用于冷凍保存和包封細胞的方法
【專利摘要】本文描述了冷凍保存已懸浮在海藻酸鹽中的細胞的方法以及包封已懸浮在海藻酸鹽中的冷凍保存的細胞的方法。本文還提供了包含已根據(jù)本文所述的方法處理的細胞的細胞組合物。
【專利說明】用于冷凍保存和包封細胞的方法
[0001]本申請主張2010年12月30日提交的美國臨時專利申請第61/428，427號的優(yōu)先權，該申請的公開內(nèi)容以其整體并入本文作為參考。
1.【技術領域】
[0002]本文描述了冷凍保存已懸浮在海藻酸鹽中的細胞的方法以及包封已懸浮在海藻酸鹽中的冷凍保存的細胞的方法。本文還提供了包含已根據(jù)本文所述方法處理的細胞的細胞組合物。
2.【背景技術】
[0003]冷凍保存是可以通過將細胞冷卻至低溫來保存的方法。在這些低溫下，有效停止了生物活性，包括在正常情況下會導致細胞死亡的生化反應。由此，冷凍保存提供了用于儲存細胞備用的有價值的方法。然而，冷凍保存細胞存在某些缺點，包括冷凍和/或解凍過程中細胞發(fā)生的損傷和融化后需要培養(yǎng)細胞以確保它們適當恢復。這些缺點限制了冷凍保存的細胞的價值，特別是在希望融化后立即使用或不久后使用冷凍保存的細胞的情況下。
3.
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明公開的目的是提供冷凍保存細胞的方法和使用解決了上述問題的已冷凍保存的細胞的方法。這些方法部分地基于以下發(fā)現(xiàn):當在細胞冷凍保存前將液體海藻酸鹽加入細胞時，所述細胞能夠(i )在融化后包封，并且隨后在將它們?nèi)诨鬅o需培養(yǎng)所述冷凍保存的細胞而用于所需目的在融化后以非包封形式使用而在將它們?nèi)诨鬅o需培養(yǎng)所述冷凍保存的細胞。所述方法另外部分基于以下發(fā)現(xiàn):將已融化的冷凍保存的細胞立即懸浮在海藻酸鹽中，并且隨后包封剩余的活細胞并在包封后可以立即使用。
[0005]由此，在一種實施方式中，本文所述的方法包括向細胞加入液體海藻酸鹽以形成細胞/液體海藻酸鹽溶液。在一些實施方式中，產(chǎn)生了細胞/液體海藻酸鹽溶液并且將所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中的細胞冷凍保存、融化并且在融化后立即包封，并且此后將所述細胞用于它們所需的目的，例如，不進行任何額外培養(yǎng)，施用于受試者，例如，立即使用細胞。在一些實施方式中，在冷凍保存的細胞融化后立即產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽溶液，隨后將其包封并在此之后將其用于它們所需的目的，例如，不進行任何額外培養(yǎng)，施用于受試者，例如，立即使用細胞。在一些實施方式中，產(chǎn)生了細胞/液體海藻酸鹽溶液并且將所述細胞冷凍保存、融化，但在融化后不包封，而是不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，立即使用細胞。
[0006]在一個方面，本文提供了用于制備適合于在將冷凍保存的細胞融化并包封在海藻酸鹽中后立即施用于受試者的冷凍保存的包封細胞的方法。根據(jù)這個方面，在冷凍保存和融化后立即包封前，將所述冷凍保存的包封細胞懸浮在液體海藻酸鹽中。作為另外一種選擇，在融化和隨后的包封后立即將所述冷凍保存的細胞懸浮在液體海藻酸鹽中。在每一種情況下，然后可以不進行任何額外培養(yǎng)將所述包封的細胞施用于受試者，例如，包封后立即使用細胞。
[0007]在一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括:(i )獲得細胞群體；(ii )將包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液加入到所述細胞群體中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(0包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在某些實施方式中，在融化和隨后的包封后不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，包封后立即使用所述細胞。
[0008]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在某些實施方式中，在融化和隨后的包封后不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，包封后立即使用所述細胞。 [0009]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液加入到所述細胞群體中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)融化所述冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物；(v)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(vi )將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(V)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。
[0010]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)融化所述冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(0將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(iv)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。
[0011]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將所述細胞在冷凍保存溶液中冷凍保存；
(iii)融化所述冷凍保存的細胞；(iv)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(V)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在某些實施方式中，在融化和隨后的包封后不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，包封后立即使用所述細胞。
[0012]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括:(i )將細胞群體在冷凍保存溶液中冷凍保存；(ii )融化所述冷凍保存的細胞；(iii)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在某些實施方式中，在融化和隨后的包封后不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，包封后立即使用所述細胞。
[0013]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將所述細胞在冷凍保存溶液中冷凍保存；(iii)融化所述冷凍保存的細胞；(iv)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(V)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(vi)將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中所述施用是在步驟(V)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。
[0014]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體在冷凍保存溶液中冷凍保存；(ii)融化所述冷凍保存的細胞；(iii)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(V)將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(iv)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。
[0015]在另一個方面，本文提供了用于制備適合于在將冷凍保存的細胞融化后立即施用于受試者的冷凍保存的細胞的方法。根據(jù)這個方面，在冷凍保存前將冷凍保存的細胞懸浮在液體海藻酸鹽中并且能夠在融化后立即施用于受試者，而無需在施用前培養(yǎng)所述包封的細胞。
[0016]在一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的細胞群體的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液加入到所述細胞群體中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物，其中，冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物中的細胞可以在融化后立即施用于受試者。
[0017]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的細胞群體的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物，其中，冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物中的細胞可以在融化后立即施用于受試者。
[0018]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液加入到所述細胞群體中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；
(iv)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(￥)將所述細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(iv)的融化后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。
[0019]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii )冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii )融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(iv)將所述細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(iii)的融化后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。
[0020]4.定義
[0021]術語“約”或“大約”表示如本領域的技術人員所確定的特定值的可接受誤差，其部分取決于如何測量或確定該值。在某些實施方式中，術語“約”或“大約”意指在1、2、3或4個標準偏差內(nèi)。在某些實施方式中，術語“約”或“大約”意指給定值或范圍的20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5% 或 0.05% 之內(nèi)。[0022]如本文所使用的，由于涉及本文所述的細胞的使用，術語“立即”表示沒有中間培養(yǎng)步驟的細胞的使用。在一些實施方式中，立即是指長于一周的時間長度。在一些實施方式中，立即是指長于六天、長于五天、長于四天、長于三天、長于兩天或長于一天的時間長度。在一些實施方式中，術語“立即”是指約I天、約22小時，約20小時，約18小時，約16小時，約14小時，約12小時，約10小時，約8小時，約6小時，約5小時，約4小時，約3小時，約2小時，約I小時，約30分鐘，約20分鐘或約10分鐘的時間長度。如本文所使用的，術語“立即”不意味著排除在細胞使用前可能希望或需要的某些步驟，例如，細胞稀釋、細胞
清洗和/或細胞儲存(例如，細胞在適合培養(yǎng)基中的冷藏，如HypoThenriost)丨“ (BioLife
Solutions, Bothell, WA))。
[0023]如本文所使用的，術語“海藻酸鹽”是指廣泛分布于褐藻細胞壁中的陰離子多糖。海藻酸鹽與堿金屬(如鈉、鉀、鋰、鎂、銨)和來源于低級胺(如甲胺、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)的取代的銨陽離子形成水溶性鹽。如本文所使用的術語“海藻酸鹽”涵蓋了本領域技術人員所知的所有海藻酸鹽形式，包括但不限于海藻酸鈣、海藻酸鈉、海藻酸丙二醇酯和海藻酸鉀。另外，如本文所使用的術語“海藻酸鹽”涵蓋了本領域技術人員用于描述海藻酸鹽的所有術語，例如，海藻酸和褐藻膠。
[0024]如本文所使用的，術語“冷凍保護劑”是指用于保護生物組織(例如，細胞)不受冷凍期間所發(fā)生的損傷(例如，由于結冰所導致的損傷)的任何物質(zhì)。示例性的冷凍保護劑包括但不限于，二醇類(含有至少兩個羥基的醇)，如乙二醇、丙二醇和甘油；二甲基亞砜(DMSO);海藻糖；和蔗糖。如本文所使用的術語“冷凍保護劑”不意味著包括海藻酸鹽。
[0025]如本文所使用的，術語“包封”是指將已懸浮在液體海藻酸鹽中的細胞封入半透膜中，然后將所述細胞/液體海藻酸鹽懸液暴露于二價陽離子(例如，氯化鈣、氯化鋅、氯化銅和氯化鍶)的過程。本文所述的包封的細胞在體外和體內(nèi)條件下均保持存活，并且仍保留了它們的功能和代謝特性。如本文所使用的，術語“包封”不意味著涵蓋僅在海藻酸鹽中冷凍細胞的過程。也就是說，如本文所使用的“包封”需要當海藻酸鹽暴露于二價陽離子時發(fā)生海藻酸鹽聚合物的交聯(lián)。
[0026]如本文所使用的，術語“冷凍保存溶液”是指其中可以冷凍保存細胞的溶液。冷凍保存溶液可以包含但不限于，海藻酸鹽、冷凍保護劑、人血清白蛋白(HSA)、水、蛋白質(zhì)、鹽、緩沖液、HypoThermosol? (BioLife Solutions, Bothell, WA)和 / 或葡聚糖。在具體的實施方式中，冷凍保存溶液不包含冷凍保護劑。
[0027]如本文所使用的，術語“干細胞”定義了可以廣泛增殖(例如，多達約40次群體倍增)，但不需要無限增值，并且可以分化(例如，體外分化為多種細胞類型)的任何給定細胞群體的功能特性。
[0028]如本文所使用的，術語“來源于”表示分離自或另外表示純化自。在細胞的語境中，術語“來源于”涵蓋了從直接分離自組織的細胞以及從原代分離細胞培養(yǎng)或擴增的細胞培養(yǎng)的細胞。
[0029]如本文所使用的，“免疫定位”意指在(例如)流式細胞術、熒光激活細胞分類術、磁性細胞分選、原位雜交、免疫組織化學等中使用免疫蛋白(例如，抗體或其片段)的化合物(例如，細胞標志物)的檢測。[0030]如本文所使用的，術語“分離的細胞”表示與所述細胞來源組織的其他細胞基本分離的細胞。如果在(例如)細胞的收集和/或培養(yǎng)期間從所述細胞中除去了至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少約99%的所述細胞與之天然相聯(lián)系的細胞，則細胞是“分離的”。
[0031]如本文所使用的，術語“分離的細胞群體”表示與所述細胞群體來源組織的其他細胞基本分離的細胞群體。如果從所述細胞中除去了至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%的所述細胞群體或所述細胞群體的來源細胞與之天然相聯(lián)系的細胞，則細胞群體是“分離的”。
[0032]如本文所使用的，當(例如)通過免疫定位或通過RT-PCR所述標志物是高于背景可檢測的，則細胞對特定標志物是“陽性的”。相反，在相同背景下“陰性”是指與背景相比，通過(例如)免疫定位或通過RT-PCR的特定標志物。
[0033]如本文所使用的，術語“受試者”或“患者”互換使用以表示動物(例如，鳥類、爬行動物和哺乳動物)。在具體的實施方式中，受試者為鳥類(例如，雞或鴨)。在另一種實施方式中，受試者為哺乳動物，其包括非靈長類(例如，駱駝、驢、斑馬、母牛、豬、馬、山羊、綿羊、貓、狗、大鼠和小鼠)和靈長類(例如，猴子、黑猩猩和人)。在某些實施方式中，受試者為非人動物。在一些實施方式中，受試者為農(nóng)畜(例如，母牛、豬、馬、綿羊、山羊等)或?qū)櫸?例如，狗、貓等)。在另一種實施方式中，受試者是人。在另一種實施方式中，受試者是嬰兒。在另一種實施方式中，受試者是兒童。 在另一種實施方式中，受試者是成人。
5.【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1示出了在4°C和37°C下懸浮在HypoTherniosoI? (HT)溶液中的包封的胎盤
干細胞在7天期間的活力。“IX細胞”對應于5 X IO5的細胞濃度；“4X細胞”對應于2X106的細胞濃度。
[0035]圖2示出了冷凍保存、融化、懸浮在海藻酸鹽中、包封并保存在
HypoThermosol:?)中而無中間培養(yǎng)步驟的胎盤干細胞的活力。在包封后4小時和24小時
評價活力?！癐 X ”代表3.75X IO6個細胞/毫升;“0.5Χ”代表1.88X IO6個細胞/毫升；“0.25Χ”代表0.94X IO6個細胞/毫升。
6.【具體實施方式】
[0036]本文提供了在海藻酸鹽中冷凍保存細胞的方法和施用根據(jù)所述方法冷凍保存的細胞的方法。在某些實施方式中，在融化后將在海藻酸鹽中冷凍保存的細胞包封。本文所述的方法使得冷凍保存的細胞能夠立即使用，并因此由于冷凍保存的細胞不需要在它們?nèi)诨筮M行培養(yǎng)或處理而比已知的冷凍保存方法具有優(yōu)勢。
[0037]本文還提供了包含已根據(jù)所述方法冷凍保存的細胞的細胞組合物。
[0038]6.1冷凍保存方法
[0039]在一個方面，本文提供了用于制備適合于在將冷凍保存的細胞融化并包封在海藻酸鹽中后立即施用于受試者的冷凍保存的包封的細胞的方法。根據(jù)這個方面，在冷凍保存和融化后立即包封前，將所述冷凍保存的包封的細胞懸浮在液體海藻酸鹽中。作為另外一種選擇，在融化并隨后包封后立即將所述冷凍保存的細胞懸浮在液體海藻酸鹽中。在每種情況下，然后可以不進行任何額外培養(yǎng)將所述包封的細胞施用于受試者，例如，包封后立即使用細胞。在這些方法中使用的細胞可以包含以下6.1.2節(jié)中所述的任何細胞。
[0040]在具體的實施方式中，本文提供了制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括:(i )獲得細胞群體；(ii )將包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液加入到所述細胞群體中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(0包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在某些實施方式中，在融化和隨后的包封后不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，包封后立即使用所述細胞。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0041]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii )冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii )融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在某些實施方式中，在融化和隨后的包封后不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，包封后立即使用所述細胞。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是 分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0042]在另一種具體的實施方式中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i )獲得細胞群體；(ii )將包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液加入到所述細胞群體中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)融化所述冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物；(v)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(vi)將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(V)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0043]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)融化所述冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(0將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(iv)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0044]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將所述細胞在冷凍保存溶液中冷凍保存；
(iii)融化所述冷凍保存的細胞；(iv)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(V)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在某些實施方式中，在融化和隨后的包封后不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，包封后立即使用所述細胞。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0045]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括:(i )將細胞群體在冷凍保存溶液中冷凍保存；(ii )融化所述冷凍保存的細胞；(iii)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在某些實施方式中，在融化和隨后的包封后不進行任何額外培養(yǎng)地使用所述細胞，例如，包封后立即使用所述細胞。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0046]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將所述細胞在冷凍保存溶液中冷凍保存；(iii)融化所述冷凍保存的細胞；(iv)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(V)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(vi)將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(V)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。[0047]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體在冷凍保存溶液中冷凍保存；(ii)融化所述冷凍保存的細胞；(iii)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(V)將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中，所述施用是在步驟(iv)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0048]在另一個方面，本文提供了用于制備適合于在將冷凍保存的細胞融化后立即施用于受試者的冷凍保存的細胞的方法。根據(jù)這個方面，在冷凍保存前將冷凍保存的細胞懸浮在液體海藻酸鹽中并且能夠在融化后立即施用于受試者，而無需在施用前培養(yǎng)所述包封的細胞，例如，可以在融化后立即使用所述細胞。在這些方法中使用的細胞可以包含以下
6.1.2節(jié)中所述的任何細胞。
[0049]在一種【具體實施方式】中，本文提供了制備適合施用于受試者的細胞群體的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液加入到所述細胞群體中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物，其中冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物中的細胞可以在融化后不進行任何額外培養(yǎng)使用，例如，可以在融化后立即使用所述細胞。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0050]在另一種具體的實施方式中，本文提供了制備適合施用于受試者的細胞群體的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物，其中該冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物中的細胞可以在融化后不進行任何額外培養(yǎng)使用，例如，可以在融化后立即使用所述細胞。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0051] 在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii )冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii )融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(iv)將所述細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中所述施用是在步驟(iii)的融化后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0052]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括:(i)獲得細胞群體；(ii)將包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液加入到所述細胞群體中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iv)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(V)將所述細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者，其中所述施用是在步驟(iv)的融化后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)細胞的情況下進行的。在一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，在所述方法中使用的細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0053]6.1.1包封的細胞群體
[0054]本文還提供了根據(jù)本文所述的方法產(chǎn)生的包封的細胞群體。這些包封的細胞可以用于任何所需的目的，例如，用于治療目的。在具體的實施方式中，如6.3節(jié)中所述使用包封的細胞。
[0055]在一種【具體實施方式】中，本文提供了包封的細胞群體，其中根據(jù)以下方法產(chǎn)生了所述細胞:(i)將細胞與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在一種【具體實施方式】中，所述細胞為干細胞。在另一種【具體實施方式】中，所述細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0056]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了包封的細胞群體，其中根據(jù)以下方法產(chǎn)生了所述細胞:(i)在冷凍保存溶液中冷凍保存細胞；(ii)融化所述冷凍保存的細胞；(iii)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(iV)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。在一種【具體實施方式】中，所述細胞為干細胞。在另一種【具體實施方式】中，所述細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0057]在另一種【具體實施方式】中，本文提供了細胞群體，其中根據(jù)以下方法產(chǎn)生了所述細胞:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物jP(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物，并且其中冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物中的細胞可以在融化后不進行任何額外培養(yǎng)使用，例如，可以在融化后立即使用所述細胞。在一種【具體實施方式】中，所述細胞為干細胞。在另一種【具體實施方式】中，所述細胞是分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞。
[0058]6.1.2 細朐
[0059]根據(jù)本文所述的方法可以使用任何細胞類型，包括直接分離自受試者的原代細胞和本領域技術人員所知的細胞系。也就是說，在所述方法中使用的細胞可以分離自或來源于任何已知的組織，包括結締組織、上皮組織、肌肉組織和/或神經(jīng)組織。根據(jù)本文所述的方法可以使用的細胞來源包括但不限于，胎盤(包括臍帶)、骨髓、基質(zhì)、間充質(zhì)、皮膚、骨骼、血液、肺、肝、腦、腎、膽囊、膀胱、心臟、脾、胃、胰腺、睪丸、卵巢、結腸、小腸和大腸。
[0060]在某些實施方式中，在本文所述的方法中使用的細胞是干細胞，例如，分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞和間質(zhì)干細胞(例如，骨髓源間質(zhì)干細胞)。在美國專利第7，468，276號、美國專利申請公開第2007/0275362號和美國專利申請公開第2010/0124569號中描述了用于獲得分離自或來源于胎盤組織(包括臍帶)的干細胞的示例性方法，以上專利的公開內(nèi)容以其整體作為參考并入本文。 [0061]在一種【具體實施方式】中，在本文所述的方法中使用的所述細胞或細胞群體是分離自胎盤的胎盤干細胞。在(例如)美國專利第7，468，276號和美國專利申請公開第2007/0275362號中詳細描述了胎盤干細胞和胎盤干細胞群體，以上專利的公開內(nèi)容以其整體作為參考并入本文。
[0062]胎盤干細胞是⑶10+、⑶34'⑶105+、⑶200+胎盤干細胞。在另一種【具體實施方式】中，所述胎盤干細胞表達⑶200但不表達HLA-G ;或表達⑶73、⑶105和⑶200 ;或表達⑶200和0CT-4 ;或表達⑶73和⑶105，但不表達HLA-G ;或表達⑶73和⑶105并且當在允許類胚狀體(embryoid-like body)形成的條件下培養(yǎng)所述群體時有利于在包含所述干細胞的胎盤細胞群體中形成一個或多個類胚狀體；或表達0CT-4并且當在允許類胚狀體形成的條件下培養(yǎng)所述群體時有利于在包含所述干細胞的胎盤細胞群體中形成一個或多個類胚狀體。在其他實施方式中，所述胎盤干細胞表達⑶44、⑶90、HLA-ABC或HLA-P中的一種或多種；和 / 或不表達 CD45、CDl 19、CD133、KDR、CD80、CD86、HLA-DR、SSEA3、SSEA4 或 CD38 中的一種或多種
[0063]在另一種【具體實施方式】中，在本文所述的方法中使用的細胞或細胞群體是分離自胎盤的干細胞，其被稱為“羊膜來源的貼壁細胞”或“AMDAC”。在(例如)美國專利申請公開第2010/0124569號中詳細描述了這些細胞和細胞群體，該專利的公開內(nèi)容以其整體作為參考并入本文。
[0064]可以通過細胞和遺傳標志物的不同組合來鑒別AMDAC。在一種【具體實施方式】中，例如，AMDAC是0CT-4_，如通過逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)可確定的。在另一種實施方式中，AMDAC是⑶49f+，如通過流式細胞術可確定的。在另一種實施方式中，AMDAC是0CT-4_和⑶49f+，如分別通過RT-PCR和流式細胞術可確定的。在另一種實施方式中，AMDAC是⑶49f+XD105+和⑶200+，如通過免疫定位(例如，流式細胞術)可確定的。在另一種實施方式中，AMDAC是0CT-4'如通過RT-PCR可確定的，和CD49f+、CD105+和CD200+，如通過免疫定位(例如，流式細胞術)可確定的。在另一種具體的實施方式中，AMDAC對VEGFRl/Flt-1(血管內(nèi)皮生長因子受體I)和/或⑶309(也被稱為血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR2) /KDR)是陽性的，如通過免疫定位(例如，流式細胞術)可確定的。在另一種具體的實施方式中，AMDAC是⑶90+和/或⑶117 -，如通過流式細胞術可確定的，和/或HLA-G'如通過RT-PCR可確定的。在另一種【具體實施方式】中，所述AMDAC是0CT-4_和HLA-G_，如通過RT-PCR可確定的，和⑶49f+、⑶90+、⑶105+和⑶117 —，如通過流式細胞術可確定的。在另一種【具體實施方式】中，任何上述AMDAC另外是CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie_2+ (血管生成素受體)、TEM-7+ (腫瘤內(nèi)皮標志物 7)、CD31'CD34^、CD45、CD 133、CD 143、CD 146-或 CXCR4^(趨化因子(C-X-C基序)受體4)中的一種或多種，如通過免疫定位(例如，流式細胞術)可確定的。在另一種【具體實施方式】中，任何上述AMDAC另外是⑶9+、⑶10+、⑶44+、⑶54+、⑶98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31' CD34 ^、CD45、CD133、CD143、CD 146 ^ 和 CXCR4 ^，如通過免疫定位(例如，流式細胞術)可確定的。在另一種【具體實施方式】中，AMDAC是GFAP+，如通過短期神經(jīng)分化測定可確定的。在另一種【具體實施方式】中，AMDAC是β-微管蛋白III (Tujl)+，如通過短期神經(jīng)分化測定可確定的。
[0065]在另一種【具體實施方式】中，在本文所述的方法中使用的細胞是間質(zhì)干細胞或“間質(zhì)樣”干細胞。在一種【具體實施方式】中，所述間質(zhì)干細胞是骨髓源間質(zhì)干細胞。
[0066]6.1.3 包封 [0067]可以根據(jù)本文所述的方法使用本領域已知用于包封懸浮在液體海藻酸鹽中的細胞的任何方法，例如，通過將細胞/液體海藻酸鹽懸液暴露于二價陽離子。通常，本文所涵蓋的用于海藻酸鹽中細胞包封的方法包括將細胞懸浮在液體海藻酸鹽中以形成細胞/液體海藻酸鹽懸液；分散所述細胞/液體海藻酸鹽懸液，例如，以逐滴的方式分散成液滴(例如，通過注射器);和將分散的懸液(例如，所述細胞/液體海藻酸鹽懸液的液滴)暴露于包含二價陽離子(例如，鈣、鋇、銅、鋅或鍶)的溶液，其使得所述細胞/液體海藻酸鹽懸液中的海藻酸鹽聚合物交聯(lián)，并因此形成包封的細胞。本文所涵蓋的包封方法不包括其中細胞/液體海藻酸鹽懸液僅在海藻酸鹽中冷凍的方法。
[0068]在某些實施方式中，當細胞包封在海藻酸鹽中時，形成了微珠。在一種【具體實施方式】中，當細胞被包封在海藻酸鹽中時形成的微珠形成水凝膠結構?？梢栽诩毎话庠诤Ｔ逅猁}中時形成微珠，從而它們的尺寸滿足所需需要。在某些實施方式中，當細胞被包封在海藻酸鹽中時形成的微珠的尺寸為約100 μ m、約200 μ m、約300 μ m、約400 μ m、約500 μ m、約600 μ m或約700 μ m。在其他實施方式中，當細胞被包封在海藻酸鹽中時形成的微珠的尺寸為約 100-200 μ m、約 100-300 μ m、約 200-400 μ m、約 200-500 μ m、約 300-500 μ m、約300-600 μ m、約400-600 μ m或約500-600 μ m、約500-700 μ m。在一種【具體實施方式】中，當細胞被包封在海藻酸鹽中時形成的微珠的尺寸小于500 μ m。
[0069]可以基于所需結果(例如，海藻酸鹽溶液所需的粘度)來確定細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的量。在某些實施方式中，所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的量為小于0.5%。在其他實施方式中，所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的量為約0.5%、約 0.6%、約 0.7%、約 0.75%、約 0.8%、約 0.9%、約 1.0%、約 1.1%、約 1.2%、約 1.3%、約 1.4%、約1.5%。在其他實施方式中，所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的量為大于1.5%。在其他實施方式中，所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的量為約0.5%至約1.0%、約0.75%至約1.5%或者約1.0%至約1.5%。在一種【具體實施方式】中，所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的量為0.75%。在具體的實施方式中，所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的量足以獲得> 0.009Pa.S的粘度。
[0070]可以通過本領域技術人員所知的任何方式完成細胞/液體海藻酸鹽溶液的分散，包括但不限于浸潰、浸沒、噴霧、分散成滴，例如，通過注射器、靜電產(chǎn)生或霧化。
[0071]用于交聯(lián)海藻酸鹽并因此包封細胞的二價陽離子可以是本領域中已知實現(xiàn)所述技術的任何二階陽離子。在某些實施方式中，用于交聯(lián)所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的二階陽離子為氯化鈣(CaCl2)、氯化鋇(BaCl2)、氯化鍶(SrCl2)、氯化銅(CuCl2)或氯化鋅(ZnCl2)。在一種【具體實施方式】中，用于交聯(lián)所述細胞/液體海藻酸鹽溶液中海藻酸鹽的二階陽離子為氯化鈣(CaCl2)。在某些實施方式中，二階陽離子溶液包含約0.5%、約0.75%、約1.0%、約1.25%、約1.5%、約1.75%或約2.0%的二階陽離子。在一種【具體實施方式】中，該二階陽離子溶液包含1.5%的二階陽離子，例如，CaCl20
[0072]6.1.4冷凍保存
[0073]可以根據(jù)本文所述的方法使用本領域中已知用于冷凍保存細胞的任何方法。細胞可以在小容器(例如，安瓿瓶)；適合于冷凍保存的袋；或任何其他適合于冷凍保存的容器中的本文所述的冷凍保存溶液中冷凍保存。在一些實施方式中，細胞冷凍保存在可商購的冷凍保存培養(yǎng)基中，例如，可商購的細胞冷凍培養(yǎng)基，例如，Sigma Aldrich產(chǎn)品目錄號C2695、C2639 (細胞冷凍培養(yǎng)基-無血清I X，不含DMS0)或C6039 (細胞冷凍培養(yǎng)基-甘油IX，含有最小必需培養(yǎng)基、甘油、小牛血清和牛血清)所標識的細胞冷凍培養(yǎng)基、LonzaPR0FREEZE?2 X 培養(yǎng)基或 Plasmalyte。
[0074]在一些實施方式中，無論是包封或非包封形式，根據(jù)本文所述的方法處理的細胞可以冷凍保存在包含一種或多種組分(如人血清白蛋白(HSA))的冷凍保存溶液中。在某些實施方式中，所述溶液包含約5 %、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%或約60%的HSA。在其他實施方式中，所述溶液包含約5%至約25%、約10%至約30%、約20%至約40%、約30%至約50%、約40%至約60%或約50%至約60%的HSA。在一種【具體實施方式】中，所述溶液包含40%的HSA。
[0075]在其他實施方式中，無論是包封或非包封形式，根據(jù)本文所述的方法處理的細胞可以冷凍保存在包含一種或多種冷凍保護劑(例如，DMS0)的冷凍保存溶液中。在某些實施方式中，所述溶液包含約1%、約1.5%、約2%、約2.5%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%的DMS0。在其他實施方式中，所述溶液包含約1%至約3%、約2%至約4%、約3%至約5%、約4%至約6%、約5%至約7%、約6%至約8%、約7%至約9%或約8%至約10%的DMS0。在一種【具體實施方式】中，所述溶液包含2.5%的DMS0。在另一種【具體實施方式】中，所述溶液包含5%的DMSO。
[0076]在其他實施方式中，無論是包封或非包封形式，根據(jù)本文所述的方法處理的
細胞可以冷凍保存在包含一種或多種在儲存細胞時使用的溶液(如I IypoThennosof
(BioLife Solutions, Bothell, WA))的冷凍保存溶液中。在某些實施方式中，所述溶液包含約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%或約70%的
HypoThermosol'在其他實施方式中，所述溶液包含約25%至約50%、約40%至約60%、約50%至約60%、約50%至約70%或約60%至約70%的HypoThermoso1?u在一種【具體實施方式】中，所述溶液包含55%的HypoThermosol'在另一種【具體實施方式】中，所述溶液包含57.5% 的'HypoThennosor
[0077]在其他實施方式中，無論是包封或非包封形式，根據(jù)本文所述的方法處理的細胞可以冷凍保存在包含一種或多種賦形劑的冷凍保存溶液中，所述賦形劑如葡聚糖、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、硅膠、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、甘油、丙烯和/或乙二醇。另外，無論是包封或非包封形式，根據(jù)本文所述的方法處理的細胞可以冷凍保存在包含某些培養(yǎng)基(例如，PBS或DMEM)的冷凍保存溶液中。
[0078]在一種【具體實施方式】中，根據(jù)本文所述的方法處理的細胞冷凍保存在包含40%HSA、5%DMS0和55% HypoTheimosoi1；的冷凍保存溶液中。在一種【具體實施方式】中，溶
液中的細胞包封并冷凍保存在所述溶液中。在另一種【具體實施方式】中，溶液中的細胞未包封，但冷凍保存在所述溶液中。
[0079]冷凍保存期間，可以(例如)以約1°C /min冷卻細胞。在一些實施方式中，冷凍保存溫度為約_80°C至約_180°C，或約_125°C至約_140°C。在融化以使用之前，可以將冷凍保存的細胞轉(zhuǎn)移至液氮的氣相。在一些實施方式中，例如，一旦細胞達到約_80°C，則將它們轉(zhuǎn)移至液氮儲存區(qū)。還可以使用速率控制的冰箱進行冷凍保存?？梢栽?例如)約25°C至約40°C的溫度下，并且通常在約37°C的溫度下融化冷凍保存的細胞。
[0080]6.2藥物組合物 [0081]本文提供了包含已根據(jù)本文所提供的方法處理的細胞的藥物組合物，包括以上
6.1.1節(jié)中所述的細胞組合物中的細胞。在具體的實施方式中，本文所提供的藥物組合物中的細胞是以上6.1.2節(jié)中所述的細胞類型。
[0082]本文所提供的藥物組合物可以包含配制用于體內(nèi)施用的細胞/液體海藻酸鹽溶液中的包封的細胞群體或非包封的細胞群體。在一些實施方式中，將細胞冷凍保存在表示可藥用組合物的冷凍保存溶液中，因此允許細胞在融化后直接施用于受試者，例如，將所述細胞冷凍保存在包含一種或多種6.1.4節(jié)中所述的組分的冷凍保存溶液中。在其他實施方式中，將細胞冷凍保存在表示可藥用組合物的冷凍保存溶液中，其中所述溶液包含海藻酸鹽并且其中所述細胞在融化后立即包封，隨后將所述包封的細胞直接施用于受試者。
[0083]在一種實施方式中，將本文所提供的組合物中的細胞以包含在容器中的細胞的組合物的形式施用于受試者。在一種【具體實施方式】中，所述容器是袋、燒瓶、小瓶或罐?？梢詫⒓毎麖乃鋈萜髦幸瞥⑹褂帽绢I域中已知的或下文6.3.1節(jié)中所述的任何適當手段(例如，注射)施用于受試者。在某些實施方式中，所述容器包含約，至少或至多IXlO2個細胞、IX IO3個細胞、I X IO4個細胞、I X IO5個細胞、I X IO6個細胞、5X IO6個細胞、I X IO7個細胞、5 X IO7個細胞、I X IO8個細胞、5 X IO8個細胞、I X IO9個細胞、5 X IO9個細胞、I X 101°個細胞或IXlO11個細胞。在一種【具體實施方式】中，所述藥物組合物中的細胞是干細胞。在另一種【具體實施方式】中，所述藥物組合物中的細胞是胎盤干細胞。在另一種【具體實施方式】中，所述藥物組合物中的細胞是AMDAC。
[0084]在某些實施方式中，本文所提供的藥物組合物包含細胞群體，所述細胞群體包含至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 99% 的活細
胞。在一種【具體實施方式】中，本文所提供的藥物組合物包含細胞群體，所述細胞群體包含至少95%的活細胞。在另一種【具體實施方式】中，本文所提供的藥物組合物包含細胞群體，所述細胞群體包含至少90%的活細胞。在一種【具體實施方式】中，本文所提供的藥物組合物包含細胞群體，所述細胞群體包含至少80%的活細胞。在一種【具體實施方式】中，本文所提供的藥物組合物包含細胞群體，所述細胞群體包含至少75%的活細胞。在一種【具體實施方式】中,本文所提供的藥物組合物包含細胞群體，所述細胞群體包含至少50%的活細胞。在一種【具體實施方式】中，本文所提供的藥物組合物包含細胞群體，所述細胞群體包含至少40%的活細胞。
[0085]6.3 用途
[0086]根據(jù)本文所述的方法處理的細胞及其藥物組合物對于多種目的是有用的，包括但不限于治療性用途。由于它們可以(i)在將它們?nèi)诨㈦S后包封后或(ii)在融化后但隨后無包封步驟的情況下施用于受試者，因此所述細胞及其藥物組合物是特別有用的。在每一種情況下，所述細胞及其藥物組合物是有用的，因為可以將它們施用于受試者而在融化后和施用前無需任何中間培養(yǎng)步驟，例如，可以立即施用所述細胞。另外，根據(jù)本文所述的方法處理的細胞及其藥物組合物是有用的，因為它們可以局部施用于受試者。如此，本文提供了將根據(jù)本文所述的方法處理的細胞或其藥物組合物施用(例如，局部施用)于受試者的方法。
[0087]6.3.1劑量和施用涂徑
[0088]根據(jù)本文所述的方法處理的細胞(例如，AMDAC或胎盤干細胞)或其藥物組合物向受試者的施用可以通過適合于所述細胞施用的任何醫(yī)學上可接受的途徑進行。在一種【具體實施方式】中，例如，在與施用目的有關的受試者體內(nèi)的特定位點處局部施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，通過推注施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，顱內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，肌內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，腹膜內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，皮內(nèi)或皮下施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，皮下施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，腦池內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，滑膜腔內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，眼內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，玻璃體內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，腦內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，腦室內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，鞘內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，通過骨內(nèi)輸液施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，膀胱內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，經(jīng)皮施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，腦池內(nèi)施用所述細胞。在另一種【具體實施方式】中，硬膜外施用所述細胞。
[0089]在另一種【具體實施方式】中，將細胞施用于受試者一次。在另一種【具體實施方式】中，以兩次或更多次單獨施用將所述細胞施用于受試者。在一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO2至I X IO3個細胞/千克受試者。在另一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO3至I X IO4個細胞/千克受試者。在另一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO4至I X IO5個細胞/千克受試者。在另一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO5至I X IO6個細胞/千克受試者。在另一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO6至I X IO7個細胞/千克受試者。在另一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO7至I X IO8個細胞/千克受試者。在另一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO8至I X IO9個細胞/千克受試者。在另一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO9至I X 101°個細胞/千克受試者。在另一種【具體實施方式】中，所述施用包括施用約IX101°至IX IO11個細胞/千克受試者。在其他【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO4至約2 X IO4個細胞/千克受試者；約2 X IO4至約3 X IO4個細胞/千克受試者；約3 X IO4至約4X IO4個細胞/千克受試者；約4X IO4至約5 X IO4個細胞/千克受試者；約5 X IO4至約6 X IO4個細胞/千克受試者；約6 X IO4至約7 X IO4個細胞/千克受試者；約7 X IO4至約8 X IO4個細胞/千克受試者；約8 X IO4至約9 X IO4個細胞/千克受試者；或約9 X IO4至約I X IO5個細胞/千克受試者。在其他【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO5至約2 X IO5個細胞/千克受試者；約2 X IO5至約3 X IO5個細胞/千克受試者；約3 X IO5至約4X IO5個細胞/千克受試者；約4X IO5至約5 X IO5個細胞/千克受試者；約5 X IO5至約6 X IO5個細胞/千克受試者；約6 X IO5至約7 X IO5個細胞/千克受試者；約7 X IO5至約8 X IO5個細胞/千克受試者；約8 X IO5至約9 X IO5個細胞/千克受試者；或約9 X IO5至約I X IO6個細胞/千克受試者。在其他【具體實施方式】中，所述施用包括施用約I X IO6至約2 X IO6個細胞/千克受試者；約2 X IO6至約3 X IO6個細胞/千克受試者；約3 X IO6至約4X IO6個細胞/千克受試者；約4X IO6至約5 X IO6個細胞/千克受試者；約5 X IO6至約6 X IO6個細胞/千克受試者；約6 X IO6至約7 X IO6個細胞/千克受試者；約7 X IO6至約8 X IO6個細胞/千克受試者；約8 X IO6至約9 X IO6個細胞/千克受試者；或約9 X IO6至約IX IO7個細胞/千克受試者。在一種【具體實施方式】中，所施用的細胞為干細胞。在另一種【具體實施方式】中，所施用的細胞為胎盤干細胞。在另一種【具體實施方式】中，所施用的細胞為AMDAC。
[0090]在另一種【具體實施方式】中，將細胞以單一單位劑量施用于受試者。在一種【具體實施方式】中，單一單位劑量的細胞在多種實施方式中可以包含大約，至少或不超過I X 105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X108、1X109、5X109、1X1010、5X1010、I X IO11個或更多個細胞。在一種【具體實施方式】中，作為單一單位劑量施用的細胞為干細胞。在另一種【具體實施方式】中，作為單一單位劑量施用的細胞為胎盤干細胞。在另一種【具體實施方式】中，作為單一單位劑量施用的細胞為AMDAC。
[0091]7.實施例
[0092]7.1實施例1:包封的胎盤干細胞的存活力
[0093]本實施例表明當包封在海藻酸鹽中時胎盤干細胞為活的。
[0094]7.1.1 在 25°C和 37°C儲存
[0095]將胎盤干細胞(5X IO5個細胞/毫升)懸浮在0.75%的海藻酸鹽溶液中并通過將所述細胞/液體海藻酸鹽溶液滴至CaCl2溶液(1.5%w/v)中進行包封。將所述包封的細胞在25°C或者37°C儲存七天，并通過用碘化丙啶標記死細胞和用乙酰甲氧基(AM)鈣黃綠素標記活細胞在各個時間點測量細胞存活力。
[0096]所述包封的胎盤干細胞在37°C保持存活7天，在25°C保持存活2天。
[0097]7.1.2 冷藏
[0098]將胎盤干細胞(5 X IO5個細胞/毫升和2 X IO6個細胞/毫升)懸浮在0.75%的海藻酸鹽溶液中并通過將所述細胞/液體海藻酸鹽溶液滴至CaCl2溶液(1.5%w/v)中進行包封。將HypoThermoso(BioLife Solutions, Bothell, WA)儲存溶液加入到包封的胎盤干細胞中，并將細胞在4°C或者37°C儲存7天(即細胞儲存在100% HypoTliermosoI" 11 O。
通過用碘化丙啶標記死細胞和用AM韓黃綠素標記活細胞或者通過使用CeliTker-Glofs發(fā)光細胞存活力測定(Promega，Madison, WI,其允許基于所存在的ATP的定量確定培養(yǎng)中活細胞的數(shù)目，它指示了代謝活性細胞的存在)測量ATP水平在各個時間點測量細胞存活力。
[0099]如所預期的，在37°C培養(yǎng)的HypoThemiosd'()中包封的胎盤干細胞在三天后死
亡。然而,在4°C培養(yǎng)的HypoThermosolR'中包封的胎盤干細胞存活長達7天。參見圖1。
[0100]7.2實施例2:冷凍保存的胎盤干細胞的包封
[0101]本實施例表明可以在融化后包封冷凍保存的胎盤干細胞，并且它們在不需要培養(yǎng)融化后細胞的情況下仍保持存活。
[0102]7.2.1融化后加入海藻酸鹽和融化后包封
[0103]將已在包含40%HSA、55%葡聚糖40和5%DMS0的冷凍保存溶液中冷凍保存的胎盤干細胞(7.5 X IO6個細胞/毫升)融化，并且在沒有任何中間培養(yǎng)步驟的情況下與1.5%的海藻酸鹽(在PBS中)以1:1的比例混合。然后，如實施例1所述包封細胞。包封后并且沒
有任何中間培養(yǎng)步驟，將HypoThermosol? (BioLife Solutions, Bothell, WA)儲存溶液加入至包封的胎盤干細胞中，并且將所述細胞在4°C在注射器中儲存7天(即所述細胞儲存在100% HypoThermosol?中)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用V1-CELL細胞存活力分析儀(Beckman Coulter, Brea, CA)分析包封的胎盤干細胞的存活力。剛包封后,所述胎盤干細胞為約80%存活。冷藏7天后，約45%的胎盤干細胞存活。
[0104]在單獨的實驗中，將已在包含40%HSA、55%葡聚糖40和5%DMS0的冷凍保存溶液中冷凍保存的胎盤干細胞(7.5X IO6個細胞/毫升)融化，并且在沒有任何中間培養(yǎng)步驟的情況下與1.5%的海藻酸鹽(在PBS中)以1:1的比例混合。然后，如實施例1所述包封細胞。包封后并且沒有任何中間培養(yǎng)步驟，將包封的胎盤干細胞在生長培養(yǎng)基中在3次單獨稀釋(IX、0.5X和0.25X)中稀釋，并且使用CellTiter-Glo?發(fā)光細胞存活力測定(Promega, Madison, WI)在包封后4小時和24小時測定存活力。所述包封的胎盤干細胞在兩個時間點均存活，其存活力在包封后4小時和24小時之間保持相對恒定。參見圖2。
[0105]這些實驗共同表明冷凍保存的胎盤干細胞可以懸浮在海藻酸鹽中并隨后在融化后包封，同時在融化后保持它們的存活力而無需進行培養(yǎng)。第一個實驗另外表明已懸浮在海藻酸鹽中并隨后在融化后立即包封的胎盤干細胞可以短時間冷藏并同時保持存活力。_6] 7.2.2冷凍保存前加入海藻酸鹽和融化后包封
[0107]將胎盤干細胞(7.5 X IO6個細胞/毫升)冷凍保存在包含5%DMS0、40%人血清白蛋白(HSA)和55%的海藻酸鹽(1.5%的濃度)的冷凍保存溶液中。隨后，將所述冷凍保存的胎盤干細胞融化，然后如實施例1所述包封所述胎盤干細胞。通過如上所述的ViCell評價所述包封的胎盤干細胞的存活力。在25°C，所述包封的胎盤干細胞在包封后長達7小時保持大于95%的存活力并且在包封后24小時保持約90%的存活力。
[0108]本實驗表明在液體海藻酸鹽中冷凍保存的胎盤干細胞可以在融化后包封，并且所述融化的包封的細胞保留了它們的存活力而無需進行培養(yǎng)。
[0109]等同件:[0110]本發(fā)明不限于本文所述的【具體實施方式】的范圍。事實上，除所述的實施方式以外，對本領域技術人員來說，通過上述說明和附圖披露的內(nèi)容，本發(fā)明的多種改變將是顯而易見的。意在將這些改變包括在所附權利要求的范圍內(nèi)。
[0111]在本文中引用了多個出版物、專利和專利申請，以上出版物、專利和專利申請的公開內(nèi)容以其全部內(nèi)容并 入本文作為參考。
【權利要求】
1.一種用于制備適合施用于受試者的包封的細胞群體的方法，所述方法包括: (i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物； (ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物； (iii)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和 (iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中的細胞。
2.一種用于制備適合施用于受試者的細胞群體的方法，所述方法包括: (i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；和 (ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物， 其中，所述冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物中的細胞可以在融化后立即施用于受試者。
3.一種用于將包封的細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括: (i)將細胞群體與包含 液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物； (ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物； (iii)融化所述冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物； (iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和 (v)將所述包封的細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者， 其中，所述施用是在步驟(iv)的包封后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)所述細胞的情況下進行的。
4.一種用于將細胞群體施用于受試者的方法，所述方法包括: (i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物； (ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物； (iii)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和 (iv)將所述細胞/液體海藻酸鹽組合物施用于受試者， 其中，所述施用是在步驟(iii)的融化后在所述細胞/液體海藻酸鹽組合物中不培養(yǎng)所述細胞的情況下進行的。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述細胞為干細胞。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中，所述干細胞分離自或來源于胎盤組織。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述干細胞為胎盤干細胞或AMDAC。
8.根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述冷凍保存溶液還包含DMSO、人血清白蛋白、葡聚糖或HypoThermosol?中的一種或多種。
9.一種包含包封的細胞群體的細胞組合物，其中，所述細胞是根據(jù)以下方法產(chǎn)生的:(i)將細胞與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；(iii)融化所述細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。
10.一種包含包封的細胞群體的細胞組合物，其中，所述細胞是根據(jù)以下方法產(chǎn)生的:(i)在冷凍保存溶液中冷凍保存細胞；(ii)融化所述冷凍保存的細胞；(iii)將包含液體海藻酸鹽的溶液加入到所述融化的細胞中以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(iv)包封所述細胞/液體海藻酸鹽組合物。
11.一種包含細胞群體的細胞組合物，其中，所述細胞是根據(jù)以下方法產(chǎn)生的:(i)將細胞群體與包含液體海藻酸鹽的冷凍保存溶液合并以產(chǎn)生細胞/液體海藻酸鹽組合物；和(ii)冷凍保存所述細胞/液體海藻酸鹽組合物，并且其中所述冷凍保存的細胞/液體海藻酸鹽組合物中的細胞可以在融化后不進行任何額外培養(yǎng)使用。
12.根據(jù)權利要求9-11中任一項所述的方法，其中，所述細胞為干細胞。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中，所述干細胞分離自或來源于胎盤組織。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中，所述干細胞為胎盤干細胞或AMDAC。
15.根據(jù)權利要求9-11中任一項所述的細胞組合物，其中，所述細胞懸浮在HypoThermosol? 中。
【文檔編號】A61K9/14GK103648507SQ201180068083
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2011年12月29日 優(yōu)先權日:2010年12月30日
【發(fā)明者】薩沙·阿布拉門遜 申請人:人類起源公司