含有透明質(zhì)酸的人工唾液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供含有透明質(zhì)酸（HA）的人工唾液。由于該人工唾液在人唾液的生理范圍內(nèi)并表現(xiàn)出足夠的抗菌活性，該人工唾液可用于治療口腔干燥或口腔念珠菌病，而且可有效地用于預(yù)防或治療唾液分泌減少所引起的并發(fā)癥。
【專利說明】含有透明質(zhì)酸的人工唾液
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及含有透明質(zhì)酸的人工唾液。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸(HA)是由單位D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖相交替組成的糖胺聚糖。D-葡糖醛酸與N-乙酰-D-氨基葡萄糖是通過β (I — 3)鍵相鏈接的，而N-乙酰-D-氨基葡萄糖與D-葡糖醛酸是通過β (I — 4)鍵相鏈接的。在眼睛的玻璃體液、關(guān)節(jié)的骨膜液以及細(xì)胞外基質(zhì)中富含ΗΑ。由于它先天的生物相容性和獨(dú)特的物理性質(zhì)，已在藥物傳遞、生物相容性物質(zhì)的制備、用于干眼病患者的人工眼淚、以及用于緩解骨關(guān)節(jié)炎癥的物質(zhì)中使用了 ΗΑ。
[0003]有報(bào)告稱,在人唾液中存在ΗΑ，而且唾液中的HA有助于唾液的潤(rùn)滑性能及治愈性能并協(xié)助保護(hù)口腔粘膜。還有報(bào)告稱，HA能起到抗念珠菌活性的作用。由于它的粘彈性和無免疫原性，HA已被認(rèn)為是代替口腔干燥患者唾液的候選物質(zhì)，并在一定濃度上表現(xiàn)出與人唾液類似的物理性質(zhì)。
[0004]已知唾液中的HA的減少與口腔干燥的發(fā)病有關(guān)，這能證明HA能夠保護(hù)并潤(rùn)滑口腔粘膜。此外，HA的傷口愈合活性和潛在抗念珠菌活性可進(jìn)一步有利于患有口干的、弱于口腔粘膜損傷和念珠菌病的患者。
[0005]一直以來，人們?cè)噲D用市場(chǎng)上可見的口腔衛(wèi)生產(chǎn)品來強(qiáng)化及復(fù)原唾液的抗菌能力。在口腔衛(wèi)生產(chǎn)品中使用最廣的抗菌蛋白質(zhì)包括溶菌酶(Iysozyme)和乳過氧化物酶(lactoperoxidase)。在唾液替代物中引入所述抗菌蛋白質(zhì)，以復(fù)原患有口干的、易受念珠菌病侵害的患者的唾液抗菌能力 。人們已了解溶菌酶的抗真菌活性和過氧化物酶的抗真菌活性的系統(tǒng)。眾所周知，通過將溶菌酶與過氧化物酶一起使用來增強(qiáng)殺傷念珠菌的活性。還未確定的是，將體外實(shí)驗(yàn)所得物以相同方法應(yīng)用到體內(nèi)環(huán)境中時(shí)，抗菌增補(bǔ)劑可能會(huì)減緩口腔干燥患者體內(nèi)的念珠菌病的發(fā)展。
[0006]口腔能提供唾液替代物與唾液分子可共存的環(huán)境。因此，所述唾液替代物HA分子也會(huì)與人唾液的抗菌分子相互作用。在現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中已提到HA-溶菌酶復(fù)合物(VanDamme et al.Binding of Hyaluronan to Lysozyme at Various PHSAj BiochemistryInternational, 1991 Julj 24(4)， 605-13 ; Van Damme et al.Binding Properties ofGlycosaminoglycans to Lysozyme-Effect of Salt and Molecular Weight, Archives ofBiochemistry and Biophysics, 1994 April, 310(1)， 16-24 ; Moss etal.Dependenceof Salt Concentration on Glycosaminoglycan-Lysozyme Interactions in Cartilage,Archives of Biochemistry and Biophysics, 1997 December 1， 348(1)， 49-55)和HA-過氧化物酶復(fù)合物(Green et al.Depolymerization of Synovial Fluid HyaluronicAcid(HA) by the Complete Myeloperoxidase (MPO) System May Involve the Formationof a HA-MPO 1nic Complex, The Journal of Rheumatology, 1990， 17:12， 1670-5)的存在。[0007]然而，還不清楚的是，HA將何以影響溶菌酶和過氧化物酶的抗念珠菌活性，以及HA會(huì)影響什么。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]技術(shù)問題
由此，本發(fā)明的一個(gè)目的，在于提供含有透明質(zhì)酸(HA)的人工唾液。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的，在于提供作為人工唾液所適合的HA濃度，以及抗菌添加劑溶菌酶和過氧化物的濃度。
[0010]技術(shù)問題
本發(fā)明提供含有0.4~0.6mg/mlHA的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液包含基于100重量份HA的10~12重量份的溶菌酶、和7 — 9重量份的過氧化物酶。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在所述人工唾液中溶菌酶的基于人工唾液總量的濃度可為50~6(^g/ml，或過氧化物酶的基于人工唾液總量的濃度可為36~43Pg/ml。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述HA的分子量可在IOODa~10，OOOKDa范圍內(nèi)，但本發(fā)明不會(huì)特別限于此范圍。
[0013]本發(fā)明的人工唾液可用于治療口腔干燥或口腔念珠菌病，而且還可以用于預(yù)防或治療唾液分泌減少所引起的并發(fā)癥。因此，本發(fā)明提供用于治療口腔干燥或口腔念珠菌病的人工唾液，或者提供用于預(yù)防或治療唾液分泌減少所引起的并發(fā)癥的人工唾液，其中所述人工唾液含有HA。
[0014]有益效果
本發(fā)明的人工唾液可用于治療口腔干燥或口腔念珠菌病，而且由于所述人工唾液在人唾液的生理范圍內(nèi)并表現(xiàn)出足夠的抗菌活性，可有效地用于預(yù)防或治療唾液分泌減少所引起的并發(fā)癥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為說明HA對(duì)人白色念珠菌ATCC10231生長(zhǎng)的抑制作用的圖。
[0016]圖2為說明HA對(duì)人白色念珠菌ATCC18804生長(zhǎng)的抑制作用的圖。
[0017]圖3為說明HA對(duì)人白色念珠菌ATCC11006生長(zhǎng)的抑制作用的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面，將結(jié)合實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
[0019]本發(fā)明提供含有0.4~0.6mg/ml透明質(zhì)酸(HA)的人工唾液,其特征在于,所述人工唾液含有基于100重量份HA的溶菌酶10~12重量份；和過氧化物酶7 — 9重量份。
[0020]在本發(fā)明中，由于所述HA在概念上同時(shí)含有HA和其鹽，在本發(fā)明中所用的術(shù)語“HA”指透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸鹽(hyaluronate)、或透明質(zhì)酸與透明質(zhì)酸鹽的混合物。所述透明質(zhì)酸鹽同時(shí)包括如透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅或透明質(zhì)酸鈷的無機(jī)鹽、以及如四丁基透明質(zhì)酸(hyaluronate tetrabutyIammonium)的有機(jī)鹽。必要時(shí)，可使用它們的組合物。[0021]溶菌酶是能水解細(xì)菌細(xì)胞壁上的多糖中的N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid，NAM)與N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之間的β_1，4_糖苷鍵的酶。通常，在雞蛋清、動(dòng)物組織、鼻粘膜、痰、胃液、流淚等中含有所述溶菌酶，而且所述溶菌酶具有殺菌及抗菌活性。
[0022]過氧化物酶是指能催化氧化反應(yīng)以使單胺、多胺、單酚、多酚、無色顏料、抗壞血酸、細(xì)胞色素C，HI等可用以下反應(yīng)式H2O2 (或CH3OOH):Η202+ΑΗ2 — 2Η20+Α表達(dá)的酶。
[0023]將HA制成在具有與唾液類似組成物的緩沖液(模擬唾液緩沖液)的濃度為0.5mg/ml時(shí)，在流變學(xué)上HA是最合適的唾液替代物。此外，作為抗菌添加劑，溶菌酶可加入基于100重量份HA的10~12重量份的量，而過氧化物酶可加入基于100重量份HA的7~9重量份的量。此時(shí)，人工唾液在人唾液的生理范圍內(nèi)，并表現(xiàn)出足夠的抗菌活性。
[0024]在本發(fā)明中，所述術(shù)語“重量份”是指重量比。
[0025]當(dāng)抗菌添加劑溶菌酶的量少于基于100重量份HA的10重量份，或過氧化物酶的量少于基于100重量份HA的7重量份時(shí)，所述人工唾液的抗真菌活性可能會(huì)不夠。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述人工唾液中的溶菌酶的濃度可以為基于人工唾液總量的50~6(^g/ml，或所述人工唾液中的過氧化物酶的濃度可以為基于人工唾液總量的36 ~43M<g/ml。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述HA的分子量可在100~10，OOOkDa范圍內(nèi)，但本發(fā)明不會(huì)特別限制于此。
[0028]本發(fā)明的人工唾液可以用來治療口腔干燥或口腔念珠菌病，而且可以用來預(yù)防或治療由唾液減少而引起的并發(fā)癥。因此，本發(fā)明提供用于治療口腔干燥或口腔念珠菌病的人工唾液，還提供用于預(yù)防或治療由唾液減少而引起的并發(fā)癥的人工唾液，其中該人工唾液包含HA。
【具體實(shí)施方式】
[0029]為能更好地理解，下面將進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明的示例性實(shí)施例。然而，這里提出的描述僅以說明優(yōu)選實(shí)施例為目的，不會(huì)限制本發(fā)明的范圍，從而應(yīng)當(dāng)理解成，在不超出本發(fā)明的范圍內(nèi)可作出其他等同物和修飾物。
[0030]設(shè)計(jì)下面的制備實(shí)施例以提供常用于本發(fā)明實(shí)施例的制備實(shí)施例。
[0031]制備實(shí)施例1:HA溶液
將HA (I, 630kDa, Sigma-Aldrich，美國(guó)密蘇里州圣路易斯)溶解在與唾液具有類似成分的緩沖液(模擬唾液緩沖液，包括SSB、0.021M的Na2HP04/NaH2P04、pH7.0、36mM的NaCl和0.96mM的CaCl2)或RPMI1640培養(yǎng)基中，形成三種不同的濃度(0.5、1.0和2.0mg/ml)。
[0032]制備實(shí)施例2:溶菌酶和過氧化物酶
將分別用作本發(fā)明的溶菌酶和過氧化物酶的雞蛋清溶菌酶(HEWL)和牛乳過氧化物酶(bLPO) (Sigma-Aldrich，美國(guó)密蘇里州圣路易斯)溶解于SSB中。為作分析，使用濃度為30.0μδ/πι1 的 HEWL，或使用濃度為 25.0μδ/πι1 的 bLPO 。
[0033]實(shí)施例1:HA的真菌生長(zhǎng)抑制活性
在本實(shí)驗(yàn)中使用了人白色念珠菌(Candida albicans)ATCC10231、18804和11006。在沙氏葡萄糖培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose medium)內(nèi)接種一個(gè)人白色念珠菌的菌落,其中每個(gè)人白色念珠菌生長(zhǎng)于沙氏葡萄糖瓊脂(SDA沖，然后在37°C下邊攪拌培養(yǎng)18小時(shí)。采集，清洗細(xì)胞，然后在RPMI1640培養(yǎng)基中使之再懸浮，其濃度為IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml。為檢測(cè)HA的真菌生長(zhǎng)抑制活性，將HA以不同濃度(0.5，1.0和2.0 mg/ml)溶解在100ml含有人白色念珠菌的RPMI1640培養(yǎng)基中，然后在37°C下邊攪拌進(jìn)行培養(yǎng)。在600nm下每隔I小時(shí)測(cè)量培養(yǎng)基的光密度而確定增殖期，然后將所述培養(yǎng)基的光密度與無HA培養(yǎng)基的光密度作比較。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)做4次。
[0034]HA表現(xiàn)出對(duì)人白色念珠菌生長(zhǎng)的抑制作用，而且該抑制作用與此實(shí)驗(yàn)中所用的HA的濃度成比例。所述HA對(duì)人白色念珠菌ATCCl 1006細(xì)胞株的抑制作用最強(qiáng)，而對(duì)人白色念珠菌ATCC18804細(xì)胞株的抑制作用最弱(見圖1、2和3)。
[0035]實(shí)施例2:HA的念珠菌殺傷活性
在IOml的RPMI1640培養(yǎng)基中接種人白色念珠菌ATCC10231、18804以及11006的菌落各一個(gè)，然后在37°C下邊攪拌培養(yǎng)18小時(shí)。采集，清洗細(xì)胞，然后在SSB中使之再懸浮，其濃度為IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml。為檢測(cè)HA的念珠菌殺傷活性，將20μ1細(xì)胞懸浮液以不同濃度加入到40μ1 HA (最終濃度:0.5、1.0和2.0mg/ml)中。在37°C下將樣本培養(yǎng)1.5小時(shí)，然后每隔15分鐘進(jìn)行混合。將最終培養(yǎng)樣本稀釋10倍，而后在SDA板上接種50μ1 (167個(gè)細(xì)胞)稀釋培養(yǎng)樣本，各弄成3份，然后在37°C下培養(yǎng)一夜。通過比較實(shí)驗(yàn)板與無HA對(duì)照板上的菌落數(shù)量，而檢測(cè)出念珠菌殺傷活性。此外，計(jì)算細(xì)胞存活率的損失(1-實(shí)驗(yàn)板上的菌落數(shù)/對(duì)照板上的菌落數(shù)X 100)。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)做6次。
[0036]HA (最終濃度:0.5、1.0和2.0mg/ml)表現(xiàn)出無可測(cè)的念珠菌殺傷活性,而且表現(xiàn)出所述實(shí)驗(yàn)板的所有細(xì)胞株與對(duì)照組(無HA)相比在菌落數(shù)量上無明顯差異。
[0037]實(shí)施例3:HA對(duì)溶菌酶和過氧化物酶的念珠菌殺傷活性的作用(HA與念珠菌細(xì)胞一起培養(yǎng)，然后用抗菌酶進(jìn)行處理)
將上述培養(yǎng)的白念珠菌的細(xì)胞懸浮液用于SSB中，其濃度為IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml，然后將20μ1細(xì)胞懸浮液加入到等量HA(最`終濃度:0.5、1.0和2.0mg/ml)中。在37°C下，將樣本邊攪拌培養(yǎng)I小時(shí)。40μ1所述細(xì)胞懸浮液與2(^1HEWL (最終濃度:30μ8/πι1)混合，或與20μ1過氧化物酶(最終濃度:25Pg/ml的bLPO，ImM的KSCN和ΙΟΟμΜ的H2O2)混合，然后在37°C下邊攪拌培養(yǎng)I小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將樣本稀釋10倍，而后在SDA板上接種50μ1 (167個(gè)細(xì)胞)稀釋培養(yǎng)樣本，各弄成三份，然后在37°C下培養(yǎng)一夜。計(jì)算念珠菌殺傷活性及細(xì)胞存活率的損失。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)做8次。
[0038]HA表現(xiàn)出對(duì)溶菌酶和過氧化物酶系統(tǒng)中的念珠菌殺傷活性的抑制作用，而且所述抑制作用與HA的濃度成比例。根據(jù)所述人白色念珠菌細(xì)胞株，其抑制程度也不同，但HA在
1.0-2.0mg/ml時(shí)，可完全抑制本實(shí)驗(yàn)中所用的溶菌酶和過氧化物酶系統(tǒng)中的念珠菌殺傷活性。【表1】
【權(quán)利要求】
1.含有0.4~0.6mg/ml透明質(zhì)酸的人工唾液，所述人工唾液包含基于100重量份透明質(zhì)酸的: 10~12重量份的溶菌酶，和 7、重量份的過氧化物酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液中溶菌酶的基于人工唾液總量的濃度為50~6(^g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液中過氧化物酶的基于人工唾液總量的濃度為36~43Pg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任何一項(xiàng)所述的人工唾液，其特征在于，所述透明質(zhì)酸為透明質(zhì)酸本身、透明質(zhì)酸鹽、或透明質(zhì)酸與透明質(zhì)酸鹽的混合物，且所述透明質(zhì)酸鹽為無機(jī)鹽如透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅或透明質(zhì)酸鈷，或?yàn)橛袡C(jī)鹽如四丁基透明質(zhì)酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的人工唾液，其特征在于，所述透明質(zhì)酸的分子量為 100 ~10，000 kDa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液可用于治療口腔干燥或口腔念珠菌病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的人工唾液，其特征在于，所述人工唾液可用于預(yù)防或治療唾液分泌減少所引起的 并發(fā)癥。
【文檔編號(hào)】A61P27/04GK103491967SQ201180068991
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月5日
【發(fā)明者】高弘燮, 樸文秀 申請(qǐng)人:首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)