用于在植物和植物細(xì)胞中表達(dá)α-半乳糖苷酶的核酸構(gòu)建體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了核酸表達(dá)構(gòu)建體，更具體地，提供了用于在植物細(xì)胞中表達(dá)人α-半乳糖苷酶的核酸構(gòu)建體及其應(yīng)用，所述細(xì)胞表達(dá)核酸構(gòu)建體以產(chǎn)生人α-半乳糖苷酶。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于在植物和植物細(xì)胞中表達(dá)α-半乳糖苷酶的核酸構(gòu)建體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明在其一些實(shí)施方式中涉及核酸表達(dá)構(gòu)建體，并且更具體但不排它地，涉及用于表達(dá)植物細(xì)胞中α -半乳糖苷酶的核酸構(gòu)建體及其應(yīng)用，所述細(xì)胞表達(dá)核酸構(gòu)建體和人α-半乳糖苷酶。
【背景技術(shù)】
[0002]法布里病(Fabry disease)是一種由溶酶體酶α -半乳糖苷酶A ( a-Gal Α)的活性缺陷引起的伴X溶酶體貯積病?；加械湫头ú祭锊〉幕颊咄ǔ＞哂械腶-Gal A活性小于1%，并且通常表現(xiàn)出很多種癥狀，包括四肢劇痛(肢端感覺(jué)異常)、少汗、角膜和晶狀體改變、皮膚損傷(血管角質(zhì)瘤)、腎衰竭、心血管病、肺衰竭、神經(jīng)癥狀、以及中風(fēng)。在非典型的法布里病中，帶有殘余酶活性的個(gè)體在生命后期表現(xiàn)出癥狀，并且這些癥狀通常限于一個(gè)或幾個(gè)器官。由于X染色體的隨機(jī)失活，女性攜帶者的臨床表現(xiàn)差異很大。盡管攜帶者通常保持整個(gè)生命期間無(wú)癥狀，然而許多攜帶者表現(xiàn)出與男性患者相同的可變性和嚴(yán)重性。DeDuve首次提出用外源生物活性酶代替缺失的溶酶體酶可能是治療溶酶體貯積病的可行方法[Fed Proc.23:1045(1964)]。
[0003]用于酶替代療法的重組α-半乳糖苷酶A已經(jīng)在昆蟲(chóng)(sf9)細(xì)胞(參見(jiàn)US7，011，831)、人成纖維細(xì)胞(參見(jiàn)US 6，395，884)、以及植物細(xì)胞(參見(jiàn)US 6，846，968和WO2008/132743)中產(chǎn)生。已經(jīng)用重組 a-Gal A (半乳糖苷酶 β [Fabrazyme ? ]):GenzymeCorporation, Cambridge, Mass ;半乳糖苷酶 a [Replagal ⑩]:Shire Human GeneticTherapies Corporation, Cambridge, Mass)進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，并且兩種藥物已經(jīng)批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用。自2009年起，多于2000例患者已經(jīng)用這兩種可用的制劑中的任一種治療，總體而言，已經(jīng)證明了這兩種制劑的`安全性和有效性(Hoffmann, Orphanet J Rare Dis.Dis.2009;4:21)。
[0004]臨床經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)表明:考慮到患者的耐受性、免疫原性、給藥方案、以及臨床療效，可用的重組酶組合物有所不同(Hoffmann, Orphanet J Rare Dis.Dis.2009，4:21)。與現(xiàn)有重組酶相關(guān)的另一個(gè)缺點(diǎn)是它們的費(fèi)用，這一缺點(diǎn)可以對(duì)健康管理系統(tǒng)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物、生物反應(yīng)器、或昆蟲(chóng)細(xì)胞中生產(chǎn)重組酶時(shí)，復(fù)雜的純化、修飾方案和現(xiàn)有治療所需的相當(dāng)大量的治療導(dǎo)致了這些重組酶的高成本。因此，迫切需要降低α -半乳糖苷酶的成本，使得這種挽救生命的治療可以更低廉地向所有需要這種治療的患者提供。
[0005]可以在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)人溶酶體酶以解決安全性、病毒感染、免疫反應(yīng)、產(chǎn)物產(chǎn)率和成本的問(wèn)題。US 2002/0088024教導(dǎo)了使用水稻-淀粉酶ER靶向信號(hào)肽以及在C端部分截短的人α-半乳糖苷酶編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)重組人α-半乳糖苷酶，所述人α-半乳糖苷酶編碼序列用于有效表達(dá)和分泌到細(xì)胞內(nèi)液。
[0006]WO 97/10353教導(dǎo)了使用創(chuàng)傷誘導(dǎo)(wound-1nduced) MeGA啟動(dòng)子和用于恢復(fù)的FLAG標(biāo)簽在植物中生產(chǎn)溶酶體酶，尤其是IDUA和葡糖腦苷酯酶。WO 97/10353沒(méi)有提供用于表達(dá)重組人α-半乳糖苷酶特定構(gòu)建體的指導(dǎo)。
[0007]Cramer 等(Curr.Topics Trans.1999 Plants95_118)以與 WO 97/10353 類(lèi)似的方式重復(fù)了在植物細(xì)胞中，即在煙葉的內(nèi)膜(IF)中葡糖腦苷酯酶和IDUA表達(dá)的方法，并且大體上描述了植物表達(dá)，但是沒(méi)有提供用于人重組α -半乳糖苷酶的指導(dǎo)。
[0008]US2006-0204487教導(dǎo)了用于在植物細(xì)胞中表達(dá)人溶酶體酶的方法，針對(duì)用于有效糖基化和聚糖重建(remodel)的靶向重組多肽(尤其是葡糖腦苷酯酶)，所述方法使用了多種策略。沒(méi)有披露由特異性構(gòu)建體克隆與表達(dá)重組人α-半乳糖苷酶。
[0009]W02007/010533教導(dǎo)了表達(dá)重組生物活性分子的植物細(xì)胞的施用，所述生物活性分子如溶酶體酶(如人葡糖腦苷酯酶和人α-半乳糖苷酶)。沒(méi)有披露重組人α-半乳糖苷酶的克隆與表達(dá)。
[0010]WO 2008/132743描述了將人α -半乳糖苷酶編碼序列克隆在植物表達(dá)載體中，并描述了其在煙草細(xì)胞中的表達(dá)，產(chǎn)生了具有生物活性的全長(zhǎng)糖基化α-半乳糖苷酶，證明了所述α-半乳糖苷酶在成纖維細(xì)胞中的吸收。然而，需要在臨床條件下進(jìn)一步提高具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)(pharmacokinetics)的重組人α -半乳糖苷酶蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)效率的更先進(jìn)的α-半乳糖苷酶表達(dá)載體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了一種核酸表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括編碼人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)`肽，并且其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留(retention)信號(hào)肽。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了具有N端甘氨酸殘基的人α-半乳糖苷酶蛋白，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，核酸序列包括SEQ ID Ν0:22ο
[0014]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽如SEQ ID Ν0:4中所
/Jn ο
[0015]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，核酸構(gòu)建體包括如SEQ ID Ν0:5中所示的編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽的核酸序列。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽如SEQ ID Ν0:6中所示。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，核酸構(gòu)建體包括如SEQ ID Ν0:19中所示的編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留肽的核酸序列。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，核酸序列具有如SEQ ID Ν0:2中所示的序列。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQ ID Ν0:1中所示的氨基酸序列。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，核酸序列的密碼子使用是針對(duì)煙草(Nicotiniatabaccum)優(yōu)化的。
[0021 ] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一些方面，提供了包括本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的分離細(xì)胞。[0022]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，細(xì)胞重組產(chǎn)生人α-半乳糖苷酶。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，人α-半乳糖苷酶包括N端甘氨酸殘基。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，細(xì)胞是植物細(xì)胞。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，植物細(xì)胞是煙草細(xì)胞。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，煙草細(xì)胞是ΒΥ-2細(xì)胞。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白重組產(chǎn)生，以具有至少一個(gè)
暴露的甘露糖殘基。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，人α-半乳糖苷酶蛋白重組產(chǎn)生，以具有至少一個(gè)核β_(1，2)木糖、或至少一個(gè)核α-(1，3)巖藻糖、或者至少一個(gè)核β_(1，2)木糖和至少一個(gè)核α-(1，3)巖藻糖。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，核酸構(gòu)建體穩(wěn)定整合在細(xì)胞的基因組中。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，細(xì)胞是根癌土壤桿菌(農(nóng)桿菌，(Agrobacteriumtumefaciens)細(xì)胞。
[0031]根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一方面，提供了生產(chǎn)重組人α-半乳糖苷酶蛋白的方法，所述方法包括:提供根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞，然后培養(yǎng)所述細(xì)胞以產(chǎn)生所述重組人α -半乳糖苷酶蛋白，以及從所述細(xì)胞中分離所述重組人α -半乳糖苷酶蛋白。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述細(xì)胞是在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的分離細(xì)胞。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述培養(yǎng)是在一次性生物反應(yīng)器中進(jìn)行的。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有如在SEQ ID NO: 16中所示的氨基酸序列。
[0035]根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括作為活性成分的本發(fā)明的人α-半乳糖苷酶蛋白和藥用載體。
[0036]根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括作為活性成分的本發(fā)明的細(xì)胞和藥用載體。
[0037]根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方式的一方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括作為活性成分的本發(fā)明的人α-半乳糖苷酶蛋白的群體以及藥用載體，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白的群體的主要聚糖結(jié)構(gòu)是甘露糖4- β-(I, 2)木糖(Μ4Χ)、甘露糖3- β-(I, 2)木糖-α-(1，3)巖藻糖[Fe (3) Μ3Χ]、以及甘露糖8 (Μ8)。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了在需要其的受試者中治療法布里病的方法，所述方法包括給予受試者本發(fā)明的藥物組合物。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了藥物組合物，所述藥物組合物包括本發(fā)明的人α-半乳糖苷酶蛋白以及藥用載體，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有包括9個(gè)甘露糖殘基并且其中3個(gè)是暴露的甘露糖殘基的聚糖結(jié)構(gòu)。具有包括9個(gè)甘露糖殘基并且其中3個(gè)是暴露的甘露糖殘基的聚糖結(jié)構(gòu)的人α -半乳糖苷酶蛋白可以組成0.5%、0.8%、1.0%、1.3%、2%以上的人α -半乳糖苷酶蛋白的群體。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了在需要其受試者中治療法布里病的方法，所述方法包括給予受試者包括本發(fā)明的細(xì)胞的藥物組合物。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一方面，提供了本發(fā)明的人α-半乳糖苷酶蛋白在制備用于在需要其的受試者中治療法布里病的藥物中的應(yīng)用。[0042]除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的任何普通技術(shù)人員通常理解的具有相同的意義。雖然類(lèi)似于或等價(jià)于本文中描述的那些的方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)施方式的實(shí)施或試驗(yàn)，但是如下描述了示例性的方法和/或材料。在矛盾的情況下，專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)包括定義將用于對(duì)照。此外，材料、方法、以及實(shí)施例僅是示例性的，并非旨在必要的限制。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0043]參照附圖，僅通過(guò)實(shí)施例在本文中描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方式?，F(xiàn)在具體參照詳細(xì)的附圖，強(qiáng)調(diào)了通過(guò)實(shí)例的方式示出細(xì)節(jié)，并且這些細(xì)節(jié)是為了示例性地討論本發(fā)明的實(shí)施方式。在這點(diǎn)上，利用附圖進(jìn)行的描述使得可以如何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
[0044]在附圖中:
[0045]圖1是由本發(fā)明的核酸編碼的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO: 1，下面序列)與包括天然信號(hào)前導(dǎo)肽(SEQ ID Ν0:3，以紅色突出顯示)的天然人α-半乳糖苷酶蛋白(基因庫(kù):Χ05790，上面的序列)的氨基酸序列的排列。擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(SEQ ID Ν0:4)以綠色突出顯示。SEKDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽(SEQ ID NO:6)位于植物表達(dá)蛋白的C端。成熟的天然α-半乳糖苷酶蛋白序列(SEQ ID NO: 7)以黃色突出顯示。
[0046]圖2是示出植物細(xì)胞中不同人α -半乳糖苷酶構(gòu)建體表達(dá)水平的SDS-PAGE凝膠掃描。用不同的人ct -半乳糖苷酶構(gòu)建體浸潤(rùn)(infiltrate)的本氏煙(N.benthamaina)植物葉片的提取物在12%的SDS-PAGE還原凝膠上分離，并且使用用于蛋白可視化的考馬斯藍(lán)染色。泳道(Iane)I=編碼具有蘋(píng)果果膠酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(蘋(píng)果果膠酶信號(hào)肽=SEQ IDN0:9)的α-半乳糖苷酶構(gòu)建體(SEQ ID NO: 8)的表達(dá)產(chǎn)物。泳道2=編碼具有ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(ΑΒΡΙ信號(hào).肽=SEQ ID NO: 4)的α-半乳糖苷酶的SEQ ID NO:2的表達(dá)產(chǎn)物。泳道3=編碼具有蘋(píng)果果膠酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(SEQ ID Ν0:9)的SEQ ID Ν0:12的SEQ IDΝ0:11的表達(dá)產(chǎn)物。泳道4=陰性(沒(méi)有α-半乳糖苷酶編碼序列)對(duì)照。泳道2中的突出帶(箭頭)對(duì)應(yīng)成熟重組α-半乳糖苷酶單體的大小(SEQ ID Ν0:21)?？捡R斯染色帶顯示豐富的α-半乳糖苷酶蛋白；
[0047]圖3是示出表達(dá)不同人α-半乳糖苷酶構(gòu)建體的植物提取物中催化活性水平的柱狀圖。本氏煙植物的葉片用如下的不同人α -半乳糖苷酶構(gòu)建體浸潤(rùn):A=SEQ ID Ν0:8，其編碼具有蘋(píng)果果膠酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(蘋(píng)果果膠酶信號(hào)肽=SEQ ID Ν0:9)的α-半乳糖苷酶蛋白。B=SEQ ID NO:2，其編碼具有ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(ΑΒΡΙ信號(hào)肽=SEQ ID Ν0:4)的α-半乳糖苷酶蛋白。C=SEQ ID NO: 13，其編碼具有內(nèi)切殼多糖酶B內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(內(nèi)切殼多糖酶信號(hào)蛋白=SEQ ID Ν0:14)的α -半乳糖苷酶蛋白。D=SEQ ID Ν0:11，其編碼具有蘋(píng)果果膠酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(蘋(píng)果果膠酶信號(hào)序列=SEQ ID Ν0:9)的α-半乳糖苷酶蛋白(SEQ ID NO: 12)。在活性檢測(cè)緩沖液中提取各植物的葉片，使用對(duì)硝基苯基-a-D-批喃半乳糖苷(pNP-α -D-Gal, GBB1290, IRIS Biotech, Germany)作為水解基質(zhì)(substrate)測(cè)定催化活性。在405nm下監(jiān)測(cè)對(duì)硝基苯酚酯/鹽生色團(tuán)的生成。
[0048]圖4是通過(guò)殘基的催化活性測(cè)定的人血漿(37°C)中兩種植物重組人α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的比較圖。用SEQ ID NO: 11轉(zhuǎn)化的本氏煙植物葉片中的α-半乳糖苷酶，所述SEQ ID NO: 11編碼具有蘋(píng)果果膠酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(空心方形)的SEQ ID N0:12;以及用SEQ ID N0:2轉(zhuǎn)化的本氏煙植物葉片中的α-半乳糖苷酶，所述SEQ ID Ν0:2編碼具有ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(實(shí)心方形)的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:1 )，通過(guò)植物破碎、鹽析、以及層析純化，并在37°C下的人血漿中溫育至多達(dá)I小時(shí)以模擬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。在指定的時(shí)間間隔內(nèi)，通過(guò)PNP-G檢測(cè)測(cè)定樣品的α-半乳糖苷酶的催化活性。記錄表達(dá)SEQ IDNO:1 (實(shí)心方形)的本氏煙植物葉片中α-半乳糖苷酶的較大的穩(wěn)定性。
[0049]圖5是植物細(xì)胞中表達(dá)的α -半乳糖苷酶(實(shí)心方形)與人細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的商用人重組α-半乳糖苷酶(R印Iagal㊣，空心三角形)催化活性穩(wěn)定性的比較圖。表達(dá)SEQID NO:2的ΒΥ2細(xì)胞的未純化提取物，所述SEQ ID Ν0:2編碼具有ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽(實(shí)心方形)的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:1);以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(R印Iagal⑩，空心三角形)中表達(dá)的人重組α-半乳糖苷酶在37°C的血漿中溫育至多達(dá)I小時(shí)以模擬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。在指定的時(shí)間間隔內(nèi)，通過(guò)PNP-G檢測(cè)測(cè)定樣品的α-半乳糖苷酶的催化活性。記錄植物細(xì)胞表達(dá)酶和人細(xì)胞表達(dá)酶的相似穩(wěn)定性。
[0050]圖6是植物細(xì)胞中表達(dá)的α -半乳糖苷酶(實(shí)心方形)與人細(xì)胞培養(yǎng)(Replagal ?，空心三角形)中表達(dá)的商用人重組α-半乳糖苷酶的催化活性的穩(wěn)定性比較圖。表達(dá)SEQID NO:2的ΒΥ2細(xì)胞的未純化提取物，所述SEQ ID Ν0:2編碼具有ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽
(實(shí)心方形)的α-半乳糖苷酶(seq ID NO:1);以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(Replagalx,空
心三角形)中表達(dá)的人重組α-半乳糖苷酶在37°c下的模擬溶酶體環(huán)境[酸性(PH4.6)]的條件下溫育11天。當(dāng)溫育時(shí)，在指定的時(shí)間間隔內(nèi)，通過(guò)PNP-G檢測(cè)測(cè)定樣品的α-半乳糖苷酶的催化活性。記錄植物表達(dá)酶和哺乳動(dòng)物表達(dá)酶至多達(dá)9天的相似穩(wěn)定性。
[0051]圖7是示出植物細(xì)胞表達(dá)的α -半乳糖苷酶的糖基酶消化產(chǎn)物中聚糖結(jié)構(gòu)分布的彩圖。還原、烷基化、并在SDS-PAGE上分離表達(dá)SEQ ID NO:2的ΒΥ2細(xì)胞提取物樣品，所述SEQ ID Ν0:2編碼具有ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:1)。通過(guò)胰蛋白酶消化，隨后用PNG ase A (肽N-糖苷酶Α)和PNGase F (肽N-糖苷酶F)消化，采用蛋白帶進(jìn)行聚糖分析。萃取、純化、用熒光試劑鄰氨基苯甲酰胺(2ΑΒ)標(biāo)記、使用TSK凝膠酰胺80正相HPLC分離、并使用熒光檢測(cè)器檢測(cè)生成的自由聚糖。記錄在5.9⑶和8.9⑶(84.55分鐘和108.05分鐘)處的主鋒，以及在112.35處的次峰(minor peak)M9 ；
[0052]圖8是示出植物細(xì)胞表達(dá)α -半乳糖苷酶的聚糖分布(profile)的表格,所述聚糖分布表示為圖7的彩圖中表示的單個(gè)聚糖的百分比面積。記錄各次單獨(dú)分析(A和B)的相同分布。
【具體實(shí)施方式】
[0053]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中涉及用于在植物細(xì)胞中重組表達(dá)人α-半乳糖苷酶的表達(dá)載體、用于在植物細(xì)胞中表達(dá)人α-半乳糖苷酶的方法、以及由此產(chǎn)生的人α-半乳糖苷酶。
[0054]應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并非將其應(yīng)用必要地限于如下描述中所給出的或由實(shí)施例舉例說(shuō)明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明可以是其它實(shí)施方式，或能夠以各種方式實(shí)施或進(jìn)行。
[0055]本發(fā)明人已構(gòu)建了用于在植物細(xì)胞中重組表達(dá)人α-半乳糖苷酶的表達(dá)載體，用載體轉(zhuǎn)化的煙草植物和植物細(xì)胞，并且從植物和細(xì)胞培養(yǎng)物中催化分離了活性人α -半乳糖苷酶。表達(dá)的重組人α-半乳糖苷酶在模擬通常體內(nèi)施用所存在的條件下保持良好的催化活性，這表明與其它源于植物的重組人α-半乳糖苷酶相比，其具有改善的模擬藥代動(dòng)力學(xué)，并且與那些哺乳動(dòng)物表達(dá)的重組人α -半乳糖苷酶(Replaga廣)相似。
[0056]因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了核酸表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括編碼人α -半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α -半乳糖苷酶蛋白在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽，并且其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽。
[0057]如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“人α-半乳糖蛋白”是指人α -半乳糖苷酶Α( a-D-半乳糖苷半乳糖水解酶；EC3.2.1.22 ；α -Gal Α)多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，人α -半乳糖苷酶蛋白是具有如SEQ ID NO:7 (成熟人Α-Gal)所示的氨基酸序列的成熟人α -半乳糖苷酶蛋白。將理解，人α-半乳糖苷酶蛋白可以是改變的人α-半乳糖苷酶蛋白，具有不同于SEQ ID Ν0:7的氨基酸序列。由本發(fā)明的表達(dá)載體編碼的改變的人α-半乳糖苷酶蛋白的一個(gè)非限制性實(shí)例是SEQ ID NO: 16 (G-A-Gal)0在另一個(gè)非限制性實(shí)例中，由表達(dá)載體編碼的人α-半乳糖苷酶可以是包括具有N端甘氨酸殘基(G)如SEQ ID Ν0:16或SEQ IDNO: 21，以及不具有N端甘氨酸殘基如，但不限于，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 20的α-半乳糖苷酶蛋白的人α-半乳糖苷酶蛋白混合物。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，人α -半乳糖苷酶蛋白在N端被翻譯融合在擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽，并且人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽。
[0059]如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“在N端翻譯融合”或“在C端翻譯融合”指的是指定的肽通過(guò)肽鍵共價(jià)連接至成 熟人α-半乳糖苷酶蛋白的N端氨基酸或C端氨基酸，作為重組表達(dá)的結(jié)果。
[0060]如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽”是指擬南芥(Arabidopsis thaliana)生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白的前導(dǎo)肽序列(Un1-Prot登記號(hào):P33487),所述前導(dǎo)肽序列能夠直接表達(dá)在植物細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在一個(gè)實(shí)施方式中，擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽是如SEQ ID NO:4所示的33個(gè)氨基酸的多肽。
[0061]如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽”是指當(dāng)存在于多肽的N端或C端時(shí)引起多肽從高爾基體中返回(retrieve),并保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的多肽序列(參見(jiàn)Rayon等，Journal of Experimental Botany, Vol.49, N0.326, pp.1463-1472，1998 ；以及 Neumann 等Annals of Botany, 2003; 92:167-180)。在一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽是KDEL(SEQID NO: 17)或SEKDEL (SEQ ID N0:6)。本領(lǐng)域已知其它合適的植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)(參見(jiàn)Pagny等，Journal of Experimental Botany, Vol.50，pp.157-64)。
[0062]因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽的人α-半乳糖苷酶蛋白，并且在C端被翻譯融合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽的人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0063]如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸序列”是指能夠分離和以RNA序列、互補(bǔ)多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合多核苷酸序列(例如，以上序列的組合)形式提供的單鏈核酸序列或雙鏈核酸序列。
[0064]如在本文中使用的短語(yǔ)“互補(bǔ)多核苷酸序列”是指使用反轉(zhuǎn)錄酶或任何其它RNA依賴(lài)性DNA聚合酶由信使RNA的反轉(zhuǎn)錄得到的序列。這種序列隨后可以使用DNA依賴(lài)性DNA聚合酶在體內(nèi)或體外擴(kuò)增。
[0065]如在本文中使用的短語(yǔ)“基因組多核苷酸序列”是指源于(分離自)染色體的序列，從而它代表染色體的連續(xù)部分。
[0066]如在本文中使用的短語(yǔ)“復(fù)合多核苷酸序列”是指其為至少部分互補(bǔ)的并且至少部分基因組的序列。復(fù)合序列可以包括一些編碼本發(fā)明的多肽需要的外顯子序列，以及插入在其中的一些內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可以是包括其它基因的任何來(lái)源，并且通常將包括保守剪接信號(hào)序列。這種內(nèi)含子序列還可以包括順式作用表達(dá)調(diào)控元件。
[0067]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，編碼本發(fā)明多肽的核酸序列是用于表達(dá)的最佳序列。這種序列改變的實(shí)例包括，但不限于，改變G/C含量以更接近通常在關(guān)注的植物中確定的含量，以及去除在植物中發(fā)現(xiàn)的非典型密碼子，通常被稱(chēng)為密碼子優(yōu)化。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列的密碼子使用是用于煙草或本氏煙的優(yōu)化密碼子，所述人α-半乳糖苷酶在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽，并且所述人α-半乳糖苷酶在C端被翻譯融合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽。
[0068]短語(yǔ)“密碼子優(yōu)化”是指選擇適當(dāng)?shù)腄NA核苷酸用于結(jié)構(gòu)基因或其片段內(nèi)，其接近在關(guān)注的植物內(nèi)的密碼子使用。因此，優(yōu)化的基因或核酸序列是指其中已將原始或天然存在的基因改變以在植物中利用統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)選的或統(tǒng)計(jì)學(xué)有利的密碼子的基因。通常在DNA水平以及用于在植物中表達(dá)的優(yōu)化編碼區(qū)檢查核苷酸序列，使用任何合適的程序測(cè)定，例如在Sardana等(1996, Plant Cell Reportsl5:677_681)中描述的。在該方法中，首先可以通過(guò)找到相對(duì)于高度表達(dá)的植物基因，天然基因的每個(gè)密碼子的使用的比例方差，隨后計(jì)算平均方差來(lái)計(jì)算密碼子使用的標(biāo)準(zhǔn)偏差(一種密碼子使用偏性的測(cè)度)。使用的公式是:I SDCU=n=l N[ (Xn-Yn)/Yn] 2/N，其中Xn是指在高表達(dá)的植物基因中密碼子η的使用頻率，Yn是指在關(guān)注的基因中的密碼子η的使用頻率，并且N是指關(guān)注的基因中的密碼子的總數(shù)。來(lái)自雙子葉植物的高表達(dá)基因中的密碼子使用的表格是利用Murray等(1989，Nuc AcidsRes.17:477-498)的數(shù)據(jù)編譯的`。
[0069]根據(jù)用于特定植物細(xì)胞類(lèi)型的優(yōu)選密碼子使用的核酸序列優(yōu)化的一個(gè)方法基于直接使用密碼子優(yōu)化表，如通過(guò)日本的NIAS (National Institute of AgrobiologicalSciences) DNA 庫(kù)(Hypertext Transfer Protocol Hypertext Transfer ProtocolHypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/)在密碼子使用資料庫(kù)(Codon Usage Database)在線提供的那些,而沒(méi)有進(jìn)行任何額外的統(tǒng)計(jì)計(jì)算。密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)包括用于許多不同物種的密碼子使用表，每個(gè)密碼子使用表已經(jīng)基于存在于基因庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)定。
[0070]通過(guò)利用上述表格以測(cè)定針對(duì)在特定物種(例如，水稻)中的每種氨基酸的最優(yōu)選或最有利的密碼子，編碼關(guān)注的蛋白的天然存在的核苷酸序列可以是針對(duì)特定植物品種的優(yōu)化密碼子。這是通過(guò)取代那些可能在具有相應(yīng)密碼子的特定物種的基因組中具有低統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)生率的密碼子實(shí)現(xiàn)的，就氨基酸而言，那些是統(tǒng)計(jì)學(xué)更有利的。然而，可以選擇一種或多種不太有利的密碼子以刪除現(xiàn)有的限制性位點(diǎn)，從而在潛在有用的連接(5'和3'端以增加信號(hào)肽或終止盒，可能用于切斷和剪接區(qū)段以產(chǎn)生正確的全長(zhǎng)序列的內(nèi)部位點(diǎn))處創(chuàng)建新的連接，或者除去可能對(duì)mRNA穩(wěn)定性或表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響的核苷酸序列。
[0071]在任何改變之前，期望的編碼核苷酸序列可以已經(jīng)包含相應(yīng)于在特定植物品種中統(tǒng)計(jì)學(xué)有利的密碼子的許多密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可以包括:在期望的核苷酸序列內(nèi)確定對(duì)于特定植物而言統(tǒng)計(jì)學(xué)不利的密碼子，以及根據(jù)特定植物的密碼子使用表改變這些密碼子以產(chǎn)生密碼子優(yōu)化衍生物。改變的核苷酸序列可以針對(duì)植物密碼子使用完全或部分優(yōu)化，條件是由改變的核苷酸序列編碼的蛋白以比由相應(yīng)天然產(chǎn)生或原始基因編碼的蛋白更高的水平產(chǎn)生。通過(guò)改變密碼子使用構(gòu)建的合成基因描述于，例如，PCT專(zhuān)利申請(qǐng)93/07278中。
[0072]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，通過(guò)如SEQ ID NO: 18所示的核酸序列編碼人α-半乳糖苷酶蛋白。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式，通過(guò)如SEQ ID Ν0:5所示的核酸序列編碼擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽。根據(jù)本發(fā)明的還進(jìn)一步的實(shí)施方式，通過(guò)如SEQ ID NO: 19所示的核酸序列編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽。因此，根據(jù)本發(fā)明的又進(jìn)一步的實(shí)施方式，通過(guò)如SEQ ID Ν0:2所示的核酸序列編碼在N端被翻譯融合在擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽的人α-半乳糖苷酶蛋白，并且在C端被翻譯融合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽的人α-半乳糖苷酶蛋白。
[0073]如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸表達(dá)構(gòu)建體”是指包括本發(fā)明的一些實(shí)施方式的核酸(例如，SEQ ID Ν0:2)和至少一種用于在宿主植物細(xì)胞中直接轉(zhuǎn)錄核酸的啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體。在下文中進(jìn)一步詳細(xì)地提供了合適的轉(zhuǎn)化方法。
[0074]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，提供了包括本發(fā)明的核酸序列以及用于在植物宿主細(xì)胞中直接轉(zhuǎn)錄核酸序列的核酸構(gòu)建體。
[0075]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，核酸可操作地連接至啟動(dòng)子序列。
[0076]如果調(diào)節(jié)序列能夠在連接至其上的編碼序列發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，編碼核酸序列是“可操作地連接”至調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)。
[0077]本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以使用任何合適的啟動(dòng)子序列。優(yōu)選地，啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0078]如在本文中使用的，短語(yǔ)“植物可表達(dá)”是指包括加入其中或包含在其中的任何另外的調(diào)控元件的啟動(dòng)子序列是至少能夠誘導(dǎo)、賦予、激活、或增強(qiáng)植物細(xì)胞、組織、器官，優(yōu)選單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞、組織、或器官中的表達(dá)。這種啟動(dòng)子可以是組成型，即在多種組織中能夠直接高水平基因表達(dá)；組織特異性的，即在特定的一種或多種組織中能夠直接基因表達(dá)；可誘導(dǎo)的，即在刺激下能夠直接基因表達(dá)；或嵌合的，即由至少兩種不同的啟動(dòng)子部分形成。
[0079]可用于本發(fā)明的一些實(shí)施方式中的方法的優(yōu)選啟動(dòng)子的實(shí)例顯不在表1、表I1、表II1、和表IV中。
[0080]表I
[0081]用于進(jìn)行本發(fā)明的一些實(shí)施方式的示例性組成型啟動(dòng)子
【權(quán)利要求】
1.一種核酸表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括編碼人α-半乳糖苷酶蛋白的核酸序列，其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在N端被翻譯融合至擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽，并且其中所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體,其中，所述核酸序列包括SEQID NO:22。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述擬南芥ABPI內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽如SEQID NO:4 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，包括編碼所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID Ν0:5所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽如SEQID Ν0:6所/Jn ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，包括編碼所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID NO: 19所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體,其中,所述核酸序列具有如SEQID NO: 2所示的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求`1所述的核酸，其中，所述核酸序列的密碼子使用是針對(duì)煙草(Nicotinia tabaccum)優(yōu)化的。
10.一種包括權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體的分離細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，重組產(chǎn)生所述人a-半乳糖苷酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶包括N-端甘氨酸殘基。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞，其中，所述植物細(xì)胞是煙草細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，其中，所述煙草細(xì)胞是BY-2細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶蛋白是重組產(chǎn)生的，以具有至少一個(gè)暴露的甘露糖殘基。
17.根據(jù)權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶蛋白是重組產(chǎn)生的，以具有至少一個(gè)核β_(1，2)木糖。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶蛋白是重組產(chǎn)生的，以具有至少一個(gè)核a-(l，3)巖藻糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述人a-半乳糖苷酶蛋白是重組產(chǎn)生的，以具有至少一個(gè)核β_(1，2)木糖和至少一個(gè)核α-(1，3)巖藻糖。
20.根據(jù)權(quán)利要求10至19中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中，所述核酸構(gòu)建體穩(wěn)定整合在所述細(xì)胞的基因組中。
21.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞,其中，所述細(xì)胞是根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)細(xì)胞。
22.—種產(chǎn)生重組人α-半乳糖苷酶蛋白的方法，包括: 提供根據(jù)權(quán)利要求11至20中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞；以及 培養(yǎng)所述細(xì)胞以產(chǎn)生所述重組人α-半乳糖苷酶蛋白；以及從所述細(xì)胞中分離所述重組人α-半乳糖苷酶蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述細(xì)胞是在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的分離細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述培養(yǎng)是在一次性生物反應(yīng)器中進(jìn)行的。
25.一種具有N端甘氨酸殘基的人α-半乳糖苷酶蛋白，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白在C端被翻譯融合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的人α-半乳糖苷酶蛋白，具有如SEQID Ν0:16所示的氨基酸序列。
27.一種藥物組合物，包括作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的人α-半乳糖苷酶蛋白和藥用載體。
28.一種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求25或26、或者根據(jù)權(quán)利要求25和26所述的人α-半乳糖苷酶蛋白以及藥用載體，所述人α-半乳糖苷酶蛋白具有包括9個(gè)甘露糖殘基并且其中3個(gè)是暴露的甘露糖殘基的聚糖結(jié)構(gòu)。
29.一種藥物組合物，包括作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求25或26、或者根據(jù)權(quán)利要求25和26所述的人α -半乳糖苷酶蛋白的群體，其中，至少0.5%的所述群體具有包括9個(gè)甘露糖殘基并且其中3個(gè)是暴露的甘露糖殘基的聚糖結(jié)構(gòu)。
30.一種藥物組 合物，包括作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求25或26、或者根據(jù)權(quán)利要求25和26所述的人α -半乳糖苷酶蛋白的群體以及藥用載體，其中，所述人α _半乳糖苷酶蛋白的群體的主要聚糖結(jié)構(gòu)是甘露糖4-β-(1，2)木糖(Μ4Χ)、甘露糖3-β-(1，2)木糖-α-(1，3)巖藻糖[Fc(3)M3X]、和甘露糖 8 (M8)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中，所述人α-半乳糖苷酶蛋白的群體進(jìn)一步包括以下聚糖結(jié)構(gòu)，所述聚糖結(jié)構(gòu)包括9個(gè)甘露糖殘基(Μ9)并且其中3個(gè)是暴露的甘露糖殘基。
32.—種藥物組合物，包括作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求10至20中任一項(xiàng)所述的活性成分以及藥用載體。
33.一種在需要其的受試者中治療法布里病的方法，包括給予所述受試者根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥物組合物。
34.一種在需要其的受試者中治療法布里病的方法，包括給予所述受試者根據(jù)權(quán)利要求30所述的藥物組合物。
35.一種在需要其的受試者中治療法布里病的方法，包括給予所述受試者根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物組合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求25或26中任一項(xiàng)所述的人α_半乳糖苷酶蛋白在制備在需要其的受試者中用于治療法布里病的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P3/00GK103443270SQ201180069560
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月20日
【發(fā)明者】阿維多爾·舒爾曼, 尤里·阿納尼亞, 塔利·基日涅爾, 約瑟夫·沙爾提埃爾 申請(qǐng)人:普羅塔里克斯有限公司