用于牛免疫接種的組合物和方法發(fā)明

背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過使用問號鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)哈勒焦(hardjo)血清型(hardjoprajitno型)免疫接種牛(特別是奶牛和小母牛)以抵御博氏鉤端螺旋體(Leptospiraborgpetersenii)哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)的組合物、其用途和方法?，F(xiàn)有技術(shù)鉤端螺旋體病是世界上最流行的人畜共患疾病。它會影響大多數(shù)哺乳動物而且是世界各地牛繁殖失敗的一個重要原因(參見Faine等，1999；HeathandJohnson，1994)。鉤端螺旋體是革蘭氏陰性的螺旋狀細(xì)菌，分為至少12個致病種和4個腐生種，具有超過250種致病性血清變型。這種細(xì)菌可在環(huán)境中存活長達半年，尤其是在堿性土壤(pH7.2-8.0)和溫暖濕潤的環(huán)境中。這種細(xì)菌很少在干燥或極端寒冷的條件下生存(參見Faine等，1999；HeathandJohnson，1994)。致病種以寄存宿主腎小管的慢性感染持續(xù)存在，有時會導(dǎo)致很少的疾病或不會致病。傳染是通過直接接觸受感染的尿液或通過接觸被受感染的尿液污染的飼料或鋪墊而傳染。在牛中，該病常見的臨床癥狀包括生殖功能衰竭、弱犢、流產(chǎn)、死胎、干尸化和無乳。尿液中細(xì)菌的釋出的可能會在較長的時間內(nèi)發(fā)生。腎臟病變可能是因感染鉤端螺旋體血清型哈勒焦型、波莫納型和流感傷寒型所致的鉤端螺旋體血病(leptospiremia)的直接結(jié)果(參見Faine等，1999；HeathandJohnson，1994；Ellis，1994)。牛是問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)(LHP)和博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)(LHB)的主要寄存宿主庫。LHP主要在歐洲被發(fā)現(xiàn)，而全世界許多地方的牛的鉤端螺旋體病的最常見的病因是LHB。LHB是迄今已從美國的牛分離的唯一的hardjo血清變型。(Bolin等，1989(a).)。含有鉤端螺旋體血清型哈勒焦型(hardjo)、犬型(canicola)、波莫納型(pomona)、流感傷寒型(grippotyphosa)和出血黃疸型(icterohaemorrhagiae)的全細(xì)胞滅活的鉤端螺旋體疫苗進行免疫接種，是控制牛鉤端螺旋體病的主要手段。因為疫苗制造相關(guān)的成本與用于配制疫苗的組分的類型和數(shù)量直接相關(guān)，人們希望降低疫苗中組分的數(shù)量卻不損失疫苗效價。本文描述了針對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)提供保護而在疫苗中不包含哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)的疫苗，以及相關(guān)的方法及用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供克服現(xiàn)有技術(shù)不足之處的免疫原性組合物、疫苗和相關(guān)的方法和用途。所述組合物、方法和用途通過免疫接種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)防止博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、減少其發(fā)病率、和/或減輕其嚴(yán)重程度。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗包含問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌或能夠針對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)誘發(fā)免疫應(yīng)答的細(xì)菌。優(yōu)選地，該問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)是滅活的一種或多種細(xì)菌。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還可以進一步包含一種或多種選自傳染性牛鼻氣管炎(IBR)病毒(BovineRhinotracheitis(IBR)virus)、1型和2型牛病毒性腹瀉(BVD)病毒(BovineVirusDiarrhea(BVD)Types1and2)、3型副流感(PI3)病毒(Parainfluenza3(PI3)virus)和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)(BovineRespiratorySyncytialVirus(BRSV))的經(jīng)修飾的活病毒(MLV)。優(yōu)選的免疫原性組合物和疫苗包含滅活的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)、經(jīng)修飾的傳染性牛鼻氣管炎(IBR)活病毒、經(jīng)修飾的1型牛病毒性腹瀉(BVD)活病毒和經(jīng)修飾的2型牛病毒性腹瀉(BVD)活病毒的組合，例如經(jīng)批準(zhǔn)的市售組合產(chǎn)品3VL5，BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.，St.Joseph。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可能還包含經(jīng)修飾的牛呼吸道合胞活病毒(BRSV)，或滅活的胎兒彎曲桿菌(CampylobacterFetus)、睡眠嗜血菌(Haemophilussomnus)和鉤端螺旋體血清型犬型、流感傷寒型、哈勒焦型、出血黃疸型和波莫納型的任一種的組合。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗在受試者中防止博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、減少其發(fā)病率、和/或減輕其嚴(yán)重程度。優(yōu)選地，受試者是牛，更優(yōu)選地，牛是母?；蛐∧概?heifer)，最優(yōu)選地，牛是小母牛。本發(fā)明的免疫原性組合物，其包含至少一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌(如本文所定義)，可進一步包含生理上可接受的媒劑，如藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑、佐劑或其組合。本文提供的任何問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌或本文提供的包含一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌的任何免疫原性組合物可以用作藥物，優(yōu)選作為疫苗或免疫原性組合物，最優(yōu)選用于預(yù)防或治療針對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的受試者。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本文使用的組合物可與已知的可注射的、生理上可接受的無菌溶液混合。為了制備對于非經(jīng)腸注射或滴注可隨時使用的溶液，可使用水性等滲溶液，如生理鹽水或血漿蛋白溶液。此外，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑、等滲劑、穩(wěn)定劑或佐劑。本發(fā)明還提供用于在受試者中防止博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、減少其發(fā)病率、和/或減輕其嚴(yán)重程度的方法以及本發(fā)明的組合物的用途，其包括向受試者施用免疫原性組合物或疫苗，其中所述的免疫原性組合物或疫苗包含問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)。本發(fā)明的方法以及本發(fā)明的組合物的用途，其包括但不限于，用于在受試者中針對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法或用途，包括向受試者施用包含一種或多種本文所定義的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌的免疫原性組合物的步驟。優(yōu)選地，所引發(fā)的免疫應(yīng)答抵御一種以上的博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)血清型或菌株。本發(fā)明的組合物可用于治療或者預(yù)防博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染。優(yōu)選地，這樣的免疫應(yīng)答降低由一種或多種博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)血清分型感染引起的或與其相關(guān)的一種或多種臨床癥狀的發(fā)生率或嚴(yán)重程度。本文中，需要施用本發(fā)明的組合物的合適的受試者包括需要預(yù)防或治療病毒、微生物、寄生蟲、原生動物、細(xì)菌或真菌的相關(guān)感染、疾病、或狀況的動物和人類。通過使用本發(fā)明的組合物或方法刺激免疫應(yīng)答的的動物包括家畜，例如豬、牛、家禽(例如雞、鴨、鵝、或火雞)、山羊、綿羊、和馴養(yǎng)動物，例如小鼠、兔、狗、貓和馬。優(yōu)選的動物包括牛，最優(yōu)選奶牛和小母牛。本發(fā)明還提供降低由博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染引起的或與其相關(guān)的一種或多種臨床癥狀的發(fā)生率或嚴(yán)重程度的方法以及本發(fā)明的組合物的用途，其包括施用本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟，所述組合物包含一種或多種如本文所述的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌和優(yōu)選地載劑分子，使得相對于未獲得本文所述的免疫原性組合物的受試者而言，博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的臨床癥狀的發(fā)生率或嚴(yán)重程度降低至少10%，優(yōu)選至少20%，進一步更優(yōu)選至少30%，進一步更優(yōu)選至少50%，還更優(yōu)選至少70%，和最優(yōu)選100%。根據(jù)進一步的方面，本發(fā)明還涉及預(yù)防博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的方法以及本發(fā)明的組合物的用途，其包括施用本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟，所述組合物包含一種或多種本文所述的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)。本發(fā)明的另一個方面提供生產(chǎn)一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌誘導(dǎo)針對至少一種博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)血清型，和更優(yōu)選兩種或多種博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)血清型的免疫應(yīng)答。該方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的表達載體，所述載劑編碼并表達一種或多種本文所述的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌。表達的細(xì)菌或被表達生物保留，或分泌到培養(yǎng)基中。表達在足以產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)免疫應(yīng)答的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌的條件下進行。制備本發(fā)明的組合物的方法還可以進一步包括混合一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌和具有生理上可接受的媒劑，如藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑、佐劑、或其組合的載劑分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，可通過遞送路線、個人喜好和動物物種確定媒劑、佐劑或其組合的選擇。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種診斷受試者中博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的方法，以及本發(fā)明的組合物的用途。方法和用途包括：提供一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌；將一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌與獲得自受試者的樣品接觸；并且如果在樣品中檢測到能夠結(jié)合一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌的抗體，則確定受試者具有博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染。本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含免疫原性組合物、包裝免疫原性組合物的容器、一組印刷說明書、和能夠給動物施用免疫原性組合物的分配器(dispenser)，所述免疫組合物包含一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌，以及任選地一種載劑分子。任選地，所述一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌和載劑分子可以包裝在一起，或作為單獨的組分包裝。當(dāng)單獨提供時，提供混合或結(jié)合所述一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌和載劑分子的裝置，以及合適的印刷說明書。本發(fā)明還提供用于免疫接種動物的試劑盒，其包含：一組印刷說明書；能夠給動物施用本文所述的包含一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌的免疫原性組合物的分配器；且其中至少一種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌有效地免疫動物，使其抵御至少一種與博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染相關(guān)的疾病。優(yōu)選地，所述一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌選自本文提供的細(xì)菌。本發(fā)明的試劑盒可進一步包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑、佐劑、或其組合。本發(fā)明的試劑盒中的分配器能夠?qū)⑵鋬?nèi)容物分散為液滴；當(dāng)給動物皮下、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、或肌內(nèi)注射施用時，包含在試劑盒中的包含本文所述的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌的免疫原性組合物能夠降低博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的至少一種臨床癥狀的嚴(yán)重程度。優(yōu)選地，與未處理的受感染動物相比，將臨床癥狀的嚴(yán)重程度降低至少10%，進一步更優(yōu)選至少20%，進一步更優(yōu)選至少30%，進一步更優(yōu)選至少50%，還更優(yōu)選至少70%，并最優(yōu)選100%。同樣公開了本發(fā)明的組合物用于治療或預(yù)防博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)引起的感染的方法和用途。所述方法和用途包括向受試者施用有效量的一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌，其中所述治療或預(yù)防選自：減輕博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的癥狀，減少博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的臨床癥狀的嚴(yán)重程度或發(fā)生率，降低博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的個體死亡率，及其組合。本發(fā)明的組合物進一步包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑、佐劑、或其組合。這樣的組合物可以用作疫苗并包括減毒疫苗、滅活疫苗、或其組合。這類疫苗針對至少一種與博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染有關(guān)的疾病或臨床癥狀引起保護性免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文使用的組合物可與已知的可注射的、生理上可接受的無菌溶液混合。為了制備對于非經(jīng)腸注射或滴注可隨時使用的溶液，液體等滲溶液，如生理鹽水或血漿蛋白溶液，均可使用。此外，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑、等滲劑、穩(wěn)定劑或佐劑。本發(fā)明的方法和用途也可以包括將本發(fā)明的組合物與獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑、佐劑、或其組合混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，可通過遞送路線、個人喜好和動物物種確定載劑、佐劑或其組合的選擇。本發(fā)明還提供一種用于降低動物中博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染嚴(yán)重程度的方法或用途，其包括對動物施用包含一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌的組合物。同樣公開了用于治療或預(yù)防博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)引起的感染的方法，以及本發(fā)明的組合物的用途。所述方法包括對動物施用有效量的本發(fā)明的一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌。優(yōu)選的施用途徑包括皮下、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、和肌內(nèi)注射。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明的組合物也可以兩種或多種劑量施用，以及通過其他施用途徑施用。例如，這樣的其它途徑包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、血管內(nèi)、動脈內(nèi)、腹腔、鞘內(nèi)、氣管、心內(nèi)、小葉內(nèi)、髓內(nèi)、肺內(nèi)、或陰道內(nèi)。根據(jù)所需的持續(xù)時間和治療效果，本發(fā)明的組合物可以一次或數(shù)次施用，也可間歇地施用，例如持續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月施用并以不同的劑量施用。本發(fā)明還提供用于接種動物的試劑盒，其包含：一組印刷說明書；能夠給動物施用疫苗的分配器；和針對至少一種博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)相關(guān)疾病有效地免疫動物的至少一種滅活的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)細(xì)菌。本發(fā)明的試劑盒可進一步包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑、佐劑、或其組合。本發(fā)明的試劑盒的分配器能夠?qū)⑵鋬?nèi)容物分散為液滴；當(dāng)給動物鼻內(nèi)、口服、真皮內(nèi)、或肌內(nèi)注射施用時，包含在試劑盒中的分離物能夠降低博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的至少一種臨床癥狀的嚴(yán)重程度。在某些試劑盒中，分離物還能夠降低博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的至少一種臨床癥狀的嚴(yán)重程度。優(yōu)選地，與未處理的受感染動物相比，將臨床癥狀的嚴(yán)重程度降低至少10%。本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢將從下面的詳細(xì)描述體現(xiàn)。然而，應(yīng)該理解，雖然給出了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但詳細(xì)描述和具體實施例僅以說明的方式給出，因為從這樣的詳細(xì)描述出發(fā)，在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的各種改變和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過免疫接種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)防止博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、減少其發(fā)病率、和/或減輕其嚴(yán)重程度的免疫原性組合物、疫苗、相關(guān)方法和用途。本發(fā)明證明了兩種不同的組合疫苗的LHP組分抵御LHB攻擊(challenge)的能力。攻擊后培養(yǎng)結(jié)果表明疫苗治療組(組1和2，實施例1)中接種的小母牛，作為攻擊的結(jié)果均未被感染(見表2和6，實施例1)。這些結(jié)果與安慰劑對照接種的動物(100%的小母牛被感染(見表2、3和5，實施例1))形成了鮮明的對比。與本文報道的結(jié)果相反，以往的研究報道指出，當(dāng)用LHB攻擊接種后的動物時，含有LHP的疫苗針對尿液釋出或腎感染沒有表現(xiàn)出良好的保護。用于制備疫苗的哈勒焦血清型的細(xì)微差別可能部分地導(dǎo)致這種疫苗提供的保護水平。這種差別可能包括原始分離物的差異，以及基于生長和傳代方法引起的差異。在本領(lǐng)域中能夠理解，疫苗提供的保護水平不僅依賴于疫苗中包含的生物體的血清型/菌株的特性，而且還依賴于疫苗制劑中使用的佐劑，如果有的話。本文中，使用的疫苗包括佐劑。此外，用于生產(chǎn)菌株的生長和失活條件也可以影響疫苗所提供的功效。血清型差異加上佐劑制劑和產(chǎn)生疫苗的生物可以影響疫苗誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的能力。任何或所有這些因素結(jié)合在一起可能會導(dǎo)致他人先前的失敗和本發(fā)明的成功。接種經(jīng)修飾的活病毒/LHP菌素組合和滅活病毒/LHP菌素組合均防止尿液釋出，并阻止LHB攻擊后的腎臟感染和定居(clonization)。本研究的結(jié)果顯示測試疫苗的哈勒焦型鉤端螺旋體組分高度有效地抵抗腎感染以及由于LHB引起的定居和相關(guān)的尿液釋出。本發(fā)明的實踐中，除非另有說明，采用本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)的常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、蛋白化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中均有完整的解釋。例如，參見Sambrook，F(xiàn)ritsch&Maniatis，MolecularCloning:ALaboratoryManual，Vols.I，IIandIII，SecondEdition(1989)；DNACloning，Vols.IandII(D.N.Glovered.1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait等，1984)；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；AnimalCellCulture(R.K.Freshneyed.1986)；ImmobilizedCellsandEnzymes(IRLpress，1986)；Perbal，B.，APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)；theseries，MethodsInEnzymology(S.Colowick和N.Kaplaneds.，AcademicPress，Inc.)；Proteinpurificationmethods–apracticalapproach(E.L.V.Harris和S.Angal，eds.，IRLPressatOxfordUniversityPress)；和HandbookofExperimentalImmunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwelleds.，1986，BlackwellScientificPublications)。在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限定于特定的細(xì)菌培養(yǎng)物或工藝參數(shù)，這些當(dāng)然會發(fā)生變化。也應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語僅是用于描述本發(fā)明特定的實施例的目的，并不打算進行限制。必須指出的是，如在本說明書和所附的權(quán)利要求書中所用的，單數(shù)形式“一”、“一個”、“一種”包括復(fù)數(shù)對象，除非文中另有明確規(guī)定。因此，例如，“疫苗”的含義包括兩種或多種抗原的混合物，“免疫原性組合物”的含義包括兩種或兩種以上免疫原性疫苗成分的混合物，等等。A.定義除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與提交申請時本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的技術(shù)人員的通常理解具有相同的含義。術(shù)語的含義和范圍應(yīng)清楚，然而，在有任何潛在歧義的情況下，本文提供的定義優(yōu)先于任何字典或外在的定義。此外，除非上下文另有規(guī)定，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)而復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。本文中，使用“或”是指“和/或”，除非另有說明。此外，使用的術(shù)語“包括”以及其他形式(如“含有”和“包含”)不是限制性的。本文提及的所有專利和出版物均引入本文作為參考?！胺乐辜膊　?、“保護性免疫”，“功能性免疫”和類似的短語，是指通過施用本發(fā)明的一種或多種治療性組合物或其組合所產(chǎn)生的對疾病或病癥的應(yīng)答，其導(dǎo)致比在已暴露于疾病或感染而未進行免疫的個體中所預(yù)期的更少的有害影響。即，在接種的個體中感染的有害影響的嚴(yán)重程度減輕了。在接種的個體中，感染可能會降低、減慢、或可能完全防止。本文中，當(dāng)完全預(yù)防感染時將會具體聲明。如果未聲明完全預(yù)防，則該術(shù)語包括部分預(yù)防。本文中，“臨床癥狀發(fā)病率和/或嚴(yán)重程度的降低”或“臨床癥狀的減少”是指(但不限于)與野生型感染相比在一組中感染者的數(shù)量減少，表現(xiàn)出感染的臨床癥狀的個體的數(shù)目減少或消除，或在一個或多個個體中存在的任何臨床癥狀的嚴(yán)重程度的減少。例如，它應(yīng)該是指病原體載量、病原體釋出的任何減少、病原體傳播的減少，或瘧疾的任何臨床癥狀的減少。優(yōu)選地，與不接受組合物進而被感染的受試者相比，在接受本發(fā)明的治療組合物的一個或多個的受試者中這些臨床癥狀減少至少10%。更優(yōu)選在接受本發(fā)明的組合物的受試者中臨床癥狀減少至少20%，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%，和進一步更優(yōu)選至少50%。在本文中，術(shù)語“增加的保護”是指(但不限于)與非接種對照組的受試者相比，接種組受試者中與感染性病原體(優(yōu)選博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型))，引起的感染有關(guān)的一種或多種臨床癥狀在統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低。術(shù)語“臨床癥狀在統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低”是指(但不限于)在傳染性病原體攻擊后，在接種組受試者中至少一種臨床癥狀的發(fā)生頻率低于未接種對照組至少10%，優(yōu)選20%，更優(yōu)選30%，進一步更優(yōu)選50%，和進一步更優(yōu)選70%?！俺志玫谋Ｗo”是指“提高的效力”持續(xù)至少3周，但更優(yōu)選至少3、4、5、6或7個月，還更優(yōu)選8、9、10、11、或12個月，還更優(yōu)選13、14、15、16、17、或18個月，最優(yōu)選19個月或更長的時間。對于家畜而言最優(yōu)選的是，持久的保護將繼續(xù)到銷售動物肉的平均年齡。在小母?；蚰膛５那闆r下最優(yōu)選的是持久的保護應(yīng)繼續(xù)到動物不再生育并被銷售的平均年齡?！懊庖咴越M合物或免疫組合物”是指包含至少一種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)或其免疫原性部分的組合物，其在宿主內(nèi)針對該組合物引起細(xì)胞免疫應(yīng)答或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并且，更優(yōu)選地，賦予針對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染引起一種或多種臨床癥狀的保護性免疫?！懊庖邞?yīng)答”或“免疫學(xué)反應(yīng)”是指(但不限于)響應(yīng)于組合物或疫苗而產(chǎn)生的細(xì)胞免疫和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，免疫應(yīng)答或免疫學(xué)反應(yīng)包括(但不限于)一種或多種以下效應(yīng)：特異性針對包括在感興趣的組合物或疫苗中的抗原，產(chǎn)生或激活抗體、B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主將增強治療性或保護性免疫(記憶)反應(yīng)，使得抵御新感染和/或降低疾病的臨床嚴(yán)重程度。將通過癥狀數(shù)目、癥狀的嚴(yán)重程度的降低，或與病原感染相關(guān)的癥狀中的一種或多種的去除，病毒血癥發(fā)作的延遲，病毒持續(xù)感染的減少，整體病毒載量的降低和/或病毒排出的減少證明這種保護作用。本文中，“特異性免疫應(yīng)答性”是指免疫應(yīng)答性蛋白或多肽能夠識別博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的抗原特性，但不與嚴(yán)歷攻擊對照的抗原特性發(fā)生反應(yīng)。如本文使用的，“藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載劑”包括任何以及所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑、及類似物。在一些優(yōu)選的實施方案中，尤其是包括冷凍干燥的免疫原性組合物的那些實施方案中，用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑包括凍干或冷凍干燥的穩(wěn)定劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含佐劑。本文使用的“佐劑”可包括氫氧化鋁和磷酸鋁、皂苷、例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.，CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液可以特別是基于輕質(zhì)液體石蠟油(歐洲藥典型)；異戊二烯油，如角鯊?fù)榛蚪酋徬?；烯烴(特別是異丁烯或癸烯)低聚產(chǎn)生的油；包含直鏈烷基的酸或醇的酯，更特別是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸/癸酸)酯、甘油三(辛酸/癸酸)酯或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，特別是異硬脂酸酯。將油與乳化劑聯(lián)合使用以形成乳液。乳化劑優(yōu)選的是非離子型表面活性劑，特別是脫水山梨醇、二縮甘露醇(例如油酸脫水甘露醇酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇的酯和任選乙氧基化的油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯，和聚氧丙烯-聚氧乙烯聚合物，特別是普朗尼克(Pluronic)產(chǎn)品，特別是L121。參見Hunter等，TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Ed.Stewart-Tull，D.E.S.)，JohnWiley和Sons，NY，pp51-94(1995)和Todd等，Vaccine15:564-570(1997)。典型的佐劑是“VaccineDesign，TheSubunitandAdjuvantApproach”M.Powell和M.Newman編輯，PlenumPress，1995，第147頁描述的SPT乳液和同一本書第183頁描述的MF59乳液。佐劑的其他實例是選自以下的化合物：丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，和馬來酸酐與鏈烯基衍生物的共聚物。有利的佐劑化合物是交聯(lián)的，特別是與糖醇或多元醇的聚烯醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。這些化合物已知的術(shù)語為卡波姆(carbomer)(PhameuropaVol.8，No.2，June1996)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以參考美國專利第2,909,462號，其描述了這樣的與多羥基化合物交聯(lián)的丙烯酸聚合物，所述多羥基化合物具有至少3個羥基(優(yōu)選不超過8個)，所述至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂肪族基團取代的。優(yōu)選的基團是那些含有2-4個碳原子，例如乙烯基、烯丙基和其它烯類不飽和基團。不飽和基團可以自身含有其它取代基，如甲基。商品名為卡波普(Carbopol；BFGoodrich，Ohio，USA)的產(chǎn)品是特別合適的。它們是與烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián)的。其中，可提及的有卡波普974P、934P和971P。最優(yōu)選的是使用卡波普971P。在馬來酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是馬來酸酐和乙烯的共聚物。這些聚合物在水中的溶解產(chǎn)生酸性溶液，其需要中和，優(yōu)選中和到生理pH條件，以得到合并有免疫原性、免疫學(xué)或疫苗組合物的佐劑溶液。其他合適的佐劑包括(但不限于)RIBI佐劑系統(tǒng)(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)、SAF-M(Chiron，EmeryvilleCA)、單磷脂酰脂質(zhì)A、阿夫立定脂質(zhì)-胺佐劑、來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定的腸毒素(重組或非重組)、霍亂毒素、IMS1314或胞壁酰二肽、或者天然存在或重組的細(xì)胞因子或其類似物或內(nèi)源性細(xì)胞因子釋放的刺激物，等等。據(jù)預(yù)計，每劑量可以添加佐劑的量為約100μg至約10mg，優(yōu)選的量為每劑量約100μg至約10mg，更優(yōu)選的量為每劑量約500μg至約5mg，進一步更優(yōu)選的量為每劑量約750μg至約2.5mg，最優(yōu)選的量為每劑量約1mg。另外，佐劑在最終產(chǎn)品體積中的濃度可為0.01-50%，優(yōu)選在約2%-30%，更優(yōu)選在約5%-25%，還更優(yōu)選在約7%-22%，最優(yōu)選在約10%-20%。稀釋劑可以包括水、生理鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。等滲劑包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖等。穩(wěn)定劑包括白蛋白和乙二胺四乙酸的堿鹽等?！鞍踩笔侵附臃N后在接種疫苗的動物中沒有不良后果，所述不良后果包括但不限于：細(xì)菌為基礎(chǔ)的疫苗向毒力的潛在逆轉(zhuǎn)，臨床上顯著的副作用，如持續(xù)性、全身性疾病，或疫苗接種部位不可接受的炎癥。如本文使用的術(shù)語“接種”或“疫苗接種”或它們的變體，是指(但不限于)包括施用本發(fā)明的免疫原性組合物的過程，當(dāng)給動物施用所述組合物時，在動物中針對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)直接或間接地引發(fā)或者能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的內(nèi)容中，“死亡”是指博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染導(dǎo)致的死亡，并包括感染是如此嚴(yán)重以致將動物安樂死以防止痛苦并人道地結(jié)束其生命的情況?！皽p毒”是指減少病原體的毒力。在本發(fā)明中“減毒”與“無毒”是同義的。在本發(fā)明中，減毒的細(xì)菌是已經(jīng)將其毒力降低使其不會引起鉤端螺旋體病的臨床癥狀，但能夠在目標(biāo)哺乳動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)菌，但也可指：與經(jīng)非減毒的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)感染并且不接受減毒細(xì)菌感染的“對照組”動物相比，減毒的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)感染的動物中的臨床癥狀的發(fā)病率和嚴(yán)重程度有所降低。在此內(nèi)容中，與上文定義的對照組相比，術(shù)語“減少/減少的”是指減少至少10%，優(yōu)選25%，進一步更優(yōu)選50%，還更優(yōu)選60%，進一步更優(yōu)選70%，還更優(yōu)選80%，進一步更優(yōu)選90%和最優(yōu)選100%。因此，減毒的、無毒力的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)菌株適于摻入包含問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)經(jīng)修飾的活細(xì)菌的免疫原性組合物中。在本文中，“有效劑量”是指(但不限于)在施用抗原的動物中誘發(fā)或者能夠誘發(fā)使臨床癥狀減少的免疫應(yīng)答的抗原的量。如本文使用的術(shù)語“有效量”是指，在組合物的內(nèi)容中，能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫原性組合物的量，所述免疫應(yīng)答在動物中降低感染的發(fā)生率、減輕感染的嚴(yán)重程度或降低疾病的發(fā)生率。特別是，有效量是指每劑量的菌落形成單位(CFU)?；蛘撸谥委煹膬?nèi)容中，術(shù)語“有效量”是指這樣的治療量：足夠減少或改善疾病或病癥或其一種或多種癥狀的嚴(yán)重程度和持續(xù)時間，防止疾病或病癥的進展，引起疾病或病癥的消退，防止與疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的復(fù)發(fā)、發(fā)展、發(fā)病或進展，或增強或改善另一種治療或治療劑的預(yù)防或治療。如本文使用的術(shù)語“對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)的免疫反應(yīng)性”是指肽或片段針對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)引發(fā)的免疫應(yīng)答。B.佐劑為了進一步提高本文提供的免疫原性組合物的免疫原性，包含一種或多種問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)的組合物可以還包含一種或多種佐劑。佐劑可通過先前描述的或本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進行純化。優(yōu)選的純化技術(shù)是硅膠色譜法，特別是如W.ClarkStill等，J.OrganicChemistry，43，2923-2925(1978)描述的“閃式”(快速)色譜技術(shù)。然而，其他色譜方法，包括HPLC，可用于佐劑純化。結(jié)晶該也可用于純化佐劑。在某些情況下，因為分析純的產(chǎn)品是直接從合成得到，故無需純化。本發(fā)明的疫苗組合物是在適當(dāng)?shù)臒o菌條件下，根據(jù)產(chǎn)生佐劑組合物的已知技術(shù)，通過將佐劑與問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)物理混合制備。結(jié)合物上存在凈負(fù)電荷以被靜電吸引到長鏈烷基化合物佐劑的正電荷上，促進了問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)與佐劑的絡(luò)合。據(jù)預(yù)計，可以添加佐劑的量為每劑量約100μg至約10mg，優(yōu)選的量為每劑量約100μg至約10mg，更優(yōu)選的量為每劑量約500μg至約5mg，進一步更優(yōu)選的量為每劑量約750μg至約2.5mg，最優(yōu)選的量為每劑量約1mg。另外，佐劑在最終產(chǎn)品體積中的濃度可為0.01-75%的濃度，優(yōu)選在約2%-30%的濃度，更優(yōu)選在約5%-25%的濃度，還更優(yōu)選在約7%-22%的濃度，最優(yōu)選在約10%-20%的濃度。C.生理上可接受的媒劑可以使用那些用于其他藥物多肽組合物的類似的技術(shù)配制本發(fā)明的疫苗組合物。因此，佐劑和問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)可以凍干形式儲存并于施用前在生理上可接受的媒劑中重組以形成懸浮液?；蛘?，佐劑和偶聯(lián)物可存儲在媒劑上。優(yōu)選的媒劑是無菌溶液，特別是無菌緩沖溶液，如磷酸鹽緩沖液。結(jié)合媒劑上的佐劑和偶聯(lián)物，使得免疫原性組合物的免疫效果改進的任何方法都是適用的。本發(fā)明的疫苗的單劑量的體積可以變化，但通常將在常規(guī)疫苗常用的范圍內(nèi)。以如上所述的偶聯(lián)物和佐劑的濃度，單劑量的體積優(yōu)選是在約0.1ml至約3ml之間，優(yōu)選在約0.2ml至約1.5ml之間，更優(yōu)選在約0.2ml至約0.5ml之間?？梢酝ㄟ^任何方便的、合適的方式施用本發(fā)明的疫苗組合物。D.制劑可以將包含問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)的免疫原性組合物用作針對博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)進行免疫的疫苗。在生理上可接受的媒劑中包含免疫原性組合物的疫苗在免疫動物，優(yōu)選牛，優(yōu)選奶牛，最優(yōu)選小母牛，以治療或預(yù)防博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的方法中是非常有用的。通過用免疫原性組合物免疫而產(chǎn)生的針對本發(fā)明的免疫原性組合物的抗體，可以用于被動免疫治療，并用于產(chǎn)生治療或預(yù)防博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的抗個體基團抗體。施用組合物的受試者優(yōu)選是動物，包括但不限于牛、馬、羊、豬、家禽(例如雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠和大鼠，最優(yōu)選動物是奶?；蛐∧概?。本發(fā)明的制劑包含有效免疫量的一種或多種免疫原性組合物或其抗體和生理上可接受的媒劑。疫苗包含有效免疫量的一種或多種免疫原性組合物和生理上可接受的媒劑。制劑應(yīng)適應(yīng)于施用方式。如果需要的話，免疫原性組合物也可以包含少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。免疫原性組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑、或粉末?？诜苿┛砂瑯?biāo)準(zhǔn)的載劑，例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。E.有效劑量本文所述的化合物可以以治療鉤端螺旋體相關(guān)疾病的治療有效劑量施用于受試者。劑量依賴于接受疫苗的宿主以及例如宿主的體型、體重和年齡等因素。應(yīng)用于制劑的本發(fā)明的免疫原性偶聯(lián)物或抗體的精確劑量依賴于施用途徑和受試者的性質(zhì)(例如，物種、年齡、體型、疾病的階段/水平)，并應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的臨床技術(shù)根據(jù)醫(yī)生的判斷和的每個受試者的情況決定。有效免疫量是在受試者中足夠治療或預(yù)防博氏鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染性疾病的量。有效劑量也可從來自于動物模型測試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線推斷，并可以在0.001mg/kg-100mg/kg之間變化?；衔锏亩拘院童熜Э赏ㄟ^在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏袠?biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序確定，例如LD50(群體的50%致死的劑量)和ED50(在群體的50%中治療有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，而且它可以表示為LD50/ED50之比。表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的化合物是首選的。雖然可以使用具有毒副作用的化合物，應(yīng)該謹(jǐn)慎設(shè)計一種遞送系統(tǒng)，所述系統(tǒng)使這樣的化合物靶向到受影響的組織位點以減少對未感染細(xì)胞的潛在損害并且由此減少副作用。從細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用來制定用于動物，特別是牛的劑量范圍。這樣的化合物的劑量優(yōu)選在包括很少或沒有毒性的ED50的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可以根據(jù)使用的劑型和施用途徑在此范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明的方法中使用的任何化合物，可從細(xì)胞培養(yǎng)測定初步估計治療有效劑量?？梢栽趧游锬Ｐ椭信渲苿┝恳詫崿F(xiàn)包括細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC50(即，獲得半-最大癥狀抑制的測試化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這樣的信息可以用于更準(zhǔn)確地確定受試者的有效劑量?？梢詼y量在血漿中的水平，例如通過高效液相色譜法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何免疫測定方法，通過監(jiān)測測試受試者免疫接種組合物后的免疫應(yīng)答測定組合物的免疫原性。可將體液(抗體)應(yīng)答和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的產(chǎn)生作為免疫應(yīng)答的指示。測試受試者包括動物，如豬、小鼠、倉鼠、狗、貓、兔、牛、馬、羊、家禽(如雞、鴨、鵝、火雞）、和人類?？梢酝ㄟ^各種辦法測試受試者的免疫應(yīng)答，例如：如通過已知的技術(shù)，例如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫印跡、免疫沉淀等，分析所得到的免疫血清對免疫原性結(jié)合物的反應(yīng)性；或通過免疫的宿主由本領(lǐng)域已知的任何方法抵御病原體感染和/或使病原體感染引起的癥狀減輕，以此測定感染性疾病病原體的水平，例如細(xì)菌水平(例如通過來自受試者的樣品的培養(yǎng))，或通過本領(lǐng)域中已知的其它技術(shù)測定。傳染性疾病病原體的水平也可通過測量免疫球蛋白所針對抗原的水平來確定。傳染性疾病病原體水平的降低或感染性疾病癥狀的改善表明組合物是有效的?？梢栽趧游锘蛉梭w內(nèi)使用之前，在體外測試本發(fā)明的治療劑所期望的治療或預(yù)防活性。例如，可用于確定是否施用一種特定治療劑的體外分析可以包括體外細(xì)胞培養(yǎng)分析，在此分析中，將適當(dāng)細(xì)胞(細(xì)胞系或從具有特定的疾病或病癥的受試者培養(yǎng)而來的細(xì)胞)暴露于治療劑或者對其施用治療劑，并觀察治療劑對細(xì)胞的影響。另外地，可以通過使治療劑接觸細(xì)胞，所述細(xì)胞易于傳染性疾病病原體感染但沒有感染傳染性疾病病原體(從受試者或從培養(yǎng)的細(xì)胞株培養(yǎng)該細(xì)胞)，將細(xì)胞暴露于傳染病病原體，然后確定與治療劑接觸的細(xì)胞的感染率是否低于未與治療劑接觸的細(xì)胞的感染率。細(xì)胞感染傳染性疾病病原體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法測定。此外，可以通過在治療之前、期間或之后的合適的時間間隔，測量動物模型或人類受試者中抗體所針對分子的水平來評估治療?？梢源_定分子的量有無任何變化，并與受試者的治療結(jié)果相關(guān)聯(lián)。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法確定分子的水平。使用本發(fā)明的方法和組合物用問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)接種動物后，可用本領(lǐng)域已知的任何結(jié)合分析評估產(chǎn)生的抗體與特定分子之間的結(jié)合。這些分析方法也可以用來篩選對特定抗原表現(xiàn)出較高的親和力或特異性的抗體。F.檢測和診斷方法使用本發(fā)明的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)組合物產(chǎn)生的抗體或其結(jié)合部分，對于檢測樣品中鉤端螺旋體的存在是有用的。該檢測方法包括以下步驟：提供一種針對本發(fā)明的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)產(chǎn)生的分離的抗體或其結(jié)合部分，將分離的抗體或其結(jié)合部分加入到懷疑含有一定量鉤端螺旋體的樣品中，并檢測包含結(jié)合鉤端螺旋體的分離的抗體或其結(jié)合部分的復(fù)合物的存在。使用本發(fā)明的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)組合物產(chǎn)生的抗體或其結(jié)合部分，對于檢測樣品中鉤端螺旋體的存在也是有用的。該檢測方法包括以下步驟：提供一種針對本發(fā)明的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)產(chǎn)生的分離的抗體或其結(jié)合部分，將分離的抗體或其結(jié)合部分加入到懷疑含有一定量鉤端螺旋體的樣品中，并檢測包含結(jié)合鉤端螺旋體的分離的抗體或其結(jié)合部分的復(fù)合物的存在。如本文所述的，與結(jié)合對的成員的特定分子結(jié)合的免疫球蛋白，特別是抗體(及其功能活性片段)可用于診斷和預(yù)測。在各種實施方式中，本發(fā)明提供了結(jié)合對的成員的測量，以及這樣的測量在臨床應(yīng)用中的用途。本發(fā)明中的免疫球蛋白可用于例如檢測生物樣品中的抗原，其中檢測受試者免疫球蛋白所結(jié)合分子的異常水平，和/或檢測這樣的分子的異常形式的存在。所謂“異常水平”是指相對于來自身體的一部分或不具有該疾病的受試者的類似的樣品中存在的水平，或代表性的標(biāo)準(zhǔn)水平增加或減少。本發(fā)明的抗體也可以作為試劑包括在用于診斷或預(yù)后技術(shù)的試劑盒中。在一個方面中，使用本發(fā)明的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)組合物所產(chǎn)生的特異性地結(jié)合鉤端螺旋體的抗體可用于診斷、預(yù)測或篩選鉤端螺旋體感染。在另一個方面中，本發(fā)明提供一種診斷或篩選鉤端螺旋體感染或?qū)ζ涞拿庖呤欠翊嬖诘姆椒?，包括測定受試者中對于來自受試者樣品的抗體的免疫特異性結(jié)合水平(該抗體在受試者中免疫特異性地結(jié)合鉤端螺旋體肽)，其中相對于來自不具有感染性疾病病原體的受試者的類似樣品中的免疫特異性結(jié)合的水平，若免疫特異性結(jié)合水平的增加，則表明存在豬鏈球菌(S.suis.)。檢測鉤端螺旋體肽或其拮抗劑存在的合適的檢測的實例包括但不限于ELISA、放射免疫分析、凝膠擴散沉淀反應(yīng)試驗、免疫擴散試驗、凝集試驗、熒光免疫分析、蛋白A免疫分析、或免疫電泳分析。對特定分子的免疫分析通常包括在可檢測的標(biāo)記抗體的存在下培育樣品，例如生物體液、組織提取物、新鮮收獲的細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞的溶解物，并通過任何一種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)檢測結(jié)合的抗體。給定的抗體的結(jié)合活性可根據(jù)公知的方法來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過采用常規(guī)實驗來確定每次測定的操作和最佳檢測條件。本發(fā)明的另一個方面涉及用于檢測或測量LHB的診斷試劑盒。提供了診斷用的試劑盒，其在一個或多個容器中包含抗-問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)抗體，以及該抗體的任選一種標(biāo)記的結(jié)合配偶體?；蛘撸隹?問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)抗體可以是標(biāo)記的(用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記，例如化學(xué)發(fā)光、酶、熒光或放射性部分)。因此，本發(fā)明提供了一種包含抗-問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)抗體和對照免疫球蛋白的診斷試劑盒。在一個特定實施方式中，容器的一種上述化合物可被可檢測地標(biāo)記。試劑盒可以任選地進一步在容器中包含預(yù)定量的問號鉤端螺旋體哈勒焦血清型(hardjoprajitno型，其由該試劑盒的抗體識別)，用于作為標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ铡.對受試者的施用優(yōu)選的施用途徑包括但不限于血管內(nèi)和肌內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到本發(fā)明的組合物也可以一種、兩種或更多種劑量施用，以及通過其他的施用途徑施用。例如，這樣的其他途徑包括口服、真皮內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)、氣管內(nèi)、心內(nèi)、小葉內(nèi)、髓內(nèi)、肺內(nèi)、和陰道內(nèi)。根據(jù)所需的持續(xù)時間和治療效果，本發(fā)明的組合物可以以一次或數(shù)次施用，也可間歇地，例如基于天數(shù)以數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月并以不同的劑量施用。包括下面的實施例以闡明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是實施方案中公開的技術(shù)是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)以在本發(fā)明的實踐中發(fā)揮良好作用，而因此可以被認(rèn)為是構(gòu)成其實踐的優(yōu)選模式。然而，在本公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明白在所披露的具體實施方案中可以進行許多改變而在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，仍能獲得相同或類似的結(jié)果。實施例材料與方法動物：所有涉及牛的程序已經(jīng)獲得RuralTechnologiesIncorporated(RTI)動物關(guān)愛及使用委員會(AnimalCareandUseCommittee)的批準(zhǔn)。疫苗接種前10天，55只6月齡荷斯坦(Holstein)小母牛到達干燥的飼養(yǎng)場中。所有的動物是健康的，無鉤端螺旋體疫苗接種史，且在鉤端螺旋體顯微鏡凝集試驗(MAT)血清學(xué)檢測中對6種鉤端螺旋體血清型(波莫納型、哈勒焦型、流感傷寒型、布拉迪斯拉發(fā)型(brataslava)、犬型和出血黃疸型)呈血清學(xué)陰性。此外，所有55只動物通過免疫組化(IHC)檢測，耳缺口對牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)呈陰性。最初采購55只動物以確保至少50只動物可進行接種和攻擊部分的研究，以及2只動物用于攻擊材料的傳代。動物居住和喂養(yǎng)：到達后，動物群養(yǎng)在帶有150英尺(ft)混凝土雙層圍欄線的33,750平方英尺(sqft)的干燥多用設(shè)施中。攻擊前，將動物作為一組轉(zhuǎn)移到約4,080平方英尺大小的窩棚(hoopbarn)。窩棚設(shè)施提供100英尺的帶頭鎖的隔間，以及兩個自動飲水器。給所有動物喂食帶干草的與年齡適當(dāng)?shù)目诩Z并提供自由采食的水。此外，在工作的日子利用飼料吸引小母牛進入頭鎖。遮蔽(致盲)：進行攻擊后臨床評估的研究者和/或指定人不知道治療組所分配的個體。檢測血清、尿液和組織樣本的實驗室人員也不知道治療組的分配。動物登記、隨機分組、和動物觀察：初次接種前，治療組動物的分配遵循完全隨機的分布。使用Excel中提供的分析工具庫中的隨機數(shù)字生成器將小母牛分配到治療組。在第0天，將53只動物隨機分配到三個治療組(表1)。隨機選取兩只小母牛作為攻擊傳代動物。在研究結(jié)束時，利用之前所述的隨機數(shù)字生成器將登記的小母牛隨機分配到兩個剖檢日期之一。B.治療組在研究中使用下列病毒/菌素聯(lián)合疫苗(表1)：表1.治療組、動物數(shù)量和施用的疫苗劑量治療組1：施用的疫苗是由牛鼻氣管炎病毒性腹瀉-副流感3-呼吸道合胞病毒疫苗、經(jīng)修飾的活病毒，胎兒彎曲桿菌-鉤端螺旋體犬型-流感傷寒型-哈勒焦型-出血黃疸型-波莫納型菌素(許可市售的組合產(chǎn)品，5VL5，BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)組成的經(jīng)修飾的活病毒組合物產(chǎn)品。治療組2：施用的疫苗是由牛鼻氣管炎病毒性腹瀉-副流感3-呼吸道合胞病毒疫苗、滅活的病毒，胎兒彎曲桿菌-睡眠嗜血菌-鉤端螺旋體犬型-流感傷寒型-哈勒焦型-出血黃疸型-波莫納型菌素(未經(jīng)許可的實驗組合產(chǎn)品，BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)組成的滅活的病毒組合產(chǎn)品。治療組3：安慰劑接種的對照組是施用由牛鼻氣管炎病毒性腹瀉-副流感3-呼吸道合胞病毒疫苗(許可市售的組合產(chǎn)品，5，BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)組成的經(jīng)修飾的活病毒。用于治療組1和3的疫苗的產(chǎn)品是完全可得的市售產(chǎn)品。用于第2組的疫苗的產(chǎn)品是特定用于本研究中的實驗系列產(chǎn)品。所有的疫苗是通過皮下(SC)途徑施用。測試疫苗和安慰劑以二種劑量施用，如表1中所示的每次2或5mL，接種之間的時間間隔21天。所使用的測試疫苗配制成對于哈勒焦型鉤端螺旋體組分生物的最小免疫劑量。以等于或高于正常釋放劑量水平的量分批處理所有剩余的組分。動物健康檢查：在第0天，采集樣品之前由獸醫(yī)檢查所有動物并認(rèn)為是健康的。接種：如本文概述的在接種后(PV)第0和21天對治療組1、2和3的動物接種疫苗。未在任何動物中發(fā)現(xiàn)接種后的不良反應(yīng)。血樣采集：在第0、21、35、43、105、112、119、126、133、140、147、154和160天經(jīng)頸靜脈穿刺從所有動物采集血液樣本。日期和動物的識別(ID)號對管進行標(biāo)記，并返回實驗室進行處理。使樣品在室溫下凝結(jié)，以800×g離心15分鐘，然后分裝。微量凝集試驗(MAT)：如上所述處理血清樣品，并等分提交到南達科他大學(xué)動物疾病研究和診斷實驗室(SouthDakotaStateUniversityAnimalDiseaseResearchandDiagnosticLaboratory,SDSUADRDL)進行鉤端螺旋體MAT測試以確定對鉤端螺旋體犬型、流感傷寒型、哈勒焦型、出血黃疸型、布拉迪斯拉發(fā)型(bratislava)和波莫納型的抗體反應(yīng)。通過將已知的鉤端螺旋體活培養(yǎng)物加入等量的稀釋血清中并在反應(yīng)時間結(jié)束時顯微鏡觀察混合物的凝集，進行測試。終點滴度是表示至少50%測試孔中的鉤端螺旋體凝集的最高血清稀釋度?；赟DSUADRDLMAT程序，認(rèn)為>100的MAT終點滴度是陽性的。在哈勒焦型鉤端螺旋體MAT中使用了LHP菌株。尿液采集：在PV第0、105、112、119、126、133、140、147、154和160天從每只小母牛采集兩個50mL錐形瓶的尿液。在排尿中段采集樣本。給每只小母牛靜脈注射(IV)500mg呋塞米(Furosemide，VedcoInc.，St.Joseph，MO)后收集樣本。收集后，每個管形瓶的外部進行消毒，用動物的ID號標(biāo)記，并運送到RTI實驗室進行鉤端螺旋體培養(yǎng)。尿液培養(yǎng)：尿液樣本通過尿液培養(yǎng)用于檢測尿液中的鉤端螺旋體。簡而言之，將每只小母牛的1mL尿液在運送培養(yǎng)基中連續(xù)按1:10稀釋到10-2稀釋度。從每個稀釋度的100μL和300μL樣品體積接種到Ellis(80/40)培養(yǎng)基中并在29℃孵育長達兩個月。顯微鏡觀察培養(yǎng)物中鉤端螺旋體生長的跡象。呈現(xiàn)陽性生長的培養(yǎng)樣本通過暗視野顯微鏡確證為鉤端螺旋體。觀察2個月后沒有顯示出生長的培養(yǎng)物認(rèn)為是陰性的。腎培養(yǎng)：緊隨安樂死，從每個小母牛去除兩個腎臟。收集每份腎臟共約1cm2/1g組織的組織樣本。如果標(biāo)注了腎的可疑區(qū)域(以腎表面上凹陷的蒼白區(qū)域為特征)，則組織樣品從這些區(qū)域獲得。如果沒有見到可疑區(qū)域，則從每個腎臟隨機取樣。勻漿每個腎樣品，在生長培養(yǎng)基中稀釋腎勻漿并在29℃培養(yǎng)長達兩個月。顯微鏡觀察培養(yǎng)物中鉤端螺旋體生長的跡象。呈現(xiàn)陽性生長的培養(yǎng)樣本通過暗視野顯微鏡確證為鉤端螺旋體。觀察2個月后沒有顯示出生長的培養(yǎng)物認(rèn)為是陰性的。C.攻擊階段的產(chǎn)品動物：在PV研究的第25天，將用于生產(chǎn)攻擊接種物的兩只未經(jīng)治療的小母牛(編號為29和48)移到相同設(shè)施的一個單獨的建筑進行攻擊。將動物與剩余的組保持相同的口糧，并允許自由接近干草。水隨意供給。攻擊材料：用于攻擊的LHB菌株203最初獲得自國家動物疾病中心(NationalAnimalDiseaseCenter)，Ames，艾奧瓦州(Iowa)。該菌株之前已經(jīng)描述過。參見Bolin等，1989(a)；Bolin等，1989(b)；和Bolin等，1991。攻擊準(zhǔn)備：在PV研究的第25、26和27天攻擊兩只傳代小母牛。在每一攻擊日，用包含在1.0ml接種物中的約1.4×107個新鮮生長的LHB培養(yǎng)物眼內(nèi)攻擊每只小母牛。將動物限制在一個斜槽中并用籠頭保護頭部。通過向下拉動下眼瞼暴露結(jié)膜囊，從而眼內(nèi)攻擊動物。將體積0.5ml的攻擊材料滴入每個囊，一只眼睛一次，并且在給予攻擊材料后每個眼瞼保持關(guān)閉60秒。在第一次攻擊后第0、15、23、28、36、42和51天，從兩只傳代小母牛獲得血液和尿液樣本以跟蹤感染的進展。測試兩只動物的尿液樣本以確定生物體的存在。在攻擊后第三周開始和繼續(xù)直到尸檢的尿液中，48號小母牛的培養(yǎng)物呈鉤端螺旋體陽性。在攻擊后第六和第七周，29號小母牛的尿液培養(yǎng)物呈鉤端螺旋體陽性。在第一次攻擊后第51天，通過IV過量施用動物巴比妥類藥物(Euthanasia6Grain，VedcoInc.，St.Joseph，MO)人道安樂死29和48號動物。從動物身上取出腎臟并轉(zhuǎn)移到RTI實驗室進行處理并分離鉤端螺旋體。從48號小母牛的每個腎臟去除懷疑損傷的部位，將其稱重并勻漿，然后加入到培養(yǎng)基中。在29號小母牛腎臟上沒有發(fā)現(xiàn)可疑損傷，因此將隨機的部分稱重并勻漿，然后加入到培養(yǎng)基中。在生長培養(yǎng)基中稀釋腎組織勻漿并培養(yǎng)。如本文所述的，在與尿培養(yǎng)相同的條件下培養(yǎng)腎培養(yǎng)物。在剖檢時從小母牛＃48獲得腎臟樣本是培養(yǎng)陽性，而從小母牛＃29獲得的為陰性。將陽性腎培養(yǎng)物傳代到新鮮生長培養(yǎng)基中以產(chǎn)生攻擊接種物。每周檢查一次攻擊接種物以確定生物的生長和運動性。當(dāng)運動性高并可提供足夠進行全部研究的三次攻擊的培養(yǎng)物(包含約106生物每mL的1ml接種物)時，認(rèn)為可以攻擊接種。通過暗視野顯微鏡鑒定培養(yǎng)物作鉤端螺旋體。實施例1：在小母牛中接種和攻擊的有效性本研究目的在于評估市售五價聯(lián)合疫苗的LHP組分抵抗LHB毒力攻擊的有效性。有效性基于1)腎感染/定居的減少，2)攻擊菌株尿釋出的減少。治療包括經(jīng)修飾的活病毒(MLV)和菌素聯(lián)合疫苗(許可市售的組合產(chǎn)品，3VL5，BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.，St.Joseph)(治療組1)，滅活病毒菌素聯(lián)合疫苗(未許可的實驗組合產(chǎn)品，BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)(治療組2)，和使用不含鉤端螺旋體菌素(leptobacterin)的經(jīng)修飾的活病毒疫苗(許可市售的組合產(chǎn)品，5，BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)接種的的安慰劑對照組(治療組3)。基于剖檢時在尿液和腎組織中攻擊后生物體復(fù)原(organismrecovery)，通過比較接種和對照小母牛來確定有效性。為每個變量構(gòu)建阻止分?jǐn)?shù)(preventedfraction)和相應(yīng)的95%置信區(qū)間。A.操作接種：如本文概述的在接種后(PV)第0和21天對治療組1、2和3的動物接種疫苗。接種后未在任何動物中發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。攻擊：按照上文所述的兩只動物攻擊傳代階段之后，將LHB菌株203培養(yǎng)于RTI實驗室并用于攻擊。在PV第105、106、和107天，將新鮮材料用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)并分裝到3mL注射器中，各含有1mL的約106個鉤端螺旋體每mL的攻擊材料。此外，將攻擊后樣品返回RTI實驗室并在血細(xì)胞計數(shù)器上計數(shù)。如上所述，使用等分試樣眼內(nèi)攻擊治療組1、2和3中的小母牛。簡單而言，限制動物并通過向下拉動下眼瞼暴露結(jié)膜囊進行眼內(nèi)攻擊。將體積0.5ml的攻擊材料投進每個囊，一只眼睛一次。施用攻擊材料后將每個眼瞼保持關(guān)閉60秒。攻擊后觀察：從攻擊當(dāng)天直到剖檢日，每天一次觀察動物一般的臨床癥狀。血液和尿液樣品采集：恰好在攻擊之前和在攻擊后(DPC)7-55天每周一次經(jīng)頸靜脈穿刺從所有動物采集血液樣本。如上所述處理樣品，并將等分試樣提交到SDSUADRDL進行鉤端螺旋體MAT測試。DPC0-55天每周一次從每只動物采集兩個50mL錐形瓶的尿液。如上所述收集樣本。如上所述，通過培養(yǎng)將尿液樣本用于檢測尿中的鉤端螺旋體。動物處置和組織樣品采集：在PV第161和162天(DPC56和57天)，將動物(n=53)運送到SDSUADRDL進行剖檢并且采集組織樣品。在第161天將大約一半的小母牛隨機分配進行剖檢，并將另一半分配在第162天進行剖檢。通過IV注射巴比妥類藥物過量將動物人道安樂死。緊隨安樂死從每個尸體將兩個腎臟取出。從腎臟取出可疑損傷。如果沒有觀察到可疑損傷，從腎臟隨機取樣。將樣品稱重、勻漿，然后加入培養(yǎng)基中。如本文所述的，在與尿培養(yǎng)物相同的條件下培養(yǎng)腎培養(yǎng)物。統(tǒng)計學(xué)分析：將53只動物隨機分配到治療組，在治療組1和2中各有21只小母牛，在第3組(安慰劑對照組)中有11只動物。在PV第0天、PV第105天(DPC0天)、PV第112天(DPC7天)、PV第119天(DPC14天)、PV第126天(DPC21天)、PV第133天(DPC28天)、PV第140天(DPC35天)、PV第147天(DPC42天)、PV第154天(DPC49天)、PV第160天(DPC55天)評估尿液樣品的生物體復(fù)原。剖檢后評估腎組織樣本的生物體復(fù)原。阻止分?jǐn)?shù)用來比較接種組和對照組間尿液釋出和腎培養(yǎng)物的生物體復(fù)原。尿液釋出的生物體復(fù)原定義為(1)在研究期間至少存在一個陽性尿液培養(yǎng)物或(0)在任何研究天沒有陽性尿液培養(yǎng)物。腎組織樣品的生物體復(fù)原定義為(1)陽性腎培養(yǎng)物或(0)陰性腎培養(yǎng)物。估計的阻止分?jǐn)?shù)(pf)按照風(fēng)險比的補集計算，并且被定義為：pf=1-(y2/n2)/(y1/n1)/n1)，其中y2=在治療組中受影響的數(shù)目(“存在”或=1)，n2=治療組中的總數(shù)，y1=在對照組中受影響的數(shù)目(“存在”或=1)，和n1=對照組中的總數(shù)?；跇?biāo)準(zhǔn)化的統(tǒng)計學(xué)單側(cè)檢驗和反相單側(cè)檢驗，將8.0用于計算風(fēng)險比準(zhǔn)確的95%置信區(qū)間。阻止分?jǐn)?shù)的可信限是風(fēng)險比的可信限的補集，或[1-U，1-L]。報道了由8.0產(chǎn)生的相應(yīng)的雙側(cè)值。阻止分?jǐn)?shù)=0(Ho)的精確檢驗的p值與StatXact"提供的風(fēng)險比=1的精確檢驗的p值是相同的。當(dāng)阻止分?jǐn)?shù)與0.0%有顯著性差異(P<0.05)時，整個的95%置信區(qū)間大于0.0%。使用p-水平為0.05構(gòu)建所有的假設(shè)檢驗。在進行比較的組中，受影響的動物數(shù)量為零和接近零的值(數(shù)目“存在”或=1)可能會導(dǎo)致不穩(wěn)定的置信限和p值。B.結(jié)果微量凝集測試結(jié)果：在PV第0、21、35和43天從第1、2和3組中所有登記的小母牛抽取血液樣本進行MAT測試以確定對鉤端螺旋體犬型、流感傷寒型、哈勒焦型、出血黃疸型和波莫納型的抗體反應(yīng)。在對兩個接種組第二次接種后的第14和21天，在40%-75%的接種小母牛中對鉤端螺旋體犬型、流感傷寒型、出血黃疸型和波莫納型血清型檢測接種MAT后瞬時的血清學(xué)反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。僅在第二次接種后第14天，在不到24%的接種組中觀察到對L.hardjo的瞬時陽性MAT血清學(xué)反應(yīng)。攻擊當(dāng)天，所有未接種對照對所有血清型保持陰性。在DPC第0、7、14、21、28、35、42、49和55天從第1、2和3組中所有登記的小母牛抽取攻擊后血液樣本進行MAT測試，以確定對鉤端螺旋體犬型、流感傷寒型、哈勒焦型、出血黃疸型和波莫納型的抗體反應(yīng)。直到研究結(jié)束時，在所有動物中，對鉤端螺旋體犬型、流感傷寒型、出血黃疸型和波莫納型的攻擊后MAT抗體反應(yīng)仍為陰性。直到研究結(jié)束時，在所有第1和2組的接種小母牛中，對哈勒焦型鉤端螺旋體的攻擊后MAT結(jié)果保持陰性。然而，在第3組對照小母牛中，在DPC14天在11只動物的9只中、在DPC21天在所有11只動物中(100%)，攻擊后MAT抗體反應(yīng)是明顯的。在未接種對照中MAT峰滴度范圍為800(11只小母牛中的7只)到1600(11只小母牛中的4只)(數(shù)據(jù)未顯示)。尿液釋出結(jié)果：從接種的小母牛(第1和2組)收集的所有尿液樣本的所有攻擊前和攻擊后尿液培養(yǎng)物均呈鉤端螺旋體生長陰性(表2)。這與安慰劑對照小母牛(第3組)形成對比，安慰劑組中至少兩個攻擊后樣品(表3)100%具有尿液培養(yǎng)陽性(表2和3)。陽性培養(yǎng)物/小母牛范圍為2-6(表3)。在DPC21天在第3組安慰劑對照小母牛中首次發(fā)現(xiàn)尿液釋出，動物釋出的最高數(shù)目在DPC35和49天(表3)。表2.所有小母牛的攻擊后尿液結(jié)果的匯總組陽性小母牛數(shù)陰性小母牛數(shù)陽性百分比10210%20210%3110100%表3.第3組(對照組)攻擊后尿液培養(yǎng)和腎組織培養(yǎng)的結(jié)果0=陰性；1=陽性對各接種組的尿液釋出所計算的阻止分?jǐn)?shù)結(jié)果與安慰劑組相比為1.0000(100%)，而且相應(yīng)的精確95%置信區(qū)間為[0.8389，1.0000]或[83.9%，100%](表4和5)。在兩接種組中沒有動物具有任何陽性尿液培養(yǎng)，和對照組中所有動物具有至少2個陽性尿液培養(yǎng)(表2和表3)。表4.生物體復(fù)原存在的阻止分?jǐn)?shù)和精確95%置信區(qū)間表5.生物體復(fù)原存在的頻率和比例(%)腎培養(yǎng)結(jié)果：所有接種疫苗的小母牛(組1和組2)腎組織對鉤端螺旋體分離株呈陰性(表6)，而對照組中11只小母牛中的10只具有陽性的腎組織鉤端螺旋體培養(yǎng)(表3和表6)。表6.第1、2、和3組的腎培養(yǎng)結(jié)果的匯總組陽性小母牛數(shù)陰性小母牛數(shù)陽性百分比10210%20210%310190.9%對各接種組的腎組織培養(yǎng)樣品所計算的阻止分?jǐn)?shù)結(jié)果與對照組相比為1.0000(100%)，而且相應(yīng)的精確95%置信區(qū)間為[0.8349，1.0000]或[83.5%，100%](表4和5)。在兩接種組中小母牛沒有任何陽性培養(yǎng)結(jié)果(表6)，且對照組中11只小母牛中的10只具有陽性腎培養(yǎng)結(jié)果(表3和表6)。C.結(jié)論血清學(xué)MAT結(jié)果顯示了第二次接種后在接種的一部分動物中的全部血清型的瞬時血清學(xué)轉(zhuǎn)換。在攻擊時在所有組的所有動物中對所有血清型均為MAT陰性(數(shù)據(jù)未顯示)。攻擊三周后的，所有的安慰劑對照動物均對L.hardjo呈MAT陽性(作為對攻擊的應(yīng)答)并導(dǎo)致攻擊生物的感染。在接種的動物中，動物的LHB攻擊沒有引起對L.hardjo的記憶性MAT血清學(xué)反應(yīng)，然而安慰劑對照組的100%(11/11)在攻擊后呈陽性MAT結(jié)果。利用從攻擊后56天每周間隔收集的尿液樣本的培養(yǎng)來復(fù)原攻擊生物。安慰劑對照動物(第3組)的每只動物有至少兩個尿液樣本測試培養(yǎng)陽性，表明釋出至少7天。安慰劑對照組中釋出的持續(xù)時間范圍為7天-35天。在第三組中，11只小母牛中的1只在2個取樣日釋出；11只中的4只在4天釋出；11只中的4只在5個取樣日釋出；11只中的2只在6個取樣日釋出。在任何接種的動物的任何尿液樣本中均沒有生物體復(fù)原?；谂囵B(yǎng)結(jié)果，L.hardjo疫苗接種完全阻止了攻擊生物的尿液釋出。還培養(yǎng)了剖檢時取得的腎臟樣本以確定攻擊生物體復(fù)原。安慰劑對照組的11只動物中的10只(90.9%)的腎組織攻擊生物體復(fù)原為陽性。在任何接種的小母牛(第1和2組)的任何腎臟樣本中均沒有生物體復(fù)原。基于培養(yǎng)結(jié)果，哈勒焦型鉤端螺旋體疫苗接種完全阻止了攻擊生物的腎臟感染/定居。用經(jīng)修飾的活病毒聯(lián)合產(chǎn)品或滅活的病毒聯(lián)合產(chǎn)品接種LHB的小母牛進行的攻擊沒有引起對哈勒焦型鉤端螺旋體的記憶性MAT血清學(xué)反應(yīng)，然而安慰劑對照組的100%(11/11)在攻擊后呈陽性MAT結(jié)果。這些結(jié)果表明，安慰劑對照小母牛產(chǎn)生血清學(xué)MAT反應(yīng)作為活性感染的結(jié)果。該結(jié)果與攻擊后在接種的動物中沒有MAT血清學(xué)反應(yīng)形成鮮明的對比。在接種的動物中MAT血清學(xué)反應(yīng)的缺失可能表明在這些接種的動物中并不會發(fā)生攻擊生物體的復(fù)制，至少不足以引起記憶性血清學(xué)反應(yīng)的程度。其他人也報道了在鉤端螺旋體接種的動物中不存在攻擊后記憶性血清學(xué)反應(yīng)(Trueba等，1990；Bolin和Alt，2001)，并已經(jīng)討論過免疫原抗原表位上的IgG阻斷作用或B淋巴細(xì)胞受體的負(fù)反饋作用，因而防止繼發(fā)性抗體反應(yīng)的可能性(Trueba等，1990)。從歷史上看，主要基于在動物模型中利用對鉤端螺旋體脂多糖的抗體的被動保護的研究，認(rèn)為針對哈勒焦型鉤端螺旋體的保護性免疫是抗體介導(dǎo)的(Jost等，1986;Masuzawa等，1990)。然而，涉及攻擊時具有高滴度抗LPS抗體的動物的攻擊的研究沒有受到抵御L.hardjo攻擊的保護(Bolin等，1989年(b)；Bolin等，1991)。利用提供針對LHB菌株203攻擊保護的疫苗在牛中進行的研究已經(jīng)表明，接種后誘導(dǎo)強效的Th1型免疫應(yīng)答(其涉及CD4和λδT淋巴細(xì)胞)可能與疫苗誘導(dǎo)的針對攻擊的保護相關(guān)(Naiman等，2001；Naiman等，2002)。也許在接種的動物中，Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答提供的強大的保護記憶方面能夠防止攻擊生物體的復(fù)制。其結(jié)果可能是沒有足夠的抗原以導(dǎo)致誘發(fā)基于記憶性抗體的應(yīng)答和被接種/攻擊的動物的免疫系統(tǒng)識別。這里報告的結(jié)果與報告一價鉤端螺旋體疫苗對LHB菌株2038攻擊提供保護的疫苗研究相似。在這些研究中所用的鉤端螺旋體疫苗據(jù)報道從LHB菌株93U制備，而這里報道的研究的疫苗制備中利用的菌株是LHP。這些是兩種血清學(xué)上相同但遺傳上不同的哈勒焦血清型(Ellis等，1986;Djordjevic等，1993；Thiermann等，1986；Skilbeck和Davies，1989)。與這里報道的結(jié)果相反，以往的研究已經(jīng)報道當(dāng)用LHB攻擊接種的動物時，包含LHP的疫苗對尿液釋出或腎臟感染沒有表現(xiàn)出良好的保護(Bolin等，1989(a)；Bolin等，1989(b)；Bolin等，1991;Bolin和Alt，2001)。在用于制備疫苗的哈勒焦血清型上的細(xì)微差別，可能部分地影響這種疫苗提供的保護水平。這種區(qū)別可能包括原始分離物的差異，以及由生長和傳代方法引起的差異。疫苗提供的保護水平不僅依賴于疫苗中包含的生物體的血清型/菌株的特性，而且還依賴于疫苗制劑中使用的佐劑，如果有的話。本文中，使用的疫苗包含佐劑。用于生產(chǎn)菌株的生長和滅活條件也可能影響疫苗提供的功效。血清型差異、佐劑制劑和處理疫苗的生物體可以影響疫苗誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答的能力。用經(jīng)修飾的活病毒/LHP菌素組合和滅活的病毒/LHP菌素組合的接種，均在LHB攻擊后導(dǎo)致尿液釋出的保護和腎臟感染和定居的預(yù)防。本研究的結(jié)果表明測試疫苗的哈勒焦型鉤端螺旋體組分對于抵御由于LHB攻擊誘導(dǎo)的腎部感染和定居和相關(guān)的尿液釋出是高度有效的?？梢灾苽浜蛨?zhí)行本文公開并要求保護的所有組合物和方法而在本公開內(nèi)容基礎(chǔ)上無需過多的實驗。雖然在優(yōu)選實施方案中已經(jīng)描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，將變化應(yīng)用到本文所述的組合物和方法和步驟或方法的步驟的順序中是顯而易見的。更具體地，化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的某些試劑可以取代本文所述的試劑而將獲得相同或相似的結(jié)果，這將是顯而易見的。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有這些相似的取代和修改被視為是在所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻下列參考文獻，在它們提供的示范性過程或補充本文前述內(nèi)容的其他細(xì)節(jié)的范圍內(nèi)，特定地整合入本文作為參考。1.FaineS,AdlerB,BolinCA,等人，Leptospiraandleptospirosis,2nded.Melborne,Australia,MediSciPress,1999.2.HeathSandJohnsonR.Leptospirosis.JAmVetMedAssoc205:1518-1523,1994.3.EllisWA.Leptospirosisasacauseofreproductivefailure.VetClinNAmFoodAnimPract10-463-478,1994.4.Bolin,CA,ThiermannAB,等人，EffectofvaccinationwithapentavalentleptospiralvaccineonLeptospirainterrogansserovarhardjotypehardjo-bovisinfectionofpregnantcattle.AmJVetRes50:161-165,1989(a).5.BolinCA,ZuernerRL,TruebaG.EffectofvaccinationwithapentavalentleptospiralvaccinecontainingLeptospirainterrogansserovarhardjotypehardjo-bovisontheyhardjo-bovisinfectionofcattle.AmJVetRes.50:2004-2008,1989(b).6.BolinCA,CassellsJA,ZuernerRL等人，EffectofvaccinationwithamonovalentLeptospirainterrogansserovarhardjotypehardjo-bovisvaccineontypehardjo-bovisinfectionofcattle.AmJVetRes.52:1639-1643,1991.7.TruebaGA.,BolinCA,ThoenCO.EvaluationofanenzymeimmunoassayfordiagnosisofbovineleptospirosiscausedbyLeptospirainterrogansserovarhardjotypehardjo-bovis.JVetDiagnInvest2:323-329,1990.8.Bolin,CAandAltDP.UseofamonovalentleptopsiralvaccinetopreventrenalcolonizationandurinarysheddingincattleexposedtoLeptospriaborpeterseniiserovarhardjo.AmJVetRes62(7):995-1000,2001.9.JostBH,AdlerB,VihnT,FaineS.Amonoclonalantibodyreactingwithadeterminantonleptospirallipopolysaccharideprotectsguineapigsagainstleptospirosis.JMedMicrobiol.22:269-275,1986.10.MasuzawaT,NakamuraR,HashiguchiY等人，Immunologicalreactivityandpassiveprotectiveactivityofmonoclonalantibodiesagainstprotectiveantigen(PAg)ofLeptospirainterrogansserovarlai.ZentblBakteriolReiheA272:328-336,1990.11.Naiman,BM,AltD,BolinCA等人，ProtectivekilledLeptospiraborpeterseniivaccineinducespotentTh1ImmunitycomprisingresponsesbyCD4andλδTLymphocytes.InfectionandImmunity69(12):7550-7558,2001.12.Naiman,BM,BlumermanS,AltD,等人，EvaluationofType1immuneresponseinnaiveandvaccinatedanimalsfollowingchallengewithLeptospiraborgpeterseniiserovarhardjo:involvementofWC1+λδandCD4Tcells.InfectionandImmunity70(11):6147-6157,2002.13.Ellis,WA,ThiermannAB,MarshallRB.GenotypesofLeptopriahardjoandtheirroleinclinicaldisease.InProceedings.14thWorldCongressDiseasesofCattle.966-970,1986.14.DjordjevicS,HornitzkyM,RossAD,等人，RestrictionendonucleaseanalysisofAustralianisolateofLeptospirainterrogansserovarhardjofromcattlewithagalactiaandabortion.AustVetJ.70(3):98-100,1993.15.ThiermannAB,HandakerAL,FolyJW,KingscoteBF.ReclassificationofNorthAmericanleptospiralisolatesbelongingtoserogroupsMiniandSejroebyrestrictionendonucleaseanalysis.AmJVetRes.47:61-66,1986.16.SkilbeckNWandDaviesWD.RestrictionendonucleaseanalysisofAustralianisolatesofLeptospirainterrogansserovarhardjo.AustVetJ.66:183-184.1989.