修飾的免疫調(diào)節(jié)粒子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一項(xiàng)驚人的發(fā)現(xiàn)，即當(dāng)對(duì)受試者施用羧化粒子如羧化的聚苯乙烯、PLGA或金剛石粒子時(shí)，炎癥性免疫反應(yīng)得到改善。此外，本發(fā)明描述了通過施用這些上述的羧化粒子來治療炎癥性疾病的方法。
【專利說明】修飾的免疫調(diào)節(jié)粒子
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求都在2011年11月12日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/413，016和61/413，018的優(yōu)先權(quán)，并且兩者都以引用的方式整體并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]炎癥性疾病和病癥是異常的或以其它方式失調(diào)的炎癥性反應(yīng)造成疾病的病因?qū)W或嚴(yán)重程度的病狀。實(shí)例包括自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和糖尿病、感染性疾病如肺結(jié)核以及各種形式的腦膜炎和包括西尼羅河病毒性腦炎(West NileVirus encephalitis)在內(nèi)的腦炎、以及包括動(dòng)脈粥樣硬化和缺血再灌注在內(nèi)的其它病癥。
[0005]很多這些疾病的特征在于組織損傷或其它損傷部位的單核細(xì)胞浸潤。在這些浸潤中觀察到的單核細(xì)胞的實(shí)例包括淋巴細(xì)胞，特別是T淋巴細(xì)胞，以及如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和其它細(xì)胞等單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS細(xì)胞)的細(xì)胞。
[0006]在單核細(xì)胞浸潤中觀察到的很多細(xì)胞被懷疑在這些異常炎癥性反應(yīng)中起作用。例如，在如多發(fā)性硬化癥等疾病中，已經(jīng)知道CD4+T細(xì)胞在病理性自身免疫反應(yīng)中起重要作用。在T細(xì)胞活化的早期時(shí)間點(diǎn)，樹突狀細(xì)胞和其它MPS細(xì)胞可能負(fù)責(zé)CD4+T細(xì)胞的活化。MPS細(xì)胞還可以通過吞噬作用來促成炎癥，不過在至少一些炎癥性疾病中，還不清楚這些細(xì)胞在不存在CD4+T細(xì)胞的情·況下是否能夠如此。
[0007]外周血液單核細(xì)胞可以根據(jù)某些細(xì)胞表面分子的表達(dá)或不表達(dá)來歸類為兩組之一。具體來說，已了解人“常駐單核細(xì)胞”或“成熟單核細(xì)胞”具有CDH1t5CDie+表型(小鼠的對(duì)應(yīng)表型是CX3CRlhiCCR2_Grl_)。已了解另一組細(xì)胞，“炎癥性單核細(xì)胞”或“不成熟單核細(xì)胞”具有CD14+CD16_表型(小鼠的對(duì)應(yīng)表型是CX3CRl1t5CCI^+Grrh (Geissmann F.等，2003Immunityl9:71-82)
[0008]重要的是，雖然后者就觀察到它們從骨髓來源的外周血液細(xì)胞遷移到發(fā)炎的組織中的意義而言被理解為“炎癥性”，但是這些細(xì)胞沒有顯示出直接或通過其它細(xì)胞的作用引起炎癥。此外，這些細(xì)胞分化時(shí)可形成的各種MPS細(xì)胞也沒有顯示出引起炎癥。
[0009]在與不希望的免疫反應(yīng)相關(guān)的病癥中進(jìn)行全面長期免疫抑制的常規(guī)臨床策略是以長期施用廣效免疫抑制藥為基礎(chǔ)的，例如信號(hào)I阻滯劑，如環(huán)孢菌素A (CsA)、FK506(他克莫司(taciOlimus))以及皮質(zhì)類固醇。長期使用高劑量的這些藥物可導(dǎo)致毒副作用。此外，即使是在能夠耐受這些藥物的那些患者中，要求終身免疫抑制藥物治療帶來嚴(yán)重副作用的重大風(fēng)險(xiǎn)，包括腫瘤、嚴(yán)重感染、腎毒性以及代謝性病癥。
[0010]已發(fā)展出誘導(dǎo)抗原特異性耐受的方法，包括抗原或肽的細(xì)胞偶合。例如，在一種方法中，肽誘導(dǎo)的細(xì)胞偶合性耐受涉及收集、分離外周血液細(xì)胞并用疾病特異性自身抗原和亞乙基碳化二亞胺(ECDI)偶合試劑在無菌條件下處理，以及隨后再輸注至供體/患者體內(nèi)。這種方法成本高，并且必須在密切監(jiān)測的條件下由熟練的從業(yè)人員來執(zhí)行,并且可執(zhí)行所述程序的中心數(shù)量有限。使用紅血球作為供體細(xì)胞類型使得潛在來源擴(kuò)大至包括同種異體供體，因此增加來源細(xì)胞的供應(yīng)，從而使此療法的遞送顯著并潛在地?cái)U(kuò)展至任何有輸血認(rèn)證的配置。這些方法在來源細(xì)胞的供應(yīng)以及組織配型以使對(duì)供體細(xì)胞的免疫反應(yīng)減至最少的必要性方面受到明顯的限制。此外，本地處理細(xì)胞以便通過EDCI偶合自身抗原會(huì)帶來顯著的品質(zhì)控制問題。此外，這些方法還需要至少在一定程度上了解所要尋求免疫耐受的病理性抗原。
[0011]最近，已經(jīng)描述了消除了對(duì)來源細(xì)胞供應(yīng)的需要并且避免現(xiàn)有方法的組織配型的需要的肽偶合粒子，參見W02010/085509，所述專利以引用的方式整體并入本文。然而，這些方法仍然依賴于抗原特異性免疫耐受。
[0012]抗原特異性耐受一般并不理想，因?yàn)樵谌思膊≈刑禺愋钥乖?抗原表位一般是未知的。此外，抗原可以在受試者與受試者之間變化，以便使抗原特異性方法有效，因此有必要確定每個(gè)個(gè)別患者所識(shí)別的抗原，或者要求在施用之前使可能的肽的文庫與粒子偶合。這些肽的合成和個(gè)別偶合都耗時(shí)而且耗費(fèi)高昂。因此，對(duì)同時(shí)解決這兩個(gè)問題存在需要，由此消除對(duì)組織匹配細(xì)胞來源的需要，并同時(shí)消除對(duì)合成和偶合大量肽的需要。
發(fā)明概要
[0013]本發(fā)明涉及一項(xiàng)驚人的發(fā)現(xiàn)，即單獨(dú)的修飾粒子(即沒有肽與其偶合)可有效改善有需要的患者的炎癥性免疫反應(yīng)。令人驚奇的是，減輕炎癥性免疫反應(yīng)和治療炎癥性疾病所需要的僅僅是施用羧化粒子，而不需要有肽與其偶合。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含羧化粒子的藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子沒有連接的肽或抗原部分。在一些實(shí)施方案中，羧化粒子是聚苯乙烯粒子。在其它實(shí)施方案中，羧化粒子是金剛石粒子。在其它實(shí)施方案中，羧化粒子是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)粒子。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，含有羧化粒子的藥物組合物當(dāng)施用給有需要的受試者時(shí)誘導(dǎo)免疫耐受。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有羧化粒子的藥物組合物當(dāng)施用給有需要的受試者時(shí)改善炎癥性免疫反應(yīng)。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案 中，構(gòu)成本發(fā)明藥物制劑的羧化粒子具有約0.14 111至約1(^111的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.3μπι至約5μπι的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.5μπι至約3μπι的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.5 μ m的直徑。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種減少受試者的炎癥性免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間或嚴(yán)重程度的方法，其包括對(duì)受試者施用包含羧化粒子的藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子沒有連接的肽或抗原部分。在一些實(shí)施方案中，羧化粒子是聚苯乙烯粒子。在其它實(shí)施方案中，羧化粒子是金剛石粒子。在其它實(shí)施方案中，羧化粒子是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)粒子。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法當(dāng)施用給有需要的受試者時(shí)誘導(dǎo)免疫耐受。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法當(dāng)施用給有需要的受試者時(shí)改善炎癥性免疫反應(yīng)。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法利用羧化粒子，包含那些具有約0.1 μ m至約IOym直徑的粒子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.3μπι至約5μπι的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.5 μ m至約3 μ m的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.5μπι的直徑。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有自身免疫性病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫性病癥是多發(fā)性硬化癥、硬皮病、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡、雷諾氏(Reynaud’ s)綜合征、修格蘭氏(Sjorgen’s)綜合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、或克羅恩氏(Crohn’s)病。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，自身免疫性疾病是多發(fā)性
硬化癥。
[0021]在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有過敏性病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，過敏性病癥是濕疹、哮喘、過敏性鼻炎或皮膚過敏癥。
[0022]在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者是移植受者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試者已患上了心肌梗塞。在另Iv實(shí)施方案中，患者患有缺血再灌注。在另Iv實(shí)施方案中，患者患有動(dòng)脈粥樣硬化。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以任何合適的方式施用羧化粒子。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物是口服、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)眼、透皮、或皮下施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，羧化粒子是經(jīng)鼻施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，粒子是靜脈內(nèi)施用。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療受試者的細(xì)菌性或病毒性感染的方法，其包括對(duì)受試者施用包含羧化粒子的藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子沒有連接的肽或抗原部分。在一些實(shí)施方案中，羧化粒子是聚苯乙烯粒子。在其它實(shí)施方案中，羧化粒子是金剛石粒子。在其它實(shí)施方案中，羧化粒子是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)粒子。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法當(dāng)施用給患有細(xì)菌性或病毒性感染的受試者時(shí)誘導(dǎo)免疫耐受。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述方法當(dāng)施用給患有細(xì)菌性或病毒性感染的受試者時(shí)改善或減輕炎癥性免疫反應(yīng)。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療細(xì)菌性或病毒性感染的方法利用羧化粒子，包含具有約0.1 μ m至約10 μ m直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.3 μ m至約5 μ m的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.5μπι至約3μπι的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羧化粒子具有約0.5μπι的直徑。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者患有病毒性感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒性感染是皰疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼羅河病毒感染、黃病毒、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳頭瘤病毒感染、或副流感病毒感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒性感染感染所述受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒性感染引起病毒性腦炎或病毒性腦膜炎。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者患有細(xì)菌性感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌性感染感染所述受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌性感染引起敗血癥細(xì)菌性腦炎或細(xì)菌性腦膜炎。
[0029]附圖簡述
[0030]圖1示出(A)用WNV高劑量或低劑量感染之后小鼠的存活百分比；⑶與用WNV高劑量感染小鼠相關(guān)的體重減輕；(C)在死于感染的小鼠的腦中的病毒滴度；(D)受到高劑量和低劑量WNV感染的小鼠在感染后0-7天內(nèi)的體重減輕；(E)在受到高劑量或低劑量WNV感染的小鼠的腦中在感染后第7天的病毒滴度，以及在第7天時(shí)的體重減輕百分比與病毒滴度之間的相關(guān)性；(F)在用高劑量和低劑量WNV感染后7天時(shí)，體重減輕百分比與在小鼠腦中CD45+白細(xì)胞的存在之間的相關(guān)性；(G)在用高劑量和低劑量WNV感染后7天時(shí)，腦中的病毒滴度與在小鼠腦中CD45+白細(xì)胞的存在之間的相關(guān)性；(H)在用高劑量和低劑量WNV感染后7天時(shí)，體重減輕百分比與在小鼠腦中CD45hi巨噬細(xì)胞的存在之間的相關(guān)性。
[0031]圖2示出體重減輕百分比與(A)⑶45int⑶Ilb+遷移小膠質(zhì)細(xì)胞；(C)⑶3+T細(xì)胞；(D)CDllbhi Ly6G+嗜中性粒細(xì)胞，以及(E)NKl.1+CDllbw_天然殺傷細(xì)胞的存在之間的相關(guān)性，而CD451。常駐小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量⑶在用高劑量或低劑量WNV感染后的7天之后保持不變；(F)示出處死用低劑量WNV感染的小鼠時(shí)體重減輕與腦中病毒滴度之間的相關(guān)性；(G)示出在用低劑量WNV感染的小鼠的白細(xì)胞浸潤與體重減輕百分比的相關(guān)性，并且(H)示出在感染低劑量WNV后的病毒滴度與白細(xì)胞浸潤之間沒有相關(guān)性。
[0032]圖3(A)示出在用高劑量WNV感染后第6天，用含羧化聚苯乙烯微珠的PBS處理的小鼠的長期存活；(B)示出在感染后第6天開始用羧化聚苯乙烯微珠處理低劑量WNV感染的小鼠對(duì)于延長小鼠存活期是無效的；(C)示出在感染之后第6天開始用羧化聚苯乙烯微珠處理低劑量WNV感染的小鼠對(duì)于防止小鼠的體重減輕，相比于對(duì)照小鼠來說是無效的；(D)示出當(dāng)對(duì)體重減輕的小鼠施用微珠時(shí)，處理低劑量WNV感染的小鼠有效延長小鼠存活期。(E-G)示出直到這些小鼠感染后20天的體重減輕記錄。
[0033]圖4(A_D)是在小鼠體重減輕時(shí)用羧化聚苯乙烯微珠處理低劑量WNV感染的小鼠的實(shí)例，在(A-B)中的小鼠只要求微珠處理5天，并且體重保持穩(wěn)定，且它們?cè)跊]有進(jìn)一步微珠處理的情況下繼續(xù)存活，然而(C-D)中的小鼠當(dāng)在5天之后停止微珠處理時(shí)開始再次出現(xiàn)減輕體重，因此重新開始處理直到體重再次穩(wěn)定為止，(E)示出在感染后9天低劑量WNV感染的小鼠腦中⑶45+⑶Ilb+巨噬細(xì)胞的浸潤，該小鼠在感染后的第8天體重減輕或體重未減輕并用PBS或羧化微珠進(jìn)行處理；(F)是感染后9天發(fā)現(xiàn)浸潤WNV感染的小鼠的腦的細(xì)胞類型的圖形表示，該小鼠在感染后第8天體重減輕或體重未減輕并用PBS或羧化微珠進(jìn)行處理。
[0034]圖5示出(A)在用WNV低劑`量感染后用羧化聚苯乙烯微珠、裸聚苯乙烯微珠或PBS處理的小鼠存活期的差異；(B)示出用WNV低劑量感染后用羧化聚苯乙烯微珠、裸聚苯乙烯微珠或PBS處理的小鼠的體重減輕百分比的差異；(C、D)示出用WNV低劑量感染后用羧化聚苯乙烯微珠處理和用裸聚苯乙烯微珠處理的小鼠之間的體重減輕百分比的差異；(E、O)示出在第O天用高劑量WNV感染的小鼠在第7天時(shí)偶聯(lián)FITC的羧化微珠或裸微珠，以及在第6天時(shí)FITC-羧化微珠、FITC-裸微珠或PBS的定位。(E-G)是來自3只分別用PBS處理的小鼠的血液，(H-J)是來自3只分別用裸聚苯乙烯微珠處理的小鼠的血液，并且(L-N)是來自3只分別用羧化聚苯乙烯微珠處理的小鼠的血液，它們示出保留在血液中的普通微珠要比羧化微珠多。
[0035]圖6示出(A-C)在如圖E-O所示的感染和處理的小鼠的腦中缺乏偶聯(lián)FITC的聚苯乙烯微珠的浸潤；(D-E)示出如圖5 (E-O)用羧化聚苯乙烯微珠或裸聚苯乙烯微珠處理的WNV感染的小鼠的腦中各種白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤減少。
[0036]圖7示出(A)脾臟中的偶聯(lián)FITC的聚苯乙烯羧化微珠和偶聯(lián)FITC的裸聚苯乙烯微珠與 CDllb+(C、G)、CDllc+(D、H)Ly6c+(E、I)細(xì)胞中的 CD45+ 白細(xì)胞(A、B、F)的締合；(J-R)示出攝取的偶聯(lián)FITC的羧化微珠和偶聯(lián)FITC的裸微珠的細(xì)胞的類型。
[0037]圖8示出偶聯(lián)FITC的聚苯乙烯羧化微珠或偶聯(lián)FITC的裸聚苯乙烯微珠被用高劑量WNV感染后的脾臟中的⑶llb+CDllc_單核細(xì)胞㈧和⑶I Ib+⑶I Ic+⑶或CDllbXDllc+(C)樹突狀細(xì)胞攝取并增加它們的數(shù)量的能力。[0038]圖9示出(A-D)偶聯(lián)FITC的羧化聚苯乙烯微珠或偶聯(lián)FITC的裸聚苯乙烯微珠被用高劑量WNV感染后的脾臟中的CD19+B細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞子集攝取并增加它們的數(shù)量的能力。
[0039]圖10示出(A-L)偶聯(lián)FITC的羧化聚苯乙烯微珠或偶聯(lián)FITC的裸聚苯乙烯微珠被具體來說在用高劑量WNV感染后的肝臟中的⑶Ilb+⑶11(:_單核細(xì)胞(J)和⑶IIb+⑶IIc+(K)或 CDllb-CDllc+(L)樹突狀細(xì)胞中的 CDlIb+(C、G)、CDlIc+(D、H)和 Ly6c+(E、I)細(xì)胞攝取的能力。
[0040]圖11示出(A-G)偶聯(lián)FITC的羧化聚苯乙烯微珠或偶聯(lián)FITC的裸聚苯乙烯微珠被用高劑量WNV感染后的骨髓中的⑶I Ib+(C、F)、⑶I Ic+和Ly6C+(D、G)細(xì)胞攝取的能力。
[0041]圖12示出(A )用不同尺寸的高劑量或低劑量羧化聚苯乙烯微珠處理的低劑量WNV感染的小鼠的存活百分比；(B)示出用偶聯(lián)FITC的羧化聚苯乙烯微珠、偶聯(lián)FITC的裸微珠、羧化PLGA球體或裸PLGA球體處理的低劑量WNV感染的小鼠的存活百分比；(C)示出用低劑量WNV感染并用羧化FITC-微珠、羧化FITC-PLGA球體、或羧化納米金剛石處理的小鼠的腦中不同單核細(xì)胞群體的浸潤/活化。
[0042]圖13示出用高劑量或低劑量WNV感染的野生型和T細(xì)胞缺乏型小鼠的(A)存活百分比和(B)體重減輕；(C)用高劑量或低劑量WNV感染的野生型和T細(xì)胞缺乏型小鼠的體重減輕與腦中病毒滴度之間的相關(guān)性；在感染后第8天用高劑量WNV感染的野生型和T細(xì)胞缺乏型小鼠的⑶體重減輕(E)和腦中的免疫細(xì)胞浸潤；用高劑量或低劑量WNV感染并在顯著體重減輕時(shí)用羧化微珠或PBS處理的野生型和T細(xì)胞缺乏型小鼠的(F)存活百分比(G)和體重減輕。
[0043]發(fā)明詳述
[0044]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)受試者施用羧化粒子如特定尺寸的羧化聚苯乙烯、PLGA或金剛石粒子時(shí)炎癥性免疫反應(yīng)得到改善。此外，本發(fā)明人還驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)患有活動(dòng)性病毒性或細(xì)菌性感染的受試者，特別是那些感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)延長的受試者施用這些上述的羧化粒子時(shí)，可引起這些感染的癥狀顯著降低和延長存活期。因此，這些粒子可用于治療任何特征為過度炎癥性免疫反應(yīng)的疾病和病狀如自身免疫性疾病，以及治療細(xì)菌性和病毒性感染。
[0045]本文所用的“粒子”是指非組織來源的微小的物質(zhì)組合物，它可以是球體或球樣實(shí)體或微珠。術(shù)語“粒子”和術(shù)語“微珠”可以互換使用。此外，術(shù)語“粒子”可用于涵蓋微珠和球體。
[0046]“羧化粒子”或“羧化微珠”或“羧化球體”包括任何在其表面上被修飾而含有羧基的粒子。在一些實(shí)施方案中，添加羧基增強(qiáng)吞噬細(xì)胞/單核細(xì)胞從循環(huán)中攝取粒子，例如，通過與清道夫受體如MARCO的相互作用。
[0047]本文所用的“抗原部分”是指可被主體免疫系統(tǒng)識(shí)別的任何部分，例如肽?？乖糠值膶?shí)例包括但不限于，自身抗原和/或細(xì)菌或病毒蛋白質(zhì)、肽或組分。不受理論的限制，雖然羧化微珠自身可被免疫系統(tǒng)識(shí)別，但出于本發(fā)明的目的，沒有連接其它基團(tuán)的羧化微珠不視為“抗原部分”。
[0048]本文所用的“裸微珠”或“裸粒子”或“裸球體”是指沒有羧化的微珠、粒子或球體。
[0049]粒子可以具有任何粒子形狀或構(gòu)形。然而，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用在活體內(nèi)不太可能簇集的粒子。在這些實(shí)施方案中的粒子的實(shí)例是那些有球形形狀的粒子。
[0050]每個(gè)粒子不必在尺寸上一致，但是粒子通常必須具有足夠觸發(fā)抗原呈遞細(xì)胞或其它MPS細(xì)胞的吞噬作用的尺寸。優(yōu)選地，粒子在尺寸上是微米級(jí)或納米級(jí)的，以便提高溶解度、避免在活體內(nèi)由聚集引起可能的并發(fā)癥、以及促進(jìn)胞飲作用。粒度可以是影響從組織間隙攝取到淋巴細(xì)胞成熟區(qū)內(nèi)的一個(gè)因素。具有約0.1 μπι至約10 μπι的直徑的粒子能夠觸發(fā)吞噬作用。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，粒子具有在這些限度內(nèi)的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，粒子具有約0.3μηι至約5μηι的直徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，粒子具有約0.5 μ m至約3μπι的直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，粒子具有約0.5μπι的尺寸。在組合物中的粒子不需要具有均一的直徑。作為實(shí)例，藥物制劑可含有多個(gè)粒子，其中一些是約0.5 μ m，而其它的是約1.0 μ m。粒度在這些指定范圍內(nèi)的任何混合物都是適用的。
[0051]在一些實(shí)施方案中，粒子是非金屬的。在這些實(shí)施方案中，粒子可由聚合物形成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，粒子在個(gè)體中是生物可降解的。在這個(gè)實(shí)施方案中，可以在多次劑量中向個(gè)體提供粒子而不會(huì)在個(gè)體中積累粒子。合適的粒子的實(shí)例包括聚苯乙烯粒子、PLGA粒子、以及金剛石粒子。
[0052]優(yōu)選地粒子表面由使非特異性或不希望的生物學(xué)相互作用減至最少的材料構(gòu)成。粒子表面和間質(zhì)組織之間的相互作用可以是在淋巴攝取中起作用的一個(gè)因素。粒子表面可涂有防止或減少非特異性相互作用的材料。如由皮下注射之后提高的淋巴攝取所證明，通過對(duì)粒子涂布親水層如聚(乙二醇)(PEG)和其共聚物如PLUR0NICS(包含聚(乙二醇)-bl-聚(丙二醇)-bl-聚(乙二醇))獲得的空間穩(wěn)定可以減少與間質(zhì)組織蛋白質(zhì)的非特異性相互作用。所有的這些事實(shí)指出就淋巴攝取而言粒子的物理特性的重要性。生物可降解的聚合物可用于制造所有或一些聚合物和/或粒子和/或?qū)印Ｉ锟山到獾木酆衔锟梢岳缬捎诠倌軋F(tuán)與溶液中的水反應(yīng)而遭受降解。本文所用的術(shù)語“降解”是指由于分子量降低或疏水性基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性基團(tuán)而變得可溶。具有酯基的聚合物通常發(fā)生自發(fā)水解，例如聚丙交酯或聚乙交酯。
[0053]本發(fā)明的粒子還可以包含另外的組分。例如，載體可具有與載體合并或偶聯(lián)的成像劑。具有當(dāng)前可購得的成像劑的載體納米球體的一個(gè)實(shí)例是Kodak X-sight納米球體。稱為量子點(diǎn)(QD)的無機(jī)量子限制發(fā)光納米晶體在FRET應(yīng)用中表現(xiàn)為理想的供體:它們的高量子產(chǎn)率和可調(diào)諧的尺寸依賴性斯托克斯位移(Stokes Shifts)當(dāng)在單紫外線波長下激發(fā)時(shí)，允許不同尺寸發(fā)射藍(lán)光到紅外光。(Bruchez等,Science, 1998, 281, 2013 ；Niemeyer, C.M Angew.Chem.1nt.Ed.2003，42，5796 ；Waggoner, A.Methods Enzymol.1995，246，362 ；Brus, L.E.J.Chem.Phys.1993，79，5566)。量子點(diǎn)，如基于稱為樹枝狀聚合物的一類聚合物的混合有機(jī)/無機(jī)量子點(diǎn)，可用于生物的標(biāo)記、成像以及光學(xué)生物傳感系統(tǒng)。(Lemon等，J.Am.Chem.Soc.2000, 122，12886)。與傳統(tǒng)無機(jī)量子點(diǎn)的合成不同，這些混合量子點(diǎn)納米粒子的合成不需要高溫或高毒性、不穩(wěn)定的試劑。(Etienne等，Appl.Phys.Lett.87，181913，2005)。
[0054]粒子可以由各種各樣的材料形成。粒子優(yōu)選由適合于生物用途的材料構(gòu)成。例如，粒子可由玻璃、硅石、羥基羧酸的聚酯、二羧酸的聚酐、或羥基羧酸和二羧酸的共聚物構(gòu)成。更一般來說，載體粒子可以由以下構(gòu)成:直鏈或支鏈的、取代或未取代的、飽和或不飽和的、線性或交聯(lián)的烷基、鹵烷基、硫烷基、氨烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、雜芳基、或烷氧基羥基酸的聚酯，或直鏈或支鏈的、取代或未取代的、飽和或不飽和的、線性或交聯(lián)的烷基、鹵烷基、硫烷基、氨烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、雜芳基、或烷氧基二羧酸的聚酐。此外，載體粒子可以是量子點(diǎn)、或由量子點(diǎn)如量子點(diǎn)聚苯乙烯粒子構(gòu)成(Joumaa等(2006)Langmuir22:1810-6)。還可以使用包括酯和酐鍵的混合物(例如乙醇酸和癸二酸的共聚物)的載體粒子。例如，載體粒子可包含包括以下的材料:聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(乳酸-共-癸二酸)共聚物(PLSA)、聚(乙醇酸-共-癸二酸)共聚物(PGSA)等?？捎糜诒景l(fā)明的其它生物相容性、生物可降解的聚合物包括己內(nèi)酮、碳酸鹽、酰胺、氨基酸、原酸酯、縮醛、氰基丙烯酸酯、以及可降解聚氨酯的聚合物或共聚物，以及它們與直鏈或支鏈的、取代或未取代的烷基、齒烷基、硫烷基、氨烷基、烯基、或芳香族羥基酸或二羧酸的共聚物。此外，具有反應(yīng)性側(cè)鏈基團(tuán)的生物學(xué)上重要的氨基酸，例如賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、以及半胱氨酸、或它們的對(duì)映異構(gòu)體，可以包括在與任何上述材料的共聚物中，以便為與抗原肽和蛋白質(zhì)或偶聯(lián)部分的偶聯(lián)提供反應(yīng)性基團(tuán)。適合于本發(fā)明的生物可降解材料包括金剛石、PLA、PGA、以及PLGA聚合物。生物相容但不可生物降解的材料也可以用于本發(fā)明的載體粒子中。例如，可以使用丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯、?；〈囊宜崂w維素、不可降解的聚氨酯、苯乙烯、氯乙烯、氟乙烯、乙烯基咪唑、氯磺化烯烴、環(huán)氧乙烷、乙烯醇、TEFLON? (DuPont, Wilmington, Del.)、以及尼龍的不可生物降解聚合物。
[0055]當(dāng)前可購得的合適的微珠包括聚苯乙烯微珠，如FluoSpheres (MolecularProbes, Eugene, Oreg.)。
[0056]物理特性還涉及在具有不成熟淋巴細(xì)胞的區(qū)域內(nèi)攝取和保留之后的納米粒子的適用性。它們包括機(jī)械特性如剛性或彈性。一些實(shí)施方案是基于彈性核心，例如具有覆蓋層例如親水性覆蓋層的聚(丙烯硫醚)(PPS)核心，如在PEG中，如在最近發(fā)展并且表征用于全身性(但是不是靶向或免疫的)遞送的PPS-PEG系統(tǒng)中。彈性核心與大體上剛性的核心相反，如在聚苯乙烯或金屬納米粒子系統(tǒng)中。術(shù)語彈性是指除天然或合成的橡膠制品之外的某些有彈性的材料，而彈性對(duì)于聚合物領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來說是一個(gè)熟悉的術(shù)語。例如，交聯(lián)PPS可用于形成疏水性彈性核心。PPS是一種聚合物，其在氧化條件下降解為聚亞砜以及最后形成聚砜，從疏 水性橡膠轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性水溶性聚合物。其它硫化物聚合物可能適合使用，其中術(shù)語硫化物聚合物是指在基體的主鏈上具有硫的聚合物。其它可以使用的彈性聚合物是在水合條件下的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度低于約37°C的聚酯。疏水性核心可以有利地與親水性覆蓋層一起使用，因?yàn)楹诵暮透采w層會(huì)傾向于不混合，因而覆蓋層傾向于在空間上從核心擴(kuò)張開來。核心是指其上面具有層的粒子。層是指覆蓋核心的至少一部分的材料。層可以是吸附的或共價(jià)結(jié)合的。粒子或核心可以是實(shí)心或中空的。彈性疏水性核心有利地在剛性疏水性核心上方，如結(jié)晶或玻璃(如在聚苯乙烯的情況下)核心，其中具有彈性疏水性核心的粒子可以攜帶更高的疏水性藥物負(fù)載量。
[0057]另一個(gè)物理特性是表面的親水性。親水性材料當(dāng)它未交聯(lián)時(shí)可在水中具有至少I克每公升的溶解度。具有親水性聚合物的粒子的空間穩(wěn)定可通過減少非特異性的相互作用而提高從間質(zhì)組織的攝?。蝗欢?，粒子增加的隱身性質(zhì)也可以減少具有不成熟淋巴細(xì)胞的區(qū)域中吞噬細(xì)胞的內(nèi)在化。然而，已經(jīng)遇到了平衡這些競爭的特征的挑戰(zhàn)，并且本申請(qǐng)記載了用于有效地通過淋巴遞送至DC和淋巴結(jié)中的其它APC的納米粒子的產(chǎn)生。一些實(shí)施方案包括親水性組分如親水性材料層。合適的親水性材料的實(shí)例是以下中的一種或多種:聚環(huán)氧烷、聚環(huán)氧乙烷、聚糖、聚丙烯酸、以及聚醚?？梢哉{(diào)整層中的聚合物的分子量以便在活體內(nèi)提供有用的位阻，例如約1，OOO至約100，000或甚至更多；技術(shù)人員會(huì)立即了解涵蓋明確說明的范圍內(nèi)的范圍和數(shù)值，例如在10，000和50，000之間。
[0058]納米粒子可以并有用于其它反應(yīng)的官能團(tuán)。用于其它反應(yīng)的官能團(tuán)包括親電子試劑或親核試劑；它們便于跟其它分子反應(yīng)。親核試劑的實(shí)例是伯胺、硫醇、以及羥基。親電子試劑的實(shí)例是琥珀酰亞胺酯、醛、異氰酸酯、以及馬來酰亞胺。
[0059]本發(fā)明的粒子可以以有效減輕有需要的受試者的炎癥性免疫反應(yīng)，或治療有需要的受試者的細(xì)菌性或病毒性感染的任何劑量給予。在實(shí)施某些方案中，對(duì)個(gè)體提供約IO2至約102°個(gè)粒子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供約IO3至約IO15個(gè)之間的粒子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供約IO6至約IO12個(gè)之間的粒子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供約IO8至約101°個(gè)之間的粒子。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的劑量是0.1%固含量/ml。因此,對(duì)于0.5μηι的微珠，優(yōu)選的劑量是大約4Χ IO9個(gè)微珠，對(duì)于0.05 μ m的微珠，優(yōu)選的劑量是大約4X IO12個(gè)微珠，對(duì)于3μπι的微珠，優(yōu)選的是2X107個(gè)微珠。然而，本發(fā)明涵蓋任何有效治療有待治療的具體病狀的劑量。
[0060]本發(fā)明適用于治療免疫相關(guān)性病癥，如自身免疫性疾病、移植排斥、以及過敏性反應(yīng)。取代合成的生物相容性粒子系統(tǒng)以誘導(dǎo)免疫耐受可導(dǎo)致制造更容易、擴(kuò)大治療劑的可用性、增加樣品之間的均一性、增加潛在治療部位的數(shù)量、以及顯著降低對(duì)載體細(xì)胞的過敏性反應(yīng)的可能性。
[0061]本文所用的術(shù)語“免疫反應(yīng)”包括T細(xì)胞介導(dǎo)和/或B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。示例性免疫反應(yīng)包括T細(xì)胞反應(yīng)，例如細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此外，術(shù)語免疫反應(yīng)包括由T細(xì)胞活化所間·接影響的免疫反應(yīng),例如抗體產(chǎn)生(體液反應(yīng))和細(xì)胞因子應(yīng)答細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞的活化。免疫反應(yīng)中所涉及的免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，如B細(xì)胞和T細(xì)胞(⑶4+、⑶8+、Thl和Th2細(xì)胞)；抗原呈遞細(xì)胞(例如專職性抗原呈遞細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞(Langerhans cells)，以及非專職性抗原呈遞細(xì)胞，如角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)；自然殺傷細(xì)胞；骨髓細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、以及粒細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的粒子有效減少轉(zhuǎn)運(yùn)到炎癥部位的炎癥性細(xì)胞。
[0062]本文所用的術(shù)語“無反應(yīng)”、“耐受”、或“抗原特異性耐受”是指T細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞受體介導(dǎo)的刺激不敏感。這種不敏感通常是抗原特異性的，并且在停止暴露于抗原肽之后仍持續(xù)。例如，T細(xì)胞無反應(yīng)的特征為缺乏細(xì)胞因子例如IL-2的產(chǎn)生。當(dāng)T細(xì)胞暴露于抗原并在不存在第二信號(hào)(協(xié)同刺激信號(hào))的情況下接收第一信號(hào)(T細(xì)胞受體或CD-3介導(dǎo)的信號(hào))時(shí)可發(fā)生T細(xì)胞無反應(yīng)。在這些條件下，細(xì)胞重新暴露于相同的抗原(即使重新暴露是在協(xié)同刺激分子存在的情況下發(fā)生)導(dǎo)致不能產(chǎn)生細(xì)胞因子，并且隨后不能增殖。因此，不能產(chǎn)物細(xì)胞因子防止增殖。然而，如果與細(xì)胞因子(例如IL-2) —起培養(yǎng)，則無反應(yīng)的T細(xì)胞可以增殖。例如，還可以通過使T淋巴細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生缺乏而觀察到T細(xì)胞無反應(yīng)，如通過ELISA或通過使用指示細(xì)胞系的增殖測定所測量?；蛘?，可以使用報(bào)告基因構(gòu)建體。例如，無反應(yīng)T細(xì)胞不能起始由異源啟動(dòng)子在5’ IL-2基因增強(qiáng)子的控制下誘導(dǎo)的或者由可在增強(qiáng)子中發(fā)現(xiàn)的API序列多聚體誘導(dǎo)的DL-2基因轉(zhuǎn)錄(Kang等，1992Science.257:1134)。[0063]本文所用的術(shù)語“免疫耐受”是指與未治療的受試者相比，對(duì)一部分接受治療的受試者執(zhí)行的方法，其中:a)特異性免疫反應(yīng)(認(rèn)為至少部分是由抗原特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、抗體、或它們的等同物所介導(dǎo))的水平降低；b)特異性免疫反應(yīng)的發(fā)作和發(fā)展延遲；或者c)特異性免疫反應(yīng)發(fā)作或發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)降低。當(dāng)與其它相比優(yōu)先引發(fā)針對(duì)某些抗原的免疫耐受時(shí)，發(fā)生“特異性”免疫耐受。當(dāng)針對(duì)導(dǎo)致炎癥性免疫反應(yīng)的抗原的免疫耐受的引發(fā)無差別時(shí)，發(fā)生“非特異性”免疫耐受。當(dāng)針對(duì)導(dǎo)致致病性免疫反應(yīng)的抗體而未對(duì)導(dǎo)致保護(hù)性免疫反應(yīng)的其它抗原半?yún)^(qū)別性地引發(fā)免疫耐受時(shí)，發(fā)生“準(zhǔn)特異性”免疫耐受。
[0064]致耐受活性的一個(gè)代表是粒子在靶位點(diǎn)刺激適當(dāng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生的能力。由T抑制細(xì)胞在靶位點(diǎn)釋放的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子被認(rèn)為是TGF-β (Miller等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:421, 1992)。在耐受期間可以產(chǎn)生的其它因子是細(xì)胞因子IL-4和IL-10、以及介體PGE。相反，經(jīng)歷主動(dòng)免疫破壞的組織中的淋巴細(xì)胞分泌如IL-1、IL-2、IL-6和IFNy等細(xì)胞因子。因此，修飾粒子的功效可通過測量它刺激適當(dāng)類型的細(xì)胞因子的能力來評(píng)價(jià)。
[0065]有鑒于此，可以使用動(dòng)物模型系統(tǒng)來進(jìn)行用于修飾粒子、有效粘膜結(jié)合組分、有效組合、或粘膜施用的有效模式和時(shí)程的快速篩選測試。用測試粒子組合物處理動(dòng)物的粘膜表面，并且有時(shí)通過施用致病性抗原或感染性病原體對(duì)動(dòng)物進(jìn)行激發(fā)。分離脾臟細(xì)胞，并在濃度為約50μ g/mL的致病性抗原或來源于感染性病原體的抗原存在下活體外培養(yǎng)。可以通過標(biāo)準(zhǔn)免疫測定來定量分泌至培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子。
[0066]粒子抑制細(xì)胞活性的能力可使用從用修飾的粒子免疫的動(dòng)物分離的細(xì)胞，或通過創(chuàng)造對(duì)致病性抗原或病毒抗原祀抗原可反應(yīng)的細(xì)胞系來測定(Ben-Nun等，Eur.J.1mmunol.11:195, 1981)。在此實(shí)驗(yàn)的一個(gè)變形中，輕度照射抑制細(xì)胞群(約1000至1250拉德)以防止增殖，將抑制細(xì)胞與應(yīng)答細(xì)胞一起培養(yǎng)，并且然后使用氚化胸苷摻入法(或MTT)來定量應(yīng)答細(xì)胞的增殖活性。在另一個(gè)變形中，在雙腔transwell培養(yǎng)系統(tǒng)(Costar, Cambridge M ass.)的上層和下層中培養(yǎng)抑制細(xì)胞群和應(yīng)答細(xì)胞群，所述培養(yǎng)系統(tǒng)允許細(xì)胞群在相互由聚碳酸酯膜隔開Imm內(nèi)共孵育(W093/16724)。在這種方法中，照射抑制細(xì)胞群是不必要的，因?yàn)閼?yīng)答細(xì)胞的增殖活性可單獨(dú)測量。
[0067]施用的用于治療特定疾病的組合物和模式的有效性還可以在相應(yīng)的動(dòng)物疾病模型上進(jìn)行闡述。在適合于所用的模型的疾病的循環(huán)生物化學(xué)和免疫學(xué)標(biāo)志、受影響的組織的免疫組織學(xué)、以及總體臨床特征的層面上監(jiān)測所述治療減弱或延遲疾病癥狀的能力?？捎糜跍y試的動(dòng)物模型的非限制性實(shí)例包括在以下部分內(nèi)。
[0068]本發(fā)明涵蓋通過調(diào)節(jié)THl反應(yīng)、TH2反應(yīng)、Thl7反應(yīng)、或這些反應(yīng)的組合來調(diào)節(jié)耐受性。調(diào)節(jié)THl反應(yīng)涵蓋改變例如干擾素-Y的表達(dá)。調(diào)節(jié)TH2反應(yīng)涵蓋改變例如IL-4、IL-5、IL-10以及IL-13的任意組合的表達(dá)。通常TH2反應(yīng)的增加(減少)將包括IL-4、IL-5、IL-10、或IL-13中至少一個(gè)的表達(dá)的增加(減少);更通常TH2反應(yīng)的增加(減少)將包括IL-4、IL-5、IL-10、或IL-13中至少兩個(gè)的表達(dá)增加(減少)，最通常TH2反應(yīng)的增加(減少)將包括IL-4、IL-5、IL-10、或IL-13中至少三個(gè)的增加，而理想地TH2反應(yīng)的增加(減少)將包括IL-4、IL-5、IL-10、和IL-13中全部的表達(dá)的增加(減少)。調(diào)節(jié)TH17涵蓋改變例如TGF-β、IL-6、IL-21和IL-23的表達(dá)以及IL-17、IL-21和IL-22的效應(yīng)水平。[0069]對(duì)自身抗原和自身免疫性疾病的耐受是通過多種包括胸腺中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的負(fù)選擇的機(jī)制，以及那些逃脫胸腺清除并在外周中發(fā)現(xiàn)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的外周耐受的機(jī)制來達(dá)成。提供外周T細(xì)胞耐受的機(jī)制的實(shí)例包括自身抗原的“忽視”、對(duì)自身抗原無反應(yīng)或不應(yīng)答、細(xì)胞因子免疫偏離、以及活化誘導(dǎo)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞死亡。此夕卜，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞已經(jīng)顯示參與介導(dǎo)的外周耐受。參見,例如Walker等(2002)Nat.Rev.1mmunol.2:11-19 ;Shevach 等(2001) Immunol.Rev.182:58-67。在一些情況下，失去(或破壞)對(duì)自身抗原的外周耐受并且接著發(fā)生自身免疫反應(yīng)。例如，在EAE的動(dòng)物模型中，顯示通過TLR先天性免疫受體使抗原呈遞細(xì)胞(APCs)活化會(huì)破壞自身耐受性并導(dǎo)致誘發(fā)EAE(Waldner 等(2004)J.Clin.1nvest.113:990-997)。
[0070]因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于增加抗原呈遞同時(shí)抑制或減少TLR7/8、TLR9、和/或TLR7/8/9依賴性細(xì)胞刺激的方法。如本文所述的，施用特定修飾粒子導(dǎo)致DC或APC的抗原呈遞，同時(shí)抑制與免疫刺激性多核苷酸有關(guān)的TLR7/8、TLR9、和/或TLR7/8/9依賴性細(xì)胞反應(yīng)。這種抑制可包括一種或多種TLR相關(guān)性細(xì)胞因子的水平降低。
[0071]如上文所討論的，本發(fā)明提供具有可用于治療Mac-1和LFA-1介導(dǎo)的病癥的生物特性的新穎化合物。
[0072]因此，在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含羧化粒子并任選地包含藥學(xué)上可接受的載劑的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，這些組合物任選地進(jìn)一步包含一種或多種另外的治療劑。或者，本發(fā)明的修飾粒子可與施用一種或多種其它治療劑組合施用給有需要的患者。例如，用于聯(lián)合施用或包含于具有本發(fā)明的化合物的藥物組合物中的另外的治療劑可以是已批準(zhǔn)的消炎劑，或者它可以是在食品與藥品管理局(Food and DrugAdministration)正在進(jìn)行批準(zhǔn)的多種藥劑中的任一種，這些藥劑最終獲得批準(zhǔn)用于治療任何特征為不受控制的炎癥性免疫反應(yīng)或細(xì)菌性或病毒性感染的病癥。還應(yīng)了解，本發(fā)明的某些修飾的粒子可以以游離形式存在用于治療，或適當(dāng)時(shí)以其藥學(xué)上可接受的衍生物形式存在。
[0073]本發(fā)明的藥物組合 物另外包含藥學(xué)上可接受的載劑，本文所用的載劑包括適于所希望的特定劑型的任何及所有溶劑、稀釋劑、或其它液體媒劑、分散劑或助懸劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等。Remington’s Pharmaceutical Sciences,第十六版,E.ff.Martin(Mack PublishingC0., Easton, Pa., 1980)公開了用于配制藥物組合物的各種載劑以及其已知制備技術(shù)。除非任何常規(guī)載劑介質(zhì)與本發(fā)明的化合物不相容，諸如因產(chǎn)生任何不希望的生物效應(yīng)，或者另外以有害的方式與藥物組合物的任何其它組分相互作用，否則預(yù)期其使用是在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢杂米魉帉W(xué)上可接受的載劑的材料的一些實(shí)例包括但不限于，糖如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉狀黃芪膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑如可可油和栓劑蠟；油如花生油、棉籽油；紅花油、芝麻油；橄欖油；玉米油和大豆油；二醇；如丙二醇；酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑如氫氧化鎂和氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原質(zhì)水；等滲鹽水；林格氏(Ringer’s)溶液；乙醇、和磷酸鹽緩沖溶液、以及其它無毒相容性潤滑劑如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、涂布劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可以根據(jù)配制者的判斷而存在于組合物中。[0074]用于口服施用的液體劑型包括但不限于，藥學(xué)上可接受的乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除活性化合物之外，液體劑型還可包含本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具體來說，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、和脫水山梨糖醇脂肪酸酯、以及其混合物。除惰性稀釋劑之外，口服組合物還可以包含佐劑，如潤濕劑、乳化劑和助懸劑、甜味齊U、調(diào)味劑以及芳香劑。
[0075]可注射制劑，例如無菌注射水性或油性懸浮液可根據(jù)已知的技術(shù)使用合適的分散劑或潤濕劑和助懸劑來配制。無菌可注射制劑還可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液、懸浮液或乳液，例如，在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒劑和溶劑包括水、林格氏溶液、U.S.P.以及等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。出于這個(gè)目的，可使用任何無刺激性的不揮發(fā)性油，包括合成的單甘油酯或雙甘油酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制備可注射劑。
[0076]例如，可通過截留細(xì)菌的過濾器過濾，或通過并入滅菌劑來對(duì)可注射制劑進(jìn)行滅菌，呈可在使用前溶解或分散于無菌水或其它無菌可注射介質(zhì)中的無菌固體組合物的形式。
[0077]為了延長藥物的作用，經(jīng)常需要減慢皮下注射或肌肉內(nèi)注射的藥物的吸收。這可以通過使用水溶性較差的液體懸浮液或結(jié)晶性或無定型材料來實(shí)現(xiàn)。藥物的吸收速率因此取決于它的溶解速率，而溶解速率又可以取決于結(jié)晶尺寸和結(jié)晶形式?；蛘撸改c外施用的藥物形式的延遲吸收通過將藥物溶解或懸浮于油性媒劑中來實(shí)現(xiàn)?？勺⑸鋬?chǔ)槽形式是通過在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成藥物的微囊基質(zhì)來制備。視藥物與聚合物的比率和所用特定聚合物的性質(zhì)而定，可以控制藥物釋放的速率。其它生物可降解的聚合物的實(shí)例包括(聚(原酸酯)和聚(酸酐)。儲(chǔ)槽可注射制劑還可以通過將藥物截留于與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳液中來制備。
[0078]用于口服施用的固體`劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑以及顆粒劑。在所述固體劑型中，將修飾的粒子與至少一種以下材料混合:惰性的藥學(xué)上可接受的賦形劑或載劑，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或a)填充劑或增量劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、以及硅酸，b)粘合劑，如羧甲基纖維素、褐藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖以及阿拉伯膠，c)保濕劑，如甘油，d)崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸鹽、以及碳酸鈉，e)溶解阻滯劑，如石蠟，f)吸收促進(jìn)劑，如季銨化合物，g)潤濕劑，如十六烷醇和單硬脂酸甘油酯，h)吸附劑，如高嶺土和膨潤土，以及i)潤滑劑，如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉、以及其混合物。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，劑型還可以包含緩沖劑。
[0079]相似類型的固體組合物還可以在使用如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的賦形劑的軟或硬填充式明膠膠囊中用作填充劑。片劑、糖衣丸劑、膠囊劑、丸劑以及顆粒劑的固體劑型可以制備成具有包衣和外殼，如腸溶包衣和藥物配制領(lǐng)域中眾所周知的其它包衣。它們可以任選地包含乳濁劑并且還可以具有使它們僅在或優(yōu)先在腸道的某一部分中任選地以延遲方式釋放活性成分的組成?？墒褂玫陌窠M合物的實(shí)例包括聚合物質(zhì)和蠟。相似類型的固體組合物還可以在使用如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)的賦形劑以及高分子量聚乙二醇等的軟或硬填充式明膠膠囊中用作填充劑。
[0080]修飾的粒子還可以呈具有一種或多種上文所述的賦形劑的微囊化形式。片劑、糖衣丸劑、膠囊劑、丸劑以及顆粒劑的固體劑型可以制備成具有包衣和外殼，如腸溶包衣、釋放控制包衣以及藥物配制領(lǐng)域中眾所周知的其它包衣。在所述固體劑型中，可將活性化合物與至少一種惰性稀釋劑如蔗糖、乳糖以及淀粉混合。所述劑型在正常實(shí)踐中還可以包含除惰性稀釋劑外的其它物質(zhì)，例如壓片潤滑劑以及其它壓片助劑，如硬脂酸鎂和微晶纖維素。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，劑型還可以包含緩沖劑。它們可以任選地包含乳濁劑，并且還可以具有使它們僅在或優(yōu)先在腸道的某一部分中任選地以延遲方式釋放修飾粒子的組成?？墒褂玫陌窠M合物的實(shí)例包括聚合物質(zhì)和蠟。
[0081]本發(fā)明涵蓋本發(fā)明的修飾粒子的藥學(xué)上可接受的局部制劑。本文所使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的局部制劑”意思是對(duì)于通過將制劑涂覆到表皮上來皮內(nèi)施用本發(fā)明的修飾粒子是藥學(xué)上可接受的任何制劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，局部制劑包含載劑系統(tǒng)。藥學(xué)上有效的載劑包括但不限于，溶劑(如醇、多元醇、水)、乳膏、洗劑、軟膏、油、膏藥、脂質(zhì)體、散劑、乳液、微乳液以及緩沖溶液(如低滲或緩沖鹽水)或本領(lǐng)域已知用于局部施用藥物的任何其它載劑。業(yè)內(nèi)已知載劑的更完整清單由本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考著作提供，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，1980 和第 17 版,1985,兩個(gè)版本都是由Mack Publishing Company, Easton, Pa.出版,其公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。在某些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的局部制劑可包含賦形劑。任何本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的賦形劑都可用于制備本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的局部制劑?？砂诒景l(fā)明的局部制劑中的賦形劑的實(shí)例包括但不限于，防腐劑、抗氧化劑、潤膚劑、緩和劑、緩沖劑、增溶劑、其它滲透劑、皮膚保護(hù)劑、表面活性劑、和推進(jìn)劑、和/或與修飾粒子組合使用的其它治療劑。合適的防腐劑包括但不限于，醇、季胺、有機(jī)酸、對(duì)羥基苯甲酸酯以及酚。合適的抗氧化劑包括但不限于，抗壞血酸及其酯、亞硫酸氫鈉、丁基化羥基甲苯、丁基化羥基茴香醚、生育酚、以及螯合劑，如EDTA和檸檬酸。合適的潤膚劑包括但不限于，甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、尿素以及丙二醇。用于本發(fā)明的合適的緩沖劑包括但不限于，檸檬酸緩沖液、鹽酸緩沖液以及乳酸緩沖液。合適的增溶劑包括但不限于，季銨氯化物、環(huán)糊精、苯甲酸芐酯、卵磷脂、以及聚山梨醇酯。用于本發(fā)明的局部制劑中的合適的皮膚保護(hù)劑包括但不限于維生素E油、尿囊素、二甲基硅油、甘油、凡 士林、以及氧化鋅。
[0082]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的局部制劑至少包含本發(fā)明的修飾粒子和滲透增強(qiáng)劑。局部制劑的選擇將取決于若干因素，包括待治療的病狀、本發(fā)明化合物和存在的其它賦形劑的物理化學(xué)特征、它們?cè)谥苿┲械姆€(wěn)定性、可用的制造設(shè)備、以及成本限制。本文所用的術(shù)語“滲透增強(qiáng)劑”意思是能夠轉(zhuǎn)運(yùn)藥理學(xué)活性化合物穿過角質(zhì)層并進(jìn)入表皮或真皮而優(yōu)選地幾乎沒有或沒有全身吸收的試劑。已經(jīng)評(píng)估了多種化合物在增強(qiáng)藥物滲透穿過皮膚方面的效果。參見，例如，Percutaneous Penetration Enhancers, Maibach
H.1.和 Smith H.E.(編著)，CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.(1995)，其調(diào)查了不同皮膚滲透增強(qiáng)劑的使用和測試，以及 Buyuktimkin 等，Chemical Means of Transdermal DrugPermeation Enhancement in Transdermal and Topical Drug Delivery Systems, GoshT.K., Pfister ff.R., Yum S.1.(編著),Interpharm Press Inc., Buffalo Grove, 111.(1997)。在某些示例性實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的滲透劑包括但不限于，甘油三酯(例如，大豆油)、蘆薈組合物(例如蘆薈凝膠)、乙醇、異丙醇、辛基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-癸基甲基亞砜、脂肪酸酯(例如豆蘧酸異丙酯、月桂酸甲酯、單油酸甘油酯、以及丙二醇單油酸酯)以及N-甲基吡咯烷酮。
[0083]在某些實(shí)施方案中，組合物可以呈軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、散劑、溶液、噴霧劑、吸入劑或貼片的形式。在某些示例性實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物的制劑是乳膏劑，該乳膏劑可進(jìn)一步包含飽和或不飽和脂肪酸，如硬脂酸、棕櫚酸、油酸、棕櫚油酸、鯨蠟醇或油醇，硬脂酸特別優(yōu)選。本發(fā)明的乳膏劑還可以包含非離子型表面活性劑，例如聚氧-40-硬脂酸酯。在某些實(shí)施方案中，活性組分在無菌條件下與藥學(xué)上可接受的載劑和可能需要時(shí)任何所需要的防腐劑或緩沖劑混合。眼用制劑、滴耳劑或滴眼劑也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，本發(fā)明涵蓋使用具有提供化合物向身體的控制遞送的附加優(yōu)勢的透皮貼片。這種劑型是通過將化合物溶解或分散于適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中來制備的。如上文所討論的，滲透增強(qiáng)劑還可以用來增加化合物穿過皮膚的流量。可以通過提供速率控制膜或通過將化合物分散于聚合物基質(zhì)或凝膠中來控制速率。
[0084]可通過氣霧劑來施用修飾的粒子。這是通過制備包含修飾粒子的水性氣霧劑、脂質(zhì)體制劑或固體粒子來實(shí)現(xiàn)的。可以使用非水性(例如碳氟化合物推進(jìn)劑)懸浮液。
[0085]通常，水性氣霧劑是通過配制藥劑與藥學(xué)上可接受的常規(guī)載劑或穩(wěn)定劑一起的水性溶液或懸浮液而制成。載劑和穩(wěn)定劑隨著具體化合物的要求而變化，但通常包括非離子型表面活性劑(吐溫(Tweens)、普朗尼克(Pluronics)或聚乙二醇)、無害蛋白質(zhì)如血清白蛋白、脫水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、緩沖劑、鹽、糖或糖醇。氣霧劑通常由等滲溶液制備。
[0086]應(yīng)了解的是，可以配制本發(fā)明的修飾粒子和藥物組合物并且在組合療法中使用，即，化合物或藥物組合物可以與一種或多種其它所希望的治療劑或醫(yī)學(xué)程序一起配制或與其同時(shí)、在其之前或之后施用。用于組合方案中的療法(治療劑或程序)的具體組合將考慮到所希望的治療劑和/或程序與待達(dá)成的所希望的治療效果的相容性。還應(yīng)了解的是，所用療法對(duì)于同樣的病癥可以達(dá)成所希望的效果(例如，可以同時(shí)施用本發(fā)明的化合物與另一種消炎劑)，或者它們可以達(dá)成不同的效果(例如控制任何不良作用)。
[0087]在某些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的修飾粒子的藥物組合物進(jìn)一步包含一種或多種其它治療活性成分(例如，消炎劑和/或姑息劑)。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“姑息劑”是指著重于減輕疾病癥狀和/或治療方案的副作用但并非治愈的治療。例如，姑息性治療涵蓋止痛藥、防暈藥、以及止吐藥。
[0088]本發(fā)明提供調(diào)節(jié)個(gè)體，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人的免疫反應(yīng)的方法，其包括對(duì)個(gè)體施用本文所述的修飾粒子。由本發(fā)明提供的免疫調(diào)節(jié)方法包括遏制和/抑制先天性免疫反應(yīng)或適應(yīng)性免疫反應(yīng)的方法，所述免疫反應(yīng)包括但不限于由免疫刺激性多肽或病毒或細(xì)菌組分刺激的免疫反應(yīng)。
[0089]施用足夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的量的修飾粒子。如本文所述，免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)可以是體液的和/或細(xì)胞的，并且使用本領(lǐng)域的以及本文所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行測量。
[0090]在某些實(shí)施方案中，個(gè)體罹患與不希望的免疫活化有關(guān)的病癥，例如過敏性疾病或病狀、過敏癥和哮喘?；加羞^敏性疾病或哮喘的個(gè)體是具有現(xiàn)有過敏性疾病或哮喘的可識(shí)別癥狀的個(gè)體。[0091]在某些實(shí)施方案中，個(gè)體罹患與不希望的免疫活化有關(guān)的病癥，如動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌住損傷、以及心肌梗塞。
[0092]在某些實(shí)施方案中，個(gè)體罹患與不希望的免疫活化有關(guān)的病癥，例如自身免疫性疾病或炎癥性疾病?；加凶陨砻庖咝约膊』蜓装Y性疾病的個(gè)體是具有現(xiàn)有自身免疫性疾病或炎癥性疾病的可識(shí)別癥狀的個(gè)體。
[0093]自身免疫性疾病可以分為兩大類:器官特異性和全身性。自身免疫性疾病包括但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病、II型糖尿病、多發(fā)性硬化癥(MS)、免疫介導(dǎo)的不孕如卵巢功能早衰、硬皮病、修格蘭氏(Sjogren’s)病、白癜風(fēng)、禿頭癥(脫發(fā))、多腺體衰竭、格拉夫氏(Grave’s)病、甲狀腺機(jī)能減退、多肌炎、尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、包括克羅恩氏(Crohn’s)病和潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的炎癥性腸病、包括與乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的肝炎在內(nèi)的自身免疫性肝炎、垂體機(jī)能減退、移植物抗宿主疾病(GvHD)、心肌炎、愛迪生氏(Addison’s)病、自身免疫性皮膚病、葡萄膜炎、惡性貧血、以及甲狀旁腺功能減退。
[0094]自身免疫性疾病還可以包括但不限于,橋本氏(Hashimoto’s)甲狀腺炎、I型和II型自身免疫性多腺體綜合征、副腫瘤性天皰瘡、大皰性類天皰瘡、皰疹樣皮炎、線狀I(lǐng)gA病、獲得性大皰性表皮松解癥、結(jié)節(jié)紅斑、妊娠性類天皰瘡、瘢痕性類天皰瘡、混合型原發(fā)性冷凝球蛋白血癥、兒童慢性大皰性疾病、溶血性貧血、血小板減少性紫斑、古德帕斯丘氏(Goodpasture’s)綜合征、自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥、重癥肌無力、伊頓_蘭姆伯特二氏(Eaton-Lambert)肌無力綜合征、強(qiáng)直人綜合征、急性播散性腦脊髓炎、格林-巴雷二氏(Guillain-Barre)綜合征、慢性炎癥性脫髓鞘性多神經(jīng)根神經(jīng)病、有傳導(dǎo)阻滯的多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、有單克隆丙種球蛋白病的慢性神經(jīng)病、眼球斜視痙攣綜合癥、小腦退化、腦脊髓炎、視網(wǎng)膜病、原發(fā)性膽汁性硬化癥、硬化性膽管炎、谷蛋白敏感性腸病、強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、多肌炎/皮肌炎、混合型結(jié)締組織病、白塞氏(Bechet’s)綜合征、銀屑病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、過敏性脈管炎和肉芽腫病(許爾-施特勞斯二氏(Churg-Strauss)病)、多血管炎重疊綜合征、過敏性血管炎、魏格納氏(Wegener’s)肉芽腫病、顳動(dòng)脈炎、高安氏(Takayasu's)動(dòng)脈炎、川崎氏( Kawasaki’s)病、孤立性中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、血栓閉塞性脈管炎、肉狀瘤病、腎小球性腎炎、以及寒冷病。這些病狀在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是眾所周知的，并且描述于例如 Harrison’s Principles of Internal Medicine,第 14 版，F(xiàn)auci A S 等編著，New York: McGraw-Hi 11, 1998 中。
[0095]用于研究自身免疫性疾病的動(dòng)物模型在本領(lǐng)域中是已知的。例如，表現(xiàn)出與人自身免疫性疾病最相似的動(dòng)物模型包括自發(fā)地產(chǎn)生特定疾病的高發(fā)病率的動(dòng)物品系。所述模型的實(shí)例包括但不限于，發(fā)生類似I型糖尿病的疾病的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠以及易發(fā)生狼瘡樣疾病的動(dòng)物，例如新西蘭雜交種、MRL-Faslpr以及BXSB小鼠。已經(jīng)誘發(fā)自身免疫性疾病的動(dòng)物模型包括但不限于，作為多發(fā)性硬化癥的模型的實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)、作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的模型的膠原蛋白誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(CIA)、以及作為葡萄膜炎的模型的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)。自身免疫性疾病的動(dòng)物模型還已經(jīng)通過遺傳操作制造出來，并且包括例如用于炎癥性腸病的IL-2/IL-10基因敲除小鼠、用于SLE的Fas或Fas配體基因敲除、以及用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的IL-1受體拮抗劑基因敲除。
[0096]在某些實(shí)施方案中，個(gè)體罹患細(xì)菌性感染或病毒性感染。患有細(xì)菌性感染或病毒性感染的個(gè)體是具有現(xiàn)有細(xì)菌性感染或病毒性感染的可識(shí)別癥狀的個(gè)體。
[0097]可用本發(fā)明的修飾粒子治療的病毒性感染的非限制性清單包括皰疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼羅河病毒感染、黃病毒感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳頭瘤病毒感染、副粘病毒感染、副流感病毒感染、以及逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。優(yōu)選的病毒是那些感染受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒。最優(yōu)選的病毒是那些引起腦炎或腦膜炎的病毒。
[0098]可用本發(fā)明的修飾粒子治療的細(xì)菌性感染的非限制性清單包括葡萄球菌感染、鏈球菌感染、分支桿菌感染、芽孢桿菌感染、沙門氏菌感染、弧菌感染、螺旋菌感染、以及奈瑟氏球菌感染。優(yōu)選的細(xì)菌是感染受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)菌。最優(yōu)選的細(xì)菌是引起腦炎或腦膜炎的細(xì)菌。
[0099]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在疾病發(fā)作之前使用本發(fā)明的組合物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的組合物來抑制正發(fā)展的疾病。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改善受試者的疾病。改善受試者的疾病意思是包括治療、預(yù)防或抑制受試者的疾病。
[0100]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)。例如，不希望的免疫反應(yīng)可以發(fā)生在肽的一個(gè)區(qū)域(如抗原決定子)。與不希望的免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病的復(fù)發(fā)可能因在肽的不同區(qū)域具有免疫反應(yīng)攻擊而發(fā)生。由于本發(fā)明的羧化粒子沒有連接的肽或抗原部分，因此粒子將有效針對(duì)多個(gè)表位。在一些包括MS和其它TH1/17介導(dǎo)的自身免疫性疾病在內(nèi)的免疫反應(yīng)病癥中的T細(xì)胞反應(yīng)可以是動(dòng)態(tài)的，并且在復(fù)發(fā)緩解型和/或慢性進(jìn)行性疾病的過程中進(jìn)化。T細(xì)胞譜系的動(dòng)態(tài)性質(zhì)暗示可用于治療某些疾病，因?yàn)榘袠?biāo)可以隨著疾病發(fā)展而變化。在此之前，需要預(yù)先了解反應(yīng)型態(tài)以便預(yù)測疾病的發(fā)展。本發(fā)明提供可以防止動(dòng)態(tài)變化的疾病的·作用，即“表位擴(kuò)展”的功能的組合物。用于復(fù)發(fā)的已知模型是對(duì)蛋白質(zhì)脂蛋白(PLP)的免疫反應(yīng)作為多發(fā)性硬化癥(MS)的模型。初始免疫反應(yīng)可通過對(duì)PLP139_151的反應(yīng)而發(fā)生。隨后的疾病發(fā)作可以通過對(duì)PLP151-171的復(fù)發(fā)免疫反應(yīng)而發(fā)生。
[0101]本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及治療與不希望的超敏反應(yīng)相關(guān)的病理學(xué)病狀。超敏反應(yīng)可以是1、I1、III以及IV型中的任一種。速發(fā)型(I型)超敏反應(yīng)。施用的頻率通常與過敏原暴露的時(shí)機(jī)相對(duì)應(yīng)。合適的動(dòng)物模型在本領(lǐng)域是已知的(例如,GundeI等,Am.Rev.Respir.Dis.146:369，1992 ；ffada 等，J.Med.Chem.39，2055，1996 ；以及 W096/35418)。
[0102]本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及移植。這是指組織樣品或移植物從供體個(gè)體轉(zhuǎn)移到接受個(gè)體，并且經(jīng)常對(duì)需要組織以便恢復(fù)由所述組織提供的生理學(xué)功能的人接受者進(jìn)行。移植的組織包括(但不限于)完整器官如腎臟、肝臟、心臟、肺；器官組分如皮膚移植物和眼角膜；以及細(xì)胞懸浮液如骨髓細(xì)胞和從骨髓或循環(huán)血液選擇并擴(kuò)增的細(xì)胞培養(yǎng)物，以及全血輸血。
[0103]任何移植的嚴(yán)重潛在并發(fā)癥將因宿主接受者與移植組織之間的抗原性差異而發(fā)生。根據(jù)差異的性質(zhì)和程度，可能存在宿主對(duì)移植物或移植物對(duì)宿主進(jìn)行免疫攻擊的風(fēng)險(xiǎn)，或兩者都可能發(fā)生。通過追蹤受過相似治療的具有相似表型的受試者的群體中的反應(yīng)型態(tài)，并且根據(jù)公認(rèn)的臨床程序使各種可能的貢獻(xiàn)因素相關(guān)聯(lián)來確定風(fēng)險(xiǎn)的程度。免疫攻擊可能是預(yù)先存在的免疫反應(yīng)(如預(yù)先形成的抗體)的結(jié)果，或者是大致在移植時(shí)起始的免疫反應(yīng)(如產(chǎn)生TH細(xì)胞)的結(jié)果?？贵w、輔助性T(TH)細(xì)胞、或細(xì)胞毒性T(Tc)細(xì)胞可能參與相互之間和與各種效應(yīng)分子和細(xì)胞的任何組合。然而，免疫反應(yīng)中所涉及的抗原通常并不知道，因此在設(shè)計(jì)抗原特異性療法或誘導(dǎo)抗原特異性耐受方面造成困難。本發(fā)明的修飾粒子特別適用于預(yù)防器官排斥反應(yīng)，因?yàn)椴恍枰B接的肽或抗原與修飾粒子偶聯(lián)來使粒子有效誘導(dǎo)耐受或改善炎癥性免疫反應(yīng)。
[0104]本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及減小宿主抗移植物疾病，從而引起接受者對(duì)組織移植物的排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。可執(zhí)行治療來預(yù)防或減少超急性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)或慢性排斥反應(yīng)的影響。優(yōu)選在移植之前足夠長的時(shí)間開始治療，以使得耐受性在安置移植物時(shí)即就位；但是在這樣不可能的情況下，可以與移植同時(shí)或在移植之后開始治療。不管開始的時(shí)間如何，治療通常將在移植之后定期持續(xù)至少一個(gè)月。如果出現(xiàn)移植物的充分適應(yīng)則可能不需要后續(xù)劑量，但是如果存在移植物排斥或炎癥的任何跡象則可以重新開始。當(dāng)然，本發(fā)明的耐受程序可與其它形式的免疫抑制組合以達(dá)成甚至更低水平的風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例
[0105]提供以下實(shí)施例以便進(jìn)一步說明本發(fā)明的優(yōu)勢和特征，但是不欲限制本發(fā)明的范圍。
[0106]材料和方法
[0107]病毒增殖
[0108]如先前所述(Getts等，J Neurochem.103:1019，2007),西尼羅河病毒(Sarafend株)來源于新生小鼠的腦并且用于以每個(gè)細(xì)胞5個(gè)病毒噬斑形成單位(PFU)的感染倍率下感染匯合的vero細(xì)胞單層，將細(xì)胞與病毒一起在37°C下孵育40個(gè)小時(shí)，隨后將它們冷凍。然后將燒瓶解凍并且通過離心澄清富含病毒的上清液，之后將等分試樣在-70°C下儲(chǔ)存直至使用。
[0109]小鼠和感染
[0110]從西澳大利亞州的動(dòng)物資源中心獲得八至i^一周齡的雌性C57BL/6(⑶45.2)和同類系的B6.SJL-PtprcaP^)3b/B0yJ(CD45.I)小鼠。從澳大利亞昆士蘭州的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物資源中心獲得C57BL/6-7.2fms-EGFP轉(zhuǎn)基因(⑶45.2)小鼠。所有程序都是在悉尼大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)的允許下進(jìn)行的。在hepa過濾器的頂籠中在II類生物危害條件下圈養(yǎng)所有的動(dòng)物。隨意地提供食物和水。
[0111]如先前所述用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS5Gibco BRL, California, USA)中的6X IO4PFU WNV進(jìn)行高劑量鼻內(nèi)感染。對(duì)于低劑量感染，對(duì)小鼠接種6X IO3PFU WNV。通過僅用無菌PBS接種小鼠來進(jìn)行模擬感染。(Getts等，J Neurochem.103:1019, 2007 ；ffacher等，J Virol.81:860，2007)。
[0112]感染后每天兩次稱量小鼠。在麻醉下通過使用40ml的冰冷PBS進(jìn)行心臟灌注而將小鼠處死。對(duì)于組織學(xué)來說，可用20ml的在PBS中的4%多聚甲醛(Sigma Aldrich, StLouis, USA)進(jìn)一步灌注小鼠。
[0113]測定病毒滴度的病毒蝕斑測定
[0114]為測定組織樣品中活病毒的滴度，可使用應(yīng)用易感染病毒的BHK細(xì)胞(由澳大利亞堪培拉的John Curtin Medical School的Guna Kapuriah友情捐贈(zèng))的病毒蝕斑測定。如先前所述(Getts等，J Neurochem.103:1019, 2007),可以從動(dòng)物剖離組織樣品并且用功率勻衆(zhòng)器(Tissue Tearor, Biospec, Bartles, OK, USA)解離。簡而言之，在洛斯維派克紀(jì)念研究所(Roswell Park Memorial Institute) 1640 培養(yǎng)基(RPMI; CSL Biosciences)中制備澄清的組織勻漿的五倍稀釋液，并且將其用于感染6孔板中的匯合BHK細(xì)胞(IX IO6個(gè)細(xì)胞在2mL的RPMI中接種過夜)。
[0115]將細(xì)胞在37°C下孵育I小時(shí)，之后通過抽吸去除接種物。用3ml的含1.5%(w/v)低膠凝度瓊脂糖II (Amresco, Solon, OH, USA)的2X最低必需培養(yǎng)基(MEM ；GibcoBRL, GrandIsland, NY, USA)將孔覆蓋。將細(xì)胞在37 °C下再孵育3天，之后將它們用3ml的10%福爾馬林(C0.)固定2小時(shí)，隨后去除瓊脂糖塊。使用3%結(jié)晶紫(Hopkins andWilliams, Essex, England)染料于 20% 甲醇(Fronine, Riverstone, NSW, Australia)中的溶液對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行染色。使用菌落計(jì)數(shù)器(IUL S.A.，Barcelona，Spain)對(duì)病毒蝕斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且通過因式分解病毒蝕斑數(shù)量、接種物體積以及樣品稀釋度來確定最終的每克(組織)的PFU。
[0116]產(chǎn)生嵌合小鼠
[0117]如先前所述(Getts等，J Neurochem.103:1019, 2007)，以一次劑量的 950 拉德照射六至八周齡的B6.SJL-PtprcaP^)3b/B0yJ(CD45.I)小鼠。十二個(gè)小時(shí)以后，用IO7個(gè)來自C57BL/6-7.2fms-EGFP供體的骨髓細(xì)胞復(fù)原小鼠。照射后在飲用水中對(duì)小鼠給予10天的磺胺甲卩惡唑(Sigma Aldrich)和甲氧節(jié)唳(Sigma Aldrich)。如上文所述,將小鼠在照射后六周用WNV感染。使用流式細(xì)胞術(shù)檢查嵌合現(xiàn)象并且始終發(fā)現(xiàn)96-99%的如先前證明的供體來源(Getts 等,J Neurochem.103:1019, 2007)。
[0118]靜脈內(nèi)注射微珠
[0119]從Polyscience, NY, USA 獲得 0.5 μ m、0.05 μ m、以及 3 μ m FITC 或 BrightBlue (BB)Flouresbrite裸聚苯乙烯微珠和羧化聚苯乙烯微珠。從Phosphorex, MA, USA獲得聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)裸微珠和羧化微珠。
[0120]在無菌PBS中稀釋微珠，并且將300 μ I靜脈內(nèi)注射到感染或模擬感染的小鼠的尾靜脈中。對(duì)于高劑量存活研究(6X104PFU WNV鼻內(nèi))，從感染后的第6天開始，對(duì)小鼠每天給予一劑微珠。需要時(shí)，對(duì) 小鼠每天再給予注射直到體重重新穩(wěn)定。對(duì)于低劑量存活研究(6X103PFU WNV鼻內(nèi))，從感染后第6天開始，或者當(dāng)記錄到顯著的體重減輕(總體重的4-6%)時(shí)對(duì)小鼠注射微珠。對(duì)小鼠每天注射一次300ul的微珠，持續(xù)5天或直到體重重新穩(wěn)定。對(duì)于組織收集，在感染后第6天或者當(dāng)記錄到顯著的體重減輕時(shí)，對(duì)6X IO4或6X IO3注射的小鼠注射300 μ I微珠，并且在需要時(shí)進(jìn)行淘汰。采集器官進(jìn)行如下文所述的組織免疫化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、病毒蝕斑測定以及細(xì)胞因子分析。
[0121]免疫組織學(xué)
[0122]對(duì)從C57BL/6 和 cFMS_EGFP (在 Β6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ 中)嵌合體收集到的腦、脾臟、肝臟、肺以及腎臟中執(zhí)行熒光免疫組織化學(xué)(IHC)。灌注后，在4°C下將器官在4%多聚甲醛中固定4小時(shí)，并且然后在30%蔗糖中浸泡過夜，隨后于最佳切削溫度化合物(0CT ；Tissue-Tek, Tokyo Japan)中冷凍。在恒冷箱切片機(jī)中切割八微米組織切片并風(fēng)干。在添加根據(jù)制造商說明使用的基于酪胺的放大系統(tǒng)(TSA試劑盒；Perkin Elmer, Belgium)下,如先前所述進(jìn)行熒光 IHC(Getts 等，J Exp Med.29:2319, 2007)。用 DAPI 抗褪色劑(Vector)對(duì)組織切片進(jìn)行復(fù)染色，隨后觀測。
[0123]顯微鏡和圖像獲取
[0124]在Olympus BX-51 顯微鏡(Olympus, Japan)上使用 DP-70 照相機(jī)和 DP 管理 2.2.1軟件(Olympus)獲取圖像。
[0125]自腦和肝臟分離白細(xì)胞
[0126]如先前所述(Getts等，J Exp Med.29:2319，2007)，通過在37°C下在PBS中用脫氧核糖核酸酶(0.005g/ml ；Sigma Aldrich)和膠原酶 IV(0.05g/ml ；Sigma Aldrich)將腦消化60分鐘，從灌注PBS的小鼠的腦中獲得白細(xì)胞。用10%的FCS停止消化，并且使勻漿通過70 μ m尼龍細(xì)胞過濾器(Becton Dickinson, NJ, USA)。將在340 X g下離心10分鐘之后獲得的集結(jié)塊重新懸浮在30%Percoll (Amersham, Norway)中并且在80%Percoll上分層。在室溫下以1140Xg離心25分鐘之后，從30%/80%界面收集白細(xì)胞。還使用相同的方案來從肝臟獲得白細(xì)胞，其中在處理之前對(duì)組織稱重。
[0127]從脾臟、血液和骨髓分離白細(xì)胞
[0128]對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)分析，剖離右股骨，并且使用裝有PBS的注射器洗出骨髓細(xì)胞。對(duì)于骨髓前體分離，要用到至少4只小鼠的股骨和脛骨。將沖洗后得到的細(xì)胞懸浮液通過70 μ m細(xì)胞過濾器過濾，并在340g下離心5分鐘。使所得集結(jié)塊中的紅血球在基于NH4Cl的紅細(xì)胞溶解緩沖液(BD Pharm Lyse? ；BD Pharmingen)中溶解,隨后在340 X g下離心5分鐘。在外周血液的情況下，通過心臟穿刺來收集血液，并且立即轉(zhuǎn)移到檸檬酸鹽緩沖液(mMol, Sigma Alrich)中。所得懸浮液在70%Percoll上分層，并且在解除制動(dòng)下在室溫下以1140Xg離心20分鐘。收集界面，并且將細(xì)胞在PBS中洗滌一次，以340Xg離心。對(duì)于分離脾臟白細(xì)胞，將脾臟通過7070 μ m細(xì)胞過濾器并以340g離心5分鐘。使所得集結(jié)塊中的紅血球在基于NH4Cl的紅細(xì)胞溶解緩沖液(BD Pharm Lyse?;BD Pharmingen)中溶解，隨后在340 X g下離心5分鐘。`
[0129]流式細(xì)胞術(shù)
[0130]將從腦、肝臟、血液以及骨髓中(如上文所述)收集到的細(xì)胞在PBS中洗滌，并用抗⑶16/⑶32抗體(Biolegend)阻斷。使用通常顯示>95%細(xì)胞活力的臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)計(jì)算活細(xì)胞數(shù)。
[0131]測量細(xì)胞表面分子的表達(dá)，并且在裝備有氬離子和氦氖激光的FACS ARIA (BectonDickinson)中進(jìn)行細(xì)胞分選。活細(xì)胞群由前向散射和側(cè)向散射來閘控，并且通過其后的前向閘控測定標(biāo)識(shí)的熒光細(xì)胞群。使用鑒別相關(guān)細(xì)胞群的特定熒光和散射數(shù)據(jù)來進(jìn)行分選。將分選嚴(yán)格性設(shè)置為純度對(duì)于骨髓細(xì)胞群要達(dá)到>98%的純度。
[0132]使用流式細(xì)胞儀程序Flow Jo (FlowJo, Ashland, OR, USA)對(duì)獲取的FACS數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析?；诜治鲋械牧魇郊?xì)胞儀百分比和來自每個(gè)器官的絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算相關(guān)細(xì)胞群的定量。
[0133]過繼轉(zhuǎn)移
[0134]Ly6Chi/cFMS-EGFP+/CDllb+ 和 Ly6C1(VCfms-EGFP7CDllb+ 細(xì)胞群都是從第6天鼻內(nèi)WNV感染的小鼠中分選而來。將Ly6Chi BM用IOmM細(xì)胞示蹤橙色染料(CMTMR[5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲?；?氨基)四甲基羅丹明)_混合異構(gòu)體；Invitrogen)標(biāo)記。離心分選的細(xì)胞，并在Iml含有10 μ M CMTMR的PBS中培育。將細(xì)胞染色10分鐘，隨后用10%FCS停止反應(yīng)。將細(xì)胞在50ml PBS中洗滌至少三次。然后將標(biāo)記的CMTMR Ly6Chi BM細(xì)胞與Ly6ClQ細(xì)胞以1:1混合，所述Ly6ClQ細(xì)胞除了添加CMTMR外，還已經(jīng)以類似于Ly6Chi細(xì)胞群的方式進(jìn)行了處理。將總共2X IO6個(gè)BM細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到第6.5天WNV感染或模擬感染的Ly5.1-C57BL/6同類系小鼠體內(nèi)。這之后立即靜脈內(nèi)注射300ulBB聚苯乙烯微珠。12小時(shí)后，如上文所述采集腦、脾臟以及肝臟。使用流式細(xì)胞術(shù)來調(diào)查供體細(xì)胞的存在，兩者都使用cFMS-EGFP和CMTM細(xì)胞示蹤橙色染料。
[0135]多路ELISA
[0136]根據(jù)制造商說明(QuansysBiosciences, Logan, Utah, USA)進(jìn)行多路板 ELISA。簡而言之，使腦、脾臟以及肝臟組織在PBS中均質(zhì)化、通過IOOOXg旋轉(zhuǎn)使之澄清、并且在-20°C下儲(chǔ)存直到進(jìn)行測定。還使用血清樣品。將解凍的樣品和標(biāo)準(zhǔn)物在提供的緩沖液中稀釋，并且將各30 μ I涂鋪在含有16個(gè)點(diǎn)的各孔中，其中每個(gè)點(diǎn)含有特定可溶性蛋白質(zhì)的捕捉抗體。然后將板在軌道振蕩器上120r.p.m下孵育I小時(shí)。將板洗滌3次，并且將30 μ I的檢測抗體添加到每個(gè)孔中并再孵育一小時(shí)。洗滌3次之后，添加抗生蛋白鏈菌素-HRP并再孵育15分鐘。然后將板洗滌6次，并添加底物混合物。立即在CCD成像機(jī)(Kodak, Rochester NY, USA)上讀取各板。使用 Quansys Q-view 軟件(QuansysBiosciences)分析板圖像。
[0137]實(shí)驗(yàn)性自身免疫性 腦炎(EAE)的誘發(fā)和評(píng)估
[0138]向 C57BL/6 小鼠皮下注射含有 0.1mg MOG 肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK ;Ausp印，Parkville, Victoria, Australia ；>95%HPLC純度)的乳液和含有2mg/mL肺結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) (Sigma Aldrich)的完全弗氏佐劑。兩天之后,對(duì)小鼠腹膜內(nèi)施用500μ I百日核毒素(Sigma Aldrich)。監(jiān)測小鼠的疾病發(fā)展并按以下量表來評(píng)級(jí):1，尾巴無力和/或I條后肢虛弱；2，一條以上肢體虛弱，步態(tài)紊亂；3，I條肢體麻痹；4，一條以上肢體麻痹，失禁；5，垂死。
[0139]誘發(fā)由巰基乙酸酯誘發(fā)的腹膜炎
[0140]通過注射Iml溶解在PBS中的巰基乙酸酯(4%(w/v) ；Sigma Alrich)誘發(fā)腹膜炎。對(duì)通過頸脫位法處死的小鼠執(zhí)行腹膜內(nèi)灌洗。簡而言之，將5ml腹膜灌洗緩沖液(PLB ;含有
0.5mM EDTA(Fronine)和 9.9 單位/ml 的肝素(Sigma Aldrich)的 PBS)注射到腹膜中。輕緩按摩腹膜，隨后將PLB吸入到IOml注射器中。重復(fù)這個(gè)過程兩次。然后將灌洗液在PLB中增加到50ml并以340Xg旋轉(zhuǎn)5分鐘。如上文所述制備用于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞。
[0141]統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0142]制作圖表，并分別在GraphPad Prism和InStat (兩個(gè)程序都來自GraphPad軟件，San Diego1CA, USA)中進(jìn)行計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)數(shù)據(jù)，進(jìn)行不成對(duì)雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)或有Tukey-Kramer后檢驗(yàn)的單因素方差分析,其中P〈0.05視為顯著。
[0143]對(duì)于如體重減輕、浸潤以及病毒滴度等參數(shù)之間的相關(guān)性分析，在二階多項(xiàng)式(Y=A+B*X+C*X-2)的情況下使用非線性回歸(曲線擬合)。
[0144]實(shí)施例1
[0145]WNV腦炎的高劑量和低劑量模型的表征
[0146]用6X IO4PFU WNV鼻內(nèi)高劑量感染C57BL/6小鼠導(dǎo)致感染后第7天死亡率為100%(圖1A)。我們先前已經(jīng)顯示是來源于循環(huán)Ly6chi單核細(xì)胞前體(Getts等，J ExpMed.29:2319, 2007)的巨噬細(xì)胞和遷移小膠質(zhì)細(xì)胞從感染后第5天開始浸潤到WNV感染的腦中。T細(xì)胞、NK細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞也從這個(gè)時(shí)間點(diǎn)往后進(jìn)入CNS，其中在感染后第7天可見到浸潤峰值。(圖1F-H，圖2A-D)腦病毒滴度也從感染后第5天開始以指數(shù)方式增長，在感染后第7天達(dá)到高水平(圖1C)，并且感染小鼠的體重從感染后第5天開始顯著降低，直到死亡(圖1B)。
[0147]以少10倍的病毒即6X IO3PFU鼻內(nèi)接種小鼠產(chǎn)生亞致死結(jié)果。當(dāng)比較獨(dú)立實(shí)驗(yàn)時(shí)，死亡率發(fā)生一些變化，其范圍在40-60%之間(圖1A);然而，始終顯示體重減輕百分比和病毒滴度/浸潤之間具有強(qiáng)相關(guān)性(圖1B-H，圖2A-E)。每天監(jiān)測小鼠體重證明是預(yù)測個(gè)體感染結(jié)果的可靠方法，并且指示何時(shí)小鼠需要干預(yù)以便在感染中存活(圖1B)。
[0148]在接種6X IO3WNV后沒有減輕體重的小鼠未死于感染，并且對(duì)隨后以6X IO4再感染免疫(圖1A-B)。這些小鼠在初次感染或高劑量再感染時(shí)未顯示包括體重減輕在內(nèi)的任何疾病癥狀。相反地，與模擬感染對(duì)照組的正常波動(dòng)相比體重量顯著減輕的小鼠(通常在24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)體重減輕>4%)通常繼續(xù)損失體重，通常持續(xù)2-3天，隨后發(fā)生死亡。在腦炎的這個(gè)模型中，死于感染的大部分小鼠在感染后的第6天和第11天之間開始損失體重，并且在感染后第16天之前發(fā)生死亡。這些小鼠相比于第7天用6 X IO4感染的小鼠，在TOD時(shí)在腦中顯示高病毒滴度(圖1C)。
[0149]與在6X IO4和6X IO3感染的小鼠的腦中的白細(xì)胞浸潤比較的流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)揭示，在感染后第7天的體重減輕百分比與總的白細(xì)胞(圖1F)、巨噬細(xì)胞(圖1H)、遷移小膠質(zhì)細(xì)胞(圖2A)、T細(xì)胞(圖2C)和NK細(xì)胞(圖2Ε)的浸潤具有強(qiáng)相關(guān)性，并且顯示體重減輕與嗜中性粒細(xì)胞遷移(2D)之間具有一定程度的相關(guān)性。不出意外，在所有小鼠中CD451。小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量保持相對(duì)不變，因?yàn)檫@個(gè)群體主要包括腦的常駐小膠質(zhì)細(xì)胞(圖2Β)。
[0150]為了進(jìn)一步研究感染的低劑量模型，每天稱重6Χ IO3感染的小鼠，并在第O天至第14天將其處死，并采集腦用于流式細(xì)胞術(shù)和病毒蝕斑測定。在死亡時(shí)的體重減輕百分比和病毒滴度(圖2F)或白細(xì)胞浸潤(圖2G)之間顯示出一定程度的相關(guān)性。然而，病毒滴度和白細(xì)胞浸潤之間的比較揭示，一些小鼠具有高病毒滴度而沒有顯著的浸潤(圖2Η)，并且雖然這些小鼠中的一些也損失顯著量的體重，但其它小鼠并沒有(圖2F)。因?yàn)楸仨毺幩佬∈髞頊y定腦中的病毒滴 度，所以尚不清楚腦中具有病毒而沒有顯著的體重減輕或白細(xì)胞浸潤的這些小鼠是否在未顯示體重減輕或浸潤的情況下清除病毒，或者所見到的高病毒滴度是否是在腦浸潤/體重減輕之前。
[0151]實(shí)施例2
[0152]羧化微珠處理顯著提高了 WNV腦炎的高劑量和低劑量模型的存活率
[0153]在文獻(xiàn)中經(jīng)常使用熒光微珠來追蹤疾病的各種活體內(nèi)模型中單核細(xì)胞子集的轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，這些研究忽視了這些理論上“惰性的”微珠可能對(duì)單核細(xì)胞功能所具有的潛在影響，并且因而影響到疾病的結(jié)果。
[0154]為了試圖在WNV感染期間追蹤單核細(xì)胞，我們使用裸聚苯乙烯微珠和羧化聚苯乙烯微珠兩者，并且在疾病過程中發(fā)現(xiàn)意料之外的改變。以下數(shù)據(jù)揭示裸聚苯乙烯微珠和羧化聚苯乙烯微珠兩者都使免疫細(xì)胞對(duì)腦的浸潤顯著減少，并且提升了感染小鼠的長期存活率。
[0155]在感染后第6天對(duì)6 X IO4WNV感染的小鼠靜脈內(nèi)注射含4.41 X IO90.5 μ m羧化聚苯乙烯微珠的300 μ I PBS在這種疾病致死模型中得到10%的小鼠長期存活(圖3Α)。為了解存活率結(jié)果是否可以提高，我們也在感染后第6天將此相同濃度的微珠注射到用6 X IO3的較低劑量感染的小鼠體內(nèi) 。然而，與PBS處理的對(duì)照組相比，這種策略使所處理小鼠的存活率降低(圖3B)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了微珠需要作為治療，即當(dāng)小鼠開始顯示顯著的體重減輕(我們已經(jīng)表明這指示了高病毒滴度和白細(xì)胞群對(duì)腦的浸潤(參見圖1、2))時(shí)方才施用。
[0156]因此，我們?cè)诘蛣┝扛腥灸Ｐ椭胁扇≈委煼椒▉硎┯梦⒅?。將小鼠每天稱重(圖3E-G)，并且如果在24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)檢測到顯著的體重減輕(相比于模擬感染的對(duì)照組的正常波動(dòng)，通常>4%的總體重)則施用4.41 X IO9羧化聚苯乙烯微珠。使用這種策略，我們能夠使通常繼續(xù)損失體重并且在沒有干預(yù)下會(huì)死亡的小鼠的存活率增加60%(在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中是40-80%)(圖3D)。正如所料，損失體重并用PBS處理的所有小鼠繼續(xù)損失體重并在2-4天后死亡(圖3E，G)。在任何時(shí)候都沒有損失顯著量的體重的小鼠顯示與PBS感染的對(duì)照組相似的體重穩(wěn)定性(圖3E-F)。
[0157]在初始檢測到顯著體重減輕后連續(xù)5天用羧化微珠處理小鼠。在一些小鼠中，5天的微珠處理是足夠的并且體重在停止注射微珠后保持穩(wěn)定，并且這些小鼠在沒有進(jìn)一步干預(yù)的情況下在感染中存活下來(圖4A-B)。然而，一些小鼠在5天后停止微珠處理時(shí)再次開始損失體重，因此重新開始處理直到體重再次穩(wěn)定，并且這些小鼠也長期存活(圖4C-D)。
[0158]在感染后第9天對(duì)6 X IO3WNV感染的小鼠的腦進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，所述小鼠在感染后第8天檢測到顯著的體重減輕時(shí)用羧化聚苯乙烯微珠或PBS進(jìn)行了處理。在第8天也對(duì)沒有損失體重的小鼠進(jìn)行微珠或PBS處理作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。如圖4D-L所示，在感染后第8天沒有損失體重但是以微珠(圖4H-1)或PBS (圖4D-E)處理的小鼠顯示沒有單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞或遷移小膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞對(duì)腦的浸潤，其中分離的主要細(xì)胞群是⑶45Wint⑶Ilb+常駐小膠質(zhì)細(xì)胞。在感染后第8天體重減輕并且用PBS處理的小鼠中，在感染后第9 天明顯存在大量的腦浸潤(圖4F-G)，其中主要細(xì)胞群是CD45hi炎癥性單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞(圖4L)。然而，在感染后第8天損失體重并用微珠處理的小鼠中，仍然存在顯著的浸潤，但是相比于PBS處理的小鼠大為減少(圖4J-L)。需要重復(fù)對(duì)體重減輕時(shí)用微珠或PBS處理的IO3感染的小鼠進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，以顯示當(dāng)在感染后6-14天內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行微珠處理時(shí)出現(xiàn)浸潤減少。
[0159]實(shí)施例3
[0160]微珠的羧化對(duì)于WNV感染的小鼠的存活率的顯著提高以及白細(xì)胞群的變化是關(guān)鍵的
[0161]在研究的這個(gè)階段，尚不清楚微珠的羧化作用對(duì)于存活率中所見到的提高以及轉(zhuǎn)運(yùn)到腦中的白細(xì)胞的減少是否關(guān)鍵。當(dāng)記錄到顯著的體重減輕時(shí)，對(duì)6X IO3WNV感染的小鼠注射含4.41 X IO90.5 μ m裸微珠或羧化微珠的300 μ I PBS或僅PBS。注射了羧化微珠的小鼠顯示存活率顯著提高60%，而裸微珠處理的小鼠顯示低得多的25%的提高(圖5Α)。未損失體重的小鼠不處理，并且在沒有干預(yù)下在感染中存活下來，而損失體重并用PBS處理的小鼠在感染后第14天全部死亡(圖5B-D)。在這些小鼠中監(jiān)測體重減輕直到感染后第20天；沒有損失顯著量的體重的小鼠顯示與PBS感染的對(duì)照組相似的穩(wěn)定型態(tài)(數(shù)據(jù)未顯示)，而用羧化微珠或裸微珠(圖5B-C)處理的小鼠最終穩(wěn)定并且存活，或繼續(xù)損失體重并在2-4天后死亡。損失體重并用PBS (B，D)處理的所有小鼠繼續(xù)損失體重并在2-5天后死亡。
[0162]為了研究白細(xì)胞群的變化并確定何種細(xì)胞可能發(fā)現(xiàn)與羧化微珠或裸微珠締合，對(duì)用6X104PFU WNV感染的小鼠進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。在感染后第6天對(duì)小鼠注射在300 μ I PBS中靜脈內(nèi)遞送的4.41 X IO90.5 μ m羧化FITC微珠或裸FITC微珠或單獨(dú)的PBS。將小鼠在感染后第7天處死，并且收集血液、腦、骨髓、肝臟以及脾臟用于流式細(xì)胞術(shù)。
[0163]可以通過流式細(xì)胞儀(Ex/Em Max441/486nm)檢測“游離”微珠以及與⑶45+白細(xì)胞締合的微珠。正如所料，在PBS處理的對(duì)照組(圖5E-G)的血液中檢測不到微珠，但是可以在裸(圖5H-J)和羧化(圖L-M)微珠處理的小鼠中見到微珠。當(dāng)微珠是羧化的時(shí)它們似乎更有效地被清除，并且仍然保留在循環(huán)中的那些中的很多與CD45+白細(xì)胞締合(圖50)，相比之下，裸微珠(圖5K)主要是“游離的”。這個(gè)數(shù)據(jù)表明，羧化作用在一定程度上促進(jìn)白細(xì)胞從循環(huán)中攝取微珠，相比之下，一些裸微珠在注射后24小時(shí)仍然在循環(huán)中保持“游離”。
[0164]腦的流式細(xì)胞術(shù)揭示在用羧化微珠或裸微珠處理的小鼠的腦中白細(xì)胞群的減少方面存在一些顯著差異。在感染后第7天，即處理后的第I天(圖6A-C)在腦中檢測不到羧化微珠或裸微珠，這表明攝取微珠的細(xì)胞未進(jìn)入感染的CNS。在裸微珠和羧化微珠處理的小鼠的腦中白細(xì)胞的總數(shù)與PBS處理的對(duì)照組相比顯著減少，總的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞也一樣(圖6D)。然而，只有羧化微珠使這些小鼠腦中T細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量減少。巨噬細(xì)胞的Ly6chi和Ly6cWint細(xì)胞群兩者都因兩種微珠處理而顯著減少，并且Ly6c_細(xì)胞的小細(xì)胞群中沒有見到變化。對(duì)于CD45int活化小膠質(zhì)細(xì)胞，Ly6chi子集的減少僅在羧化微珠處理的情況下見到，但是Ly6cWint和Ly6c_子集的減少在兩種微珠處理的情況下都能見到。在Ly6chi⑶451°靜止小膠質(zhì)細(xì)胞的小子集中沒有見到變化，然而兩種微珠處理都使Ly6cwint和Ly6c_子集顯著減少。
[0165]脾臟的流式細(xì)胞術(shù)揭示在此器官中很多微珠被白細(xì)胞攝取，并且在處理之間存在細(xì)胞群的一些有趣的差異。如圖7A-1所示，微珠+細(xì)胞主要是⑶I lb+、⑶I Ic+和Ly6c+。
[0166]進(jìn)一步分析顯示，發(fā)現(xiàn)三個(gè)主要的相關(guān)子集可在脾臟中攝取微珠--⑶lib+、⑶llc—單核細(xì)胞(圖7J、M、P)、railb+、railc+ “髓性”樹突狀細(xì)胞，主要為Ly6cw_(圖7K、N、Q)、以及CDllb' CDllc+樹突狀細(xì)胞，主要為Ly6cw_(圖7L、O、R)。
[0167]這3個(gè)細(xì)胞群的增加在羧化微珠處理的小鼠的脾臟中也是明顯的。在羧化微珠處理的小鼠中發(fā)現(xiàn)總CDllb+、CDllc_單核細(xì)胞、以及總Ly6cint/h1、微珠+Ly6cint/hi和微珠_1^6(^^1子集的增加(圖8A)。在羧化微珠處理的情況下也發(fā)現(xiàn)總Ι^6(ΓΛ°、微珠+LyecV10以及微珠Tyecvit5的增加。這些數(shù)據(jù)表明由于羧化微珠處理，單核細(xì)胞可以轉(zhuǎn)運(yùn)至脾臟，并且不僅募集微珠+細(xì)胞而且也募集微珠_細(xì)胞。
[0168]發(fā)現(xiàn)在脾臟中的⑶IIb+⑶IIc+樹突狀細(xì)胞的Ι^6(ΓΛ°細(xì)胞群攝取兩種類型的微珠(圖8B)。然而，只有羧化微珠增加脾臟中的⑶Ilb+⑶Ilc+樹突狀細(xì)胞以及這些細(xì)胞中的Lyecvi0細(xì)胞群的總數(shù)。由于微珠—LyecV1。樹突狀細(xì)胞沒有增加，因此顯然只有微珠+1^6(^1(5樹突狀細(xì)胞在攝取羧化微珠之后轉(zhuǎn)運(yùn)到脾臟?？赡苓@些細(xì)胞實(shí)際上是來源自于Ly6chi炎癥性單核細(xì)胞，所述單核細(xì)胞攝取循環(huán)中的微珠，轉(zhuǎn)移到脾臟而不是轉(zhuǎn)運(yùn)到腦，在脾臟中隨著它們分化成樹突狀細(xì)胞，它們向下調(diào)節(jié)Ly6c表達(dá)，并且向上調(diào)節(jié)⑶Ilc表達(dá)。
[0169]在脾臟中的⑶IlbXDllc+樹突狀細(xì)胞群的Ly6cw_細(xì)胞攝取兩種微珠類型(圖8C)。用羧化微珠處理見到⑶IIbTDlIc+樹突狀細(xì)胞群，更具體來說是Ly6cw_細(xì)胞的總數(shù)增加。在這個(gè)細(xì)胞群的微珠+和微珠_細(xì)胞中都見到增加，表明在脾臟中不僅微珠+細(xì)胞增加而且微珠_細(xì)胞也增加。這個(gè)細(xì)胞群可以包含脾臟常駐DC、從外周募集而來的非髓性DC，還可以潛在性地由攝取了微珠、向下調(diào)節(jié)⑶Ilb和Ly6c表達(dá)、并且向上調(diào)節(jié)⑶Ilc表達(dá)的炎癥性單核細(xì)胞組成。
[0170]還發(fā)現(xiàn)在脾臟中微珠與小百分比的B細(xì)胞締合，然而只有羧化微珠顯著地增加脾臟中B細(xì)胞的數(shù)量(圖9A-D)。在脾臟中見到的僅有的其它顯著增加是CD8+T細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、以及嗜中性粒細(xì)胞保持不變。
[0171]還可以在肝臟中檢測主要與表達(dá)⑶I lb、⑶I Ic以及Ly6c的細(xì)胞締合的微珠(圖10Α-Ι) O 對(duì)于脾臟，發(fā)現(xiàn) CDllb+CDllc-單核細(xì)胞(圖 10J)、CDllb+CDllc+(圖 10K)以及CDllb—CDlIc+(圖10L)樹突狀細(xì)胞在肝臟中攝取微珠。然而，肝臟的任何白細(xì)胞群沒有顯著的增加或減少。在骨髓的⑶llb+CDllC+Ly6C+白細(xì)胞小群中也檢測到少量微珠(圖11A-G)。然而，在骨髓的任何白細(xì)胞群中都沒有發(fā)現(xiàn)顯著的增加或減少。
[0172]實(shí)施例4
[0173]當(dāng)記錄到顯著的體重減輕時(shí)，對(duì)6X IO3WNV感染的小鼠靜脈內(nèi)注射含低劑量0.1%微珠或高劑量0.5%微珠的0.5,0.05、或3 μ m羧化聚苯乙烯微珠的300 μ I PBS或僅PBS。用低劑量的0.5,0.05、或3 μ m的微珠處理的小鼠在存活率方面顯示相似的大約40-50%的提高(圖12A)。然而，高劑量處理的小鼠似乎對(duì)存活不利，提高低得多，為20%。用高劑量微珠處理的大量小鼠顯示出非典型的疾病癥狀，并且可以推斷在幾天內(nèi)在要害器官中積累這樣高劑量的微珠對(duì)于小鼠是有害的。重復(fù)此時(shí)程，其中有可能包括其它較低劑量的珠粒。還將在感染后第6天以不同尺寸的微珠處理的6X IO4WNV感染的小鼠中執(zhí)行流式細(xì)胞術(shù)。
[0174]這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了這個(gè)事實(shí)，即羧化聚苯乙烯微珠不能在活體內(nèi)分解，并且因此可能具有有限的治療適用性。因此，我們獲得0.5 μ m生物可降解的羧化或裸聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)球體(然而裸球體也包含少量的羧基)。當(dāng)檢測到顯著的體重減輕時(shí)，對(duì)6 X IO3WNV感染的小鼠注射4.41 X IO90.5 μ m的裸的或羧化的聚苯乙烯微珠或PLGA球體。如在圖12B中可見， 迄今為止，PLGA裸球體或羧化球體顯示在存活率方面與羧化聚苯乙烯微珠具有相似的提聞。
[0175]為了解在感染后第6天注射羧化PLGA球體是否減少第7天6 X 104WNV感染的小鼠的腦的浸潤，我們比較了用靜脈內(nèi)遞送的4.41 X 109個(gè)粒子對(duì)小鼠進(jìn)行的PBS、0.5 μ m羧化微珠、0.5 μ m羧化PLGA球體、以及0.5 μ m羧化金剛石粒子處理。將腦、血液、脾臟以及肝臟處理用于流式細(xì)胞術(shù)。繼續(xù)分析本實(shí)驗(yàn)，然而這些小鼠的腦的初步分析顯示出所有的三種粒子成功地減少了免疫細(xì)胞對(duì)腦的浸潤(圖12C)。還觀察到脾臟中總白細(xì)胞增加，與我們?cè)隰然⒅樘幚淼男∈笾幸姷降慕Y(jié)果一致。
[0176]實(shí)施例5
[0177]在T細(xì)胞缺乏型小鼠中的微珠處理
[0178]將C57BL/6野生型(WT)和RAG (T細(xì)胞缺乏型)小鼠用6 X IO4或6 X IO3PFU WNV感染。用6X104的高劑量感染的WT小鼠在感染后第7天顯示100%死亡率，而用相同劑量感染的RAG小鼠在感染后第8天開始死亡，并且一些小鼠活到了感染后第13天。用6 X IO3的低劑量感染的WT小鼠在感染后第8天顯示出60%的死亡率，但是在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后有40%的長期存活。用這個(gè)相同劑量感染的RAG小鼠在感染后第14天之前都沒有開始死亡，然而在第16天所有的RAG小鼠都死亡(圖13A-B)。這些數(shù)據(jù)表明T細(xì)胞在WNV的免疫病理學(xué)中起到直接或間接的作用，因?yàn)門細(xì)胞缺乏型小鼠比RAGS存活時(shí)間長。然而，還強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是T細(xì)胞對(duì)于控制病毒感染是關(guān)鍵的，因?yàn)樗械挠玫蛣┝扛腥镜腞AG小鼠死于疾病，然而40%的WT小鼠通過免疫存活下來。
[0179]每天記錄這些小鼠的體重減輕，并且顯示在RAGS和WT小鼠中體重減輕發(fā)生在死亡之前(圖13B)。然而，觀察到WT在初始體重減輕之后最多只活2-3天，而RAGS在體重減輕開始之后可活多達(dá)5天。從用6X IO4或6X IO3感染的RAG和WT小鼠采集的腦的病毒蝕斑測定揭示體重減輕百分比與病毒滴度強(qiáng)相關(guān)(圖12C)。通常，RAG小鼠顯示與WT小鼠相比在死亡時(shí)體重減輕更大和病毒滴度更高。似乎這可以歸因于以下實(shí)情，即它們?cè)诔跏俭w重減輕之后能夠比WT小鼠存活更長，并且因此病毒繼續(xù)在腦中增加，而小鼠在死亡時(shí)間之前繼續(xù)損失體重，與在沒有T細(xì)胞下不能控制病毒的結(jié)果直接相反。這個(gè)假設(shè)受到其中比較第7天WT和第7/8天RAG小鼠腦的腦流式細(xì)胞術(shù)(圖13D-E)。RAG小鼠顯示巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞(因?yàn)樗鼈兪侨狈π偷?、以及嗜中性粒細(xì)胞對(duì)腦的浸潤顯著減少，它們?cè)诟腥竞蟮?天和第8天之間沒有增加。這可以解釋為 什么在免疫病理學(xué)是這些動(dòng)物死亡的主要原因的情況下這些動(dòng)物在初始體重減輕之后比WT小鼠存活更長。
[0180]還用6X103PFU WNV感染RAG和WT小鼠，并且每天稱重，以測試在T細(xì)胞不存在的情況下羧化微珠的功效。在顯著體重減輕(在24小時(shí)內(nèi)>4%)時(shí)，用以300ul體積靜脈內(nèi)遞送的4.41 X IO9個(gè)羧化微珠或PBS來處理小鼠。微珠注射未使RAG小鼠的存活率顯著提高(圖12F)。微珠或PBS注射后，RAG小鼠繼續(xù)損失體重并在2_5天后死亡(圖12G)。需要再次重復(fù)這個(gè)實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)結(jié)果。
[0181]實(shí)施例6
[0182]EAE的微珠處理
[0183]用MOG和CFA佐劑誘發(fā)C57BL/6小鼠。在如通過步態(tài)、姿勢和其它活動(dòng)的變化所確定發(fā)展疾病癥狀時(shí)，每8個(gè)小時(shí)、每16個(gè)小時(shí)、每天或每48個(gè)小時(shí)靜脈內(nèi)施用羧化粒子。疾病的嚴(yán)重程度由疾病評(píng)分的變化來確定。輸注粒子將預(yù)防單核細(xì)胞遷移到腦中并且后續(xù)T細(xì)胞誘發(fā)使得疾病評(píng)分顯著降低。
[0184]實(shí)施例7
[0185]動(dòng)脈粥樣硬化和新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖的微珠處理
[0186]用聞脂肪飲食喂養(yǎng)ΑΡ0/Ε缺乏型小鼠。從4周齡開始,每8個(gè)小時(shí)、每16個(gè)小時(shí)、每24個(gè)小時(shí)、每48個(gè)小時(shí)、每72個(gè)小時(shí)、每周一次、或每個(gè)月一次靜脈內(nèi)施用羧化粒子。疾病的嚴(yán)重程度由動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)的變化來確定。輸注粒子將預(yù)防單核細(xì)胞遷移到動(dòng)脈壁中，并且預(yù)防對(duì)于驅(qū)動(dòng)血管平滑肌增殖和內(nèi)膜斑塊形成關(guān)鍵的后續(xù)免疫后遺癥。
[0187]雖然已經(jīng)描述和說明了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但這些實(shí)施方案應(yīng)該僅僅被認(rèn)為是說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明，本發(fā)明是根據(jù)隨附權(quán)利要求書來解釋。
[0188]本文所弓I用的所有專利、申請(qǐng)以及其它參考文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。
【權(quán)利要求】
1.一種包含羧化粒子的藥物組合物，其中所述粒子沒有連接的抗原部分。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述抗原部分是肽。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述羧化粒子是聚苯乙烯粒子、金剛石粒子或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)粒子
4.如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述粒子是聚苯乙烯粒子。
5.如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述粒子是金剛石粒子。
6.如權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述粒子是PLGA粒子。
7.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述組合物在有需要的受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受。
8.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述組合物改善有需要的受試者的炎癥性免疫反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述羧化粒子的直徑是在約0.1 μ m至約10 μ m之間。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.3 μ m至約5 μ m之間。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.5 μ m至約3 μ m之間。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.5μπι至約I μπι之間
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述羧化粒子的直徑是約0.5 μ m
14.一種減少受試者的炎癥性免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間或嚴(yán)重程度的方法，其包括對(duì)所述受試者施用包含羧化粒子的藥物組合物，其中所述粒子沒有連接的肽或抗原部分。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述羧化粒子是聚苯乙烯粒子、金剛石粒子或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)粒子。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述粒子是聚苯乙烯粒子。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述粒子是金剛石粒子。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述粒子是PLGA粒子。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述組合物在有需要的受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受。
20.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述組合物改善炎癥性免疫反應(yīng)。
21.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.1 μ m至約10 μ m之間。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.3 μ m至約5 μ m之間。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.5 μ m至約3 μ m之間。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.5 μ m至約I μ m之間
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是約0.5 μ m。
26.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述受試者患有自身免疫性病癥。
27.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受試者是移植受者。
28.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述受試者患有缺血再灌住損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、或已罹患心肌梗塞。
29.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述受試者患有銀屑病或皮膚炎。
30.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述受試者罹患過敏性病癥。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述過敏性病癥是濕疹、哮喘、過敏性鼻炎或皮膚過敏癥。
32.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述自身免疫性病癥是選自由以下組成的組:多發(fā)性硬化癥、硬皮病、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎、全身性紅斑狼瘡、雷諾氏(ReynaudJ s)綜合征、修格蘭氏(Sjorgen’ s)綜合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、以及克羅恩氏(Crohn’ s)病。
33.如權(quán)利要求3 2所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥。
34.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述組合物是口服、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)眼、透皮、或皮下施用。
35.一種治療受試者的病毒性感染或細(xì)菌性感染的方法,其包括對(duì)所述受試者施用包含羧化粒子的藥物組合物，其中所述粒子沒有連接的肽或抗原部分。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述羧化粒子是聚苯乙烯粒子、金剛石粒子或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)粒子。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述粒子是聚苯乙烯粒子。
38.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述粒子是金剛石粒子。
39.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述粒子是PLGA粒子。
40.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組合物在有需要的受試者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受。
41.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述組合物改善炎癥性免疫反應(yīng)。
42.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.Ιμπι至約ΙΟμπι之間。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.3 μ m至約5 μ m之間。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.5 μ m至約3 μ m之間。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是在約0.5 μ m至約I μ m之間
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述羧化粒子的直徑是約0.5 μ m
47.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述病毒性感染是選自由以下組成的組:皰疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼羅河病毒感染、黃病毒、流感病毒感染、鼻病毒感染、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、乳頭瘤病毒感染、副粘病毒感染、以及副流感病毒感染
48.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述病毒性感染感染所述受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
49.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述病毒性感染引起病毒性腦炎或病毒性腦膜炎。
50.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述細(xì)菌性感染感染所述受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
51.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述細(xì)菌性感染引起細(xì)菌性腦炎或細(xì)菌性腦膜炎。
52.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述組合物是口服、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)眼、透皮、或皮下施用。`
【文檔編號(hào)】A61K9/54GK103429232SQ201180064803
【公開日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月12日
【發(fā)明者】D.蓋茨, R.特里, N.金 申請(qǐng)人:蓋茨咨詢和項(xiàng)目管理公司