任一種抗體具有90%序列同源性并且與所述抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人⑶81。
15.抗人CD81抗體，其包含: (a-25)包含SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的CDR ； (b-25)包含SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的CDR ； (c-25)包含SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的CDR ； (d-25)包含SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的CDR ； (e-25)包含SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的CDR ;和 (f-25)包含SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的CDR。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所 述的抗體，其包含: (g-25)包含以上確定的CDR(a-25)至(c_25)的輕鏈可變區(qū)；和 (h-25)包含以上確定的CDR(d-25)至(f-25)的重鏈可變區(qū)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體，其包含: (1-25)包含SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；和 (j-25)包含SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的抗體，其包含: (k-25)包含SEQ ID NO:30中所示氨基酸序列的輕鏈；和 (1-25)包含SEQ ID NO:32中所示氨基酸序列的重鏈。
19.抗體，其與權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的抗體競爭地結(jié)合具有SEQID NO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的抗體，其具有T細(xì)胞遷移的抑制作用。
21.抗人CD81抗體，其中所述抗體包含權(quán)利要求15的一個(gè)或多個(gè)CDR并且與權(quán)利要求15所述的抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人⑶81。
22.抗人CD81抗體，其中所述抗體與權(quán)利要求15中所述的抗體具有90%序列同源性并且與所述抗體競爭地結(jié)合具有SEQ ID NO:22中所示氨基酸序列的人⑶81。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至6、11至14和19至22中任一項(xiàng)所述的抗體，其是人源化抗體或人抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求7至10和15至18中任一項(xiàng)所述的抗體，其是人源化抗體或人抗體。
25.包含核苷酸序列的多核苷酸,所述核苷酸序列編碼權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
26.以下兩種多核苷酸的組合，所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求1至6、11至14和19至23中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求I至6、11至14和19至23中任一項(xiàng)所述的抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
27.以下兩種多核苷酸的組合，所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求7至10、15至18和24中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求7至10、15至18和24中任一項(xiàng)所述的抗體的相應(yīng)輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
28.包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈和輕鏈。
29.以下兩種多核苷酸的組合，所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求1至6、11至14和19至23中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求1至6、11至14和19至23中任一項(xiàng)所述的抗體的輕鏈的核苷酸序列。
30.以下兩種多核苷酸的組合，所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求7至10、15至18和24中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含編碼權(quán)利要求7至10、15至18和24中任一項(xiàng)所述的抗體的相應(yīng)輕鏈的核苷酸序列。
31.表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求25或28所述的多核苷酸。
32.重組細(xì)胞，其用權(quán)利要求31所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
33.用以下兩種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含含有編碼權(quán)利要求1至6、11至14和19至23中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈的核苷酸序列的多核苷酸，和所述表達(dá)載體包含含有編碼權(quán)利要求 1至6、11至14和19至23中任一項(xiàng)所述的抗體的輕鏈的核苷酸序列的多核苷酸。
34.用以下兩種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含含有編碼權(quán)利要求7至10、15至18和24中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈的核苷酸序列的多核苷酸，和所述表達(dá)載體包含含有編碼權(quán)利要求7至10、15至18和24中任一項(xiàng)所述的抗體的相應(yīng)輕鏈的核苷酸序列的多核苷酸。
35.產(chǎn)生抗人⑶81抗體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求32至34中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，和從獲得的培養(yǎng)上清回收抗體。
36.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的抗體。
37.用于預(yù)防、改善或治療選自炎性腸病、多發(fā)性硬化、牛皮癬和血液癌癥的疾病的藥齊U，其包含權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了用作人用醫(yī)藥品的抗CD81抗體。具體而言，本發(fā)明提供了可以與肽結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗人CD81抗體，所述肽結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO22代表的氨基酸序列中氨基酸編號80至175所代表的氨基酸序列組成。
文檔編號A61P1/04GK103249833SQ20118005871
公開日2013年8月14日 申請日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者渡邊孝正, 吉間忠彥, M·馬特松, A·沙內(nèi)菲爾特, 長谷崎拓也 申請人:大日本住友制藥株式會(huì)社