治療自身免疫失調的組合物及其方法
【專利摘要】本公開涉及包含葫蘆巴糖苷Ib（葫蘆巴皂苷Ib，Trigoneoside?Ib）和葫蘆巴苷-1（巢菜素-1，vicenin-1）的組合物，用于治療和處理古德帕斯徹病、腎小球腎炎、類風濕性關節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡和特發(fā)性血小板減少性紫癜。本公開還涉及由葫蘆巴獲得所述組合物的方法。
【專利說明】治療自身免疫失調的組合物及其方法【技術領域】
[0001]本公開涉及含有葫蘆巴糖苷Ib(葫蘆巴皂苷Ib，Trigoneoside Ib)和葫蘆巴苷-1(巢菜素-1，Vicenin-D的組合物和獲得所述組合物的方法。本公開進一步涉及所述組合物用于治療和處理自身免疫失調如古德帕斯徹病，腎小球腎炎，類風濕性關節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡和特發(fā)性血小板減少性紫癜的用途。
【背景技術】
[0002]自身免疫失調如古德帕斯徹病，腎小球腎炎，類風濕性關節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡和特發(fā)性血小板減少性紫癜證實會過多生產導致對細胞、組織、器官等嚴重損傷的自身抗體。這些疾病的特征在于身體對自身抗原的耐受性受損，并隨后激活導致?lián)p傷的免疫反應。遺傳易感性和環(huán)境因素是這些疾病的主要原因。
[0003]古德帕斯徹病和腎小球腎炎的特征在于沿著腎臟中的腎小球基底膜(GBM)沉積抗體，導致毛細管外腎小球腎炎。這些疾病通常稱為抗腎小球基底膜(抗GBM)疾病?；加锌笹BM疾病的患者僅具有10%的腎存活機會。古德帕斯徹病是百萬人中出現(xiàn)一例的罕見疾病。自身抗體介導的腎臟損害是古德帕斯徹病的主要問題。某些患者也會發(fā)生肺出血，然而，由抗GBM抗體造成的肺部損傷不是永久性的，并且相比于腎臟損傷時很少是致命性的。
[0004]現(xiàn)有對古德帕斯徹病或腎小球腎炎的治療包括血漿置換法或血漿交換法，這些方法會從血液中消除循環(huán)的抗GBM抗體。暴露于血液制品，血腫，輸血反應和輸血傳播疾病的風險是與血漿置換法相關聯(lián)的主要并發(fā)癥。其他治療選項包括給予免疫抑制劑例如皮質類固醇和環(huán)磷酰胺，它們被開具用于處理漸進性腎功能衰竭和肺出血。這些藥物以非特異性方式抑制免疫反應并且增加患者獲得機會性感染的機會。對于抗GBM疾病治療的現(xiàn)有路線并不能完全控制這種疾病。這種疾病發(fā)展至終末期器官功能衰竭會增加死亡風險。
[0005]類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種慢性漸進性疾病，影響約I %的世界人口，其通過自身抗體來介導。類似于古德帕斯徹病，RA的特征在于身體對自身抗原的耐受性受損并隨后激活免疫反應，導致組織損傷。靶向滑膜，軟骨和底層骨關節(jié)的自身抗體的產生定義為RA的發(fā)病機理。關節(jié)變形會導致嚴重的殘疾和生活質量下降。常見的癥狀包括關節(jié)疼痛，僵硬和關節(jié)腫脹，運動傷殘，肌肉無力，發(fā)燒和一般性不適感覺。血液中C-反應蛋白、類風濕因子的水平升高是RA的診斷指標?，F(xiàn)有對RA的治療包括疾病修飾抗風濕藥物(DMARD)如羥氯喹，免疫抑制劑如硫唑嘌呤(azathiprine)、皮質類固醇類、選擇性C0X-2抑制劑、NSAID和用于癥狀緩解的止痛藥。長期使用止痛藥，NSAID會引起潰瘍和對大多數(shù)患者具有較低耐受性而選擇性C0X-2抑制劑與心臟毒性有關。
[0006]免疫抑制劑是治療RA的主要路線。正如前面討論的，這些藥物以非特異性方式抑制免疫反應并且產生危及生命的并發(fā)癥。生物藥，如TNF抑制劑即阿達木單抗、依那西普、英夫利昔單抗等，IL-1受體拮抗劑即阿那白滯素和IL-6受體拮抗劑即托珠單抗，廣泛用于治療RA。這些藥物設計成通過起到細胞因子受體拮抗劑作用來影響導致關節(jié)發(fā)炎和關節(jié)損傷的生化途徑。生物制品的一個主要缺點是，對于長期使用患者會對這些藥物產生耐藥性并且療效下降。由于毒性分布曲線，這些藥物中許多僅推薦用于對其他RA治療不產生反應的患者。
[0007]全身性紅斑狼瘡(系統(tǒng)性紅斑狼瘡，SLE)是一種多系統(tǒng)自身免疫失調，其基于多種特征(如關節(jié)痛，發(fā)熱，乏力，皮膚損傷，光敏感性，胸部疼痛，脫發(fā)，口腔潰瘍等)進行臨床診斷，并通過在血液中發(fā)現(xiàn)自身抗體和在尿液中發(fā)現(xiàn)過量血清蛋白來支持。腎功能衰竭是SLE的主要并發(fā)癥之一。超過50%的SLE患者出現(xiàn)由于抗體在腎小球中沉積導致的腎功能衰竭，并需要腎透析或移植。自身抗體介導的其他并發(fā)癥包括肺損傷、心損傷，溶血性貧血，血小板減少癥，腦功能障礙等。對于SLE的現(xiàn)有治療選項包括NSAID，抗瘧藥物，皮質類固醇類和甲氨蝶呤，用于減輕肌肉-骨骼癥候和皮膚癥候。根據(jù)USFDA，對SLE治療的現(xiàn)有路線具有多種問題，例如不完全控制疾病，向終末期器官功能衰竭發(fā)展和衰弱的副作用(Guidancefor Industry:Systemic Lupus Erythematosus—Developing Medical Products forTreatment，June 2010)。
[0008]特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是由血小板急劇減少所致的出血性疾病。ITP可能是由感染，免疫失調如SLE，某些藥物，妊娠等觸發(fā)的。盡管ITP發(fā)病的確切機制尚不清楚，但是ITP主要歸咎于由抗血小板抗體損壞血小板，因為50%以上的ITP患者對于血小板相關抗體測試呈陽性(Gernsheimer，2009)。對于ITP的現(xiàn)有治療選擇包括:(i)藥物如皮質類固醇類和靜脈注射免疫球蛋白，它們干擾抗體包被血小板的清除；(ii)通過藥物如硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素的非特異性T-細胞免疫抑制；(iii)干擾抗體合成的嗎替麥考酚酯和生物制劑如利妥昔單抗；(iv)脾切除術和血漿置換法，它們清除循環(huán)的抗血小板抗體；(V)通過輸注血小板和骨髓移植等來增加血小板數(shù)。所有上述治療選項都有潛在的副作用，如抑制免疫力，暴露于具有輸血反應和/或輸血傳播疾病及血腫風險的血液產品。
[0009]由于對自身免疫失調(如古德帕斯徹病，腎小球腎炎，類風濕性關節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡，特發(fā)性血小板減少性紫癜等)的現(xiàn)有治療選擇具有缺點，為了解決這些慢性的威脅生命的疾病，對于制藥公司而言研究和開發(fā)具有較低副作用的更加有效的治療方法是至關重要的。`
[0010]授予Malireddy S.Reddy等人的美國專利號6080401,描述了包含幾種草藥(其中一種是葫蘆巴(Trigonella foenum-graecum)的混合物,連同幾種益生菌制劑的混合物的組合物，用于治療多種疾病(即貧血、關節(jié)炎、便秘、抑郁癥、糖尿病、消化不良、痔瘡、肝炎、高血壓、陽痿、超重、牙周疾病以及它們的組合)的用途。
[0011]授予Chaim Lieberman的美國專利號5707631公開了由葫蘆巴、丁香果(Syzygiumaromatium fruit)、大蒜球莖(Allium sativum bulb),錫蘭肉桂樹皮(Cinnamonzeylanicum bark),雪蓮木香(Saussurea costus root)和續(xù)隨子芽(Euphorbia Iathyrusbud)構成的中草藥組合物的制劑用于降低膽固醇，治療關節(jié)炎，血壓和阿爾茨海默氏病。然而，該專利文獻沒有公開在本專利中這種組合物在關節(jié)炎中的任何作用方面，本領域任何技術人員能夠理解和實踐的任何證據(jù)。
[0012]Chopra等人(2010)最近公開了多草藥組合物，其含有葫蘆巴(Trigonellafoenum-graecum)(葫蘆巴(Fenugreek))萃取物連同乳香(Boswellia serrata)(乳香(Salai Guggul))、亞麻(Linum usitatissimum)(亞麻桿(Flaxseed)),山茶(Camelliasinensis)(綠茶(Green tea)),姜黃(Curcuma 1nga)(姜黃(Turmeric)),刺蔡藜(Tribulus Terrestris)(刺蔡藜(Gokshur))和胡椒(Piper nigrum)(黑胡椒(Blackpepper))的萃取物,用于治療RA。
[0013]Khan等(2011)臨床上評價了草藥組合物,其含有黑種草苜猜(Nigella sativa),催目民睡茄(Withania somnifera),菝葜(Smilax china),芹菜(Apium graveolens),葫蘆巴(Trigonella foenum graecum),生姜(Zingiber officinale)和秋水仙(Colchicumautumnal e),用于治療類風濕性關節(jié)炎。
[0014]所有上面討論的現(xiàn)有技術都公開了包含幾種草藥的組合物，并且難以確定葫蘆巴對所要求的有益作用做出貢獻。
[0015]葫蘆巴(Trigonella foenum-graecum)或葫蘆巴(fenugreek)在傳統(tǒng)醫(yī)學中最常用。葫蘆巴種子萃取物正研究用于治療各種疾病，如糖尿病、痛風、胃潰瘍、腹瀉、便秘等。Ahmadiani等(2001)研究了葫蘆巴的抗炎和解熱活性。Vyas等(2008)證明了葫蘆巴種子萃取物具有鎮(zhèn)痛和抗炎活性。這些研究并沒有舉例說明或教導對要求的活性具有貢獻的葫蘆巴種子中的特定組分或化學組成。
[0016]葫蘆巴種子包含許多化學物質，即生物堿類如葫蘆巴堿、龍膽堿、番木瓜堿、膽堿；氨基酸類如4-羥基異亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；黃酮類一木犀草素(毛地黃黃酮)、槲皮素(櫟皮黃酮)、牡荊素(牡荊葡基黃酮)、異牡荊素(異牡荊葡基黃酮)、葒草素(東方寥黃素)、異葒草素(異東方寥黃素)、葫蘆巴苷-1、葫蘆巴苷-2;呋喃甾醇皂苷類一葫蘆巴糖苷C、Trigofoenoside、葫蘆巴苷、葫蘆巴素B ;螺旋甾燒醇阜苷類一葫蘆巴阜苷(Graecunin)、葫蘆巴肽苷(Fenugreekine);阜苷元(Sapinogen)—薯菌阜苷元、亞莫阜苷元、絲蘭阜苷元、利拉皂苷元、惕告吉寧、新惕告吉寧、吉托吉寧、新吉托吉寧、薩爾薩皂苷元、菝葜配基；花青苷類；纖維-膠質；其他酚類組分一葫蘆巴香豆精、東莨菪內酯、綠原酸、咖啡酸和對香豆酸；脂質；維生素和痕量無機元素。
[0017]本公開的主要實施方式是含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1的組合物，用于治療自身免疫失調如古德帕斯徹病，腎小球腎炎和類風濕性關節(jié)炎。本發(fā)明的新穎性和創(chuàng)造性在于葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1的獨特組合物。葫蘆巴糖苷Ib已經報道是葫蘆巴種子中存在的許多呋喃甾醇皂苷之一。圖1中顯示了葫蘆巴糖苷Ib的結構。Yoshikawa等(1997)和Murakami等(2000)已經表征了葫蘆巴中存在的所有葫蘆巴糖苷，并報道了這些分子的13C NMR, 1H NMR和[a]D數(shù)據(jù)。葫蘆巴糖苷Ia，Ib和XIb是結構異構體，分子量為906，具有可比較的NMR數(shù)據(jù)和不同的[a]D數(shù)據(jù)。具體異構體的鑒定能夠使用酸解法進行實施，其中葫蘆巴糖苷Ia產生新吉托吉寧，葫蘆巴糖苷Ib產生吉托吉寧而葫蘆巴糖苷XIb產生L-鼠李糖。
[0018]許多黃酮苷存在于葫蘆巴種子中，即牡荊素、異牡荊素、葒草素、異葒草素、葫蘆巴苷等。這些黃酮類化合物針對各種生理活性(如抗氧化性、抗甲狀腺、抗凋亡、抗炎、抗疼痛、抗焦慮等)都已經進行了研究。本公開涉及黃酮苷之一葫蘆巴苷-1。葫蘆巴苷-1存在于葫蘆巴中已經由Wagner等(1973)報道。葫蘆巴苷-1的結構如圖2所示。其他含有葫蘆巴苷_1的植物種類有亞麻(Linum usitatissimum)、蒜葉婆羅門參(Tragopogon porrifolius)和小麥(Triticum aestivum)。Sato等(2010)已公開了合成葫蘆巴苷-1的方法并為合成的和天然獲得的葫蘆巴苷-1提供了 13C NMR的對比數(shù)據(jù)。
【發(fā)明內容】

[0019]因此，本公開涉及含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1，可選地連同至少一種可接受賦形劑的組合物；制備含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1可選地連同至少一種賦形劑的組合物的方法，所述方法包括以下操作:a)將葫蘆巴種子壓成片，b)用溶劑混合物萃取壓片的葫蘆巴種子接著過濾和濃縮以獲得半固體物質，c)溶解所述物質以獲得清澈溶液，d)用正丁醇逆流萃取所述清澈溶液以獲得包含水層和丁醇層的溶液，e)將所述水層通過離子交換樹脂和吸附柱以獲得包含所述葫蘆巴糖苷Ib和所述葫蘆巴苷-1的洗脫液，f)純化所述洗脫液以獲得自由流動粉末和g)可選地加入至少一種賦形劑以獲得所述組合物；和治療自身免疫失調的方法，所述方法包括以下操作:向需要其的受試者給予含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1可選地連同至少一種賦形劑的組合物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1顯示了葫蘆巴糖苷Ib的結構。[0021]圖2顯示了葫蘆巴苷-1的結構。
[0022]圖3顯示了 46%葫蘆巴糖苷Ib和6%葫蘆巴苷_1的HPLC色譜圖。
[0023]圖4顯示了 76%葫蘆巴糖苷Ib和15%葫蘆巴苷_1的HPLC色譜圖。
[0024]圖5顯示了 91%葫蘆巴糖苷Ib和5%葫蘆巴苷_1的HPLC色譜圖。
[0025]圖6顯示了腎小球腎炎誘導大鼠的腎組織病理學圖片；(右側)GBM對照組；(左側)GBM+測試組合物(75mg/kg)組:(1)尿液形成的空間；(2)腎小球的損壞；(3)腎小管腫脹；
(4)腎小管管型(Tubular cast) ； (5)細胞浸潤；(6)腎小球腎炎的免疫反應。
【具體實施方式】
[0026]本公開涉及包含葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1可選地連同至少一種賦形劑的組合物。
[0027]在本公開的一個實施方式中，所述葫蘆巴糖苷Ib濃度范圍為約40%(w/w)~約90%(w/w)而葫蘆巴苷-1濃度范圍為約l%(w/w)~約20%(w/w)。
[0028]在本公開的另一個實施方式中，所述葫蘆巴糖苷Ib和所述葫蘆巴苷-1獲自植物葫蘆巴。
[0029]在本公開的又另一個實施方式中，所述賦形劑選自包含以下各項的組中:成粒劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、增甜劑、著色劑、調味劑、包衣劑、增塑劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑、纖維素材料和滾圓劑或它們的任何組合。
[0030]在本公開的又另一個實施方式中，所述組合物配制成選自包含以下各項的組中的劑型:片劑、膠囊、錠劑、糖錠、粉劑、糖漿、溶液、氣溶膠、懸浮液、可分散粉末或顆粒、硬或軟凝膠膠囊中的乳液、糖漿類、酏劑、搽劑、油膏、皮膚貼劑、植物劑、營養(yǎng)劑和食品。
[0031]本公開還涉及制備含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1可選地連同至少一種賦形劑的組合物的方法，所述方法包括以下操作:
[0032]a.將葫蘆巴種子壓成片；
[0033]b.用溶劑混合物萃取壓片的葫蘆巴種子，接著過濾和濃縮以獲得半固體物質；
[0034]c.溶解所述物質以獲得清澈溶液；[0035]d.用正丁醇逆流萃取所述清澈溶液以獲得包含水層和丁醇層的溶液；
[0036]e.將所述水層通過離子交換樹脂和吸附柱以獲得包含所述葫蘆巴糖苷Ib和所述葫蘆巴苷-1的洗脫液；
[0037]f.純化所述洗脫液以獲得自由流動的粉末；和
[0038]g.可選地加入至少一種賦形劑以獲得所述組合物。
[0039]在本公開的一個實施方式中，所述種子壓片成約Imm~約5mm的尺寸，更具體地2mm的尺寸。
[0040]在本公開的另一個實施方式中，所述溶劑混合物包含比率約1:1~約9:1更具體地4:1的脂肪醇和水。
[0041]在本公開的又另一個實施方式中，所述脂肪醇選自包含以下各項的組中:甲醇，乙醇，丙醇和異丙醇或它們的任何組合。
[0042]在本公開的又另一個實施方式中，所述物質溶解于去離子水中。
[0043]在本公開的又另一個實施方式中，進行所述純化以獲得具有約90%~約95%純度的所述葫蘆巴糖苷Ib和具有約90%~約95%純度的所述葫蘆巴苷-1。
[0044]在本公開的 又另一個實施方式中，所述純化包括以下步驟:緩沖劑處理接著醇或酸處理和濃縮以獲得純化的自由流動的粉末。
[0045]在本公開的又另一個實施方式中，所述濃縮在約40°C~約80°C，更具體地約50°C的溫度下實施。
[0046]在本公開的又另一個實施方式中，所述組合物含有濃度范圍為約40%(w/w)~約90%(w/w)的所述葫蘆巴糖苷Ib和濃度范圍為約l%(w/w)~約20%(w/w)的所述葫蘆巴苷-1。
[0047]在本公開的又另一個實施方式中，所述賦形劑選自包含以下各項的組中:成粒劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、增甜劑、著色劑、調味劑、包衣劑、增塑劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑、纖維素材料和滾圓劑或它們的任何組合。
[0048]本公開還涉及治療自身免疫失調的方法，所述方法包括以下操作:向需要其的受試者給予含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1可選地連同至少一種賦形劑的組合物。
[0049]在本公開的一個實施方式中，所述自身免疫失調選自包含以下各項的組中:古德帕斯徹病，腎小球腎炎，類風濕性關節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)和特發(fā)性血小板減少性紫癜。
[0050]在本公開的另一個實施方式中，所述受試者是動物或人類。
[0051 ] 在本公開的又另一個實施方式中，所述組合物給藥的日劑量范圍為在動物中約lmg/kg~約100mg/kg而在人類中約lmg/kg~約50mg/kg。
[0052]本公開還涉及含有40%~90%(w/w)葫蘆巴糖苷Ib和1%~20%(w/w)葫蘆巴苷-1的組合物通過防止自身抗體介導的器官損傷來治療古德帕斯徹病，腎小球腎炎，類風濕性關節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡和特發(fā)性血小板減少性紫癜的用途。獲得包含由葫蘆巴種子獲得的葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1的特定組合物的方法在本領域內還是未知的。本公開中公開的方法的獨特性在于具體地包含葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1的組合物的萃取。進行另外純化以獲得90%~95%的純化葫蘆巴糖苷Ib和95%純的葫蘆巴苷-1用于所述組合物的結構表征和標準化。[0053]在本公開的另一個實施方式中，葫蘆巴糖苷Ib具有的分子量為906而化學式為
C44H74019。
[0054]在本公開的又另一個實施方式中，葫蘆巴苷-1具有的分子量為564而化學式為
^26^28^14°
[0055]在本公開的又另一個實施方式中，所述組合物獲自植物葫蘆巴。
[0056]在本公開的另一個實施方式中，所述組合物為選自包含以下各項的組中的形式:片劑、膠囊、錠劑、糖錠、粉劑、糖漿、溶液、氣溶膠、懸浮液、可分散粉末或顆粒、硬或軟凝膠膠囊中的乳液、糖漿類、酏劑、搽劑、油膏、皮膚貼劑、植物劑、營養(yǎng)劑和食品。
[0057]本公開還涉及從葫蘆巴中萃取和純化含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1的組合物的方法，所述處理步驟包括以下各項:
[0058]a.通過脫脂和去除含氮化合物如生物堿、氨基酸來萃取清澈溶液；和
[0059]b.將清澈溶液通過陽離子交換大孔樹脂和吸附柱以洗脫葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1 ;濃縮洗脫液和進一步純化。
[0060]在本公開的一個實施方式中，所述組合物范圍為40%~90%(w/w)的葫蘆巴糖苷Ib和1%~20%(w/w)的葫蘆巴苷-1。
[0061]在本公開的另一個實施方式中，由于葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1是由葫蘆巴種子萃取的，這暗示所述組合物可以包括含有如從HPLC結果可見的較小比例的來自葫蘆巴種子的有益分子的纖維素材料。(圖3-5)`[0062]在本公開的另一個實施方式中，步驟(a)中從葫蘆巴萃取清澈溶液由以下步驟組成:
[0063]1.將葫蘆巴種子壓成片；
[0064]i1.用溶劑萃取壓片的種子；
[0065]ii1.過濾萃取物以獲得清澈溶液；
[0066]iv.真空下濃縮清澈溶液以獲得半固體物質；
[0067]V.溶解濃縮的物質以獲得清澈溶液；
[0068]v1.用正丁醇逆流萃取清澈溶液以去除脂肪性物質；
[0069]在本公開的一個實施方式中，步驟(b)中所用的溶劑是水和選自包含甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇的組中的醇的混合物，比率為1:1~9:1且優(yōu)選4:1。
[0070]在本公開的又另一個實施方式中，進行所述萃取約8~12h且優(yōu)選約10h。
[0071]在本公開的又另一個實施方式中，所述萃取在約30°C~約40°C，且優(yōu)選約35°C的溫度下頭施。
[0072]在本公開的又另一個實施方式中，所述萃取物在真空下在約45°C~約55°C且優(yōu)選約50°C的溫度下進行濃縮。
[0073]在本公開的又另一個實施方式中，所述濃縮的物質溶解于去離子水中。
[0074]在本公開的另一個實施方式中，含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1的組合物采用以下步驟由步驟(b)的所述清澈溶液獲得:
[0075]1.將清澈水層通過陽離子交換大孔樹脂和吸附柱以洗脫葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1 ;
[0076]i1.濃縮洗脫液并噴霧干燥。[0077]在本公開的又另一個實施方式中，所述吸附柱選自包含以下各項的組中:酸性陽離子交換大孔樹脂，Sephadex LH-20, Dowex Optipore L493或它們的等效物。
[0078]在本公開的又另一個實施方式中，吸附柱的洗脫采用水和乙醇以初始比率30:70接著變換至5:95的比率進行實施。
[0079]在本公開的又另一個實施方式中，吸附柱的洗脫持續(xù)約I~約4h，優(yōu)選約2h。
[0080]在本公開的又另一個實施方式中，所述濃縮的物質在約110°C~約130°C，優(yōu)選約120°C下噴霧干燥。
[0081]本公開的又另一實施方式涉及純化葫蘆巴糖苷Ib的方法，所述處理步驟包括以下各項:
[0082]1.將濃縮的洗脫液溶解于緩沖液中并濾除不溶物質；
[0083]i1.用正丁醇沖洗緩沖溶液；
[0084]ii1.濃縮正丁醇部分；
[0085]iv.將濃縮部分重新溶解于溶劑中；和
[0086]V.將所得的溶液通過吸附柱。
[0087]在本公開的又另 一個實施方式中，所述緩沖溶液選自包括磷酸二氫鉀和鹽酸的組。
[0088]在本公開的又另一個實施方式中，用于重新溶解的溶劑是乙醇。
[0089]本公開的又另一實施方式涉及從包含其他黃酮苷的正丁醇層中純化葫蘆巴苷-1的方法，所述處理步驟包括以下各項:
[0090]1.真空下濃縮；
[0091]i1.用緩沖溶液沖洗濃縮液以除去不溶物質；
[0092]ii1.濃縮所得的溶液至一半體積并攪拌；
[0093]iv.過濾以移出不純晶體；和
[0094]V.用溶劑回流不純晶體并過濾以獲得95%純的葫蘆巴苷-1。
[0095]在本公開的又另一個實施方式中，濃縮物質的攪拌持續(xù)I~48h，優(yōu)選24h。
[0096]在本公開的又另一個實施方式中，濃縮物質的攪拌在30~40°C，優(yōu)選35°C下進行。
[0097]在本公開的又另一個實施方式中，用于回流的溶劑是1:1比率范圍的甲醇和二氯甲烷。
[0098]本公開還涉及生產包含40-90%(w/w)葫蘆巴糖苷Ib和l_20%(w/w)葫蘆巴苷_1可選地連同至少一種賦形劑的組合物的藥物的方法和給予有效量的所述組合物用于治療和處理選自包含以下各項的組中的自身免疫疾病的方法:古德帕斯徹病，腎小球腎炎，類風濕性關節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡和特發(fā)性血小板減少性紫癜。
[0099]本公開還涉及治療和處理選自包含以下各項的組中的自身免疫性疾病的方法:古德帕斯徹病，腎小球腎炎，類風濕性關節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡和特發(fā)性血小板減少性紫癜。
[0100]在本公開的一個實施方式中，所述受試者選自包括動物和人類的組中。
[0101]本公開利用以下實施例進行進一步闡述。然而，這些實施例不應該解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0102]實施例1:[0103]1000g葫蘆巴種子(具有小于5%含水量)，在滾筒壓片機中壓片成2mm厚度。所述壓片的物質在包含比率為80:20的乙醇和水的溶劑混合物(8L)中萃取，并通過再循環(huán)所述洗脫液在40°C下通過所述層持續(xù)10h。IOh后，萃取物通過200目網(wǎng)布過濾，得到清澈溶液。所述清澈溶液在真空下在50°C下濃縮成半固體物質。將所述濃縮的物質溶解于5L去離子水中，得到清澈溶液。清澈水溶液經過正丁醇逆流萃取。清澈的水層通過含有200mL強酸性陽離子交換大孔樹脂的柱子持續(xù)2h。不含所有氨基酸、蛋白質、葫蘆巴堿和其他兩性化合物的清澈柱流出液在50°C下濃縮并在120°C下噴霧干燥以獲得自由流動粉末，其組成為約40%~46% (w/w)的葫蘆巴糖苷Ib和1%~6% (w/w)的葫蘆巴苷-1。組成范圍的變化歸因于季節(jié)性變化。所述收率為約60g。在以下條件下進行HPLC分析:柱子一250mm長，
4.6mm直徑的Kromasil C18RP5ym;流動相一水:乙腈梯度持續(xù)20min從75:25至65:35,流速一lmL/min ;檢測波長一210nm UV0如圖3可見的HPLC輸出顯示，葫蘆巴糖苷Ib峰在
2.2min處而葫蘆巴苷_1峰在3.2min處。通過外標法采用獲自實施例4的葫蘆巴糖苷Ib和獲自實施例5的葫蘆巴苷-1的純化樣品來構成所述組合物。
[0104]實施例2:
[0105]1000g葫蘆巴種子(具有小于5%的含水量)，在滾筒壓片機中壓片成2mm厚度。所述壓片的物質在包含比率為70:30的異丙醇和水的溶劑混合物(8L)中萃取，并通過再循環(huán)所述洗脫液在35°C下通過所述層持續(xù)10h。IOh后，萃取物通過200目網(wǎng)布過濾，得到清澈溶液。所述清澈溶液在真空下在50°C下濃縮成半固體物質。將所述濃縮的物質溶解于5L去離子水中，得到清澈溶液。清澈水溶液經過正丁醇逆流萃取。清澈的水層通過含有200mL的強酸性陽離子交換大孔樹脂的柱子持續(xù)2h。不含所有氨基酸、蛋白質、葫蘆巴堿和其他兩性化合物的清澈柱流出液在2h內再次通過含有Dowex Optipore L493或其等效物的樹脂床并通過包括甲苯:乙酸乙酯:甲醇:水比率為6:3:6:1的薄層色譜系統(tǒng)來監(jiān)控所述吸附過程。當洗脫過程采用95%乙醇時，由薄層色譜系統(tǒng)監(jiān)控的生物活性化合物開始洗脫。收集這些餾分，篩選并匯集在一起并在`50°C下濃縮成55%~65%(w/w)的葫蘆巴糖苷Ib和8%~12%(w/w)的葫蘆巴苷-1。組成范圍的變化歸因于季節(jié)性變化。收率為約15g。按照實施例1中所述的方法進行HPLC分析。通過外標法采用獲自實施例4的葫蘆巴糖苷Ib和獲自實施例5的葫蘆巴苷-1的純化樣品來構成所述組合物。
[0106]實施例3:
[0107]1000g葫蘆巴種子(具有小于5%的含水量)，在滾筒壓片機中壓片成2mm厚度。所述壓片的物質在包含比率為80:20的乙醇和水的溶劑混合物(8L)中萃取，并通過再循環(huán)所述洗脫液在35°C下通過所述層持續(xù)10h。IOh后，萃取物通過200目網(wǎng)布過濾，得到清澈溶液。所述清澈溶液在真空下在50°C下濃縮成半固體物質。將所述濃縮的物質溶解于5L去離子水中，得到清澈溶液。清澈水溶液經過正丁醇逆流萃取。清澈的水層通過含有200mL的強酸性陽離子交換大孔樹脂的柱子持續(xù)2h。不含所有氨基酸、蛋白質、葫蘆巴堿和其他兩性化合物的清澈柱流出液在2h內再次通過含有Dowex Optipore L493或其等效物的樹脂床并通過包括甲苯:乙酸乙酯:甲醇:水比率為6:3:6:1的薄層色譜系統(tǒng)來監(jiān)控所述吸附過程。當洗脫過程采用70:30的乙醇:水混合物時，由薄層色譜系統(tǒng)監(jiān)控的生物活性化合物開始洗脫。收集這些餾分，篩選并且匯集在一起并在50°C下濃縮成70%~76%(w/w)的葫蘆巴糖苷Ib和15%~18%(w/w)的葫蘆巴苷-1。組成范圍的變化歸因于季節(jié)性變化。收率為約9g。按照實施例1中所述的方法進行HPLC分析并且在圖4中顯示輸出色譜圖。通過外標法采用獲自實施例4的葫蘆巴糖苷Ib和獲自實施例5的葫蘆巴苷-1的純化樣品來構成所述組合物。
[0108]葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1的純標準品不能由參照標準品供應商獲得。因此，為了結構說明和標準化組合物的目的，進行實施例4和實施例5以分別分離出葫蘆巴糖苷IB和葫蘆巴苷-1的純化樣品。
[0109]實施例4:
[0110]將來自實施例1-3的所述組合物溶解于50mM磷酸二氫鉀緩沖液(300mL)中，并濾出不溶物質。所述緩沖溶液用正丁醇(75mLX3)洗滌三次并且所有三個流分獨立地濃縮。流分1、2和3顯示葫蘆巴糖苷Ib純度分別為85%，68%和40%。所述85%純粉末化葫蘆巴糖苷Ib為約10%的起始重量，將其再溶解于乙醇中并通過S印hadex LH-20床，床體積125mL,收集所述流分并針對純葫蘆巴糖苷Ib進行篩選。所述純葫蘆巴糖苷Ib流分濃縮獲得約90%~95%的面積純度，其適宜進行結構表征。收率約為灰白色結晶粉末起始重量的
0.2%。按照實施例1中所述的方法進行HPLC分析，并且輸出色譜圖如圖5中所示。
[0111]熔點為220°C，且LCMS分析證實質量為906 (M+Na=929)。呋喃甾醇皂苷結構的存在通過薄層色譜法(TLC)采用甲苯:乙酸乙酯:甲醇:水比率為6:3:6:1，接著5%茴香醒硫酸噴霧并在110°C下加熱15min顯示綠褐色單一斑點來驗證。在CT3OD(IOOMhz)中 13C NMR 分析:δ c(ppm)44.43(C-1)，71.6(C-2)，85.8(C-3)，34.9(C-4)，44.4(C-5)，28.4 (C-6)，30.78 (C _7)，34.1 (C_8) ,51.7 (C_9)，36.9 (C-1O)，22.0 (C-1l)，39.6 (C-12)，41.8 (C-13)，57.8 (C-14)，32.8 (C-15)，82.4 (C-16)，65.06 (C-17)，16.9 (C-18)，12.08 (C-19) ,40.8(C-20)，16.3(C_21) , 114.0 (C-22) , 38.5 (C-23) , 28.9 (C-24)，34.9 (C-25), 76.0 (C-26), 17.6 (C-27)；葡萄 H -1:102.35 (C-1 ' )，75.1 (C_2 ')，79.3 (C-3 ' ) ,73.7 (C_4 ' ), 77.0 (C_5 ' ), 70.6 (C-6 ');木糖:104.57 (C_l ")，76.05(C-2" )，78.08(C-3" )，72.4(C_4" )，67.0(C_5");葡萄糖-11: 103.0 (C_l "')，76.5(C-2" ' ),79.7 (C-3" ' )，72.1 (C_4 " ' )，82.43(C_5" ' ),62.8 (C-6 ;/ ');在CD3OD 中 1H NMR分析:0.744 (19-?)，0.869 (18-?)，0.959 (27-?)，1.05 (5_H)，1.51 (21-H3)，2.06(25-H)，2.206(20-H)，3.48,4.05(26-?) ,3.699(3_H)，4.14(2_H)，4.04,5.1 (6，-H2)；[a ]d24(c=0.37，吡啶):-41.9。。
[0112]實施例5:
[0113]約SOOOmL包含來自實施例1~3的其他黃酮苷的正丁醇層在50°C下使用真空蒸發(fā)器濃縮至400mL。該溶液用50mM磷酸二氫鉀溶液洗滌兩次接著500mLl%鹽酸水溶液。在這個階段，不溶物質析出為黃色無定形粉末。將上述溶液濃縮至一半體積，并在30~35°C下攪拌24h以使其他黃酮苷的更多晶體析出并過濾。該不純晶體在甲醇和二氯甲烷1:1混合物中在15°C下回流3h，并在5°C下過濾以獲得95%的純葫蘆巴苷-1。收率為約1.8g。
[0114]熔點為215°C，發(fā)生分解，LCMS分析證實質量為564 (M+H=565)。黃酮苷結構的存在進一步通過薄層色譜法(TLC)采用甲苯:乙酸乙酯:甲醇:水比率為6:3:6:1，接著5%甲醇硫酸噴霧并在110°C下加熱15min顯示黃色單一斑點來驗證。在CT3OD(IOOMhz)中13C NMR 分析:δ c (ppm) 164.57 (C_2)，103.05 (C-3)，182.7 (C_4), 161.4 (C_5)，108.55 (C-6)，158.7 (C-7), 104.1 (C-8), 155.5 (C-9), 103.1 (C-1O), 122.0 (C-l ' ), 129.2(C_2 '),116.45 (C-3 ; ),161.6(04' ),116.29(05' )，129.1 (C_6 ');木糖:74.6 (C_l ")，70.5(C-2" ),79.3 (C-3" )，70.7 (C_4 " )，68.9(C_5");葡萄糖:71.76 (C_l "')，70.99(C-2" ' ),79.67 (C-3" ' )，70.05(C_4" ' )，82.35(C_5" ' ) ,61.6 (C-6;/ ');在DMS0-d6(在25°C下)中1H NMR分析:對應于黃酮質子環(huán)的芳香族質子-[6.79，6.8 ;7.936,7.949 ；6.897,6.951 ；8.0,8.031]，糖質子-6_C_ 木糖苷處于 3.09 ~4.65 之間而8-C-葡糖苷處于3.29~4.77之間。
[0115]實施例6:
[0116]在本公開的一個實施方式中，lg76%葫蘆巴糖苷Ib和15%葫蘆巴苷-1與14g91%葫蘆巴糖苷Ib和5 %葫蘆巴苷-1混合以獲得包含15g90 %葫蘆巴糖苷Ib和5.7 %葫蘆巴苷-1的組合物。該實施例顯示，通過混合具有不同濃度的所述組分的不同組合物得到包含40%~90% (w/w)葫蘆巴糖苷Ib和1%~20% (w/w)葫蘆巴苷-1的希望的組合物的方法。本領域技術人員應該理解到，通過混合可以通過從植物來源萃取得到或通過所述組分的化學合成得到的組分，葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1，可以獲得本文中獲得的組合物。因此，葫蘆巴并不是獲得所述組合物的唯一來源。它可以通過混合合成的組分，葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1，而獲得。
[0117]此外，所述組合物還可以通過混合組分，葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1 (如本公開中描述的實施例中獲得的)，而獲得。
[0118]在以下實施例中針對生理活性進一步測試包含由上述實施例中指定方法中獲得的40%~90% (w/w)葫蘆巴糖苷Ib和1%~20% (w/w)葫蘆巴苷_1的測試組合物:
[0119]實施例7:腎小球腎炎誘導大鼠中的活性
[0120]腎小球腎炎是腎功能衰竭和自身免疫性疾病如古德帕斯徹病中死亡的一個主要原因。進行這項研究是為了檢測包含76% (w/w)葫蘆巴糖苷Ib和15% (w/w)葫蘆巴苷-1的測試組合物在抗-GBM誘導的新月體性腎小球腎炎的大鼠模型中的療效。
[0121]雄性Wistar大鼠體重180~220g,分成幾個小組,每組6只動物。腎小球腎炎按照Chen等人(2004)的指示進行誘導:通過皮下給予處于弗氏完全佐劑(FCA)中的大鼠IgG(5mg)，接著5天后靜脈內給予GBM (0.5mL)。治療組中的動物接受所述測試組合物(75mg/kg),每日口服兩次持續(xù)28天。在GBM對照組中的動物沒有接受任何治療。沒有誘導腎小球腎炎和治療的第三組動物作為正常對照來保持。在誘導腎小球腎炎之前和完成治療之后測定和分析尿排出量。在第28天，將這些動物處死以對其腎臟和肺進行組織病理學檢測。
[0122]表1:在腎小球腎炎誘導大鼠中對每日尿蛋白排出的影響(以mg/天計，MEAN土SEM)
[0123]
【權利要求】
1.一種組合物，含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1，可選地連同至少一種賦形劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述葫蘆巴糖苷Ib濃度范圍為約40%(w/w)~約90%(w/w)而葫蘆巴苷-1濃度范圍為約l%(w/w)~約20%(w/w)。
3.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述葫蘆巴糖苷Ib和所述葫蘆巴苷-1獲自植物葫蘆巴。
4.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述賦形劑選自包含以下各項的組中:成粒劑，粘合劑，潤滑劑，崩解劑，增甜劑，著色劑，調味劑，包衣劑，增塑劑，防腐劑，懸浮劑，乳化劑，纖維素材料和滾圓劑或它們的任何組合。
5.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中所述組合物配制成選自包含以下各項的組中的劑型:片劑，膠囊，錠劑，糖錠，粉劑，糖漿，溶液，氣溶膠，懸浮液，可分散粉末或顆粒，硬或軟凝膠膠囊中的乳液，糖漿類，酏劑，搽劑，油膏，皮膚貼劑，植物劑，營養(yǎng)劑和食品。
6.一種制備含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1可選地連同至少一種賦形劑的組合物的方法，所述方法包括以下操作: a.將葫蘆巴種子壓成片； b.用溶劑混合物萃取壓片的葫蘆巴種子，接著過濾和濃縮以獲得半固體物質； c.溶解所述物質以獲得清澈溶液； d.用正丁醇逆流萃取所述清澈溶液以獲得包含水層和丁醇層的溶液； e.將所述水層通過離子交換樹脂和吸附柱以獲得包含所述葫蘆巴糖苷Ib和所述葫蘆巴苷-1的洗脫液； f.純化所述洗脫液以獲得自由流動的粉末；和 g.可選地加入至少一種賦形劑以獲得所述組合物。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述種子壓片成約Imm~約5mm更具體地為2mm的尺寸。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述溶劑混合物包含比率為約1:1~約9:1更具體地4:1的脂肪醇和水。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述脂肪醇選自包含以下各項的組中:甲醇，乙醇，丙醇和異丙醇或它們的任何組合。
10.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述物質溶解于去離子水中。
11.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中進行所述純化以獲得具有約90%~約95%純度的所述葫蘆巴糖苷Ib和具有約90%~約95%純度的所述葫蘆巴苷-1。
12.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述純化包括以下步驟:緩沖劑處理接著醇或酸處理并且濃縮以獲得純化的自由流動的粉末。
13.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述濃縮在約40°C~約80°C，更具體地約50°C的溫度下實施。
14.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述組合物具有濃度為約40%(w/w)~約90%(w/w)的葫蘆巴糖苷Ib和濃度為約l%(w/w)~約20%(w/w)的葫蘆巴苷-1。
15.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述賦形劑選自包含以下各項的組中:成粒劑，粘合劑，潤滑劑，崩解劑，增甜劑，著色劑，調味劑，包衣劑，增塑劑，防腐劑，懸浮劑，乳化劑，纖維素材料和滾圓劑或它們的任何組合。
16.一種治療自身免疫失調的方法，所述方法包括向需要其的受試者給予含有葫蘆巴糖苷Ib和葫蘆巴苷-1可選地連同至少一種賦形劑的組合物的操作。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述自身免疫失調選自包含以下各項的組中:古德帕斯徹病，腎小球腎炎，類風濕性關節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡和特發(fā)性血小板減少性紫癜。
18.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述受試者是動物或人類。
19.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述組合物給藥的日劑量范圍在動物中為約lmg/kg~約100mg/kg而在人中為約`lmg/kg~約50mg/kg。
【文檔編號】A61K31/366GK103517709SQ201180070564
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2011年6月15日 優(yōu)先權日:2011年5月2日
【發(fā)明者】蘇尼爾·布哈斯卡拉恩, 莫漢·維什瓦拉曼 申請人:梧桐生物技術私人有限公司